Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.
A abordagem de montagem de baixo para cima para a construção de células sintéticas é uma ferramenta eficaz para isolar e investigar processos celulares em um ambiente de imitação celular. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de expressão livre de células demonstrou a capacidade de reconstituir os processos de produção, transcrição e tradução de proteínas (DNA→RNA→protein) de forma controlada, aproveitando a biologia sintética. Aqui descrevemos um protocolo para preparar um sistema de expressão livre de células, incluindo a produção de um potente lisato bacteriano e encapsulamento deste lisato dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ricas em colesterol( ou seja, lipossomos estáveis), para formar células sintéticas. O protocolo descreve os métodos para a preparação dos componentes das células sintéticas, incluindo a produção de lisatos bacterianos ativos, seguido de uma preparação detalhada passo a passo das células sintéticas com base em um método de transferência de emulsão de água em óleo. Estes facilitam a produção de milhões de células sintéticas de forma simples e acessível, com alta versatilidade para a produção de diferentes tipos de proteínas. As células sintéticas obtidas podem ser utilizadas para investigar a produção e a atividade de proteína/RNA em um ambiente isolado, em evolução direcionada, e também como uma plataforma controlada de entrega de medicamentos para produção sob demanda de proteínas terapêuticas dentro do corpo.
As células sintéticas são partículas artificiais semelhantes a células, imitando uma ou múltiplas funções de uma célula viva, como a capacidade de se dividir, formar interações de membrana e sintetizar proteínas com base em um código genético1,2,3. Células sintéticas que encerram sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) possuem alta modularidade devido à sua capacidade de produzir várias proteínas e seqüências de RNA após alterações no modelo de DNA. Apresentando uma alternativa atraente às abordagens atuais da produção de proteínas, os sistemas CFPS baseiam-se em lisato celular, componentes purificados ou componentes sintéticos e incluem todas as máquinas de transcrição e tradução necessárias para a síntese de proteínas como ribossomos, Polimerase de RNA, aminoácidos e fontes de energia (por exemplo, 3-fosfoliglicerato e adenina,tripofatos)4,5,6,7, 8,8.9 O encapsulamento de um sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite a produção simples e eficiente de proteínas sem depender de uma célula viva10. Além disso, esta plataforma permite a síntese de peptídeos que podem se degradar dentro das células naturais, a produção de proteínas tóxicas para as células vivas e a modificação de proteínas com aminoácidos não naturais11,12. As células sintéticas têm sido utilizadas como modelo para fins de pesquisa investigando os componentes celulares mínimos necessários para permitir a vida celular a partir de uma perspectiva evolutiva1,13. As células sintéticas também têm sido utilizadas para construir e implementar circuitogenético e como modelos para evolução dirigida14,,15,,16. Outros estudos têm focado na capacidade das células sintéticas de imitar a atividade biológica das células naturais, visando substituir células naturais danificadas, como células beta em pacientes com diabetes17. Além disso, a capacidade dessas células sintéticas encapsuladas cfps de produzir uma variedade de proteínas terapêuticas ilustra seu potencial para serem incorporadas ao uso clínico18.
Aqui descrevemos um protocolo de escala de laboratório de baixo para cima (Figura 1) para a produção de RNA e células sintéticas produtoras de proteínas com base em um sistema CFPS encapsulado em uma vesícula lipídica. Isso mostra o potencial uso de plataformas de células sintéticas como novos sistemas de entrega de medicamentos para a produção in loco de uma droga de proteína terapêutica in vivo19. Estudos anteriores têm investigado a otimização da reação cfps e os processos de preparação de lésa celular4,8,20. Além disso, várias técnicas têm sido aplicadas para a preparação do liposome do tamanho celular, tais como os métodos de estabilização de gotículas microfluidas e baseadas em polímeros21,,22,23, que também diferem na composição lipídica dos liposóis24,,25,26. No protocolo apresentado, as células sintéticas são produzidas utilizando-se um método de transferência de emulsão de água-no-óleo e o processo de encapsulamento é realizado a baixas temperaturas (<4 °C)5,10,24,27,28. Estas condições leves têm sido favoráveis para a manutenção da integridade biofuncional das máquinas moleculares, ou seja, ribossomos e proteínas27,29,30. A composição lipídica das partículas consiste tanto no colesterol quanto no 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocholine (POPC). A primeira é encontrada em todas as membranas celulares dos mamíferos e é essencial para a estabilidade, rigidez e redução da permeabilidade da membrana, e esta última imita a composição fosfolipídea dos mamíferos11,13. A transcrição celular e a maquinaria molecular de tradução são extraídas da cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que é transformada com pAR1219 plasmídeo superexpressor t7 rna polimerase para aumentar a potência cfps e a síntese de proteínas. Este sistema tem sido utilizado para produzir proteínas diagnósticas e terapêuticas, com pesos moleculares de até 66 kDa in vitro e in vivo19,31. O protocolo a seguir fornece um método simples e eficaz para a produção do sistema celular sintético, que pode abordar uma ampla gama de questões fundamentais associadas à síntese proteica na natureza e também pode ser utilizado para aplicações de entrega de medicamentos.
Este protocolo introduz um método simples e acessível para a produção de grandes quantidades de células sintéticas produtoras de proteínas. O rendimento das células ativas depende da execução cuidadosa e precisa do protocolo com ênfase em várias etapas críticas. Na seção de preparação de lisato deste método, é essencial alcançar a densidade de bactérias apropriada antes da lse celular para alcançar uma quantidade suficiente de proteínas no lisato bacteriano. Em segundo lugar, o processo de lyse dev…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo ERC-STG-2015-680242.
Os autores também reconhecem o apoio do Centro Integrado de Câncer Technion (TICC); o Russell Berrie Nanotechnology Institute; o Centro Interdisciplinar de Ciências e Engenharia de Vida Lorry I. Lokey; o Ministério da Economia de Israel para um Kamin Grant (52752); o Ministério da Ciência de Israel Tecnologia e Espaço – Escritório do Cientista Chefe (3-11878); a Fundação de Ciência de Israel (1778/13, 1421/17); a Associação israelense de câncer (2015-0116); a Fundação German-Israelense de Pesquisa e Desenvolvimento Científico para uma bolsa GIF Young (I-2328-1139.10/2012); o Programa FP-7 IRG da União Europeia para uma Bolsa de Integração de Carreira (908049); o Subsídio do Centro de Pesquisa Fosfolipídeo; uma Fundação Rosenblatt para pesquisa de câncer, uma Bolsa da Fundação Da Família Mallat; e a Unger Family Foundation. A. Schroeder reconhece as Bolsas Alon e Taub. O. Adir reconhece as bolsas Sherman e Gutwirth. G. Chen reconhece a Bolsa Sherman. N. Krinsky reconhece o Programa de Doutorado feminino da Baronesa Ariane de Rothschild da Fundação Rothschild Caesarea.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |