Denne protokol beskriver metode, materialer, udstyr og trin til bottom-up forberedelse af RNA og proteinproducerende syntetiske celler. Den indre vandige rum af de syntetiske celler indeholdt S30 bakterielle lysat indkapslet i en lipid tolags (dvs. stabile liposomer), ved hjælp af en vand-i-olie emulsion overførsel metode.
Bottom-up-samlingsmetoden til konstruktion af syntetiske celler er et effektivt værktøj til at isolere og undersøge cellulære processer i et celleefterlignende miljø. Desuden har udviklingen af cellefrie ekspressionssystemer vist evnen til at rekonstituere proteinproduktion, transskription og oversættelsesprocesser (DNA→RNA→protein) på en kontrolleret måde, der udnytter syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokol til fremstilling af en celle-frit udtryk system, herunder produktion af en potent bakteriel lysat og indkapsle dette lysat inde kolesterol-rige lipid-baserede kæmpe unilamellar vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), til at danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metoderne til fremstilling af komponenterne i de syntetiske celler, herunder produktion af aktive bakterielysater, efterfulgt af en detaljeret trinvis forberedelse af de syntetiske celler baseret på en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode. Disse letter produktionen af millioner af syntetiske celler på en enkel og overkommelig måde med en høj alsidighed til at producere forskellige typer af proteiner. De opnåede syntetiske celler kan bruges til at undersøge protein/RNA-produktion og -aktivitet i et isoleret miljø, i styret udvikling, og også som en kontrolleret lægemiddelleveringsplatform til on-demand produktion af terapeutiske proteiner inde i kroppen.
Syntetiske celler er kunstige celle-lignende partikler, efterligne en eller flere funktioner i en levende celle, såsom evnen til at opdele, danne membran interaktioner, og syntetisere proteiner baseret på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler, der omslutter cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS) har høj modularitet på grund af deres evne til at producere forskellige proteiner og RNA-sekvenser efter ændringer i DNA-skabelonen. Cfps-systemer, der udgør et attraktivt alternativ til de nuværende tilgange til proteinproduktion, er baseret på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og omfatter alle de transskriptions- og oversættelsesmaskiner, der kræves til proteinsyntese, såsom ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-phosphoglycerat og adenintrifosfat)4,5,6,7,8,9. Indkapslingen af et CFPS-system inde i lipidvesikler muliggør enkel og effektiv produktion af proteiner uden at være afhængig af en levende celle10. Desuden, denne platform tillader syntese af peptider, der kan nedbrydes inde i naturlige celler, produktion af proteiner, der er giftige for levende celler, og ændre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler er blevet anvendt som model til forskningsformål , der undersøger de minimale cellekomponenter , der er nødvendige for at muliggøre celleliv fra et evolutionært perspektiv1,13. Syntetiske celler er også blevet anvendt til at opbygge og implementere genetiske kredsløb og som modeller for styret evolution14,15,16. Andre undersøgelser har fokuseret på evne til syntetiske celler til at efterligne den biologiske aktivitet af naturlige celler, der sigter mod at erstatte beskadigede naturlige celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Desuden illustrerer disse cfps’ evne til at producere en række terapeutiske proteiner, at den ser ud til at kunne indarbejdes i klinisk anvendelse18.
Her beskriver vi en bottom-up lab-skala protokol (Figur 1) til produktion af RNA og proteinproducerende syntetiske celler baseret på et CFPS-system indkapslet i en lipidvesikel. Dette viser den potentielle brug af syntetiske celleplatforme som nye lægemiddelfremføringssystemer til onsite-produktion af et terapeutisk proteinlægemiddel in vivo19. Tidligere undersøgelser har undersøgt optimeringen af den fælles fiskeripolitiks reaktion og cellelysatforberedelsesprocesserne4,8,20. Desuden er der anvendt flere teknikker til cellestørrelse liposom præparat, såsom mikrofluidiske og polymer-baserede dråbe stabiliseringsmetoder21,22,23, som også adskiller sig i liposomer ‘lipid sammensætning24,25,26. I den præsenterede protokol fremstilles syntetiske celler ved hjælp af en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode , og indkapslingsprocessen udføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,10,24,27,28. Disse milde betingelser har vist sig at være gunstige for at bevare den biofunktionelle integritet af de molekylære maskiner, nemlig ribosomer og proteiner27,29,30. Partiklernes lipidsammensætning består af både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC). Den første findes i alle pattedyr cellemembraner og er afgørende for stabilitet, stivhed og permeabilitet reduktion af membranen, og sidstnævnte efterligner pattedyr fosfolipid sammensætning11,13. Den cellulære transskription og oversættelse molekylære maskiner udvindes fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som omdannes med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase at øge CFPS potens og proteinsyntese. Dette system er blevet anvendt til fremstilling af diagnostiske og terapeutiske proteiner med molekylvægt på op til 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokol giver en enkel og effektiv metode til produktion af det syntetiske cellesystem, som kan behandle en bred vifte af grundlæggende spørgsmål i forbindelse med proteinsyntese i naturen og kan også anvendes til lægemiddellevering applikationer.
Denne protokol indfører en enkel og økonomisk overkommelig metode til produktion af store mængder proteinproducerende syntetiske celler. Udbyttet af aktive celler er afhængig af omhyggelig og præcis udførelse af protokollen med vægt på flere kritiske trin. I lysatpræparatdelen af denne metode er det vigtigt at nå den relevante bakterietæthed før cellelysis for at opnå en tilstrækkelig mængde proteiner i bakterielysatet. For det andet bør lysisprocessen udføres ved 4 °C, og lysatet nedfryses hurtigt med …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af ERC-STG-2015-680242.
Forfatterne anerkender også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Lorry I. Lokey Tværfagligt Center for Biovidenskab og Teknik; det israelske økonomiministerium for et Kamin Grant (52752); Det Israelske Ministerium for Videnskabsteknologi og Rum – Chefforskerens Kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske fond for videnskabelig forskning og udvikling af et GIF-tilskud (I-2328-1139.10/2012); Den Europæiske Unions FP-7 IRG-program for et karriereintegrationsstipendium (908049) Phospholipid Forskningscenter Grant; en Rosenblatt Foundation for kræftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkender Alon og Taub Stipendier. O. Adir anerkender Sherman og Gutwirth stipendier. G. Chen anerkender Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkender baronesse Ariane de Rothschild Kvinder Ph.d.-program fra Rothschild Caesarea Foundation.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |