Summary
我们描述并详细介绍了跨层自治系统的使用。该系统利用人后段独立调节节段（眼内）内和视神经周围（颅内）的压力，以产生模仿青光眼性视神经病变特征的跨层压力梯度。
Abstract
目前对一种新的临床前人类模型的需求尚未得到满足，该模型可以使用颅内压（ICP）和眼内压（IOP）靶向离体疾病病因，该模型可以识别与青光眼发病机制相关的各种致病范式。离体人前段灌注器官培养模型先前已被成功利用并作为青光眼发病机制发现和治疗测试的有效技术。在离体人体器官系统上进行的临床前药物筛选和研究可以更好地转化为临床研究。本文详细介绍了一种称为跨层自主系统（TAS）的新型离体人跨层压力模型的生成和操作。TAS模型可以使用人类供体后段独立调节ICP和IOP。该模型允许以临床前方式研究发病机制。它可以减少活体动物在眼科研究中的使用。与体外实验模型相比，视神经头（ONH）组织结构，复杂性和完整性也可以在离体TAS模型中保持。
Introduction
最近调查的全球估计表明，有2.85亿人患有视力障碍，其中包括3900万盲人1。2010 年，世界卫生组织记录发现，列出的九个主要失明原因中有三个发生在眼睛后段1。眼后段疾病累及视网膜、脉络膜和视神经2。视网膜和视神经是大脑的中枢神经系统（CNS）延伸。视网膜神经节细胞（RGC）轴突容易受到损伤，因为它们通过视神经头（ONH）离开眼睛形成视神经3。ONH仍然是RGC轴突最脆弱的点，因为结缔组织束的3D网格作用称为层状（LC）4。ONH是青光眼中RGC轴突损伤的初始部位5，6，7，并且ONH内的基因表达变化已经在眼部高血压和青光眼模型中进行了研究8，9，10。由于眼内隔室（称为眼内压 （IOP））和外眼周蛛网膜腔内（称为颅内压 （ICP））之间的压差，RGC 轴突在 ONH 处易感11。LC区域将两个区域分开，保持正常的压差，IOP范围为10-21 mmHg，ICP范围为5-15 mmHg12。通过两个腔室之间层隙的压力差称为跨层压力梯度（TLPG）13。青光眼的一个主要危险因素是IOP14升高。
增加的IOP会增加层流区域内和层流区域的应变6，15，16。在人类和动物模型中的实验观察表明，ONH是轴突损伤的初始部位17，18。在ONH引起青光眼损伤的IOP相关应力和应变的生物力学范式也影响青光眼的病理生理学19，20，21。尽管在人类中，压力引起的变化会机械地损害RGC轴突22，但叶片内缺乏胶原板的啮齿动物也可能发展为青光眼7，23。此外，IOP 升高仍然是原发性开角型青光眼患者最突出的危险因素，而正常张力型青光眼患者即使没有 IOP 升高也会发生青光眼性视神经病变。此外，还有一部分眼部高血压患者没有视神经损伤。也有人提出，脑脊液压力（CSFp）可能在青光眼发病机制中发挥作用。有证据表明，与正常个体相比，青光眼患者的ICP降低至~5 mmHg，从而导致经层压升高，并在疾病中起关键作用24，25。以前，在犬类模型中已经证明，通过控制IOP和CSFp的变化，视盘可以有很大的位移26。猪眼中CSFp的升高也显示出LC区域和层后神经组织内的主要应变增加。RGC和LC区域的应变增加导致轴突运输阻塞和RGCs的损失27。RGC 的进行性变性与营养支持的丧失28，29、炎症过程/免疫调节刺激30、31 和凋亡效应物有关29、32、33、34、35。此外，轴突损伤（图3）对RGC造成不利影响，引发再生失败36，37，38，39。尽管IOP的影响已经得到了很好的研究，但对异常的跨层压力变化进行了很少的研究。青光眼的大多数治疗方法都集中在稳定眼压上。然而，即使降低眼压可以减缓疾病的进展，它也不能逆转视野丧失并防止RGC的完全丧失。了解青光眼中与压力相关的神经退行性变化对于预防RGC死亡至关重要。
目前的证据表明，由于患有创伤性或神经退行性视力障碍的患者的各种机械，生物学或生理变化引起的跨层压力调节可导致显着的视力丧失。目前，没有真正的临床前人类后段模型可以研究离体人ONH内的青光眼生物力学损伤。观察和治疗眼睛的后段是眼科的巨大挑战27。靶向后眼存在物理和生物屏障，包括高消除率、血视网膜屏障和潜在的免疫反应40。新药靶标的大多数疗效和安全性测试都是利用体外细胞和体内动物模型41完成的。眼部解剖结构很复杂，体外研究不能准确地模拟组织模型系统呈现的解剖学和生理障碍。尽管动物模型是药代动力学研究的必要条件，但人类后眼的眼部生理学可能因各种动物物种而异，包括视网膜的细胞解剖结构，脉管系统和ONH41，42。
使用活体动物需要密集而详细的道德法规、高度的财务承诺和有效的可重复性43。最近，在实验研究中对动物的道德使用提出了其他多项指南44，45，46。动物试验的替代方案是使用离体人眼模型来研究疾病发病机制和保护ONH损伤的药物的潜在分析。人类死后组织是研究人类疾病范式的宝贵资源，特别是在人类神经退行性疾病的情况下，因为在动物模型中开发的潜在药物的鉴定需要可转化为人类47。离体人供体组织已被广泛用于人类疾病的研究47、48、49，人类前段灌注器官培养系统此前为研究IOP升高的病理生理学提供了独特的离体模型50、51、52。
为了研究人眼中与IOP和ICP相关的跨层压，我们成功设计并开发了一种双腔跨层自主系统（TAS），该系统可以使用来自人类供体眼睛的后段独立调节IOP和ICP。它是第一个研究跨层压力并利用TLPG对ONH的生物力学效应的离体人体模型。
这种离体人TAS模型可用于发现和分类由于IOP或ICP慢性升高而发生的细胞和功能修饰。在本报告中，我们详细介绍了剖析，设置和监测TAS人类后段模型的分步方案。该协议将允许其他研究人员有效地复制这种新颖的离体加压人类后段模型，以研究生物力学疾病的发病机制。
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Protocol
根据《赫尔辛基宣言》的规定，眼睛被用于涉及人体组织的研究。
注意：来自信誉良好的眼库（例如，佛罗里达州坦帕狮子眼科移植研究所）的眼睛在死亡后6-12小时内收获，并检测了供体血清的乙型肝炎，丙型肝炎和人类免疫缺陷病毒1和2。一旦它们被接受，眼睛就会在24小时内被解剖并设置在TAS模型中。排除标准包括任何眼部病变。眼睛不会因年龄、种族或性别而被排除在外。为了确保接收时视网膜的活力，从组织供体中收获视网膜外植体并培养7天和14天（补充图1）。这些视网膜也被解离并在培养物中生长出健康的RGC，7天，RGC标记物染色阳性，多重剪接RNA结合蛋白（RBPMS），以及神经丝中的正神经丝轻链（NEFL）染色（补充图2）。.
1. 设备和用品的准备和灭菌
- 有关所需耗材的完整列表以及供应商和目录编号，请参阅 材料表 。
- 使用前，通过高压灭菌或使用环氧乙烷安瓿对所有设备和器械进行灭菌。
2. 灌注介质的制备
- 将1%青霉素链霉素（10，000U / mL青霉素，10，000μg/ mL链霉素在0.85%NaCl中）和1%L-谷氨酰胺（200mM）加入1，000mL高葡萄糖Dulbecco的改性Eagle培养基（DMEM）。
- 通过0.22μm过滤器对灌注介质进行灭菌。
3. 跨层自治系统 （TAS） 设置
- 设置流入注射器（IOP 和 ICP 储液器）。
- 将30 mL灌注培养基（第2部分）加入30 mL注射器中。将 3 向旋塞阀连接到 30 mL 注射器。将 0.22 μm 亲水过滤器连接到 3 通旋塞阀。将 15 G 鲁尔短截线适配器连接到 0.22 μm 亲水过滤器。
- 从注射器设置中去除气泡。将管路连接到 15 G 鲁尔短截线适配器。用未通风的通用锁盖关闭旋塞阀的侧端口。重复两次设置。
- 将一个注射器标记为通道 1 颅内压 （CH1 ICP），将另一个注射器标记为通道 2 眼内压 （CH2 IOP）。
- 设置流出注射器（IOP 和 ICP 储液器）。
- 将 3 通旋塞阀连接到 30 mL 注射器。将 15 G 鲁尔短截线适配器连接到 3 路旋塞阀。将管路连接到 15 G 鲁尔短截线适配器。
- 用未通风的通用锁盖关闭旋塞阀的侧端口。重复两次设置。将一个注射器标记为 CH1 ICP，将另一个注射器标记为 CH2 IOP。
4. 人类全眼球的制备
注意：如果收到整只眼睛，请按照以下步骤将前段与眼睛的后段分开。如果眼睛被一分为二，请从步骤4.4开始。
- 将整个眼睛放入聚维酮碘溶液中2分钟。
- 在无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）中冲洗眼睛以冲洗掉聚维酮碘。重复2次。
- 使用镊子和剪刀从整个眼球中取出附件。将赤道处的眼睛一分为二，以分隔眼睛的前段和后段。
- 切除视神经鞘。从后段移除玻璃体房。
- 如果需要，从后节修剪额外的巩膜，以确保与IOP（底部）腔室的圆形圆顶良好贴合。使用镊子，确保视网膜均匀地分布在节段的后部。
- IOP（底部）腔室设置
- 将人后段置于圆形圆顶上方TAS的IOP（底部）腔室中，视神经朝向顶部。
- 使用带有四个螺钉的环氧树脂O形圈密封后段，确保紧密密封。
- 将管道插入 IOP（底部）腔室的输入和输出端口。将带有含有介质的管子的 IOP 流入注射器插入 IN 端口，将带管子的空 IOP 流出注射器插入 OUT 端口。
- 使用推/拉方法将灌注培养基缓慢注入流入口以填充后眼罩，同时通过流出注射器缓慢地将灌注介质拉出，以去除管路中的任何气泡。一旦IN和OUT管都没有气泡，就停止输注培养基。
- 将旋塞阀锁定在关闭位置。从 IOP IN 端口过滤器组件中取出 30 mL 注射器，然后用总共 30 mL 培养基重新填充。将 30 mL 注射器更换到过滤器组件上。
-
ICP（顶部）腔室设置
- 将ICP（顶部）腔室/盖子放在后段的背面。确保视神经在顶部腔内。用四个螺钉密封顶部腔室。
- 将卡套管插入 ICP（顶部）腔室的输入和输出端口。将带有含有介质的管路的ICP流入注射器插入IN端口，并将带有管子的空ICP流出注射器插入OUT端口。
- 轻柔而缓慢地将介质注入IN端口以填充ICP室，并使用推/拉方法从管路中除去气泡。一旦ICP室以及IN和OUT管都没有气泡，就停止注入介质。
- 将旋塞阀锁定在关闭位置。从端口过滤器组件中的ICP中取出30 mL注射器，并用总共30 mL培养基重新填充。将 30 mL 注射器更换到过滤器组件上。
5. 数据记录系统设置
注：数据记录系统由8通道电源、多通道桥式放大器、静液压传感器和带数据采集软件的计算机组成（见 材料表）。下面介绍如何设置和校准系统。
- 将电源线连接到 8 通道电源的背面，然后插入备用电池设备。
- 将 USB 电缆从 8 通道电源连接到计算机背面。
- 使用随附的 I2C 电源线将 8 通道电源连接到多通道桥式放大器。
- 将卡口 Neill-Concelman （BNC） 电缆连接到 8 通道电源前面的通道输入，并将电缆末端连接到多通道放大器背面的相应通道。
- 将传感器电缆连接到多通道放大器的前面。
- 在计算机上安装数据采集软件。
- 从随附的软件光盘运行数据采集软件设置安装程序。
- 按照计算机屏幕上的说明进行操作。
- 安装完成后，选择" 完成"。
- 打开 8 通道电源。
- 打开计算机并启动数据采集软件。
- 选择 文件 | 新增功能。
- 选择 设置 | 频道设置。选择三个通道（屏幕左下角）。在 "通道标题" 列中，按如下方式重命名通道：CH1 ICP;CH2 IOP;CH3 TLPG （IOP-ICP）.
- 为所有通道上的 范围 选择 2 mV。在 "计算 "列中，为通道 1 和 2 选择" 无计算 "。
- 在" 计算 "列中，为通道 3 选择" 算术 "。在 "公式 "部分中：选择 通道/CH2;选择 算术"-";选择 通道/CH1。在" 输出 "部分中，选择" mmHg"。选择 "确定"。再次选择 "确定" 。
- 设置和校准静液压传感器。
注：在使用以下方法进行实验之前，必须对静水压力传感器进行校准。- 将静液压压力传感器连接到连接到多通道桥式放大器的传感器管路。
- 将充满空气的 30 mL 注射器连接到 CH1 （ICP） 压力传感器的侧端口。将血压计连接到 CH1 （ICP） 压力传感器的底部。
- 在图表上，查看数据采集软件的页面，通过左键单击采样时间旁边的箭头设置采样速度，然后选择 100。然后右键单击页面的 CH1 （ICP） 区域。
- 选择桥式放大器。选择电源过滤器。选择"零"并等待系统归零，注意不要移动压力传感器。
- 捏住压力传感器的白色标签，推动空气通过传感器，直到血压计上获得40 mmHg。松开白色标签，取下注射器和血压计。
- 在 "单位转换 "页上，选择"减号 （-）"。突出显示最高高原，表示 40 mmHg。单击第 1 点的 箭头 ，然后输入 40。
- 突出显示最低平台以指示 0 mmHg。单击第 2 点的 箭头 ，然后输入 0。为设备选择 mmHg。选择 "确定"。
- 选择 "确定" （"桥接放大器"页）。对 CH2 （IOP） 重复步骤 9.1–9.7，对最高平台使用 100 mmHg，对最低平台使用 0。
- 将 TAS/后段单元连接到数据采集系统。
- 将TAS/后段单元放入培养箱（37°C，5%CO 2）中。将 ICP 管从 OUT 端口连接到 CH1 （ICP） 压力传感器。
- 将 IOP 管从 OUT 端口连接到 CH2 （IOP） 压力传感器。
- 将注射器设置（ICP 和 IOP）与介质从 IN 端口连接到环形支架。
- 在 "图表视图 "页上，选择" 开始采样"。通过左键单击采样时间旁边的箭头来设置采样速度，然后选择 慢 速和 1 分钟。
- 向上或向下调整环上的注射器，以根据协议要求调节ICP和IOP压力。
- 通过推拉法每48-72小时对系统中的培养基进行全身补充。
6. 数据检索和分析
- 在数据采集软件中打开数据文件。
- 在 "数据板 "部分中，单击" 多次添加到数据板" 图标。将出现一个新窗口。
- 在 "查找使用 "部分中，从下拉菜单中选择" 时间 "。
- 在"选择"部分中，从下拉菜单中选择每 1 小时 1 小时。
- 在 "单步执行 "部分中，选择" 整个文件"， 然后单击" 添加"。
- 在 "数据板 "部分中，单击" 数据板视图" 图标。突出显示所有数据并复制/粘贴到电子表格中。
- 每 24 小时计算 IOP、ICP 和 TLPG 的均值和标准差。使用电子表格程序和图形中的数据透视表选项整理数据。
7. 免疫组化和后段的苏木精和曙红染色
- 从TAS模型中取出各个时间点后的后眼节，并在石蜡化之前固定在福尔马林中。
- 切除眼睛以产生矢状组织平面。
- 用100%二甲苯，95%乙醇，50%乙醇溶液脱蜡石蜡包埋的片段。
- 用PBS洗涤载玻片10分钟，并在室温下用封闭缓冲液阻断1小时。
- 具有一抗的标记切片：抗胶原IV（细胞外基质（ECM）标记，NB120-6586，1：100）和抗层粘连蛋白（ECM标记，NB300-144，1：100，抗RBPMS（RGC标记），GTX118619，1：50）。
- 使用Alexa Fluor二抗检测一抗（Alexa Fluor 488山羊抗兔，A11008，1：500）。
- 使用DAPI抗褪色溶液复染细胞核。
- 使用荧光显微镜使用4倍和10倍物镜捕获染色切片的图像和相位图像（见 材料表）。
- 对于苏木精和曙红（H&E）染色，在自动染色系统（见 材料表）中处理切片，使用100%，二甲苯95%乙醇，50%乙醇溶液和H&E染色进行脱蜡。
- 使用带有明场光源的显微镜使用4倍和10倍物镜拍摄图像。
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Representative Results
跨层自主系统的设计和创建
经层压差是包括青光眼在内的各种疾病发病机制的潜在关键机制。所描述的模型的用途包括但不限于青光眼（眼压升高，可能降低 ICP）、创伤性脑损伤（ICP 升高）和长期暴露于微重力相关视力障碍（ICP 升高、IOP 升高）的研究。为了帮助发现靶向人眼中跨层压的分子发病机制，我们设计、创建并验证了 TAS 模型。我们的新型离体人体模型为独立研究ICP和IOP相关的致病变化提供了独特的临床前系统。为了解决人类临床前应用，我们的模型提供了一种研究由于转层压力变化引起的发病机制的离体范例。密封的模型设计用实心正面和透明视图（图1A， 1B）描绘，并带有模型的详细图表视图，以描述所有流入和流出端口（图1C）。显示了实际3D打印模型中带有人类后段的彩色透明视图（图1D， 1E）。
跨层自主系统：一种新型离体人跨层压力模型
我们生成了具有两个自主室（即IOP和ICP室）的TAS模型。在模型的底部，人类后杯被放置在圆形圆顶的顶部，视神经朝向顶部。一旦将后杯放置并密封在IOP室中，我们将ICP室放在神经顶部。我们保持了两个腔室的独立性，并使用精确适合每个腔室的O形圈实现完美密封（图2A）。底部腔室或IOP腔室填充并调节杯子中的压力，而顶部腔室适合视神经周围，并通过静水压力储液器调节神经周围的ICP。使用该模型，我们使用静水压力独立调节IOP和ICP。两个腔室之间的差异被确定为跨层压力梯度的变化（图2B）。 图2C显示了所有最终配件就位的模型，包括连接的流入和流出储液器注射器。
跨层自主系统中的成功培养和压力维持
为了确保两个腔室在系统中独立工作，我们通过将IOP室和ICP保持在不同的平均压差（正常TLPG：IOP：ICP，15：5 mmHg;TLPG升高>10 mmHg;TLPG升高>20 mmHg）来调节几个压差。我们最初通过IOP和ICP条件的各种不同参数测试了两个腔室中平均正常压差（正常IOP / ICP）的维持：1）正常IOP：ICP降低（图3A）;2）IOP升高：ICP降低（图3B）;和3）IOP升高：ICP升高（图3C）。平均正常眼压范围为 10–21 mmHg（考虑巩膜上静脉压），正常 ICP 范围为 5–15 mmHg。为了代替没有血管压力的限制，我们仍然将压力保持在这些速率，因为这个想法是在ONH施加最大压力。我们独立调节了两个腔室中的各种压力水平（ICP，5-10 mmHg;眼压，20–40 毫米汞柱）。为了确保两个腔室之间的压力维持，我们将IOP保持在正常条件（15 mmHg）和降低的ICP（4 mmHg）下，以维持LCF（IOP-ICP）在11 mmHg之间的LCP（图3A）。然后，我们升高了IOP（43 mmHg）和降低了ICP（3 mmHg）（图3B），最后升高了两者的压力（IOP，64 mmHg;ICP，9 mmHg）在55 mmHg时产生最大水平的TLPG（图3C）。为了确保组织的活力（图4），通过将空注射器连接到流出旋塞阀上并使用推/拉方法缓慢推动约5mL灌注培养基通过流入口，每48小时更换一次组织中的培养基。在培养基交换时压力增加最小（图4G），并且不影响ONH的形态，如14天和30天免疫组织化学数据所示（图4A-F）。为了确认我们可以在TAS模型中培养具有有效生存能力的延长时间范围的后段，我们分析了在维持正常IOP和ICP14天和30天后ONH的横截面。我们能够在模型中成功地培养这些片段14天（图4A，4B），在视神经头处具有健康的ONH细胞和胶原IV（COLIV）的细胞外基质表达（图4C）。在COLIV和DAPI表达的情况下，也观察到30天的后段的相似生存和维持（图4D，4E）。TLPG（IOP-ICP）值的图形表示（图4G）描绘了随着时间的推移，IOP值在15.6±4.6 mmHg和ICP平均值在11.0±4.6 mmHg持续保持30天，TLPG为4.6±1.3 mmHg（表1）。
ONH后经层压力梯度升高的形态变化
年龄相关性神经退行性疾病青光眼的一个常见临床特征是ONH拔罐。层前拔罐的特点是先行性脱落，这增加了杯子的深度和宽度，从而增加了杯子与圆盘的比例。层流拔罐是基于结缔组织的，LC逐渐向后移动并挖掘。青光眼拔罐是这两种成分的组合，反映了层状结缔组织的损伤和重塑。眼压升高导致LC增厚，因为胶原纤维质量增加53。利用 TAS 模型，我们通过在各个时间点增加 IOP 或降低 ICP 来创建提升的 TLPG。我们维持了一系列TLPG升高7天，随着时间的推移，平均眼压值为22.8±18.6 mmHg，ICP平均值为6.9±7.6 mmHg，TLPG为15.9±11.8 mmHg（表2）。记录的最高TLPG为36 mmHg。然后，在TLPG升高下，随着对照（1天，3天和7天）之间的时间进展，在H&E染色切片中，对人后段进行层状束的渐进增厚和ONH拔罐（图5A-D）。在TLPG升高7天时观察到拔罐和增厚（图5D）。此外，COLIV表达随对照之间的时间，1天，3天和7天显示光束增厚，表达增加7天（图5E-H）。比较TAS模型中未培养的对照组织（图5I）和TAS模型中升高TLPG的7天（图5J）的相位图像显示GCL内健康的RGC（图5I）没有拔罐（图5I）用于对照，而在TLPG升高的条件下，图像显示RNFL中没有剩余RGC（RBPMS-RGC标记）的广泛拔罐（图5J）和ECM的重塑增加，如COLV在CLV内升高所示ONH（图5J）。
图 1：跨层自治系统。 模型描述。（A）坚实的前视图。（B）透明视图。（C） 图示视图。（D）彩色透明视图。（E）实际的3D打印模型。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：跨层自主系统的力学。 （A）TAS模型，带有ICP和IOP室，用于调节跨层压差。（B）描述TAS模型，通过水库高程自主调节两个腔室中的静水压力。（C）所有配件就位的TAS模型的图像以及流入和流出储液器注射器的表示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：跨层自主系统内的独立压力维护。 在顶部 （ICP） 和底部 （IOP） 腔室中独立调节的压力和保持稳定压力的图形表示，其中 （A） 正常 IOP/降低 ICP （B） IOP 升高/ICP 降低，以及 （C） IOP 升高/ICP 升高。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：跨层自主系统中后段的维护和生存能力。 使用TAS模型在正常IOP和ICP条件下培养人类后段14天和30天。在（A）低放大倍率（40倍）和（B）高放大倍率（100倍）下14天时，人类ONH的H&E染色横截面。（C）COLIV免疫染色与DAPI表达（100x）。在（D）40x和（E）100x显微照片和（F）COLIV免疫染色与DAPI表达（100x）中30天的H&E染色的类似描述。 G） 在培养中维持30天的人类后段的IOP-ICP（TLPG）mmHg中Δ的图形表示。科利夫 = 绿色;DAPI = 蓝色;（A，插图 B）;（D，插图 E）;H&E = 苏木精和曙红染色。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：经层自治系统中经层压梯度升高后视神经头的形态结构重组。 使用TAS模型在TLPG升高条件下培养人类后段的不同时间点。人类ONH的横截面描绘了（A）对照（B）在TAS中1天（C）在TAS中1天，在TAS中3天，以及（D）7天培养的H&E染色。COLIV与DAPI在ONH中的表达（E）对照（F）在TAS中1天（G）在TAS中3天，在培养物中（H）7天。相差ONH横截面图像（I）对照ONH描述（I'）RBPMS的视网膜染色和（I''）ONH染色与COLIV和DAPI染色。TAS 中 （J） 7 天 TLPG 升高的相差，其插图显示 （J'） RBPMS 的视网膜染色和 （J''） ONH 染色与 COLIV 和 DAPI。COLIV， RBPMS = 绿色;DAPI = 蓝色;（A–D） 40倍放大倍率;（E–H） 100倍放大倍率;（I 和 J）200倍放大倍率;（J'） 400倍放大倍率;（J''） 100倍放大倍率;（J，插图 J' 和 J''）;H&E = 苏木精和曙红染色;TAS = 跨层自治系统。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 日 | 平均眼压为 24 小时 | 平均 ICP 为 24 小时 | 平均 TLPG （IOP-ICP） |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| 平均 | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| 性病 | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
表1：维持正常TLPG维持30天。表格值表示每 24 小时一次的 IOP、ICP 和 TLPG 值，以及整个时间过程中的平均值和标准偏差。
| 日 | 平均眼压为 24 小时 | 平均 ICP 为 24 小时 | 平均液质酸 24 小时 |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| 平均 | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| 性病 | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
表 2：维持一系列升高的 TLPG 维持 7 天。 表格值表示每 24 小时一次的 IOP、ICP 和 TLPG 值，以及整个时间过程中的平均值和标准偏差。
补充图1：离体人视网膜外植体培养物。相差，RGC阳性染色（RBPMS-绿色）和细胞（DAPI-蓝色）染色的视网膜外植体图像在培养物中（A-C）7天和（D-F）14天（200倍放大倍率）。请点击此处下载此图。
补充图2：人类成年RGC培养物。 RGC标记（RBPMS-绿色）和DAPI（蓝色）染色的RGC在培养物（A）200x（B）400x放大7天。（C） 在 400 倍放大镜下染色为 NEFL（绿色）和 DAPI（蓝色）的 RGC。 请点击此处下载此图。
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Discussion
人类死后组织是研究人类神经退行性疾病的特别有价值的资源，因为在动物模型中开发的潜在药物的鉴定需要可转化为人类47。人类眼压升高的影响已经得到充分证实，但对异常 ONH 跨层压力变化的研究很少。尽管存在多种动物模型和人类ONH的有限建模，但没有离体人体模型来研究跨层压力变化41，54，55，56，57。目前对一种新的临床前人类模型的需求尚未得到满足，该模型可以使用IOP和ICP靶向离体疾病病因，并且可以识别与青光眼发病机制相关的各种致病范式。了解ONH与压力相关的病理变化对于预防RGC死亡至关重要。在TAS模型中结合使用IOP，ICP和TLPG是利用人后节段组织以临床前方式研究压力依赖性变性的独特方法。在TAS模型中，我们可以培养人眼罩的后段，通过自主调节IOP和ICP室来研究跨层压力的变化。它为开发一系列新的治疗方法提供了基础，这些疗法侧重于将跨层压力作为变性机制。
设置TAS模型需要在许多方面关注细节：正确解剖人类后部，确保视网膜完好无损并铺在后杯上，将节段正确放置在IOP室的圆顶上，准确地将ICP室放置在ON上，有效密封两个腔室， 并通过调节IOP和ICP储层的高度来独立维持静水压力。需要在不超过死后24-36小时的眼睛中进行解剖，因为如果不补充有效的培养基，视网膜会逐渐恶化。每48-72小时在我们的系统中进行培养基的全身补充。该系统的另一个关键方面是ON的长度。确保至少0.5-1厘米的ON留在尸体眼上至关重要。如果供体眼睛有短的ON，ON受损，球体受损和放气，或ON鞘脱落，则不应使用供体眼睛。此外，当将后段放在圆顶上时，O形圈必须紧密贴合到位，并且顶部ICP室用螺钉正确密封。还需要测试卡套管连接在模型顶部和底部底座两侧的图钉配件，以确保卡套管适合并锁定到位。如果卡套管未正确就位，则会在管内观察到气泡，并影响每个腔室内的压力测量值。
在我们的TAS模型中，死后后段的维护和可行性是该协议的关键问题。人类死后组织之前已被广泛研究48，49，最近对1，068个死后供体组织的RNA分析研究证实，几十年来收集的死后人脑组织可以作为研究人类疾病的高质量材料47。此外，先前已成功对死后的眼部人供体眼组织进行表达谱分析58。该数据集中，死后6小时视网膜组织的细胞凋亡基因的基因表达PLIER值最小或不存在58。此外，已经表明可以有效地进行眼组织的低温储存59。已经表明，当小猪眼睛在缺血和低温条件下储存时，神经节细胞活性维持50小时41，60。因此，我们使用6小时的时间点作为供体眼罩收集的纳入标准。文献中缺乏后节段和视网膜脱离的死后恶化速度，但我们在6小时内的去核，在冰上递送，并且最长36小时的培养设置完全在 补充图1 和 补充图2中所示的组织活力范围内。使用TAS模型，我们成功地实现了30天的健康组织维持。
TAS模型的另一个局限性是我们目前无法模拟在正常生理条件下观察到的ICP和IOP的循环昼夜节律。这可以在未来通过使用可以调节节律性IOP和ICP输注的泵来解决。此外，该模型的另一个警告是尸体眼内缺乏血液循环。因此，无法研究血压的影响，但这也使我们能够具体描述仅TLPG变化的致病作用，包括IOP和ICP。
该模型的未来范围将包括储层系统的自动化，用于静水变化和通过输液泵灌注介质，换能器上有一个出口空注射器，而不是该协议中实施的多轮介质变化。还可以收集和分析来自IOP和ICP储层的流体。可以收集培养基用于生物标志物表达，以靶向未来的治疗。我们还可以确定可以用药物或基因疗法治疗的途径或分子，并在转化为人体临床试验之前在ICP的各种动物模型中测试这些疗法。
总之，我们的模型不仅提供了测试的人类基础，而且还可用于验证可以靶向眼睛中跨层压力变化的疗法。它开辟了一条通过在人类供体眼罩上移植患者干细胞并在TAS模型中对其进行加压来执行精准医疗的途径。这使我们能够在体外测试疗法，这些疗法能够转化为临床并与活着的个体相关。通过我们的模型，我们现在可以评估跨层压发生的变化，以及它如何在与各种创伤和神经退行性疾病相关的发病机制中起关键作用。这将导致更好地了解ONH中与IOP和ICP相关的致病分子机制。
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Disclosures
手稿的作者没有潜在的利益冲突需要披露。
Acknowledgments
该项目的资金来自Colleen M. McDowell博士的可自由支配资金。这项工作部分得到了研究预防失明公司对威斯康星大学麦迪逊分校眼科和视觉科学系的无限制资助的支持。我们感谢Abbot F. Clark博士和Weiming Mao博士对灌注器官培养模型的技术援助。我们感谢狮子会眼科移植与研究所（佛罗里达州坦帕市）为人类供体提供眼睛。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
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