Summary
우리는 트랜스 라미나르 자율 시스템의 사용을 설명하고 자세히 설명합니다. 이 시스템은 인간 후방 세그먼트를 사용하여 세그먼트 내부의 압력(내부)과 시신경(원두개)을 둘러싸서 녹내장 신경병증의 특징을 모방한 횡하수압 그라데이션을 생성합니다.
Abstract
녹내장 병원체 발생과 관련된 다양한 병원성 패러다임을 식별할 수 있는 두개내 압력(ICP) 및 내내압(IOP)을 이용하여 질병 병인학 전 생체을 표적으로 삼을 수 있는 새로운 전임상 인간 모델에 대한 현재 충족되지 않은 필요성이 있다. Ex vivo 인간 전방 세그먼트 관류 기관 배양 모델은 이전에 녹내장 병인발생 및 치료법 의 시험을 위한 효과적인 기술로 성공적으로 활용되고 적용되었습니다. 전 생체 인간 장기 시스템에서 수행 된 전임상 약물 선별 및 연구는 임상 연구에 더 이상 번역 될 수 있습니다. 이 문서에서는 트랜스라미나르 자율 시스템(TAS)이라고 불리는 새로운 생체 내 인간 트랜스라미나 압력 모델의 생성 및 작동을 자세히 설명합니다. TAS 모델은 인간 기증자 후방 세그먼트를 사용하여 ICP 및 IOP를 독립적으로 규제할 수 있습니다. 이 모델은 전임상 방식으로 병인을 연구할 수 있습니다. 그것은 안과 연구에서 살아있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 시험관 내 실험 모델과 는 달리, 시신경 헤드(ONH) 조직 구조, 복잡성 및 무결성또한 전 생체 내 TAS 모델 내에서 유지될 수 있다.
Introduction
최근 설문 조사에서 전 세계적으로 추정에 따르면 시각 장애가 있는 3,900만 명을 포함하여 2억 8,500만 명이 시각 장애를 앓고 있는 것으로 나타났습니다1. 2010년, 세계보건기구(WHO)는 눈1의 후방 부문에서 실명의 주요 원인 9가지 중 3명이 발생한다고 기록했습니다. 후방 세그먼트 눈 질환은 망막, 코로이드 및 시신경2를 포함한다. 망막과 시신경은 뇌의 중추 신경계 (CNS) 확장입니다. 망막 신경절 세포 (RGC) 축축은 시신경 헤드 (ONH)를 통해 눈을 빠져 서 시신경3를 형성하기 때문에 손상에 취약하다. ONH는 라미나 크리브로사(LC)4라고 불리는 결합 조직 빔의 3D 메쉬워크로 인해 RGC 축축에 가장 취약한 지점으로 남아 있다. ONH는 녹내장5,6,7에서 RGC 축록색에 대한 모욕의 초기 사이트이며, ONH 내의 유전자 발현 변화는 안구 고혈압 및 녹내장 모델8,9,10에서 연구되고 있다. RGC 축축은 내피압력(IOP)이라고 불리는 안구 체획 사이의 압력 차압으로 인해 ONH에서 취약하며, 외부 심방식 수막(ICP)11이라고 불린 공간 내에서 취약하다. LC 영역은 정상 압력 차동을 유지하면서 두 영역을 분리하여 IOP가 10-21 mmHg 및 ICP에서 5-15 mmHg12에 이르는 범위로 유지합니다. 두 챔버 사이의 라미나를 통한 압력 차이는 트랜스라미나 압력 그라데이션(TLPG)13이라고 합니다. 녹내장의 주요 위험 요소는 상승 IOP14.
증가된 IOP는 라미나르 지역 내 및 전체의 균주를 증가6,15,16. 인간과 동물 모델의 실험적 관찰은 ONH를 축상 손상의 초기 부위로 제시17,18. ONH에서 녹내장 손상을 일으키는 IOP 관련 스트레스 및 균주의 생체 역학 패러다임은 또한 녹내장19,20,21의 병리생리학에 영향을 미칩니다. 인간 압력 유도 변화가 기계적으로 RGC 축22에 손상을 입히더라도, 라미나 내의 콜라주노우스 플레이트가 부족한 설치류는 녹내장7,23을 개발할 수 있다. 또한, 높은 IOP는 1 차적인 개방각 녹내장 환자에서 가장 눈에 띄는 위험 요소 남아, 정상적인 긴장 녹내장 환자는 높은 IOP 없이도 녹내장 광학 신경 병증을 개발하는 동안. 게다가, 또한 시신경 손상을 보여주지 않는 안구 고혈압 환자의 부분 집합이 있습니다. 또한 뇌척수액 압력 (CSFp)이 녹내장 병인에 역할을 할 수 있다는 것이 제안되었습니다. 증거는 ICP가 일반 개인에 비해 녹내장 환자에서 ~ 5 mmHg로 낮아져 트랜스라미나 압력을 증가시키고 disease24,25에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 이전에는 IOP 및 CSFp 변화를 제어함으로써 광학 디스크26의 큰 변위가 있을 수 있음을 개 모델에서 입증했습니다. 돼지 눈에서 CSFp를 상승시키는 것은 또한 LC 지역 및 레트로라미나 신경 조직 내의 증가된 주체 긴장을 보여주었습니다. RGC와 LC 지역에 대한 부담이 증가하여 축축운송 막힘과 RGCs27 의 손실에 기여합니다. RGC의 점진적 변성은 영양 지원28,29의 손실, 염증 과정/면역 조절의 자극30,31, 및 세포세포 이펙터29,32,33,34,35 와 관련이 있다. 또한 축 상 부상(그림 3)은 RGC에 해로운 영향을 일으켜 재생 실패36,37,38,39를 유발합니다. 비록 IOP의 효과 잘 공부 되었습니다. 녹내장에 대 한 대부분의 치료 IOP 안정화에 초점을 맞추고. 그러나 IOP의 하강은 질병의 진행을 늦추더라도 시각 필드 손실을 되돌리고 RGC의 완전한 손실을 방지하지 못합니다.
현재 의 증거는 외상성 또는 신경 퇴행성 시각 장애로 고통받는 환자의 다양한 기계적, 생물학적 또는 생리적 변화로 인한 트랜스 라미나르 압력 변조가 상당한 시력 손실을 일으킬 수 있음을 나타냅니다. 현재, 전생체 인간 ONH 내에서 녹내장 생체 역학적 손상의 연구를 허용할 수 있는 진정한 전임상 인간 후방 세그먼트 모형이 존재하지 않습니다. 눈의 후방 세그먼트의 관찰 및 치료는 안과27에 있는 거대한 도전입니다. 높은 제거 율, 혈액 망막 장벽 및 잠재적인 면역 학적 반응을 포함하여 후방 눈을 표적으로 하는 물리적 및 생물학적 장벽이 있습니다40. 새로운 약물 표적에 대한 대부분의 효능 및 안전 성 검사는 체외 세포 및 생체 내 동물 모델을 활용하여 수행됩니다41. 안구 해부학은 복잡하고, 체외 연구에서 조직 모델 시스템에 의해 제시된 해부학적 및 생리적 장벽을 정확하게 모방하지 않습니다. 동물 모델이 약동학 연구의 필요성이 있더라도, 인간 후방 눈의 안구 생리학은 망막의 세포 해부학, 혈관 및 ONH41,42를 포함하여 각종 동물 종 사이에서 다를 수 있습니다.
살아있는 동물의 사용은 집중적이고 상세한 윤리적 규정, 높은 재정 적 헌신 및 효과적인 재현성이 필요합니다43. 최근, 실험 연구에서 동물의 윤리적 사용에 대 한 여러 가지 다른 지침 44,45,46 계속. 동물 실험의 대안은 ONH 손상을 보호하기위한 질병의 발병과 약물의 잠재적 분석을 조사하기 위해 전 생체 내 눈 모델의 사용입니다. 인간 포스트모템 조직은 인간 질병 패러다임을 연구하기위한 귀중한 자원이며, 특히 인간 신경 퇴행성 질환의 경우 동물 모델에서 개발 된 잠재적 인 약물의 식별은 인간에게 번역 할 필요가 필요하기 때문에47. 전 생체 인간 기증자 조직은 인간 무질서47,48,49의 연구 결과에 광범위하게 이용되고 있고, 인간 전방 세그먼트 관류 기관 배양 시스템은 이전에 높은 IOP50,51,52의 병리생리학을 연구하기 위하여 유일한 ex vivo 모형을 제공했습니다.
인간의 눈에 IOP 및 ICP와 관련된 트랜스라미나 압력을 연구하기 위해, 우리는 성공적으로 설계및 인간의 기증자 눈에서 후방 세그먼트를 사용하여 독립적으로 IOP와 ICP를 조절 할 수있는 2 챔버 트랜스 라미나르 자율 시스템 (TAS)을 개발. 트랜스라미나 압력을 연구하고 ONH에 TLPG의 생체 역학적 효과를 악용한 최초의 전 생체 인간 모델이다.
이 ex vivo 인간 TAS 모델은 IOP 또는 ICP의 만성 고도로 인해 발생하는 세포 및 기능적 수정을 발견하고 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 보고서에서는 TAS 휴먼 후방 세그먼트 모델을 해부, 설정 및 모니터링하는 단계별 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 연구원이 생물 기계식 질병 병인을 연구하기 위하여 이 새로운 ex vivo 가압된 인간 후방 세그먼트 모형을 효과적으로 재현하는 것을 허용할 것입니다.
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Protocol
눈은 인간 조직과 관련된 연구를 위해 헬싱키 선언의 규정에 따라 얻어졌다.
참고: 평판 좋은 안구 은행(예: 이식을 위한 라이온스 눈 연구소, 연구, 탬파 FL)의 눈은 6-12h 의 죽음 및 기증자 혈청에서 B형 간염, C형 간염 및 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2에 대해 시험되었습니다. 일단 그들이 수신되면, 눈은 해부하고 24 시간 이내에 TAS 모델에 설정되었다. 배제 기준에는 안구 병리학이 포함되었습니다. 눈은 연령, 인종 또는 성별에 따라 배제되지 않았습니다. 수령 시 망막의 생존가능성을 보장하기 위해 망막 이병은 조직 기증자로부터 수확되어 7일과 14일 동안 배양되었습니다(보충 도 1). 이 망막은 또한 RGC 마커를 위한 긍정적인 염색, 다중 접합 (RBPMS)을 가진 RNA 결합 단백질, 뿐만 아니라 그들의 신경 필라멘트에 염색하는 긍정적인 신경필라멘트 광 사슬 (NEFL)를 가진 7 일 동안 문화에서 건강한 RGCs를 성장시켰습니다 (보충 도 2). .
1. 장비 및 소모품의 준비 및 살균
- 필요한 전체 소모품 목록과 공급업체 및 카탈로그 번호는 재료 표 에 참조하십시오.
- 사용하기 전에, 자동화 또는 에틸렌 산화물 앰플을 사용하여 모든 장비와 장비를 살균.
2. 관류 매체의 준비
- 페니실린 연쇄상 구균 1%(U/mL 페니실린 10,000명, μg/mL 연쇄절제술 신 0.85% NaCl) 및 1% L-글루타민(200mMMMM)을 1,000mL 고혈당 DULBecco의 수정된 미디엄 DMEM에 추가합니다.
- 0.22 μm 필터를 통과하여 관류 매체를 살균한다.
3. 트랜스라미나르 자율 시스템(TAS) 설정
- 인플로 주사기(IOP 및 ICP 저장소)를 설정합니다.
- 30mL 주사기에 관류 배지(섹션 2)의 30mL를 추가합니다. 30mL 주사기에 3방향 스톱콕을 부착합니다. 0.22 μm 친수성 필터를 3방향 스톱콕에 부착합니다. 0.22 μm 친수성 필터에 15 G 루어 스텁 어댑터를 부착합니다.
- 주사기 설정에서 기포를 제거합니다. 튜브를 15 G Luer 스텁 어댑터에 부착합니다. 발명되지 않은 범용 잠금 캡으로 스톱콕의 측면 포트를 닫습니다. 총 2개의 설정에 대해 반복합니다.
- 채널 1 내두근(CH1 ICP) 및 다른 주사기를 채널 2 내혈압(CH2 IOP)으로 표시합니다.
- 유출 주사기(IOP 및 ICP 저장소)를 설정합니다.
- 30mL 주사기에 3방향 스톱콕을 부착합니다. 15 G 루어 스텁 어댑터를 3방향 스톱콕에 부착합니다. 튜브를 15 G Luer 스텁 어댑터에 부착합니다.
- 발명되지 않은 범용 잠금 캡으로 스톱콕의 측면 포트를 닫습니다. 총 2개의 설정에 대해 반복합니다. 하나의 주사기를 CH1 ICP로, 다른 주사기는 CH2 IOP로 레이블을 지정합니다.
4. 인간 전체 눈 글로브의 준비
참고: 전체 눈이 수신되는 경우 아래 절차를 따라 전방 세그먼트를 눈의 후방 세그먼트에서 분리하십시오. 눈이 양분된 경우 4.4 단계에서 시작합니다.
- 2 분 동안 포비도네 요오드 솔루션에 전체 눈을 배치합니다.
- 멸균 인산염 완충액(PBS)에서 눈을 헹구어 포비도네 요오드를 헹구는다. 2번 반복합니다.
- 집게와 가위를 사용하여 전체 눈 글로브에서 아덱사제거합니다. 적도에서 눈을 양분하여 눈의 전방 및 후방 세그먼트를 분리합니다.
- 시신경 칼집을 제거합니다. 후부 세그먼트에서 유리체 유머를 제거합니다.
- 필요한 경우 후방 세그먼트에서 추가 클레라를 트리밍하여 IOP(아래쪽) 챔버의 둥근 돔에 잘 맞도록 합니다. 집게를 사용하여 망막이 세그먼트의 후방에 고르게 퍼지는지 확인합니다.
- IOP(아래쪽) 챔버 설정
- 인간 후방 세그먼트를 TAS의 IOP(아래쪽) 챔버에 놓고 회전 돔 위에 시신경이 위를 향하게 한다.
- 에폭시 수지 O 링에 4개의 나사로 후방 세그먼트를 밀봉하여 단단한 씰을 보장합니다.
- 튜브를 IOP(아래쪽) 챔버의 IN 및 OUT 포트에 삽입합니다. 튜브가 포함된 튜브가 포함된 IOP 유입 주사기는 IN 포트에 삽입되고 튜브가 있는 빈 IOP 유출 주사기가 OUT 포트에 삽입됩니다.
- 푸시/풀 방법을 사용하여 유입 포트에 관류 배지를 천천히 주입하여 후부 안구컵을 채우는 동시에 유출 주사기를 통해 회류 배지를 천천히 당겨 라인에서 기포를 제거합니다. IN 및 OUT 튜브가 기포가 없는 후에 배지 주입을 중지합니다.
- 오프 위치에 스톱콕을 잠급. IOP IN 포트 필터 어셈블리에서 30mL 주사기를 제거하고 총 30mL의 매체로 리필하십시오. 30mL 주사기를 필터 어셈블리에 교체합니다.
-
ICP(상단) 챔버 설정
- 후부 세그먼트 의 뒷면에 ICP(상단) 챔버/뚜껑을 놓습니다. 시신경이 상부 챔버 내에 있는지 확인하십시오. 상단 챔버를 4개의 나사로 밀봉합니다.
- ICP(상단) 챔버의 IN 및 OUT 포트에 튜브를 삽입합니다. 튜브가 포함된 튜브가 포함된 ICP 유입 주사기는 IN 포트에 삽입되고 튜브가 있는 빈 ICP 유출 주사기가 OUT 포트에 삽입됩니다.
- ICP 챔버를 채우고 푸시/풀 방법을 사용하여 라인에서 기포를 제거하기 위해 IN 포트에 매체를 부드럽고 천천히 주입합니다. ICP 챔버뿐만 아니라 IN 및 OUT 튜브가 기포가 없는 경우 배지 주입을 중지합니다.
- 오프 위치에 스톱콕을 잠급. 포트 필터 어셈블리에서 ICP에서 30mL 주사기를 제거하고 총 30mL의 매체로 리필하십시오. 30mL 주사기를 필터 어셈블리에 교체합니다.
5. 데이터 기록 시스템 설정
참고: 데이터 기록 시스템은 8채널 전원, 멀티채널 브리지 증폭기, 유압 압력 변환기 및 데이터 수집 소프트웨어가 있는 컴퓨터로 구성됩니다( 재료 표 참조). 다음은 시스템을 설정하고 보정하는 방법을 설명합니다.
- 전원 코드를 8채널 전원 뒷면에 연결하고 배터리 백업 장치에 연결합니다.
- 8채널 전원의 USB 케이블을 컴퓨터 뒷면에 연결합니다.
- 제공된 I2C 코드를 사용하여 8채널 전원을 다중 채널 브리지 증폭기에 연결합니다.
- Bayonet Neill-Concelman(BNC) 케이블을 8채널 전원 앞의 채널 입력에 연결하고 케이블끝을 멀티채널 앰프 뒷면의 해당 채널에 연결합니다.
- 트랜스듀서 케이블을 멀티채널 앰프의 전면에 연결합니다.
- 컴퓨터에 데이터 수집 소프트웨어를 설치합니다.
- 제공된 소프트웨어 CD에서 데이터 수집 소프트웨어 설치 설치 프로그램을 실행합니다.
- 컴퓨터 화면의 지침을 따릅니다.
- 설치가 완료되면 마무리를 선택 합니다.
- 8채널 전원을 켭니다.
- 컴퓨터를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.
- 파일 | 선택 새로운.
- 설치 | 선택 채널 설정. 세 개의 채널(화면 왼쪽 하단)을 선택합니다. 채널 제목 열에서 다음과 같이 채널의 이름을 변경: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- 모든 채널에서 범위에 대해 2mV를 선택합니다. 계산 열에서 채널 1과 2에 대한 계산 없음 을 선택합니다.
- 계산 열에서 채널 3에 대한 산술을 선택합니다. 수식 섹션에서: 채널/CH2 를 선택합니다. 산술 "-"를 선택합니다. 채널/CH1을 선택합니다. 출력 섹션에서 mmHg를 선택합니다. 확인을 선택합니다. 확인을 다시 선택합니다.
- 정압 변환기를 설정하고 교정합니다.
참고: 다음 방법을 사용하여 실험하기 전에 유수압 변환기를 보정해야 합니다.- 다중 채널 브리지 증폭기에 부착된 트랜스듀서 라인에 수압 변환기를 연결합니다.
- CH1(ICP) 압력 트랜스듀서의 측면 포트에 공기로 채워진 30mL 주사기를 부착합니다. CH1(ICP) 압력 변환기의 바닥에 스피그노미터를 부착합니다.
- 차트에서 데이터 수집 소프트웨어의 페이지를 보고 샘플링 시간 옆의 화살표를 클릭하여 샘플링 속도를 설정하고 100을 선택합니다. 그런 다음 페이지의 CH1 (ICP) 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.
- 브리지 앰프를 선택합니다. 메인 필터를 선택합니다. 0을 선택하고 압력 변환기를 이동하지 않도록 주의를 기울여 시스템이 0밖으로 나올 때까지 기다립니다.
- 압력 변환기의 흰색 탭을 꼬집어 40 mmHg가 스피그노미터에서 얻을 때까지 트랜스듀서를 통해 공기를 밀어 넣습니다. 흰색 탭을 해제하고 주사기와 스피그노미터를 제거합니다.
- 단위 변환 페이지에서 '마이너스(-)' 기호를 선택합니다. 40mmHg를 나타내는 가장 높은 고원을 강조 표시합니다. 점 1에 대한 화살표를 클릭하고 40을 입력합니다.
- 0mmHg를 나타내기 위해 가장 낮은 고원을 강조 표시합니다. 점 2에 대한 화살표 를 클릭하고 0을 입력합니다. 단위에 대한 mmHg를 선택합니다. 확인을 선택합니다.
- 확인을 선택 합니다 (브리지 앰프 페이지). 가장 높은 고원에 대해 100mmHg, 가장 낮은 고원에 대해 0을 사용하여 CH2(IOP)에 대해 9.1-9.7단계를 반복합니다.
- TAS/후방 세그먼트 단위를 데이터 수집 시스템에 연결합니다.
- TAS/후방 세그먼트 유닛을 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 넣습니다. OUT 포트에서 ICP 튜브를 CH1(ICP) 압력 변환기에 연결합니다.
- OUT 포트에서 CH2(IOP) 압력 변환기에 IOP 튜브를 부착합니다.
- 주사기 설정(ICP 및 IOP)을 IN 포트에서 링 스탠드에 배지로 부착합니다.
- 차트 보기 페이지에서 샘플링 시작을 선택합니다. 샘플링 시간 옆의 화살표를 클릭하여 샘플링 속도를 설정하고 천천히 1분 을 선택합니다.
- 프로토콜 요구 사항에 대한 ICP 및 IOP 압력을 조절하기 위해 링 스탠드의 주사기를 위 또는 아래로 조정합니다.
- 푸시 및 풀 방법을 통해 48-72 h마다 시스템에서 중간 크기의 전신 보충을 수행합니다.
6. 데이터 검색 및 분석
- 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 파일을 엽니다.
- 데이터 패드 섹션에서 데이터 패드에 여러 추가 아이콘을 클릭합니다. 새 창이 나타납니다.
- 사용 찾기 섹션에서 드롭다운 메뉴에서 시간을 선택합니다.
- 선택 섹션에서드롭다운 메뉴에서 1시간마다 1시간씩 선택합니다.
- 단계 별 섹션에서 전체 파일을 선택한 다음 추가를 클릭합니다.
- 데이터 패드 섹션에서 데이터 패드 뷰 아이콘을 클릭합니다. 모든 데이터를 강조 표시하고 스프레드시트에 복사/붙여넣기를 복사/붙여넣습니다.
- 24시간마다 IOP, ICP 및 TLPG의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 스프레드시트 프로그램 및 그래프에서 피벗 테이블 옵션을 사용하여 데이터를 집계합니다.
7. 후부 세그먼트의 면역 히스토화학 및 헤마톡슬린 및 에진 염색
- TAS 모델의 다양한 시점을 따라 후방 눈 세그먼트를 제거하고 파라피화 하기 전에 포르말린으로 수정합니다.
- 눈을 절제하여 조직 평면을 생성합니다.
- 100% 자일렌, 95% 에탄올, 50% 에탄올 용액으로 파라핀 임베디드 세그먼트를 deparaffinize.
- PBS로 슬라이드를 10분 동안 세척하고 실온에서 블로킹 버퍼로 1시간 동안 차단합니다.
- 1차 항체를 가진 라벨 섹션: 항 콜라겐 IV (세포외 매트릭스 (ECM) 마커, NB120-6586, 1:100) 및 항 라미닌 (ECM 마커, NB300-144, 1:100, 안티 RBPMS (RGC 마커), GTX118619, 1:50).
- 알렉사 플루오 이차 항체를 사용하여 1차 항체를 검출합니다(알렉사 플루오 488 염소 항토끼, A11008, 1:500).
- DAPI 안티 페이드 용액을 사용하여 세포 핵을 카운터스테인.
- 형광 현미경을 사용하여 4배 및 10배 의 객관적 렌즈로 스테인드 섹션 및 위상 이미지의 이미지를 캡처 합니다(재료표 참조).
- 헤마톡클린과 에오신(H&E) 염색의 경우, 100%, 자일렌 95% 에탄올, 50% 에탄올 용액 및 H&E를 사용한 스테인을 사용하여 데파라핀화를 위해 자동화된 스테인닝 시스템( 재료표 참조)에서 섹션을 처리합니다.
- 밝은 필드 광원이 있는 현미경을 사용하여 4x 및 10배 의 객관적렌즈로 이미지를 캡처합니다.
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Representative Results
트랜스라미나르 자율 시스템의 설계 및 생성
트랜스라미나르 압력 차동은 녹내장을 포함한 다양한 질병의 발병기만에 있는 잠재적인 중요한 기계장치입니다. 설명 된 모델에 대 한 용도 포함, 하지만 이한되지 않습니다., 녹내장의 연구 (높은 IOP, 아마도 감소 ICP), 외상성 뇌 손상 (높은 ICP), 그리고 미세 중력 관련 된 시각 장애에 장기 노출 (높은 ICP, 높은 IOP). 인간의 눈에서 트랜스라미나 압력을 대상으로 분자 병발생을 발견하기 위해 TAS 모델을 설계, 생성 및 검증했습니다. 우리의 새로운 ex vivo 인간 모형은 ICP와 IOP 관련 병원성 변경을 독립적으로 연구하기 위하여 유일한 전임상 시스템을 제공합니다. 인간의 전임상 응용 프로그램을 해결하기 위해, 우리의 모델은 트랜스 라미나르 압력 변화로 인한 병증을 연구하는 전 생체 내 패러다임을 제공합니다. 밀폐형 모델 디자인은 모든 유입 및 유출 포트(그림 1C)를 묘사하는 모델의 상세한 다이어그램 뷰와 함께 견고한 전면 및 투명 뷰(그림 1A, 1B)로 묘사됩니다. 실제 3D 프린팅 모델에서 인간 후방 세그먼트가 있는 색상 투명 뷰가 표시됩니다(그림 1D, 1E).
트랜스라미나르 자율 시스템: 새로운 ex 생체 내 인간 트랜스라미나르 압력 모델
우리는 두 개의 자율 챔버 (즉, IOP 및 ICP 챔버)와 TAS 모델을 생성했습니다. 모델의 하단 베이스에서, 인간 후방 컵은 상단을 향한 시신경과 둥근 돔의 상단에 배치되었다. 후방 컵을 IOP 챔버에 배치하고 밀봉하면 ICP 챔버를 신경 위에 배치했습니다. 각 챔버에 정확하게 맞는 O-링을 사용하여 챔버와 완벽한 씰의 독립성 유지(그림 2A). 하단 챔버 또는 IOP 챔버는 컵의 압력을 채우고 조절하는 반면, 상단 챔버는 시신경 주위에 적합하고 수압 저수지를 통해 신경 주위의 ICP를 조절합니다. 모델을 사용하여, 우리는 독립적으로 정수 압력을 사용하여 IOP 및 ICP를 규제. 두 챔버 간의 차이는 트랜스라미나 압력 그라데이션의 변화로 확인되었다(도 2B). 연결된 유입 및 유출 저수지 주사기를 포함하여 모든 최종 피팅으로 묘사된 모델은 도 2C에 표시됩니다.
트랜스라미나르 자율 시스템의 성공적인 문화 및 압력 유지 보수
두 챔버가 시스템에서 독립적으로 작동하도록 하기 위해 IOP 챔버와 ICP를 다른 평균 압력 차등(일반 TLPG: IOP: IOP: ICP, 15:5 mmHg; 높은 TLPG >10 mmHg; 높은 TLPG >20 mmHg)로 유지하여 여러 압력 차동을 조절했습니다. 우리는 처음에 IOP 및 ICP 조건의 다양한 매개 변수를 통해 두 챔버 (일반 IOP / ICP)에서 평균 정상 압력 차동의 유지 보수를 테스트 : 1) 정상 IOP : 감소 ICP (그림 3A); 2) 상승 된 IOP : 감소 ICP (그림 3B); 및 3) 상승 된 IOP : 상승 된 ICP (그림 3C). 평균 일반 IOP범위는 10-21 mmHg(에 인팩터링된 에피클레랄 정맥 압력) 및 5-15 mmHg의 일반 ICP입니다. 혈관 압력이 없는 한계 대신, 우리는 ONH에서 최대 압력을 가하는 것이 아이디어이기 때문에 여전히 이러한 속도에 대한 압력을 유지했습니다. 우리는 독립적으로 두 챔버에서 다양한 압력 수준을 규제 (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20-40 mmHg). 두 챔버 간의 압력 유지를 보장하기 위해 정상적인 조건(15mmHg)과 ICP(4mmHg)를 감소시켰으며, 11mmHg(그림 3A)의 LC 사이에 TLPG(IOP-ICP)를 유지하였다. 그런 다음 IOP(43 mmHg)를 상승시키고 ICP(3mmHg)(도 3B)를 감소시키고 마침내 두 가지(IOP, 64 mmHg) 모두에서 압력을 상승시켰습니다. ICP, 9mmHg)는 55mmHg(그림 3C)에서 가장 큰 수준의 TLPG를 생성한다. 조직의 생존가능성을 보장하기 위해(도 4)를 보장하기 위해, 조직 내의 배지는 유출 스톱콕에 빈 주사기를 부착하고 푸시/풀 방법을 사용하여 유입 포트를 통해 약 5mL의 관류 매체를 천천히 밀어매도록 하여 48h마다 교환되었다. 최소 압력 증가는 중간 교환 시 발생(도 4G) 14일 및 30일 면역조직화학 데이터(도 4A-F)에 도시된 바와 같이 ONH의 형태에 영향을 미치지 않았다. TAS 모델 내에서 효과적인 생존력으로 연장 된 기간 동안 후방 세그먼트를 배양 할 수 있는지 확인하기 위해 정상 IOP 및 ICP를 14 및 30 일 동안 유지 한 후 ONH의 단면을 분석했습니다. 우리는 성공적으로 시신경 헤드 (도 4C)에서 콜라겐 IV (COLIV)의 건강한 ONH 세포 및 세포 외 매트릭스 발현으로 14 일 동안 모델에서 이러한 세그먼트를 배양 할 수 있었다(도 4C). 후방 세그먼트의 유사한 생존 가능성 및 유지 보수도 COLIV 및 DAPI(도 4F)의 발현과 함께 30일 동안 관찰되었다(도 4D, 4E). TLPG(IOP-ICP) 값(도 4G)의 그래픽 표현은 4.6± 1.3mmHg(표 1)의 TLPG로 30일 동안 15.6± 4.6mmHg 및 ICP 평균 15.0 ± 4.6mmHg로 시간이 지남에 따라 IOP 값의 지속적인 유지 보수를 묘사합니다.
ONH 포스트 상승 된 트랜스라미나 압력 그라데이션에 대한 형태학적 변화
노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 녹내장의 일반적인 임상 특징은 ONH 컵핑입니다. 프리라미나 컵은 컵의 깊이와 너비를 모두 증가시키고 따라서 컵 대 디스크 비율을 증가 prelaminar 신경 조직의 점진적 손실에 의해 구별된다. 라미나르 컵핑은 결합 조직 기반이며, LC는 후방으로 점진적으로 이동하고 발굴합니다. 녹내장 컵핑은 라미나르 결합 조직의 손상과 리모델링을 모두 반영하는 이 두 가지 구성 요소의 조합입니다. IOP의 고도는 콜라겐 피브릴 질량53의 증가로 인해 LC 농축으로 이어집니다. TAS 모델을 활용하여 IOP를 늘리거나 다양한 시간 동안 ICP를 감소시켜 높은 TLPG를 만들었습니다. 우리는 22.8 ± 18.6 mmHg에서 시간 동안 평균 IOP 값과 ICP 평균 6.9 ± 7.6 mmHg에서 15.9 ± 11.8 mmHg (표 2)의 TLPG를 7 일 동안 높은 TLPG의 범위를 유지했다. 가장 높은 TLPG는 36 mmHg로 문서화되었습니다. 인간 후방 세그먼트는 그 때 높은 TLPG에서 통제, 1 일, 3 일 및 7 일 사이에서 진행되는 때 H&E 염색 단면도에 있는 ONH에서 라미나르 빔의 점진적인 두껍게 하고 cupping을 위해 형태학적으로 분석되었습니다 (그림 5A-D). 7일 의 높은 TLPG(도 5D)에서 컵과 두껍게 관찰하였다. 또한, 제어, 1일, 3일 및 7일 간의 시간이 지남에 따른 COLIV 발현은 7일(그림 5E-H)까지 두꺼워진 빔과 증가된 발현을 보였다. TAS 모델 내에서 높은 TLPG의 제어 조직을 비교하는 위상 이미지(도 5I) 및 7일(도 5J)은 GCL 내의 건강한 RG를 나타내며(도 5I)가 없는 GCL(도 5I)을 대조군, 높은 TLPG의 조건 하에서 이미지는 RNFL (그림 5J)에 남아있는 RGC (RBPMS-RGC 마커)와 광범위한 컵링을 표시하고 ECM의 증가 된 COLIV에 의해 표시된 바와 같이 ONH (그림 5J).
그림 1: 트랜스라미나르 자율 시스템. 모델 묘사. (A) 솔리드 프론트 뷰. (B) 투명 보기. (C) 다이어그램 보기입니다. (D) 색상 투명 보기. (E) 실제 3D 프린팅 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 트랜스라미나르 자율 시스템의 역학. (A) 트랜스라미나 압력 차동을 조절하기 위한 ICP 및 IOP 챔버를 갖춘 TAS 모델. (B) 저수지의 고도를 통해 두 챔버의 수압의 자율 적 조절과 TAS 모델의 묘사. (C) 모든 피팅을 제자리에 두고 유입 및 유출 저수지 주사기를 나타내는 TAS 모델의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 트랜스라미나르 자율 시스템 내의 독립적인 압력 유지 보수. (A) 일반 IOP/감소 ICP(B)가 상승된 IOP/감소 ICP를 가진 상부(ICP) 및 하부(IOP) 챔버에서 안정적인 압력이 유지되고 있고, (C) 상승된 IOP/상승ICP의 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 트랜스라미나르 자율 시스템 내의 후방 세그먼트의 유지 보수 및 생존 가능성. 인간 후방 세그먼트는 IOP 및 ICP의 정상적인 조건하에서 14 및 30일 동안 TAS 모델을 사용하여 배양되었습니다. 14일(A) 저배율(40x) 및 (B) 높은 배율(100x)에서 인간 ONH의 H&E 염색 단면. (C) DAPI 발현(100x)을 가진 COLIV 면역염색. (D) 40x 및 (E) 100x 현미경 및 (F) COLIV 면역염색에서 30일 동안 염색하는 H&E의 유사한 묘사(100x). G) 인간 후방 세그먼트에 대한 IOP-ICP(TLPG)의 mmHg에서 Δ의 그래픽 프리젠테이션은 문화권에서 30일 동안 유지된다. COLIV = 녹색; DAPI = 파란색; (A, 인세트 B); (D, 인세트 E); H&E = 헤마톡시린과 에신 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 트랜스라미나르 자율 시스템에서 높은 트랜스라미나 압력 그라데이션 후 시신경 헤드의 형태학적 구조 조정. 인간 후방 세그먼트는 높은 TLPG 조건하에서 다양한 시간 지점에 대해 TAS 모델을 사용하여 배양되었다. TAS에서 3일 TAS(C) 및 (D) 7일간의 문화에서 H&E 염색(A) 제어(B)의 교차면. TAS에서 3일 TAS(G) 및 (H) 문화에서 1일(E) 대조군(F)의 ONH에서 DAPI를 가진 COLIV의 발현. 위상 대조 ONH 단면 이미지의 (I) 제어 ONH 묘사 (I') RBPMS의 망막 염색 및 (I'') COLIV및 DAPI와 함께 염색 ONH. (J) 7일 TAS에서 RPMS의 망막 염색을 묘사한 인셋과 (J')의 상 대비(J')는 COLIV 및 DAPI로 염색합니다. 코리브, RBPMS = 녹색; DAPI = 파란색; (A-D) 40배 배율; (E-H) 100x 배율; (I와 J) 200x 배율; (J') 400배율; (J') 100배 배율; (J, 인셋 J', J'); H&E = 헤마톡시린 및 에신 얼룩; TAS = 트랜스라미나르 자율 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 일 | 평균 IOP 24 h | 24h의 평균 ICP | 평균 TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| 평균 | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| 성병 | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
표 1: 정상 TLPG의 유지 보수는 30일 동안 유지관리됩니다. IOP, ICP 및 TLPG를 묘사하는 표값은 전체 시간 과정을 통해 평균 및 표준 편차로 24h마다 값을 가합니다.
| 일 | 평균 IOP 24 h | 24h의 평균 ICP | 24h의 평균 TLPG |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| 평균 | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| 성병 | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
표 2: 7일 동안 유지된 높은 TLPG 범위의 유지 보수. IOP, ICP 및 TLPG를 묘사하는 표값은 전체 시간 과정을 통해 평균 및 표준 편차로 24h마다 값을 가합니다.
보충 도 1: Ex vivo 인간 망막 각기 문화. 위상 대비, RGC 양성 스테인드(RBPMS-green), 및 셀룰러(DAPI-blue) 7일 및 (D-F) 14일(200배율)에 대한 배양에서 망막 각종의 스테인드 이미지. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 인간 성인 RGC 문화. RGC 마커(RBPMS-green) 및 DAPI(블루) 염색 RG는 7일 동안 배양(A) 200x(B) 400x 배율로 염색하였다. (C) 400배율에서 NEFL(녹색) 및 DAPI(파란색)에 염색된 RGCs. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 사후 조직은 동물 모델에서 개발 된 잠재적 인 약물의 식별이 인간47에 번역 될 필요가 있기 때문에 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 특히 가치있는 자원입니다. 인간 IOP 고도의 영향은 잘 확립되어 있습니다, 그러나 최소한의 연구는 비정상적인 ONH translaminar 압력 변경에 행해졌습니다. 여러 동물 모델과 인간 ONH의 유한 모델링이 존재하지만, 트랜스 라미나르 압력 변화를 연구하는 전 생체 인간 모델은 없습니다41,54,55,56,57. 현재 충족되지 않은 필요는 IOP와 ICP를 사용하여 질병 병인학 ex vivo를 표적으로 하고 녹내장 병인증과 관련되되나는 각종 병원성 패러다임을 확인할 수 있는 새로운 전임상 인간 모형을 위해 존재합니다. ONH에서 압력 관련 병리학적 변화를 이해하는 것은 RGC 사망을 방지하는 데 매우 중요합니다. TAS 모델 내에서 IOP, ICP 및 TLPG를 결합하여 인간 후방 세그먼트 조직을 활용하는 전임상 방식으로 압력 의존성 변성을 연구하는 독특한 접근법입니다. TAS 모델에서는 IOP 및 ICP 챔버의 자율 규제를 통해 트랜스라미나 압력의 변화를 연구하기 위해 인간의 눈 컵의 후방 세그먼트를 배양할 수 있습니다. 그것은 변성의 기계장치로서 트랜스라미나 압력에 초점을 맞춘 새로운 치료법을 개발하기 위한 기초를 제공합니다.
TAS 모델을 설정하려면 인간 후방 세그먼트의 올바른 해부, 망막이 손상되지 않고 후방 컵 에 퍼지도록 보장하고, IOP 챔버의 돔 위에 세그먼트를 적절히 배치하고, ICP 챔버를 ON 위에 정확하게 배치하고, 두 챔버의 효과적인 밀봉, IOP 및 ICP 저장소의 높이를 조절하여 독립적으로 정수압의 유지 보수. 효과적인 배양 배지가 보충되지 않으면 망막이 점진적으로 악화되기 때문에 24-36 h postmortem 이하의 눈에서 수행되어야합니다. 매체의 전신 보충은 48-72 h마다 우리 시스템에서 수행되었다. 시스템의 또 다른 중요한 측면은 ON의 길이입니다. 적어도 0.5-1cm의 ON이 카다브릭 눈에 남아 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 기증자 의 눈은 짧은 ON이 있거나, ON이 손상되고, 지구가 손상되고 수축되거나, ON 칼집이 분리된 경우 사용해서는 안됩니다. 또한, 후방 세그먼트를 돔 위에 배치할 때 O-링은 제자리에 단단히 고정되어야 하며 상단 ICP 챔버는 나사로 올바르게 밀봉되어야 합니다. 튜빙이 모델의 상단 과 하단 베이스의 양쪽에 부착되는 푸시핀 피팅은 튜빙이 제자리에 맞는 지 확인하기 위해 테스트해야합니다. 튜브가 제대로 되지 않으면 튜브 내에서 기포가 관찰되고 각 챔버 내의 압력 측정이 손상됩니다.
TAS 모델의 사후 후방 세그먼트의 유지 보수 및 생존 가능성은 이 프로토콜에 대한 중요한 관심사였습니다. 인간 사후 조직은 이전에 광범위하게 연구되었다48,49, 최근 RNA 분석 연구와 함께 1,068 사후 기증자 조직은 수십 년 동안 수집 된 사후 인간 뇌 조직이 인간 장애의 연구를위한 고품질의 재료로 봉사 할 수 있음을 확인47. 또한, 이전에는 안구 인체 기증자 눈 조직의 성공적인 발현 프로파일링이 수행되었다58. 세포사멸 유전자에 대한 유전자 발현 플라이어 값은 망막 조직 6 h postmortem58에 대한 이 데이터 집합에서 최소 또는 존재하지 않는 값이었다. 더욱이, 눈 조직의 저체온 저장이 효과적으로 수행될 수 있음을 보여주었습니다59. 미니돼지 눈이 허혈성 및 저체온 조건에서 저장될 때 신경절 세포 활성이 50시간 동안 유지되는 것으로 나타났다41,60. 따라서, 우리는 기증자 안구 수집에 대한 우리의 포함 기준으로 6 h 시간 지점을 사용했다. 후부 세그먼트및 망막 분리의 사후 악화 속도는 문헌에서 부족하지만, 6h 내의 우리의 enucleation, 얼음을 통해 전달 및 최대 36 h의 문화 설정은 보충 도 1 및 보충 도 2에 묘사 된 바와 같이 조직 생존가능성의 범위 내에 잘 있습니다. TAS 모델을 사용하여 30일 동안 조직의 건강한 유지 를 성공적으로 달성했습니다.
TAS 모델의 또 다른 제한은 정상적인 생리적 조건하에서 관찰되는 ICP 및 IOP의 순환 순환 리듬을 모델링하는 현재 무능력입니다. 이것은 리듬 IOP 및 ICP 주입을 조절할 수 있는 펌프를 사용하여 미래에 해결될 수 있습니다. 또한, 모델에 대한 또 다른 주의 사항은 카다브눈 내의 혈액 순환 부족이다. 따라서 혈압의 효과는 연구할 수 없지만 IOP 및 ICP를 포함한 TLPG 변경의 병원성 효과를 구체적으로 설명할 수 있습니다.
모델의 향후 범위는 이 프로토콜에서 구현된 여러 차례의 중간 변화 대신 트랜스듀서에 출구 빈 주사기가 있는 주입 펌프를 통해 수압 적 변화 및 관류를 위한 저수지 시스템의 자동화를 통합할 것입니다. IOP 및 ICP 저장소의 유체도 수집 및 분석될 수 있습니다. 배지는 미래의 치료법을 표적으로 하는 바이오마커 발현을 위해 수집될 수 있다. 우리는 또한 약물 또는 유전자 치료로 치료 할 수있는 경로 또는 분자를 식별하고 인간 임상 시험에 번역하기 전에 ICP의 다양한 동물 모델에서 이러한 치료법을 테스트 할 수 있습니다.
결론적으로, 우리의 모델은 테스트의 인간의 기초를 제공 할뿐만 아니라, 또한 눈의 트랜스 라미나르 압력 변화를 대상으로 할 수있는 치료를 검증하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 인간 기증자 안구에 환자 줄기 세포의 이식을 통해 정밀 의학을 능력을 발휘하고 TAS 모형에서 그(것)들을 가압하는 도로를 엽니다. 이것은 우리가 진료소에 번역하고 살아있는 개별에게 관련있는 능력을 가진 치료 ex vivo를 시험할 수 있습니다. 우리의 모형으로 우리는 지금 translaminar 압력에서 생기는 변경 및 각종 외상성 및 신경 퇴행성 질병과 관련되었던 병인에 있는 중요한 역할을 하는 방법을 평가할 수 있습니다. 이것은 IOP와 ICP와 연관되는 ONH에 있는 병원성 분자 기계장치의 더 나은 이해로 이끌어 낼 것입니다.
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Disclosures
원고의 저자는 공개 할 잠재적 인 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대한 자금은 콜린 M. 맥도웰 박사의 임의 기금을 통해했다. 이 작품은 실명을 방지하기 위해 연구에서 무제한 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다, 안과 및 시각 과학의 UW 매디슨 부서에 Inc.. 우리는 관류 기관 문화 모델에 대한 기술 적 지원에 대한 박사 애보트 F. 클라크와 Weiming 마오에게 감사드립니다. 우리는 인간 기증자의 눈을 제공 에 대한 이식 및 연구 (탬파, 플로리다)에 대한 라이온스 눈 연구소 (탬파, 플로리다)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
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