Summary
Detta protokoll beskriver metod, material, utrustning och steg för nedifrån och upp-beredning av RNA och proteinproducerande syntetiska celler. Det inre vattenrummet i de syntetiska cellerna innehöll S30 bakteriella lysate inkapslade i en lipid bilayer (dvs. stabila liposomer), med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod.
Abstract
Den nedifrån och upp monteringsmetod för konstruktion av syntetiska celler är ett effektivt verktyg för att isolera och undersöka cellulära processer i en cell härma miljö. Vidare har utvecklingen av cellfria uttryckssystem visat förmåga att rekonstruera proteinproduktion, transkription och översättningsprocesser (DNA→RNA→protein) på ett kontrollerat sätt, utnyttja syntetisk biologi. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda en cell-yttrandefrihet system, inklusive produktion av en potent bakteriell lysate och kapsla in denna lysate inuti kolesterol-rika lipid-baserade jätte unilamellar blåsor (GUVs) (dvs. stabila liposomer), att bilda syntetiska celler. I protokollet beskrivs metoderna för att förbereda komponenterna i de syntetiska cellerna, inklusive produktion av aktiva bakteriella lyserter, följt av en detaljerad steg-för-steg-beredning av de syntetiska cellerna baserat på en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod. Dessa underlättar produktionen av miljontals syntetiska celler på ett enkelt och prisvärt sätt med en hög mångsidighet för att producera olika typer av proteiner. De erhållna syntetiska cellerna kan användas för att undersöka protein/RNA-produktion och aktivitet i en isolerad miljö, i riktad evolution, och även som en kontrollerad drug delivery-plattform för on-demand-produktion av terapeutiska proteiner inuti kroppen.
Introduction
Syntetiska celler är konstgjorda cellliknande partiklar, härma en eller flera funktioner i en levande cell, såsom förmågan att dela, bilda membran interaktioner, och syntetisera proteiner baserat på en genetisk kod1,2,3. Syntetiska celler som omsluter cellfria proteinsyntessystem (CFPS) har hög modularitet på grund av deras förmåga att producera olika proteiner och RNA-sekvenser efter förändringar i DNA-mallen. Cfps-system bygger på celllystnat, renade komponenter eller syntetiska komponenter och omfattar alla transkriptions- och översättningsmaskiner som krävs för proteinsyntes såsom ribosomer, RNA-polymeras, aminosyror och energikällor (t.ex. 3-fosfoglycerat och adenintriphosfat)4,,5,,6,,7,8,9. Inkapslingen av ett CFPS-system inuti lipidblåsor möjliggör enkel och effektiv produktion av proteiner utan att vara beroende av en levande cell10. Dessutom tillåter denna plattform syntes av peptider som kan försämras inuti naturliga celler, produktion av proteiner som är giftiga för levande celler, och ändra proteiner med icke-naturliga aminosyror11,12. Syntetiska celler har använts som modell för forskningsändamål som undersöker de minimala cellkomponenter som krävs för att möjliggöra cellliv ur ett evolutionärt perspektiv1,13. Syntetiska celler har också använts för att bygga och genomföra genetisk krets och som modeller för riktad evolution14,,15,16. Andra studier har fokuserat på syntetiska cellers förmåga att efterlikna den biologiska aktiviteten hos naturliga celler, som syftar till att ersätta skadade naturliga celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Dessutom visar förmågan hos dessa CFPS som kapslar in syntetiska celler att producera en mängd olika terapeutiska proteiner dess potential att införlivas i klinisk användning18.
Här beskriver vi ett bottom-up lab-skala protokoll (figur 1) för produktion av RNA och proteinproducerande syntetiska celler baserat på en CFPS system inkapslade i en lipid vesikel. Detta visar den potentiella användningen av syntetiska cellplattformar som nya drug delivery-system för produktion på plats av ett terapeutiskt proteinläkemedel in vivo19. Tidigare studier har undersökt optimering av CFPS-reaktionen och cell lysate förberedelseprocesserna4,,8,20. Dessutom har flera tekniker tillämpats för cellstor liposomberedning, såsom mikrofluidiska och polymerbaserade droppstabiliseringsmetoder21,22,23, som också skiljer sig åt i liposomernas lipidsammansättning24,,25,26. I det presenterade protokollet produceras syntetiska celler med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod och inkapslingsprocessen utförs vid låga temperaturer (<4 °C)5,,10,,24,27,28. Dessa milda förhållanden har visat sig vara gynnsamma för att behålla den biologiska funktionella integriteten hos det molekylära maskineriet, nämligen ribosomer och proteiner27,29,30. Partiklarnas lipidsammansättning består av både kolesterol och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den första finns i alla däggdjurscellmembran och är nödvändig för att membranet ska kunna minska stabiliteten, styvheten och permeabiliteten, och den senare efterliknar phospholipidsammansättningen11,,13. Den cellulära transkription och översättning molekylära maskiner extraheras från BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, som omvandlas med pAR1219 plasmid överuttryckA T7 RNA polymeras att öka CFPS potens och proteinsyntes. Detta system har använts för att producera diagnostiska och terapeutiska proteiner, med molekylvikter på upp till 66 kDa in vitro och in vivo19,31. Följande protokoll ger en enkel och effektiv metod för produktion av syntetiska cellsystemet, som kan ta itu med ett brett spektrum av grundläggande frågor i samband med proteinsyntes i naturen och kan också användas för drug delivery applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Illustration av hela det syntetiska cellernas produktionsprotokoll presenteras i figur 1. Enligt användarens behov kan också proteinuttrycket (avsnitt 3.2) och syntetisk cellbildning (avsnitt 4) av protokollet utföras oberoende av dem (med vissa anpassningar).
1. Beredning av S30-T7 lysate
- Streak plattan E. coli BL21(DE3) bakterier omvandlas med T7 RNA polymeras uttrycker pAR1219 plasmid på en LB-agar platta kompletteras med 50 μg/mL ampicillin för att få enstaka kolonier.
- Förbered en startlösning: Inokulera en enda koloni i 5 ml LB-media kompletterat med 50 μg/ml ampicillin i en 100 ml Erlenmeyerkolv och växa över natten med hjälp av en golvinkubator shaker vid 250 rpm och 37 °C. Förbered dubbletter.
- Inokulera varje 5 ml-start separat i 500 ml TB-media kompletterat med 50 μg/ml ampicillin i en 2 L Erlenmeyer-kolv med bafflar och odla den med hjälp av en golvinkubator shaker vid 250 varv/min och 37 °C tills den når OD600 av 0,8-1. Övervaka regelbundet med hjälp av en spektrofotometer.
- Tillsätt 2-3 ml 100 mM lager av IPTG (för att nå 0,4 - 0,6 mM) för induktion av T7 RNA polymeras uttryck och fortsätta växa kulturen tills den når OD600≈4.
- Överför lösningen från varje Erlenmeyerkolv till två 250 ml steriliserade centrifugrör.
- Centrifugera vardera vid 7 000 x g i 10 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
OBS: I detta skede kan bakteriepellet förvaras vid -20 °C i några dagar innan du går vidare till nästa steg. - Återinställ varje pellet i 250 ml kyla (4 °C) S30 lysate buffert och centrifug vid 7 000 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: S30 lysate bufferten används för att upprätthålla proteinstabilitet efter celllys utförs med hjälp av homogenisator i steg 1.9. Från detta steg framåt bör alla steg fram till 1.12 utföras i följd och snabbt.
OBS: Innan du går vidare till nästa steg, förkyla tips och 1,5-milliliter flaskor som kommer att behövas för att lagra lysate - Kasta supernatanten och suspendera alla pellets tillsammans i 15 ml kall S30 lysate-buffert. Filtrera fjädringen med gasbinda.
OBS: 15 ml lösning beror på homogenisator min. volym. Bör märkas att bakteriekoncentration är också viktigt. - Homogenisera vid ett arbetstryck på 15 000 psi, med ett lufttryck på 4 bar (två pass) för cellbrott. Undvik lösningsutspädning för en mer koncentrerad och aktiv lysate.
- Tillsätt 100 μl DTT (VARNING) per 10 ml homogeniserad suspension.
- Centrifugera suspensionen vid 24 700 x g i 30 min vid 4 °C.
- Utför följande steg snabbt för att bevara lysateaktiviteten: dela upp supernatanten en efter en i 200 μL alikvoter i förkylda 1,5 ml injektionsflaska och omedelbart knäppa frysa dem med flytande kväve. Förvaras vid -80 °C för vidare användning.
VARNING: DTT klassificeras som irriterande och skadligt och bör därför behandlas med försiktighet.
2. Beredning av lipider i oljelösning
- Lös POPC och kolesterol i kloroform (VARNING) separat, var och en till en slutlig koncentration på 100 mg/ml. Vortex varje injektionsflaska separat.
- Kombinera komponenterna i en 2mL glasflaska: tillsätt 50 μl POPC i kloroform, 50 μl kolesterol i kloroform och 500 μl mineralolja. För 100 μl syntetiska celler krävs 2 flaskor lipider i olja.
- Vortex, och sedan värma i ca 1 h vid 80 °C i en kemisk huva för att avdunsta kloroformen. Se till att fullständig avdunstning har skett genom att följa den angivna tiden/villkoren och övervaka lösningsvolymen.
OBS: Den resulterande lipid-i-olja-lösningen kan förvaras i rumstemperatur i upp till två veckor. För bättre resultat rekommenderas att använda en ny beredning före varje experiment. Lipid- och kolesterolförhållanden kan ändras beroende på önskad membransammansättning. En hög koncentration av kolesterol kan leda till bildandet av aggregat i den slutliga syntetiska celllösningen.
VARNING: Kloroform klassificeras som irriterande och skadligt och bör därför behandlas med försiktighet och i områden med rökextraktion.
3. Beredningar av yttre, förinre och utfodringslösningar
- Beredning av lagerlösningar
- Förbered de stamlösningar som anges i tabell 2 med ultrapure vatten (UPW).
OBS: Lagerlösningar bör beredas i förväg och förvaras vid -20 °C tills vidareutanysättning. Reagens 7 tenderar att bilda aggregat. Uppvärmning till 37 °C minskar aggregeringen. Liten aggregering kommer inte att påverka reaktionen nämnvärt. Reagens 8 lösning är mjölkig och grumlig.
- Förbered de stamlösningar som anges i tabell 2 med ultrapure vatten (UPW).
- Yttre lösning
- Lös glukos i DNase/RNase-fria H2O till en slutlig koncentration på 200 mM.
- För 100 μl inre lösning, förbered 1,6 ml yttre lösning.
- Förinre lösning
- Tillsätt reagenser 1-14 i enlighet med de mängder och den koncentration som anges i tabell 2. Till exempel, för en slutlig syntetisk cellvolym på 100 μL, förbered 100 μL inre lösning.
UPW bör läggas till för att slutföra den slutliga önskade volymen. I detta skede kan blandningen lagras vid 4 °C i några timmar.
- Tillsätt reagenser 1-14 i enlighet med de mängder och den koncentration som anges i tabell 2. Till exempel, för en slutlig syntetisk cellvolym på 100 μL, förbered 100 μL inre lösning.
- Matningslösning
- Tillsätt alla reagenser enligt de mängder och den koncentration som anges i tabell 3.
OBS: Använd 1:1 förhållandet mellan matningslösning:inre lösning. För en slutlig syntetisk cellvolym på 100 μL, bered 100 μl matningslösning. Det rekommenderas att förbereda en liten överskottsvolym av yttre, inre och utfodring lösning.
- Tillsätt alla reagenser enligt de mängder och den koncentration som anges i tabell 3.
4. Beredning av syntetiska celler
OBS: Följande volymer justeras för beredning av 100 μl syntetiska celler.
- Syntetiska celler som producerar protein
- I ett 15 ml-rör, placera 12 ml av den yttre lösningen och tillsätt långsamt, ovanpå ett lager, 500 μl lipider i oljelösning. Inkubera i rumstemperatur i 20 min.
- För att slutföra den inre lösningsberedningen: Blanda ingredienserna i den inre lösningen på krossad is till en slutlig volym på 100 μL genom upptining och tillsats av S30-T7 Lysate (reagens 15) och DNA-plasmid (reagens 16) till den lagrade blandningen.
- Tillsätt 100 μL av den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen till den inre lösningen. Pipett upp och ner kraftigt i 1 minut och virvel i ytterligare en minut på plan fem.
- Inkubera i 10 min på krossad is och tillsätt långsamt den resulterande emulsionen ovanpå oljefasen i 15 ml-röret (från 4.1.1).
- Centrifug i 10 min vid 100 x g och 4 °C och centrifugera sedan i 10 min vid 400 x g och 4 °C. I slutet av centrifugeringen ska en pellet i botten av röret observeras.
OBS: Att använda en svängande centrifugrotor är att föredra här för att få en bättre täckning av ett andra lager lipider under vatten-i-olja droppar passage genom interfasen. Om det inte finns någon observerbar pellet kan centrifugeringshastigheten ökas till 1000 x g. Annars, se avsnittet Diskussion som hänvisar till den yttre lösningens specifika allvar. - Extrahera pelleten.
- Ta bort överflödigt oljeskikt.
- Använd en trimmad pipettspets laddad med ca 400 μL yttre lösning för att extrahera pelleten. Släpp den yttre lösningen när du passerar genom oljefasen för att endast samla upp pelleten i vattenfasen.
- Torka av spetsen efter utsugning av pelleten för att undvika att överföra oljerester och överför pelleten till ett rent 1,5 ml-rör.
- Centrifugera i 10 min vid 1 000 x g och 4 °C, ta bort supernatanten och suspendera pelleten igen i 100 μl matningslösning (1:1 förhållandet mellan inner:utfodringslösningar).
OBS: En fast vinkel centrifugrotor kan användas även här. - För proteinuttryck inkubera i 2 timmar vid 37 °C utan skakning.
OPTIMAL inkubationstid varierar mellan olika proteiner. - Utvärdera den producerade proteinmängden med en lämplig metod enligt målproteinegenskaperna.
- Rekommenderade kontrollgrupper
- Inre lösning och lyssning aktivitetsbekräftelse
- Förbered en komplett inre lösning (med DNA & S30-T7 lysate).
- Inkubera omedelbart reaktionen ovan med hjälp av en golvinkubator shaker vid 250 rpm eller en thermomixer vid 1200 rpm, vid en konstant temperatur på 37 °C för 2 h.
OBS: Justera inkubationstiden så att den matchar inkubationstiden för syntetiska celler.
- Syntetiska celler
- Negativ kontrollgrupp: Förbered protokollet som presenteras i 4.1 med inre lösning utan DNA.
- Positiv kontroll: Förbered protokollet som presenteras i 4.1 med inre lösning som innehåller en T7 plasmid kodning för en reporter gen.
OBS: Lägg till en positiv kontrollgrupp bestående av en reportergen, såsom sfGFP, tillsammans med testgrupperna för att säkerställa inkapslingseffektivitetssteget.
- Inre lösning och lyssning aktivitetsbekräftelse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar ett protokoll för beredning av syntetiska celler genom att kapsla in en S30-T7 CFPS system baserat på BL21 E. coli inuti lipid blåsor. En schematisk beskrivning av förberedelseprocessen som innehåller en bild av varje steg presenteras i figur 2. Framgången för den syntetiska cellberedningsprocessen är beroende av lämplig prestanda för varje steg och utförs av olika parametrar. Protokollet bör justeras för att rymma produktionen av ett visst protein.
Plasmider som uttrycker modellproteinets supermapp Grönt fluorescerande protein (sfGFP) och Renilla Luciferas under T7-promotorn introducerades i CFPS bulkreaktioner och syntetiska celler, och proteinproduktionen utvärderades med hjälp av olika metoder, inklusive västra blot, flödescytometri, mikroskopi och spektroskopi (figur 3). En kontroll av sfGFP-Hans6 taggade protein (~ 27 kDa32) produktion genom västra blot analys presenteras i figur 3A. Ett prov på 30 μL syntetiska celler utspädda 6 veck blandades med 10 μL av en gemensam SDS-PAGE-provbuffert (innehållande tvätt- och rengöringsmedelsnatriumdulfat (SDS) och β-mercaptoetanol) och kokades i 10 min (95 oC). Vi fann att kombinationen av värme och rengöringsmedel i provbufferten är tillräcklig för att demontera blåsorna och för att möjliggöra drift av proteiner i SDS-PAGE gel. Protein detektion utfördes med anti-Hans polyklonala primära antikroppar (utspädd 1:12,000). Som väntat, medan proteinproduktion detekteras i prover som innehåller sfGFP-kodning DNA-mallar ("+sfGFP DNA"), observeras inget protein i negativa kontrollprover där DNA-mallen uteslöts ("-DNA"). Prover av renat sfGFP och renat sfGFP inkapslade i syntetiska cellers membran (sfGFP (inkapslad)), används som positiva kontroller för sfGFP CFPS bulkproduktion och för dess syntes inom syntetiska celler, respectivley. Denna metod kan tillämpas på olika proteintyper. Enligt Krinsky et al.19är sfGFP:s produktionsavkastning som erhålls enligt det detaljerade protokollet 380 μg/ml i CFPS-lösningen och 5,3 μg/ml, när CFPS-lösningen kapslas in inuti lipidblåslarna.
När det protein som produceras inuti de syntetiska cellerna är fluorescerande, kan dess produktion utvärderas med hjälp av mikroskopi och flödescytometribaserade metoder. Vi analyserade de syntetiska cellerna med hjälp av ett fluorescerande mikroskop med ett filter för GFP fluorescens (figur 3B). Eftersom CFPS-komponenterna har vissa autofluorescent, bör parametrarna för bildinsamling anpassas enligt ett lämpligt negativt kontrollprov (syntetiska celler utan DNA-mall, till exempel).
Dessutom använde vi flödescytometri för att bestämma den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos sfGFP-producerande syntetiska celler, och andelen aktiva syntetiska celler, som kan producera proteiner inom dem (figur 3C I&II). 10 000 händelser samlades in för varje analyserat prov. Den syntetiska cellproduktionen, som beskrivs i detta protokoll, ger vanligtvis en aktiv population på 21-25% inom en lösning med en ungefärlig koncentration av 107 syntetiska celler/ml. Den lilla fluorescensintensitet som presenteras av "-DNA"-prover i figur 3C II beror på autofluorescensen av olika komponenter i CFPS-reaktionen, såsom S30 lysate.
Representativ storleksanalys baserad på GFP-signalen (i diameter) av syntetiska celler som utarbetats med den metod som beskrivs ovan visar ett medelvärde på 2,4±0,5 μm (figur 3D II). Eftersom bildandet av vatten i oljeemulsion i denna metod är ett resultat av tillämpning av mekaniska krafter, kan partikelernas storleksfördelning påverkas av olika faktorer, såsom metoden och hastigheten för pipettering av emulsionen upp-och-ner, modellen av virvelblandaren, etc.
För att testa mångsidigheten hos syntetiska cellers proteinproduktion analyserades uttrycket av reporterproteinet Renilla luciferas inuti syntetiska celler (figur 3E). Analysen kvantifierade Renilla luciferas aktivitet genom att mäta luminescensen genereras från den enzymatiska reaktionen av luciferas och dess substrat, h-coelenterazine. För att framkalla den enzymatiska reaktionen tillsattes en slutlig koncentration på 1 μM h-coelenterazine till de syntetiska cellerna (25 μL provvolym) strax före mätningen. "-DNA"-provet, som inte innehåller luciferaskodnings-DNA-mallen, användes som en negativ kontroll för testning av luminescens på grund av icke-enzymatisk oxidation av substratet. Luminescens mättes med hjälp av en plattläsare.
Figur 1: En illustration av processen för typiska protokoll för beredning av syntetiska celler. Processen är uppdelad i två steg. Steg 1: Preparat före experiment inklusive DNA-plasmidrening, beredning av S30-T7 lysate, beredning av stamlösningar som krävs för de inre och utfodringslösningar, beredning av lipider-i-olja-lösning och framställning av yttre lösning. Steg 2: Syntetisk cellbildning som inkluderar utfodring och inre lösningar förberedelse, syntetiska celler beredning och analys. Ett exempel på den volym som krävs för varje ingrediens för att förbereda 100 μl syntetiska celler lösning presenteras i blått inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk illustration av beredningsprotokollet för syntetiska celler. En bild av en väl utförd process illustrerar varje steg i protokollet. Denna siffra har ändrats från Krinsky et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa resultat av produktionen av sfGFP och Renilla luciferas inuti syntetiska celler. (A)En västerländsk blot analys av sfGFP-His6 produktion i både CFPS bulk reaktioner och inuti syntetiska celler. Protein detektion utfördes med anti-Hans polyklonala primära antikroppar (utspädd 1:12,000). Renad sfGFP-His6 användes som en positiv kontroll (7,8 μg). sfGFP (inkapslad) är positiv kontroll av renad sfGFP inkapslad i syntetiska celler. Prover utan DNA-mallar användes som en negativ kontroll för produktionsanalysen ("-DNA"). (B)Representativa bilder av sfGFP som producerar syntetiska celler tagna med hjälp av ett fluorescerande mikroskop med ett ljusfält och ett GFP-filter. Skalstaplar = 50 μm.(C)I&II Flödescytometrianalys av sfGFP som producerar syntetisk cellaktivitet (Data som samlats in med hjälp av digital, 4-laseranalysator). Prover mättes efter 3 h inkubation. 10 000 händelser samlades in för varje analyserat prov. FSC-filter (500 V) och SSC (300 V) användes för att definiera den totala syntetiska cellpopulationen. Sedan användes ett FITC-filter (600 V) för att upptäcka fluorescens för GFP.. (I) Beräkningen av den aktiva syntetiska cellpopulationen [%] baserades på tröskelvärdet för fluorescensströskel för fluorescens enligt GFP,som definieras av provet "-DNA" (rött histogram), vilket möjliggör ett fel på ~1 %. II) Genomsnittlig fluorescensintensitet hos sfGFP-producerande syntetiska celler. Detta värde beräknades från den aktiva syntetiska cellpopulationen och normaliserades till "-DNA"-provet genom att dividera de aktiva syntetiska cellernas genomsnittliga fluorescens med medelvärdet av de syntetiska cellerna utan sfGFP-DNA. (D)I&II Analys av syntetisk cellstorlek. Utsläppsspektrumet upptäcktes av 505-560 nm respektive 642-745 nm för GFP respektive ljusa fältsignaler. (I) En representativ bild av de analyserade syntetiska cellerna. (II) Syntetiska cellers storleksfördelning. Analys utfördes och diameterfördelningerna för de aktiva syntetiska cellerna beräknades baserat på GFP-signalen. ( E) Produktion av aktiv Renilla luciferas inuti syntetiska celler. Luciferasaktiviteten kvantifierades med luminescensmätningar efter tillsats av 1 μM h-coelenterazine med hjälp av en plattläsare och presenterades som ljusintensitet [RLU] x 106. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell 1: Förberedelse av buffert- och lagerlösningar. | |
| Kommentarer | |
| Luria Bertani (LB) agar (1,5%) Plattan: | Förbered och sterilisera. Tillsätt Ampicillin vid en slutlig koncentration på 50 μg/ml först efter kylning till rumstemperatur. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumklorid (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-jästextrakt | |
| 15 g/L Agar agar renad | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| LB-media (20 ml): | Minimalt med media. Förbered och sterilisera i förväg. Strax innan bakterierna inokuleras, tillsätt Ampicillin vid en slutlig koncentration på 50 μg/ml. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumklorid (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-jästextrakt | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| Terrific Buljong (TB) media (1 L): | Rika medier. Förbered och sterilisera i förväg. Strax innan bakterierna inokuleras, tillsätt Ampicillin vid en slutlig koncentration på 50 μg/ml. |
| 12 g/L Bacto-tryptone | |
| 24 g/L Bacto-Jästextrakt | |
| 4% (v/v) Glycerol vattenfri | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| S30 lysate buffert (1,5 L): | Förbered och sterilisera i förväg (*exklusive DTT och 2-mercaptoetanol). Förvaras vid -4 °C. |
| 10 mM Tris-acetat vid pH = 7,4 | Trisma-basen. Förbered och justera pH till 7.4 med ättiksyra. |
| 14 mM magnesiumacetat | |
| 60 mM kaliumacetat | |
| *1 mM DTT | Lägg till strax före användning |
| *0,5 ml/L 2-mercaptoetanol | Lägg till strax före användning |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | Lös HEPES till en slutlig koncentration på 1 M. Justera till pH 8 med KOH-lösning. |
| HEPES (AVSPES) | |
| Kaliumhydroxid (KOH) | |
| Tabell 2: Inre lösningssammansättning. | ||||||||||
| Slutlig begärd Inre lösningsvolym | ||||||||||
| Nummer | Reagens | Lager conc. | Slutlig conc. | 25 μl | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 300 μl | 400 μ L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Förinvänd lösning |
| 2 | Magnesiumacetat | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Kaliumacetat | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Ammoniumacetat | 5,2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminosyror - blandning I | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminosyror - blandning II | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG (på andra) | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Sackaros | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA plasmid | 10 μg/ml | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabell 3: Sammansättning av matningslösning. | |||||||||
| Slutlig begärd matningslösningsvolym | |||||||||
| Nummer | Reagens | lager conc. | slutlig conc. | 25 μl | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 300 μl | 400 μl |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 83,3 mMM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Magnesiumacetat | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Kaliumacetat | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Ammoniumacetat | 5,2 M | 236,4 mMM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminosyror - blandning I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminosyror - blandning II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG (på andra) | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glukos | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabell 4: Nödvändiga lösningar för beredning av syntetiska celler. | |
| Lösning och material som krävs | Kommentarer |
| Lipider i olja | Förvaras i rumstemperatur tills den används. Förberedd enligt avsnitt 2 |
| Yttre lösning | Förberedd enligt avsnitt 3.1 |
| Inre lösning | Bereds enligt avsnitt 3.2. |
| Förbered provningar + kontrollerar proverna enligt avsnitt 4.1. | |
| Förvaras på krossad is tills den används. | |
| Matningslösning | Bereds enligt avsnitt 3.3. |
| Förvaras på krossad is tills den används. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll inför en enkel och prisvärd metod för produktion av stora mängder proteinproducerande syntetiska celler. Avkastningen av aktiva celler är beroende av noggrann och korrekt utförande av protokollet med betoning på flera kritiska steg. I lysate förberedelse delen av denna metod, är det viktigt att nå lämplig bakteriedensitet innan celllys för att uppnå en tillräcklig mängd proteiner i den bakteriella lysate. För det andra bör lysprocessen utföras vid 4 °C och lysate fryst snabbt med flytande kväve för att upprätthålla proteinaktivitet. Dessutom, i detta protokoll använde vi E. coli BL21(DE3) celler omvandlas med pAR1219 plasmid uttrycker T7 RNA polymeras. I de fall där en annan bakteriestam används kan det krävas förändringar av lysatekoncentrationen för att nå en tillfredsställande mängd RNA-polymeraser och ribosomer. Även när samma bakteriestam används, olika lysate produktioner kan ha vissa batch-till-batch variabilitet.
Vesikelproduktionsdelen innehåller också ett par viktiga steg. Solubilization av lipider och avlägsnande av kloroform från mineralolja är viktigt för att upprätta vatten-i-olja emulsion. Centrifugering av vatten-i-olja droppar i den yttre vattenbufferten är också ett viktigt steg i protokollet för att generera syntetiska celler med en lipid bilayer. Förändringar i den inre lösningen av blåsorna och lipidkompositionen kan leda till ett lager droppar vid oljevatteninterfasen utan någon observerbar pellet. För att övervinna detta är en snabb lösning att öka centrifugeringshastigheten till 1000 x g i emulsionsöverföringssteget. Om detta inte löser problemet kan den yttre vattenlösningens specifika allvar ändras så att den inre lösningen får en högre specifik gravitation än den yttre lösningen. Dessutom kan den inre lösningens osmolalitet också variera mellan olika lysakällor och produktioner, mellan 800-1100 mOsm/kg. Variationen i den inre lösningens osmolalitet beror främst på att lyset har ändrat koncentrationer under produktionsprocessen. Vanligtvis leder detta inte till betydande förändringar i proteinproduktionen, men en stor utspädning kan leda till en minskad avkastning på grund av låga koncentrationer av transkriptionen och översättningsenzymerna i själva lysate. Mätning av den totala proteinkoncentrationen i varje lysateparti kan bidra till att justera lysshalterna i den inre lösningen för att bibehålla konstanta värden (cirka 22 mg/ml mätt med Bradford-analys).
Denna metod har dock vissa begränsningar som bör nämnas. Inte alla de genererade syntetiska cellerna är aktiva och kan producera proteiner på grund av ofullständig inkapsling av alla nödvändiga komponenter. Vi mätte cirka 21-25% av aktiva celler när vi producerade sfGFP uttrycka syntetiska celler med hjälp av flöde cytometri (inga betydande storlek skillnader observerades mellan aktiva och inaktiva celler). Olja och lipid överskott rester ibland kvar i bilayer lipidmembranet efter överföringen av de syntetiska cellerna i vattenfasen. Optimera lipid- och kolesterolkoncentrationerna i oljefasen kan förbättra denna fråga. Det är också viktigt att notera att storleksfördelningen av de erhållna syntetiska cellerna är ganska bred i jämförelse med alternativa mikrofluidiska metoder, med blåsor som sträcker sig från cirka 1-50 μm.
Den höga avkastningen av emulsion överföringsmetoden gör det särskilt lämpligt för syntetiska celler kapsla in cellfria proteinsyntessystem för terapeutisk proteinproduktion. Olika variationer av emulsionsöverföringsmetoden har använts i studier av syntetiska celler och inkluderade förändringar i oljeberedningsproceduren, membransammansättningen, provvolymen, det inre förhållandet mellan lösning och olja och centrifugeringshastigheter5,,24,28. Mikrofluidiska och polymerbaserade droppstabiliseringsmetoder har också använts för beredning av syntetiska celler, men inkapsling av hela CFPS-systemet har ännu inte utförts med dessa metoder21,,22,23.
De syntetiska celler som erhållits genom denna metod visades in vivo att producera proteiner och behandla cancer i murine modeller19. Kapaciteten hos dessa celler kan utökas ytterligare i framtiden bortom proteinuttryck. Integrering av andra cellulära processer såsom cellulär kommunikation, cytoskelettemodifiering och celldelning i syntetiska celler har nyligen beskrivits33,,34,35,36. Substitution av bakteriella lysate med eukaryota cell lysate kommer att möjliggöra uttryck av proteiner med högre komplexitet och post-translationella modifieringar, och kommer kanske att vara mindre immunogen även utan ett rengöringsförfarande, därför öppna mer terapeutiska gränser37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ERC-STG-2015-680242.
Författarna erkänner också stöd av Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; lastbil I. Lokey tvärvetenskapligt centrum för biovetenskap och teknik; Israel ekonomiministeriet för ett Kamin-bidrag (52752); Israels ministerium för vetenskapsteknik och rymdvetenskap – chefsforskarens kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israeliska stiftelsen för vetenskaplig forskning och utveckling för ett GIF-barnbidrag (I-2328-1139.10/2012); Europeiska unionens IRG-program för karriärintegration (908049). Phospholipid Research Center Grant; en Rosenblatt Foundation for cancer research, en Mallat Family Foundation Grant; och Unger Family Foundation. A. Schroeder erkänner Alon och Taub Fellowships. O. Adir erkänner Sherman och Gutwirth stipendier. G. Chen erkänner Sherman Fellowship. N. Krinsky erkänner Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program från Rothschild Caesarea Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W.
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C.
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H.
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
