Summary
Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.
Abstract
El enfoque de montaje ascendente para la construcción de células sintéticas es una herramienta eficaz para aislar e investigar procesos celulares en un entorno de imitación celular. Además, el desarrollo de sistemas de expresión sin células ha demostrado la capacidad de reconstituir los procesos de producción, transcripción y traducción de proteínas (ADN-ARN-proteína) de manera controlada, aprovechando la biología sintética. Aquí describimos un protocolo para preparar un sistema de expresión libre de células, incluyendo la producción de un potente lisado bacteriano y encapsular este liso dentro de vesículas unilamelares gigantes a base de lípidos ricos en colesterol (GUVs) (es decir, liposomas estables), para formar células sintéticas. El protocolo describe los métodos para preparar los componentes de las células sintéticas, incluida la producción de lisatos bacterianos activos, seguido de una preparación detallada paso a paso de las células sintéticas basada en un método de transferencia de emulsión de agua en aceite. Estos facilitan la producción de millones de células sintéticas de una manera sencilla y asequible con una alta versatilidad para producir diferentes tipos de proteínas. Las células sintéticas obtenidas se pueden utilizar para investigar la producción de proteínas/ARN y la actividad en un entorno aislado, en evolución dirigida, y también como una plataforma de administración controlada de fármacos para la producción bajo demanda de proteínas terapéuticas dentro del cuerpo.
Introduction
Las células sintéticas son partículas similares a células artificiales, imitando una o varias funciones de una célula viva, como la capacidad de dividir, formar interacciones de membrana y sintetizar proteínas basadas en un código genético1,,2,3. Las células sintéticas que encierran sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) poseen una alta modularidad debido a su capacidad para producir varias proteínas y secuencias de ARN después de alteraciones en la plantilla de ADN. Presentando una alternativa atractiva a los enfoques actuales de la producción de proteínas, los sistemas CFPS se basan en lisato celular, componentes purificados o componentes sintéticos e incluyen toda la maquinaria de transcripción y traducción necesaria para la síntesis de proteínas como ribosomas, ARN polimerasa, aminoácidos y fuentes de energía (por ejemplo, 3-fosfoglicérido y trifosfato de adenina)4,5,6,7,8,9. La encapsulación de un sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite la producción simple y eficiente de proteínas sin depender de una célula viva10. Además, esta plataforma permite la síntesis de péptidos que pueden degradarse dentro de las células naturales, la producción de proteínas tóxicas para las células vivas, y modificar las proteínas con aminoácidos no naturales11,,12. Las células sintéticas se han utilizado como modelo para fines de investigación que investigan los componentes celulares mínimos necesarios para permitir la vida celular desde una perspectiva evolutiva1,,13. Las células sintéticas también se han utilizado para construir e implementar circuitos genéticos y como modelos para la evolución dirigida14,,15,,16. Otros estudios se han centrado en la capacidad de las células sintéticas para imitar la actividad biológica de las células naturales, con el objetivo de reemplazar las células naturales dañadas, como las células beta en pacientes con diabetes17. Además, la capacidad de estas células sintéticas encapsulantes CFPS para producir una variedad de proteínas terapéuticas ilustra su potencial para ser incorporadas en el uso clínico18.
Aquí describimos un protocolo de abajo hacia arriba a escala de laboratorio(Figura 1) para la producción de ARN y células sintéticas productoras de proteínas basadas en un sistema CFPS encapsulado en una vesícula lipídica. Esto muestra el uso potencial de plataformas celulares sintéticas como nuevos sistemas de administración de fármacos para la producción in situ de un fármaco de proteína terapéutica in vivo19. Estudios anteriores han investigado la optimización de la reacción CFPS y los procesos de preparación de lisato celular4,8,20. Además, se han aplicado varias técnicas para la preparación de liposomas del tamaño de una célula, como los métodos de estabilización de gotas microfluídicas y a base de polímeros21,22,23, que también difieren en la composición lipídica de los liposomas24,25,26. En el protocolo presentado, las células sintéticas se producen utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite y el proceso de encapsulación se lleva a cabo a bajas temperaturas (<4 oC)5,10,24,27,28. Se ha constatado que estas condiciones leves son favorables para conservar la integridad biofuncional de la maquinaria molecular, a saber, ribosomas y proteínas27,,29,,30. La composición lipídica de las partículas consiste en colesterol y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (POPC). La primera se encuentra en todas las membranas celulares de los mamíferos y es esencial para la estabilidad, rigidez y reducción de la permeabilidad de la membrana, y la segunda imita la composición de fosfolípidos de mamíferos11,,13. La transcripción celular y la maquinaria molecular de traducción se extraen de la cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que se transforma con plásmido pAR1219 sobreexpresando la polimerasa de ARN T7 para aumentar la potencia de CFPS y la síntesis de proteínas. Este sistema se ha utilizado para producir proteínas diagnósticas y terapéuticas, con pesos moleculares de hasta 66 kDa in vitro e in vivo19,,31. El siguiente protocolo proporciona un método simple y eficaz para la producción del sistema celular sintético, que puede abordar una amplia gama de cuestiones fundamentales asociadas con la síntesis de proteínas en la naturaleza y también se puede utilizar para aplicaciones de administración de fármacos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: La ilustración del protocolo de producción de las células sintéticas completas se presenta en la Figura 1. Según las necesidades del usuario, la expresión proteica (sección 3.2) y la formación de células sintéticas (sección 4) partes del protocolo también se pueden llevar a cabo de forma independiente (con algunas adaptaciones).
1. Preparación del lisado S30-T7
- Placa de raya de la bacteria E. coli BL21(DE3) transformada con el ARN T7 polimerasa que expresa pAR1219 plásmido en una placa de agar LB complementado con 50 g/ml de ampicilina para obtener colonias individuales.
- Preparar una solución de arranque: Inocular una sola colonia en 5 ml de LB-media suplementado con 50 g/ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y crezca durante la noche utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 oC. Preparar duplicados.
- Inocular cada arrancador de 5 ml por separado en 500 ml de medios de tuberculosis suplementados con ampicilina de 50 g/ml en un matraz Erlenmeyer de 2 L con deflectores y cultivarlo utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 oC hasta que alcance la OD600 de 0,8-1. Supervise periódicamente utilizando un espectrofotómetro.
- Añadir 2-3 mL de 100 mM de stock de IPTG (para llegar a 0.4 - 0.6 mM) para la inducción de la expresión de la polimerasa de ARN T7 y continuar creciendo el cultivo hasta que alcance OD600.4.
- Transfiera la solución de cada matraz Erlenmeyer a dos tubos de centrífuga esterilizados de 250 ml.
- Centrifugar cada uno a 7.000 x g durante 10 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
NOTA: En esta etapa, el pellet bacteriano se puede almacenar a -20 oC durante unos días antes de pasar a los siguientes pasos. - Vuelva a suspender cada pellet en 250 ml de tampón de lisado s30 frío (4 oC) y centrífuga a 7.000 x g durante 10 min a 4 oC.
NOTA: El tampón de lisato S30 se utiliza para mantener la estabilidad de las proteínas después de que la lisis celular se realiza utilizando el homogeneizador en el paso 1.9. A partir de este paso adelante, todos los pasos hasta la 1.12 deben llevarse a cabo de forma consecutiva y rápida.
NOTA: Antes de continuar con el siguiente paso, enfríe previamente las puntas y los viales de 1,5 mililitros que serán necesarios para almacenar el lisado - Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender todos los pellets juntos en 15 ml de tampón de lisado frío S30. Filtrar la suspensión con una almohadilla de gasa.
NOTA: 15 ml de solución se debe al volumen mínimo homogeneizador. Debe tenerse en cuenta que la concentración de bacterias también es importante. - Homogeneizar a una presión de trabajo de 15.000 psi, con una presión de aire de 4 bar (dos pasadas) para rotura celular. Evite la dilución de la solución para un lisado más concentrado y activo.
- Añadir 100 ml de TDT de 0,1 M (CAUTION) por 10 ml de la suspensión homogeneizada.
- Centrifugar la suspensión a 24.700 x g durante 30 min a 4oC.
- Realice el siguiente paso rápidamente para preservar la actividad de lisado: divida el sobrenadante uno por uno en alícuotas de 200 ml en viales preenfriados de 1,5 ml e inmediatamente congele con nitrógeno líquido. Conservar a -80oC para su uso posterior.
ADVERTENCIA: La TDT se clasifica como Irritante y Harmful y, por lo tanto, debe tratarse con cuidado.
2. Preparación de lípidos en solución de aceite
- Disolver el POPC y el colesterol en cloroformo (CAUTION) por separado, cada uno a una concentración final de 100 mg/ml. Vórtice cada vial por separado.
- Combinar los componentes en un vial de vidrio de 2 ml: añadir 50 ml de POPC en cloroformo, 50 ml de colesterol en cloroformo y 500 ml de aceite mineral. Para 100 l de células sintéticas, se requieren 2 viales de lípidos en aceite.
- Vórtice, y luego calentar durante aproximadamente 1 h a 80 oC en una campana química para evaporar el cloroformo. Asegúrese de que se ha producido una evaporación completa siguiendo el tiempo/condiciones especificados y supervisando el volumen de la solución.
NOTA: La solución resultante de lípidos en aceite se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de dos semanas. Para mejorar los resultados, se recomienda utilizar una preparación fresca antes de cada experimento. Las relaciones de lípidos y colesterol se pueden alterar de acuerdo con la composición de membrana deseada. Una alta concentración de colesterol puede conducir a la formación de agregados en la solución celular sintética final.
ADVERTENCIA: El cloroformo se clasifica como irritante y dañino y, por lo tanto, debe tratarse con cuidado y en zonas con extracción de humos.
3. Preparaciones de soluciones externas, preinternas y de alimentación
- Preparación de soluciones de stock
- Prepare las soluciones de stock enumeradas en la Tabla 2 utilizando agua ultrapura (UPW).
NOTA: Las soluciones de stock deben prepararse con antelación y almacenarse a -20 oC hasta su uso posterior. El reactivo 7 tiende a formar agregados. La calefacción a 37 oC reducirá la agregación. La agregación leve no afectará significativamente a la reacción. La solución del reactivo 8 es lechosa y turbia.
- Prepare las soluciones de stock enumeradas en la Tabla 2 utilizando agua ultrapura (UPW).
- Solución exterior
- Disolver la glucosa en DNase/RNase-free H2O a una concentración final de 200 mM.
- Para 100 ml de solución interna, prepare 1,6 ml de solución externa.
- Solución preinterna
- Añadir reactivos 1-14 según las cantidades y la concentración enumeradas en el Cuadro 2. Por ejemplo, para un volumen de celda sintética final de 100 ml, prepare 100 ml de solución interna.
NOTA: UPW debe añadirse para completar el volumen final requerido. En esta etapa, la mezcla se puede almacenar a 4oC durante unas horas.
- Añadir reactivos 1-14 según las cantidades y la concentración enumeradas en el Cuadro 2. Por ejemplo, para un volumen de celda sintética final de 100 ml, prepare 100 ml de solución interna.
- Solución de alimentación
- Añada todos los reactivos de acuerdo con las cantidades y la concentración enumeradas en la Tabla 3.
NOTA: Utilice la relación 1:1 de la solución de alimentación: solución interna. Para un volumen de células sintéticas final de 100 ml, prepare 100 ml de solución de alimentación. Se recomienda preparar un pequeño exceso de volumen de solución externa, interior y de alimentación.
- Añada todos los reactivos de acuerdo con las cantidades y la concentración enumeradas en la Tabla 3.
4. Preparación de células sintéticas
NOTA: Los siguientes volúmenes se ajustan para la preparación de 100 l de células sintéticas.
- Células sintéticas que producen proteínas
- En un tubo de 15 ml, coloque 12 ml de la solución externa y agregue lentamente, encima una capa, de 500 ml de lípidos en solución de aceite. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
- Para finalizar la preparación interna de la solución: mezclar los ingredientes internos de la solución en hielo triturado a un volumen final de 100 l descongelando y añadiendo S30-T7 Lysate (reactivo 15) y plásmido de ADN (reactivo 16) a la mezcla almacenada.
- Al segundo vial de vidrio de 2 ml con 500 ml de lípidos en solución de aceite, añadir 100 ml de la solución interna. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante 1 minuto y vórtice por otro minuto en el nivel cinco.
- Incubar durante 10 minutos sobre hielo triturado y añadir lentamente la emulsión resultante en la parte superior de la fase de aceite en el tubo de 15 ml (a partir de 4.1.1).
- Centrífuga durante 10 min a 100 x g y 4oC y luego centrífuga durante 10 min a 400 x g y 4oC. Al final de la centrifugación, se debe observar un pellet en la parte inferior del tubo.
NOTA: El uso de un rotor de centrífuga de cubo oscilante se prefiere aquí para adquirir una mejor cobertura de una segunda capa de lípidos durante el paso de las gotas de agua en aceite a través de la interfase. En caso de que no haya pellet observable, la velocidad de centrifugación se puede aumentar a 1000 x g. De lo contrario, consulte la sección Discusión que hace referencia a la gravedad específica de la solución externa. - Extraiga el pellet.
- Retire el exceso de capa de aceite.
- Utilice una punta de pipeta recortada cargada con aproximadamente 400 ml de solución externa para extraer el pellet. Liberar la solución externa mientras pasa a través de la fase de aceite con el fin de recoger sólo el pellet en la fase acuosa.
- Limpie la punta después de la extracción del pellet para evitar la transferencia de restos de aceite y transfiera el pellet a un tubo limpio de 1,5 ml.
- Centrífuga durante 10 min a 1.000 x g y 4oC, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 ml de solución de alimentación (1:1 relación de soluciones internas: de alimentación).
NOTA: Aquí también se puede utilizar un rotor de centrífuga de ángulo fijo. - Para la expresión proteica, incubar durante 2 horas a 37 oC sin agitar.
NOTA: El tiempo óptimo de incubación varía entre diferentes proteínas. - Evaluar la cantidad de proteína producida utilizando un método adecuado de acuerdo con las propiedades de la proteína objetivo.
- Grupos de control recomendados
- Solución interna y confirmación de actividad de lisado
- Preparar una solución interna completa (con ADN y lisato S30-T7).
- Incubar inmediatamente la reacción anterior utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm o un termomezclador a 1200 rpm, a una temperatura constante de 37oC durante 2 h.
NOTA: Ajuste el tiempo de incubación para que coincida con el tiempo de incubación de las células sintéticas.
- Células sintéticas
- Grupo de control negativo: Preparar el protocolo presentado en 4.1 con solución interna sin ADN.
- Control positivo: Prepare el protocolo presentado en 4.1 con una solución interna que contenga una codificación de plásmido T7 para un gen reportero.
NOTA: Agregue un grupo de control positivo compuesto por un gen de reportero, como sfGFP, junto con los grupos de prueba para garantizar el paso de eficiencia de encapsulación.
- Solución interna y confirmación de actividad de lisado
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presentamos un protocolo para la preparación de células sintéticas encapsulando un sistema S30-T7 CFPS basado en BL21 E. coli dentro de las vesículas lipídicas. En la Figura 2se presenta una descripción esquemática del proceso de preparación que incluye una imagen de cada etapa. El éxito del proceso de preparación de células sintéticas depende del rendimiento adecuado de cada etapa y se realiza mediante diferentes parámetros. El protocolo debe ajustarse para adaptarse a la producción de una proteína específica.
Los plásmidos que expresaban la supercarpeta de proteínas modelo Green Fluorescent Protein (sfGFP) y Renilla Luciferase bajo el promotor T7 se introdujeron en las reacciones a granel de CFPS y las células sintéticas, y la producción de proteínas se evaluó utilizando diferentes métodos, incluyendo la mancha occidental, la citometría de flujo, la microscopía y la espectroscopia (Figura 3). En la Figura 3Ase presenta una verificación de la producción de proteínas etiquetadas sfGFP-Su6 (27 kDa32) por análisis de manchas occidentales. Se mezcló una muestra de 30 l de células sintéticas diluidas 6 pliegues con 10 ml de un tampón de muestra SDS-PAGE común (que contiene los detergentes dodecilo sulfato sódico (SDS) y é-mercaptoetanol) y se hierve durante 10 minutos (95 oC). Encontramos que la combinación de calor y detergentes en el tampón de muestra es suficiente para desmontar las vesículas y permitir el funcionamiento de proteínas en el gel SDS-PAGE. La detección de proteínas se realizó utilizando anticuerpos primarios policlonales anti-Su (diluido 1:12.000). Como era de esperar, mientras que la producción de proteínas se detecta en muestras que contienen plantillas de ADN codificantes en sfGFP ("ADN +sfGFP"), no se observa ninguna proteína en muestras de control negativas en las que se haya excluido la plantilla de ADN ("-DNA"). Las muestras de sfGFP purificado y sfGFP purificado encapsulados dentro de la membrana de las células sintéticas ('sfGFP (encapsulado)), se utilizan como controles positivos para la producción a granel sfGFP CFPS y para su síntesis dentro de las células sintéticas, respectivley. Este método se puede aplicar a diferentes tipos de proteínas. Según Krinsky et al.19, el rendimiento de producción de sfGFP obtenido bajo el protocolo detallado es de 380 g/ml en solución de CFPS y 5,3 g/ml, cuando la solución de CFPS se encapsula dentro de vesículas lipídicas.
Cuando la proteína que se produce dentro de las células sintéticas es fluorescente, su producción se puede evaluar utilizando métodos basados en microscopía y citometría de flujo. Analizamos las células sintéticas utilizando un microscopio fluorescente con un filtro para la fluorescencia GFP(Figura 3B). Dado que los componentes CFPS tienen algunos parámetros autofluorescentes, los parámetros de adquisición de la imagen deben adaptarse de acuerdo con una muestra de control negativo adecuada (células sintéticas sin plantilla de ADN, por ejemplo).
Además, utilizamos citometría de flujo para determinar la intensidad media de fluorescencia de las células sintéticas productoras de sfGFP, y el porcentaje de células sintéticas activas, que pueden producir proteínas dentro de ellas(Figura 3C I&II). Se recopilaron 10.000 eventos por cada muestra analizada. La producción de células sintéticas, que se describe en este protocolo, generalmente produce una población activa de 21-25% dentro de una solución con una concentración aproximada de 107 células sintéticas/ml. La ligera intensidad de fluorescencia presentada por las muestras "-DNA" en la Figura 3CII se debe a la autofluorescencia de diferentes componentes en la reacción CFPS como el lisato S30.
El análisis representativo del tamaño basado en la señal GFP (en diámetro) de las células sintéticas preparadas por el método descrito anteriormente muestra un valor medio de 2,4 x 0,5 m(figura 3D II). Como la formación de agua en la emulsión de aceite en este método es un resultado de la aplicación de fuerzas mecánicas, la distribución del tamaño de las partículas podría verse afectada por diferentes factores, como el método y la velocidad de pipeteo de la emulsión hacia arriba y hacia abajo, el modelo de la máquina mezcladora de vórtice, etc.
Para probar la versatilidad de la producción de proteínas de las células sintéticas, se analizó la expresión de la proteína reportera Renilla luciferasa dentro de las células sintéticas(Figura 3E). El ensayo cuantificó la actividad de Renilla luciferasa midiendo la luminiscencia generada a partir de la reacción enzimática de la luciferasa y su sustrato, h-coelenterazine. Para inducir la reacción enzimática, se añadió una concentración final de 1 M de h-celenterazine a las células sintéticas (volumen de muestra de 25 L) justo antes de la medición. La muestra "-ADN", que no contiene la plantilla de ADN con codificación de luciferasa, se utilizó como un control negativo para probar la luminiscencia debida a la oxidación no enzimática del sustrato. La luminiscencia se midió utilizando un lector de placas.
Figura 1: Una ilustración del proceso para el protocolo típico de preparación de células sintéticas. El proceso se divide en dos pasos. Paso 1: Preparaciones previas al experimento que incluyen purificación de plásmido de ADN, preparación de lisato S30-T7, preparación de soluciones de stock necesarias para las soluciones internas y de alimentación, preparación de solución de lípidos en aceite y preparación de soluciones externas. Paso 2: Formación celular sintética que incluye alimentación y preparación de soluciones internas, preparación y análisis de células sintéticas. Un ejemplo del volumen requerido de cada ingrediente para preparar 100 l de solución de células sintéticas se presenta en azul entre corchetes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración esquemática del protocolo de preparación de células sintéticas. Una imagen de un proceso bien realizado ilustra cada etapa del protocolo. Esta cifra ha sido modificada de Krinsky et al.19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de la producción de sfGFP y Renilla luciferase dentro de células sintéticas. (A) Un análisis de la mancha occidental de la producción de sfGFP-His6 tanto en reacciones a granel CFPS como dentro de células sintéticas. La detección de proteínas se llevó a cabo utilizando anticuerpos primarios policlonales (diluido 1:12.000). El sfGFP-His6 purificado se utilizó como un control positivo (7,8 g). sfGFP (encapsulado) es el control positivo de sfGFP purificado encapsulado en células sintéticas. Las muestras sin plantillas de ADN se utilizaron como un control negativo para el análisis de producción ("-DNA"). (B) Imágenes representativas de sfGFP produciendo células sintéticas tomadas con un microscopio fluorescente con un campo brillante y un filtro GFP. Barras de escala a 50 m. (C) Análisis de citometría de flujo I&II de sfGFP produciendo actividad de células sintéticas (datos recopilados utilizando analizador digital de 4 láseres). Las muestras se midieron después de 3 h de incubación. Se recopilaron 10.000 eventos por cada muestra analizada. Los filtros FSC (500 V) y SSC (300 V) se utilizaron para definir la población total de células sintéticas. Luego, se utilizó un filtro FITC (600 V) para detectar la fluorescencia GFP.. (I) El cálculo de la población de células sintéticas activas [%] se basó en el umbral de intensidad de fluorescencia de la FPG, definido por la muestra "-ADN" (histograma rojo), lo que permite un error del 1%. (II) Intensidad media de fluorescencia de sfGFP que produce células sintéticas. Este valor se calculó a partir de la población de células sintéticas activas y se normalizó a la muestra "ADN" dividiendo la fluorescencia media de las células sintéticas activas por la media de las células sintéticas sin ADN sfGFP. (D) Análisis de tamaño de celda sintético I&II. El espectro de emisión se detectó en 505-560 nm y 642-745 nm para señales de GFP y de campo brillante, respectivamente. (I) Una imagen representativa de las células sintéticas analizadas. (II) Distribución del tamaño de las células sintéticas. Se realizaron análisis y las distribuciones de diámetro de las células sintéticas activas se calcularon sobre la base de la señal GFP. (E) Producción de Renilla luciferasa activa dentro de las células sintéticas. La actividad de la Luciferasa se cuantificó con mediciones de luminiscencia después de la adición de 1 m de h-coelenterazine utilizando un lector de placas y se presentó como intensidad de luz [RLU] x 106. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tabla 1: Preparación de soluciones de búfer y stock. | |
| Comentarios | |
| Agar Luria Bertani (LB) (1,5%) Placa: | Preparar y esterilizar. Añadir Ampicilina a una concentración final de 50 g/ml sólo después de enfriar a temperatura ambiente. |
| 10 g/L Bacto-triptolona | |
| 10 g/L Cloruro de sodio (NaCl) | |
| 5 g/L Extracto de Bacto-Hongos | |
| Agar agar de 15 g/L purificado | |
| Ampicilina de 50 g/ml | |
| Medios LB (20 mL): | Medios mínimos. Preparar y esterilizar con antelación. Justo antes de inocular las bacterias, añadir Ampicilina a una concentración final de 50 g/ml. |
| 10 g/L Bacto-triptolona | |
| 10 g/L Cloruro de sodio (NaCl) | |
| 5 g/L Extracto de Bacto-Hongos | |
| Ampicilina de 50 g/ml | |
| Medios de caldo terrible (TB) (1 L): | Medios ricos. Preparar y esterilizar con antelación. Justo antes de inocular las bacterias, añadir Ampicilina a una concentración final de 50 g/ml. |
| 12 g/L Bacto-triptolona | |
| Extracto de 24 g/L de Bacto-Yeste | |
| 4% (v/v) Glicerol anhidro | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | |
| Ampicilina de 50 g/ml | |
| Tampón de lisado S30 (1,5 L): | Preparar y esterilizar con antelación (*excluyendo la TDT y el 2-mercaptoetanol). Conservar a -4oC. |
| 10 mM Tris-acetato a pH a 7,4 | Base Trisma. Preparar y ajustar el pH a 7.4 con ácido acético. |
| 14 mM de acetato de magnesio | |
| 60 mM de acetato de potasio | |
| *1 mM DTT | Añadir justo antes de usar |
| *0,5 ml/L 2-mercaptoetanol | Añadir justo antes de usar |
| 1 M HEPES-KOH (pH n.o 8): | Disolver HEPES a una concentración final de 1 M. Ajustar a pH 8 utilizando la solución KOH. |
| HEPES | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | |
| Tabla 2: Composición de la solución interna. | ||||||||||
| Volumen final de la solución interna solicitada | ||||||||||
| Número | Reactivo | Stock conc. | Conc final. | 25 l | 50 l | 100 l | 200 l | 300 l | 400o L | |
| 1 | HEPES KOH pH-8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Solución pre-interior |
| 2 | Acetato de magnesio | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Acetato de potasio | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Acetato de amonio | 5.2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0.5m | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminoácidos - mezcla I | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminoácidos - mezcla II | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Sacarosa | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | Plásmido de ADN | 10 g/ml | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabla 3: Composición de la solución de alimentación. | |||||||||
| Volumen final solicitado de la solución de alimentación | |||||||||
| Número | Reactivo | stock conc. | conc final. | 25 l | 50 l | 100 l | 200 l | 300 l | 400 l |
| 1 | HEPES KOH pH-8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Acetato de magnesio | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Acetato de potasio | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Acetato de amonio | 5.2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0.5m | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminoácidos - mezcla I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminoácidos - mezcla II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glucosa | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabla 4: Soluciones necesarias para la preparación de células sintéticas. | |
| Solución y materiales necesarios | Comentarios |
| Lípidos en aceite | Conservar a temperatura ambiente hasta su uso. Preparado según la sección 2 |
| Solución exterior | Preparado según la sección 3.1 |
| Solución interna | Preparado según la sección 3.2. |
| Preparar pruebas + controla las muestras de acuerdo con la sección 4.1. | |
| Mantener el hielo triturado hasta su uso. | |
| Solución de alimentación | Preparado según la sección 3.3. |
| Mantener el hielo triturado hasta su uso. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo introduce un método simple y asequible para la producción de grandes cantidades de células sintéticas productoras de proteínas. El rendimiento de las células activas depende de una ejecución cuidadosa y precisa del protocolo con énfasis en varios pasos críticos. En la sección de preparación de lisados de este método, es esencial alcanzar la densidad bacteriana adecuada antes de la lisis celular para lograr una cantidad suficiente de proteínas en el lisato bacteriano. En segundo lugar, el proceso de lisis debe realizarse a 4 oC y el lisado se congela rápidamente con nitrógeno líquido para mantener la actividad proteica. Además, en este protocolo utilizamos células De. coli BL21(DE3) transformadas con plásmido pAR1219 que expresa la polimerasa de ARN T7. En los casos en que se utiliza una cepa diferente de bacterias, pueden ser necesarios cambios en la concentración de liasato para alcanzar una cantidad satisfactoria de ARN polimerasa y ribosomas. Incluso cuando se utiliza la misma cepa bacteriana, diferentes producciones de lysato pueden tener cierta variabilidad de lote a lote.
La sección de producción de vesículas también incluye un par de pasos significativos. La solubilización de los lípidos y la eliminación del cloroformo del aceite mineral es importante para establecer la emulsión de agua en aceite. La centrifugación de las gotas de agua en aceite en el tampón acuoso externo también es un paso clave en el protocolo para generar células sintéticas con una bicapa lipídica. Los cambios en la solución interna de las vesículas y la composición lipídica podrían conducir a una capa de gotas en la interfase aceite-agua sin ningún pellet observable. Para superar esto, una solución rápida es aumentar la velocidad de centrifugación a 1.000 x g en el paso de transferencia de emulsión. En caso de que esto no resuelva el problema, la gravedad específica de la solución acuosa externa puede ser alterada asegurando que la solución interna tendrá una gravedad específica más alta que la solución externa. Además, la osmolalidad de la solución interna también puede variar entre diferentes fuentes de lisato y producciones, que oscilan entre 800-1100 mOsm/kg. La variabilidad en la osmolalidad de la solución interna se debe principalmente a las concentraciones cambiantes del lisado durante su proceso de producción. Por lo general, esto no conduce a cambios significativos en la producción de proteínas, sin embargo, una gran dilución podría conducir a un rendimiento reducido debido a las bajas concentraciones de las enzimas de transcripción y traducción en el propio lisado. La medición de la concentración total de proteínas en cada lote de lisado puede ayudar a ajustar las concentraciones de lisato en la solución interna para mantener valores constantes (aproximadamente 22 mg/ml medidos por el ensayo Bradford).
Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones que deben mencionarse. No todas las células sintéticas generadas son activas y capaces de producir proteínas debido a la encapsulación incompleta de todos los componentes requeridos. Medimos aproximadamente 21-25% de las células activas al producir sfGFP expresando células sintéticas usando citometría de flujo (no se observaron diferencias de tamaño significativas entre las células activas e inactivas). El exceso de residuos de aceite y lípidos ocasionalmente permanece en la membrana lipídica bicapa después de la transferencia de las células sintéticas a la fase acuosa. Optimizar las concentraciones de lípidos y colesterol en la fase de aceite puede mejorar este problema. También es importante tener en cuenta que la distribución del tamaño de las células sintéticas obtenidas es bastante amplia en comparación con los métodos microfluídicos alternativos, con vesículas que van desde aproximadamente 1-50 m.
El alto rendimiento del método de transferencia de emulsión lo hace especialmente adecuado para células sintéticas que encapsulan sistemas de síntesis de proteínas libres de células para la producción terapéutica de proteínas. Diferentes variaciones del método de transferencia de emulsión se han utilizado en estudios de células sintéticas e incluyen cambios en el procedimiento de preparación de aceite, composición de membrana, volumen de muestra, solución interna a la relación de aceite y velocidades de centrifugación5,,24,28. Los métodos de estabilización de gotas microfluídicas y a base de polímeros también se han utilizado para la preparación de células sintéticas, sin embargo, la encapsulación de todo el sistema CFPS aún no se ha realizado con estos métodos21,,22,23.
Las células sintéticas obtenidas por este método se mostraron in vivo para producir proteínas y tratar el cáncer en los modelos murinos19. Las capacidades de estas células se pueden ampliar aún más en el futuro más allá de la expresión de proteínas. La integración de otros procesos celulares como la comunicación celular, la modificación del citoesqueleto y la división celular en células sintéticas se han descrito recientemente33,,34,,35,,36. La sustitución del lisato bacteriano por lisato de células eucariotas permitirá la expresión de proteínas de mayor complejidad y modificaciones post-traduccionales, y tal vez sea menos inmunogénica incluso sin un procedimiento de limpieza, abriendo así más fronteras terapéuticas37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por ERC-STG-2015-680242.
Los autores también reconocen el apoyo del Technion Integrated Cancer Center (TICC); el Russell Berrie Nanotechnology Institute; el Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; el Ministerio de Economía de Israel para una beca Kamin (52752); el Ministerio de Tecnología Científica y Espacio de Israel – Oficina del Científico Jefe (3-11878); la Fundación para la Ciencia de Israel (1778/13, 1421/17); la Asociación israelí contra el cáncer (2015-0116); la Fundación Alemán-Israelí para la Investigación y el Desarrollo Científico para una beca GIF Young (I-2328-1139.10/2012); el Programa FP-7 del IRG de la Unión Europea para una Beca de Integración Profesional (908049); la Beca del Centro de Investigación de Fosfolípidos; una Fundación Rosenblatt para la investigación del cáncer, una beca de la Fundación de la Familia Mallat; y la Fundación unger de la familia. A. Schroeder reconoce las becas Alon y Taub. O. Adir reconoce las becas Sherman y Gutwirth. G. Chen reconoce la Comunidad Sherman. N. Krinsky reconoce el Programa de Doctorado de Mujeres Baronesa Ariane de Rothschild de la Fundación Rothschild Cesarea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
