Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Translaminar autonom systemmodell for modulering av intraokulært og intrakranielt trykk i humane donorplakatsegmenter

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61006
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

Summary

Vi beskriver og beskriver bruken av det translaminar autonome systemet. Dette systemet bruker det menneskelige bakre segmentet til selvstendig å regulere trykket inne i segmentet (intraokulær) og rundt synsnerven (intrakraniell) for å generere en translaminartrykkgradient som etterligner egenskaper av glaucomatous optisk nevropati.

Abstract

Det er et nåværende udekket behov for en ny preklinisk menneskelig modell som kan målrette sykdomsetiologi ex vivo ved hjelp av intrakranielt trykk (ICP) og intraokulært trykk (IOP) som kan identifisere ulike patogene paradigmer relatert til glaukompatogenese. Ex vivo humant fremre segment perfusjon organkultur modeller har tidligere blitt vellykket brukt og anvendt som effektive teknologier for oppdagelsen av glaukom patogenese og testing av terapeutiske midler. Preklinisk legemiddelscreening og forskning utført på ex vivo humane organsystemer kan oversettes mer til klinisk forskning. Denne artikkelen beskriver i detalj generering og drift av en ny utrops menneskelig translaminartrykkmodell kalt translaminar autonome system (TAS). TAS-modellen kan uavhengig regulere ICP og IOP ved hjelp av humane donor posterior segmenter. Modellen gjør det mulig å studere patogenese på en preklinisk måte. Det kan redusere bruken av levende dyr i oftalmisk forskning. I motsetning til in vitro eksperimentelle modeller, kan optisk nervehode (ONH) vevsstruktur, kompleksitet og integritet også opprettholdes i ex vivo TAS-modellen.

Introduction

Globale anslag i nyere undersøkelser tyder på at 285 millioner mennesker lever med synshemming, inkludert 39 millioner som er blinde1. I 2010 dokumenterte Verdens helseorganisasjon at tre av de ni oppførte ledende årsakene til blindhet forekommer i det bakre segmentet av øyet1. Bakre segment øyesykdommer involverer netthinnen, choroid og optisk nerve2. Netthinnen og synsnerven er sentralnervesystemet (CNS) utvidelser av hjernen. Retinal ganglion celle (RGC) axoner er sårbare for skade fordi de går ut av øyet gjennom synsnerven hodet (ONH) for å danne synsnerven3. ONH er fortsatt det mest sårbare punktet for RGC-axonene på grunn av 3D-maskearbeidet til bindevevsbjelker kalt lamina cribrosa (LC)4. ONH er det første stedet for fornærmelse mot RGC-aksoner i glaukom5,6,7, og genuttrykksendringer innen ONH har blitt studert i okulær hypertensjon og glaukommodeller8,9,10. RGC-aksonene er utsatt ved ONH på grunn av trykkforskjeller mellom det intraokulære rommet, kalt intraokulært trykk (IOP), og innenfor det eksterne perioptiske subarachnoid-rommet, kalt intrakranielt trykk (ICP)11. LC-regionen skiller begge områdene, og opprettholder normale trykkforskjeller, med IOP fra 10-21 mmHg og ICP fra 5-15 mmHg12. Trykkforskjellen gjennom lamina mellom de to kamrene kalles translaminartrykkgradienten (TLPG)13. En stor risikofaktor for glaukom er forhøyet IOP14.

Økt IOP øker belastningen innenfor og over hele laminærregionen6,15,16. Eksperimentelle observasjoner hos mennesker og dyremodeller presenterer ONH som det første stedet for axonal skade17,18. Det biomekaniske paradigmet til IOP-relatert stress og belastning som forårsaker glaucomatous skade ved ONH påvirker også patofysiologien til glauoma19,20,21. Selv om trykkinduserte endringer hos mennesker mekanisk skader RGC-axoner22, kan gnagere som mangler kollagenplater i lamina også utvikle glaukom7,23. I tillegg er forhøyet IOP fortsatt den mest fremtredende risikofaktoren hos primære åpenvinkelglaukompasienter, mens normale spenningsglaukompasienter utvikler glaucomatøs optisk nevropati selv uten forhøyet IOP. Videre er det også en undergruppe av okulære hypertensive pasienter som ikke viser noen optisk nerveskade. Det har også blitt antydet at cerebrospinalvæsketrykk (CSFp) kan spille en rolle i glaukompatogenese. Bevis indikerer at ICP senkes til ~ 5 mmHg hos glaukompasienter sammenlignet med normale individer, og forårsaker dermed økt translaminartrykk og spiller en avgjørende rolle i sykdom24,25. Tidligere ble det demonstrert i en hundemodell, at ved å kontrollere IOP- og CSFp-endringer, kan det være store forskyvninger av den optiske platen26. Heving av CSFp i svineøyne har også vist økt hovedstamme i LC-regionen og retrolaminar nevralt vev. Økt belastning på RGC-ene og LC-regionen bidrar til axonal transportblokkering og tap av RGCer27. Progressiv degenerasjon av RGCer har vært forbundet med tap av trofisk støtte28,29, stimulering av inflammatoriske prosesser / immunregulering30,31, og apoptotiske effektorer29,32,33,34,35. I tillegg forårsaker axonal skade (figur 3) skadelige effekter på RGCene, og utløser regenerativ feil36,37,38,39. Selv om effektene av IOP er godt studert, er det utført minimal forskning på unormale translaminartrykkendringer. De fleste behandlinger for glaukom fokuserer på å stabilisere IOP. Men selv om senking av IOP bremser sykdomsprogresjonen, reverserer den ikke synsfelttap og forhindrer fullstendig tap av RGCer. Forstå trykkrelaterte nevrodegenerative endringer i glaukom vil være avgjørende for å forhindre RGC-død.

Nåværende bevis indikerer at translaminartrykkmoduleringer på grunn av ulike mekaniske, biologiske eller fysiologiske endringer hos pasienter som lider av traumatiske eller nevrodegenerative synshemminger, kan forårsake betydelig synstap. For tiden finnes det ingen sann preklinisk menneskelig bakre segmentmodell som kan tillate studiet av glaucomatous biomekanisk skade i ex vivo human ONH. Observasjon og behandling av det bakre segmentet av øyet er en stor utfordring i oftalmologi27. Det er fysiske og biologiske barrierer for å målrette det bakre øyet, inkludert høye eliminasjonsrater, blodretinal barriere og potensielle immunologiske responser40. De fleste effekt- og sikkerhetstester for nye legemiddelmål oppnås ved hjelp av in vitro cellulære og in vivo dyremodeller41. Okulær anatomi er kompleks, og in vitro-studier etterligner ikke nøyaktig de anatomiske og fysiologiske barrierene som presenteres av vevsmodellsystemer. Selv om dyremodeller er en nødvendighet for farmakokinetiske studier, kan den okulære fysiologien til det menneskelige bakre øyet variere mellom ulike dyrearter, inkludert cellulær anatomi i netthinnen, vaskulaturen og ONH41,42.

Bruk av levende dyr krever intensive og detaljerte etiske forskrifter, høy økonomisk forpliktelse og effektiv reproduserbarhet43. Nylig har det oppstått flere andre retningslinjer for etisk bruk av dyr i eksperimentell forskning44,45,46. Et alternativ til dyreforsøk er bruk av ex vivo menneskelige øyemodeller for å undersøke sykdomspatogenese og potensiell analyse av legemidler for å beskytte ONH-skade. Humant postmortem vev er en verdifull ressurs for å studere menneskelige sykdomsparadigmer, spesielt når det gjelder menneskelige nevrodegenerative sykdommer, fordi identifisering av potensielle stoffer utviklet i dyremodeller krever at behovet for å kunne oversettes til mennesker47. Ex vivo human donor vev har blitt mye brukt til studiet av menneskelige lidelser47,48,49, og humant fremre segmentet perfusjon organ kultursystemer har tidligere gitt en unik ex vivo modell for å studere patofysiologi av forhøyet IOP50,51,52.

For å studere translaminartrykk relatert til IOP og ICP i menneskelige øyne, designet og utviklet vi vellykket et tokammertranslaminar autonomt system (TAS) som selvstendig kan regulere IOP og ICP ved hjelp av bakre segmenter fra menneskelige donorøyne. Det er den første ex vivo menneskelige modellen som studerer translaminartrykk og utnytter de biomekaniske effektene av TLPG på ONH.

Denne ex vivo menneskelige TAS-modellen kan brukes til å oppdage og klassifisere cellulære og funksjonelle modifikasjoner som oppstår på grunn av kronisk forhøyelse av IOP eller ICP. I denne rapporten beskriver vi den trinnvise protokollen for dissekering, oppsett og overvåking av TAS human posterior segmentmodell. Protokollen vil tillate andre forskere å effektivt reprodusere denne nye ex vivo trykksatte menneskelige bakre segmentmodellen for å studere biomekanisk sykdomspatogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Øyne ble oppnådd i henhold til bestemmelsene i Helsinkideklarasjonen for forskning som involverer menneskelig vev.

MERK: Øyne fra anerkjente øyebanker (f.eks. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) ble høstet innen 6-12 timer etter død og donorserum ble testet for hepatitt B, hepatitt C og humant immunsviktvirus 1 og 2. Når de ble mottatt, ble øynene dissekert og satt opp i TAS-modellen innen 24 timer. Eksklusjonskriterier inkluderte enhver okulær patologi. Øyne ble ikke utelukket basert på alder, rase eller kjønn. For å sikre netthinnens levedyktighet ved mottak, ble netthinneutløp høstet fra vevsdonorene og dyrket i 7 og 14 dager (supplerende figur 1). Disse netthinnene ble også dissosiert og vokste sunne RGCer i kulturen i 7 dager med positiv farging for RGC-markør, RNA-bindende protein med multippel skjøting (RBPMS), samt positiv neurofilament lyskjede (NEFL) farging i nevrofilamentene (Tilleggsfigur 2). .

1. Forberedelse og sterilisering av utstyr og forsyninger

  1. Se materialfortegnelsen for en fullstendig liste over nødvendige forsyninger samt leverandør- og katalognumre.
  2. Steriliser alt utstyr og instrumenter ved å autoklavere eller bruke etylenoksidampuller før bruk.

2. Fremstilling av perfusjonsmedium

  1. Tilsett 1% penicillin streptomycin (10,000 U / ml penicillin, 10,000 μg / ml streptomycin i 0,85% NaCl) og 1% L-glutamin (200 mM) til 1000 ml høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM).
  2. Steriliser perfusjonsmediet ved å passere gjennom et 0,22 μm filter.

3. Oppsett av translaminar autonomt system (TAS)

  1. Sett opp innstrømningssprøyter (IOP- og ICP-reservoarer).
    1. Tilsett 30 ml perfusjonsmedium (avsnitt 2) i en 30 ml sprøyte. Fest en 3-veis stoppekran til 30 ml sprøyten. Fest et hydrofilt filter på 0,22 μm til 3-veis stoppekranen. Fest en 15 G Luer stub adapter til det hydrofile filteret på 0,22 μm.
    2. Fjern luftbobler fra sprøyteoppsettet. Fest slangen til 15 G Luer stub adapteren. Lukk sideporten på stoppekranen med en uventilert universal låsehette. Gjenta dette for totalt to oppsett.
    3. Merk den ene sprøyten som kanal 1 intrakranielt trykk (CH1 ICP) og den andre sprøyten som kanal 2 intraokulært trykk (CH2 IOP).
  2. Sett opp utstrømningssprøyter (IOP- og ICP-reservoarer).
    1. Fest en 3-veis stoppekran til en 30 ml sprøyte. Fest en 15 G Luer stub adapter til 3-veis stoppekranen. Fest slangen til 15 G Luer stub adapteren.
    2. Lukk sideporten på stoppekranen med en uventilert universal låsehette. Gjenta dette for totalt to oppsett. Merk den ene sprøyten som CH1 ICP og den andre sprøyten som CH2 IOP.

4. Forberedelse av menneskelig hele øyekulen

MERK: Hvis hele øyne mottas, følg prosedyren nedenfor for å skille det fremre segmentet fra det bakre segmentet av øyet. Hvis øynene mottas bisected, start på trinn 4.4.

  1. Plasser et helt øye i povidon-jodoppløsning i 2 min.
  2. Skyll øyet i steril fosfatbufret oppløsning (PBS) for å skylle av povidon-jod. Gjenta 2 ganger.
  3. Fjern adnexa fra hele øyekulen ved hjelp av tang og saks. Bisect øyet ved ekvator for å skille fremre og bakre segmenter av øyet.
  4. Fjern synsnervens kappe. Fjern glasslegemet humor fra det bakre segmentet.
  5. Trim ekstra sclera fra bakre segment, om nødvendig, for å sikre en god passform på den runde kuppelen til IOP (nederst) kammeret. Bruk tang, sørg for at netthinnen er spredt jevnt over etter bakre av segmentet.
  6. Oppsett av IOP-kammer (nederst)
    1. Plasser det menneskelige bakre segmentet i IOP (nederst) kammeret til TAS over den runde kuppelen med synsnerven vendt mot toppen.
    2. Forsegle det bakre segmentet ved hjelp av epoksyharpiks O-ringen med fire skruer, og sørg for en tett forsegling.
    3. Sett slangen inn i INN- og UT-portene på IOP-kammeret (nederst). IOP-innløpssprøyten med slange som inneholder medium settes inn i IN-porten, og den tomme IOP-utstrømningssprøyten med slanger settes inn i OUT-porten.
    4. Bruk push/pull-metoden til å sakte tilføre perfusjonsmediet inn i innløpsporten for å fylle den bakre øyekoppen samtidig som du sakte trekker perfusjonsmediet ut gjennom utløpssprøyten for å fjerne eventuelle luftbobler fra linjene. Stopp infusing medium når både IN- og OUT-rørene er tom for luftbobler.
    5. Lås stoppekranene i av-stilling. Fjern 30 ml sprøyten fra IOP IN-portfilterenheten og fyll på med totalt 30 ml medium. Sett den 30 ml sprøyten tilbake på filterenheten.
  7. Oppsett av ICP-kammer (øverst)
    1. Plasser ICP-kammeret/lokket over baksiden av det bakre segmentet. Forsikre deg om at synsnerven er i toppkammeret. Forsegle toppkammeret med fire skruer.
    2. Sett slangen inn i INN- og UT-portene på ICP-kammeret (øverst). ICP-innløpssprøyten med slange som inneholder medium settes inn i IN-porten, og den tomme ICP-utstrømningssprøyten med slanger settes inn i OUT-porten.
    3. Tilsett mediet forsiktig og sakte i IN-porten for å fylle ICP-kammeret og fjerne luftbobler fra linjene ved hjelp av push/pull-metoden. Stopp infusing medium når ICP-kammeret samt både IN- og OUT-slangen er tom for luftbobler.
    4. Lås stoppekranene i av-stilling. Fjern 30 ml sprøyten fra ICP i portfilterenheten og fyll på med totalt 30 ml medium. Sett den 30 ml sprøyten tilbake på filterenheten.

5. Oppsett av dataregistreringssystem

MERK: Dataregistreringssystemet består av en 8-kanals strømkilde, flerkanals broforsterker, hydrostatiske trykktransdusere og en datamaskin med datainnsamlingsprogramvare (se Materialfortegnelse). Nedenfor beskrives hvordan du konfigurerer og kalibrerer systemet.

  1. Koble strømledningen til baksiden av den 8-kanals strømkilden og koble den til en batteriback-up-enhet.
  2. Koble USB-kabelen fra den 8-kanals strømkilden til baksiden av datamaskinen.
  3. Koble den 8-kanals strømkilden til flerkanalsbroforsterkeren ved hjelp av den medfølgende I2C-ledningen.
  4. Koble Bayonet Neill-Concelman (BNC)-kablene til kanalinngangene foran 8-kanals strømkilden og enden av kablene til de tilsvarende kanalene på baksiden av flerkanalsforsterkeren.
  5. Koble svingerkablene til forsiden av flerkanalsforsterkeren.
  6. Installer datainnsamlingsprogramvaren på datamaskinen.
    1. Kjør installasjonsprogrammet for programvareinstallasjonsprogrammet for datainnsamling fra den medfølgende programvare-CDen.
    2. Følg instruksjonene på dataskjermen.
    3. Når installasjonen er fullført, velger du Fullfør.
  7. Slå på 8-kanals strømkilde.
  8. Slå på datamaskinen og start datainnsamlingsprogramvaren.
    1. Velg fil | Ny.
    2. Velg oppsett | Kanalinnstillinger. Velg tre kanaler (nederst til venstre på skjermen). I Kanaltittel-kolonnen endrer du navn på kanalene på følgende måte: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Velg 2 mV for området på alle kanaler. I Beregning-kolonnen velger du Ingen beregning for kanal 1 og 2.
    4. Velg Aritmetic for kanal 3 i Beregning-kolonnen. I Formel-delen: Velg kanaler/CH2; Velg aritmetisk "-"; Velg kanaler/CH1. Velg mmHg i Utdata-delen. Velg OK. Velg OK på nytt.
  9. Sett opp og kalibrer de hydrostatiske trykktransduserne.
    MERK: Hydrostatiske trykktransdusere må kalibreres før eksperimenter med følgende metode.
    1. Koble de hydrostatiske trykktransduserne til svingerlinjene som er festet til flerkanalsbroforsterkeren.
    2. Fest en 30 ml sprøyte fylt med luft til sideporten på TRYKKTRANSDUSEREN CH1 (ICP). Fest sphygmomanometeret til bunnen av trykktransduseren CH1 (ICP).
    3. På diagrammet viser du siden for datainnsamlingsprogramvaren, angir samplingshastigheten ved å venstreklikke pilen ved siden av prøvetiden og velge 100. Høyreklikk deretter i CH1 -området (ICP) på siden.
    4. Velg Bridge Amp. Velg Nettfilter. Velg Null og vent til systemet nuller ut, pass på at du ikke flytter trykktransduseren.
    5. Klem de hvite tappene på trykktransduseren og skyv luften gjennom svingeren til 40 mmHg oppnås på sphygmomanometeret. Slipp de hvite tappene og fjern sprøyten og sphygmomanometeret.
    6. Velg minustegn (-) på Enheter-konverteringssiden. det høyeste platået for å indikere 40 mmHg. Klikk pilen for punkt 1, og skriv inn 40.
    7. det laveste platået for å angi 0 mmHg. Klikk pilen for punkt 2, og skriv inn 0. Velg mmHg for enhetene. Velg OK.
    8. Velg OK (Bridge Amp-siden). Gjenta trinn 9.1-9.7 for CH2 (IOP) ved hjelp av 100 mmHg for det høyeste platået og 0 for det laveste platået.
  10. Koble TAS/posterior-segmentenheten til datainnsamlingssystemet.
    1. Plasser TAS/posterior segmentenheten i en inkubator (37 °C, 5 % CO2). Fest ICP-slangen fra OUT-porten til trykktransduseren CH1 (ICP).
    2. Fest IOP-slangen fra OUT-porten til trykktransduseren CH2 (IOP).
    3. Fest sprøyteoppsettene (ICP og IOP) med medium fra IN-portene til ringstativet.
    4. Velg Start sampling på Diagramvisning-siden. Angi samplingshastigheten ved å venstreklikke pilen ved siden av prøvetiden og velg Langsom og 1 min.
    5. Juster sprøytene på ringstativet opp eller ned for å regulere ICP- og IOP-trykk til protokollkrav.
    6. Utfør systemisk etterfylling av medium i systemet hver 48-72 timer gjennom trykk- og trekkmetoden.

6. Henting og analyse av data

  1. Åpne datafilen i datainnsamlingsprogramvaren.
  2. I Data Pad-delen klikker du på ikonet Legg til flere i Data Pad . Et nytt vindu vises.
    1. Velg Klokkeslett på rullegardinmenyen under Søk etter bruk.
    2. I Velg-delen velger du 1 time hver 1 time fra rullegardinmenyene.
    3. Velg Hele filen under Steg gjennom, og klikk deretter Legg til.
  3. I Data Pad-delen klikker du på Data Pad View-ikonet . Merk alle dataene, og kopier/lim dem inn i et regneark.
  4. Beregn gjennomsnitts- og standardavvikene for IOP, ICP og TLPG for hver 24. Sorter dataene ved hjelp av alternativet pivottabell i et regnearkprogram og en graf.

7. Immunhiistokjemi og hematoksylin og eosinfarging av bakre segmenter

  1. Fjern de bakre øyesegmentene etter ulike tidspunkter fra TAS-modellen og fest i formalin før paraffinering.
  2. Seksjon øynene for å produsere sagittal vev fly.
  3. Deparaffiniser de parafin-innebygde segmentene med en 100% xylen, 95% etanol, 50% etanoloppløsning.
  4. Vask lysbildene med PBS i 10 min og blokker med en blokkeringsbuffer ved romtemperatur i 1 time.
  5. Etikettseksjoner med primære antistoffer: anti-kollagen IV (Extracellular Matrix (ECM)-markør, NB120-6586, 1:100) og anti-laminin (ECM-markør, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC-markør), GTX118619, 1:50).
  6. Oppdag de primære antistoffene ved hjelp av Alexa Fluor sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 geit anti-kanin, A11008, 1:500).
  7. Motvirke cellekjernene ved hjelp av DAPI anti-fade løsning.
  8. Ta bilder av de fargede delene og fasebildene med objektive linser på 4x og 10x ved hjelp av et fluorescensmikroskop (se Materialfortegnelse).
  9. For hematoksylin og eosin (H&E) farging, behandle seksjonene i et automatisert fargesystem (se Materialfortegnelse) for deparaffinisering ved hjelp av en 100%, xylen 95% etanol, 50% etanoloppløsning og flekk med H&E.
  10. Ta bilder med objektive linser på 4x og 10x ved hjelp av et mikroskop med en lysfeltlyskilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Design og opprettelse av det autonome translaminarsystemet
Translaminar trykkforskjell er en potensiell nøkkelmekanisme i patogenesen av ulike sykdommer, inkludert glaukom. Bruksområder for modellen som er beskrevet inkluderer, men er ikke begrenset til, studiet av glaukom (forhøyet IOP, kanskje redusert ICP), traumatisk hjerneskade (forhøyet ICP) og langvarig eksponering for mikrogravitetsrelatert synshemming (forhøyet ICP, forhøyet IOP). For å bidra til å oppdage molekylær patogenese rettet mot translaminartrykk i det menneskelige øye, designet, opprettet og validerte vi TAS-modellen. Vår nye ex vivo menneskelige modell gir et unikt preklinisk system for selvstendig å studere ICP og IOP-assosierte patogene endringer. For å adressere menneskelige prekliniske applikasjoner, gir vår modell et utvetydigme for å studere patogenese på grunn av translaminartrykkendringer. Den forseglede modelldesignen er avbildet med solide front- og gjennomsiktige visninger (figur 1A, 1B) med en detaljert diagrammatisk visning av modellen for å skildre alle innstrømnings- og utstrømningsportene (figur 1C). Den gjennomsiktige fargevisningen med et menneskelig bakre segment i en faktisk 3D-trykt modell vises (figur 1D, 1E).

Translaminar autonome system: En ny utrop vivo menneskelig translaminar trykk modell
Vi genererte TAS-modellen med to autonome kamre (dvs. IOP- og ICP-kamre). I bunnen av modellen ble den menneskelige bakre koppen plassert over toppen av den runde kuppelen med synsnerven vendt mot toppen. Når den bakre koppen ble plassert og forseglet i IOP-kammeret, plasserte vi ICP-kammeret på toppen av nerven. Vi opprettholdt uavhengigheten til begge kamrene og en perfekt forsegling ved hjelp av O-ringer som passer nøyaktig til hvert kammer (figur 2A). Bunnkammeret eller IOP-kammeret fylte og regulerte trykket i koppen, mens toppkammeret passer rundt synsnerven og regulerte ICP rundt nerven gjennom hydrostatiske trykkreservoarer. Ved hjelp av modellen regulerte vi uavhengig IOP og ICP ved hjelp av hydrostatisk trykk. Forskjellen mellom begge kamrene ble identifisert som en endring i translaminartrykkgradient (figur 2B). Modellen som er avbildet med alle de endelige beslagene på plass, inkludert innstrømnings- og utstrømningsreservoarsprøytene som er tilkoblet, er vist i figur 2C.

Vellykket kultur og trykkvedlikehold i det autonome translaminarsystemet
For å sikre at begge kamrene fungerte uavhengig i systemet, regulerte vi flere trykkforskjeller ved å holde IOP-kammeret og ICP på forskjellige gjennomsnittlige trykkforskjeller (normal TLPG: IOP: ICP, 15:5 mmHg; forhøyet TLPG >10 mmHg; forhøyet TLPG >20 mmHg). Vi testet først vedlikehold av gjennomsnittlige normale trykkforskjeller i begge kamrene (normal IOP/ICP) gjennom ulike parametere for IOP- og ICP-forhold: 1) normal IOP: redusert ICP (figur 3A); 2) forhøyet IOP: redusert ICP (Figur 3B); og 3) forhøyet IOP: forhøyet ICP (figur 3C). Den gjennomsnittlige normale IOP varierer fra 10-21 mmHg (episcleral venøst trykk tatt i) og normal ICP fra 5-15 mmHg. I stedet for begrensningen av ikke å ha vaskulært trykk, opprettholdt vi fortsatt trykket til disse prisene, da ideen var å utøve det maksimale trykket ved ONH. Vi regulerte uavhengig ulike trykknivåer i begge kamrene (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20–40 mmHg). For å sikre trykkvedlikehold mellom begge kamrene holdt vi IOP under normale forhold (15 mmHg) og redusert ICP (4 mmHg) for å opprettholde en TLPG (IOP-ICP) mellom LC på 11 mmHg (figur 3A). Deretter forhøyet vi IOP (43 mmHg) og reduserte ICP (3 mmHg) (figur 3B) og til slutt forhøyede trykk i begge (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) for å generere det største nivået av TLPG ved 55 mmHg (figur 3C). For å sikre vevets levedyktighet (figur 4) ble mediet i vevet byttet hver 48. Minimale trykkøkninger oppstod på tidspunktet for middels utveksling (figur 4G) og påvirket ikke onh-morfologien som vist i 14- og 30-dagers immunhiistokjemidata (figur 4A–F). For å bekrefte at vi kunne dyrke bakre segmenter for lengre tidsrammer med effektiv levedyktighet i TAS-modellen, analyserte vi tverrsnitt av ONH etter vedlikehold av normal IOP og ICP i 14 og 30 dager. Vi var i stand til å dyrke disse segmentene i modellen i 14 dager (figur 4A, 4B) med sunne ONH-celler og ekstracellulært matriseuttrykk av kollagen IV (COLIV) ved synsnerven (figur 4C). Lignende levedyktighet og vedlikehold av det bakre segmentet ble også observert i 30 dager (figur 4D, 4E) med uttrykk for COLIV og DAPI (figur 4F). Den grafiske representasjonen av TLPG-verdier (IOP-ICP) (figur 4G) viser et konstant vedlikehold av IOP-verdier over tid ved 15,6 ± 4,6 mmHg og ICP-gjennomsnitt ved 11,0 ± 4,6 mmHg i 30 dager med en TLPG på 4,6 ± 1,3 mmHg (tabell 1).

Morfologiske endringer i ONH-stiftens forhøyede translaminartrykkgradient
Et vanlig klinisk trekk ved aldersrelatert nevrodegenerativ sykdom glaukom er ONH cupping. Prelaminar cupping preges av progressivt tap av prelaminar nevrale vev, noe som øker både dybden og bredden på koppen og dermed øker kopp-til-disk-forholdet. Laminær cupping er bindevevsbasert, med LC som beveger seg bakre gradvis og graver ut. Glaucomatous cupping er en kombinasjon av disse to komponentene, som reflekterer både skade og ombygging av laminære bindevev. Høyde i IOP fører til LC-fortykning på grunn av en økning i kollagenfibrilmasse53. Ved hjelp av TAS-modellen opprettet vi en forhøyet TLPG ved å øke IOP eller redusere ICP over forskjellige tidspunkter. Vi opprettholdt en rekke forhøyede TLPG i 7 dager med gjennomsnittlige IOP-verdier over tid på 22,8 ± 18,6 mmHg og ICP-gjennomsnitt på 6,9 ± 7,6 mmHg med en TLPG på 15,9 ± 11,8 mmHg (tabell 2). De høyeste TLPG-ene ble dokumentert ved 36 mmHg. Menneskelige bakre segmenter ble deretter analysert morfologisk for progressiv fortykning av laminære bjelker og cupping ved ONH i H&E fargede seksjoner etter hvert som tiden gikk mellom kontroll, 1 dag, 3 dager og 7 dager under forhøyet TLPG (figur 5A-D). Cupping og fortykning ble observert ved 7 dager med forhøyet TLPG (figur 5D). Videre viste COLIV-uttrykk over tid mellom kontroll, 1 dag, 3 dager og 7 dager fortykkede bjelker og økt uttrykk med 7 dager (figur 5E-H). Fasebilder som sammenligner kontrollvev som ikke er dyrket i TAS-modellen (figur 5I) og 7 dager (figur 5J) med forhøyet TLPG i TAS-modellen, viser sunne RGCer i GCL (figur 5I) uten cupping (figur 5I) for kontrollen, under forhold med forhøyet TLPG, viser bildene omfattende cupping uten gjenværende RGCer (RBPMS-RGC-markøren) i RNFL (figur 5J) og økt ombygging av ECM som vist ved forhøyet COLIV i ONH (figur 5J).

Figure 1
Figur 1: Translaminar autonomt system. Modell skildring. (A) Solid sett forfra. (B) Gjennomsiktig visning. (C) Diagrammatisk visning. (D) Farge gjennomsiktig visning. (E) Faktisk 3D-trykt modell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mekanikken i det autonome translaminarsystemet. (A) TAS-modellen med ICP- og IOP-kamre for regulering av translaminartrykkforskjeller. (B) Skildring av TAS-modellen med autonom regulering av hydrostatisk trykk i begge kamrene gjennom forhøyelse av reservoarer. (C) Bilde av TAS-modellen med alle beslagene på plass og representasjon av innstrømnings- og utstrømningsreservoarsprøytene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Uavhengig trykkvedlikehold i det autonome translaminarsystemet. Grafisk fremstilling av trykk som er uavhengig modulert, og stabile trykk opprettholdes i topp-ICP- og bunnkamrene (IOP) med (A) normal IOP/redusert ICP (B) forhøyet IOP/redusert ICP, og (C) forhøyet IOP/forhøyet ICP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vedlikehold og levedyktighet av bakre segmenter i det autonome translaminarsystemet. Menneskelige bakre segmenter ble dyrket ved hjelp av TAS-modellen i 14 og 30 dager under normale forhold for IOP og ICP. H&E fargede tverrsnitt av human ONH ved 14 dager i (A) lav forstørrelse (40x) og (B) høy forstørrelse (100x). (C) COLIV-immunisering med DAPI-uttrykk (100x). Lignende skildringer av H&E-farging ved 30 dager i (D) 40x og (E) 100x mikrografer og (F) COLIV-immunostaining med DAPI-uttrykk (100x). G) Grafisk presentasjon av Δ i mmHg av IOP-ICP (TLPG) for humane bakre segmenter opprettholdt i 30 dager i kulturen. COLIV = grønn; DAPI = blå; (A, innsett B); (D, innsett E); H&E = hematoksylin og eosinflekk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Morfologisk restrukturering av synsnervehodet etter forhøyet translaminartrykkgradient i translaminar autonome systemet. Menneskelige bakre segmenter ble dyrket ved hjelp av TAS-modellen for ulike tidspunkter under forhøyede TLPG-forhold. Tverrsnitt av menneskelig ONH som viser H&E farging av (A) kontroll (B) 1 dag i TAS (C) 3 dager i TAS, og (D) 7 dager med kultur. Uttrykk for COLIV med DAPI i ONH for (E) kontroll (F) 1 dag i TAS (G) 3 dager i TAS, og (H) 7 dager i kultur. Fasekontrast ONH tverrsnitt bilder av (I) kontroll ONH som viser (I') netthinnefarging av RBPMS og (I'') ONH farging med COLIV og DAPI. Fasekontrast av (J) 7 dager med forhøyet TLPG i TAS med innsett som skildrer (J') netthinnefarging av RBPMS og (J'') ONH-farging med COLIV og DAPI. COLIV, RBPMS = grønn; DAPI = blå; (A–D) 40x forstørrelse; (E–H) 100x Forstørrelse; (I og J) 200x forstørrelse; (J') 400x forstørrelse; (J'') 100x forstørrelse; (J, innsett J' og J''); H&E = hematoksylin og eosinflekk; TAS = Translaminar autonome system. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Dager Gjennomsnittlig IOP på 24 timer Gjennomsnittlig ICP på 24 timer Gjennomsnittlig TLPG (IOP-ICP)
1 17.7 12.1 5.7
2 20.0 15.0 5.0
3 13.4 9.6 3.7
4 15.1 10.5 4.5
5 11.6 8.3 3.3
6 14.0 9.5 4.5
7 17.2 13.8 3.4
8 19.3 16.1 3.2
9 17.7 15.0 2.8
10 10.9 8.0 2.9
11 16.3 10.2 6.1
12 14.7 11.8 2.9
13 7.5 4.5 3.0
14 5.5 1.4 4.1
15 13.5 8.3 5.2
16 15.4 10.3 5.1
17 11.7 4.5 7.3
18 13.3 9.3 4.0
19 23.5 19.7 3.8
20 20.3 14.5 5.7
21 12.8 5.8 7.0
22 25.8 19.9 5.9
23 19.3 13.5 5.8
24 18.8 15.1 3.7
25 14.4 8.9 5.5
AVG 15.6 11.0 4.6
STD 4.6 4.6 1.3

Tabell 1: Vedlikehold av normal TLPG opprettholdt i 30 dager. Tabellverdier som viser IOP-, ICP- og TLPG-verdier hver 24.

Dager Gjennomsnittlig IOP på 24 timer Gjennomsnittlig ICP på 24 timer Gjennomsnittlig TLPG på 24 timer
1 4.1 -1.0 5.1
2 6.3 1.1 5.3
3 13.4 4.0 9.4
4 19.0 1.1 17.9
5 55.6 19.5 36.2
6 39.5 12.8 26.7
7 21.5 10.8 10.6
AVG 22.8 6.9 15.9
STD 18.6 7.6 11.8

Tabell 2: Vedlikehold av en rekke forhøyede TLPG opprettholdt i 7 dager. Tabellverdier som viser IOP-, ICP- og TLPG-verdier hver 24.

Supplerende figur 1: Ex vivo menneskelig retinal explant kultur. Fasekontrast, RGC-positive fargede (RBPMS-grønn) og cellulære (DAPI-blå) fargede bilder av retinal explants i kultur i (A–C) 7 dager og (D–F) 14 dager (200x forstørrelse). Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 2: Menneskelige voksne RGC-kulturer. RGC-markør (RBPMS-grønn) og DAPI (blå) farget RGCer 7 dager i kultur (A) 200x (B) 400x forstørrelse. (C) RGCer farget for NEFL (grønn) og DAPI (blå) ved 400x forstørrelse. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Humant postmortem vev er en spesielt verdifull ressurs for å studere menneskelige nevrodegenerative sykdommer fordi identifisering av potensielle legemidler utviklet i dyremodeller må oversettes til mennesker47. Effektene av menneskelig IOP-høyde er veletablerte, men det er utført minimal forskning på unormale ONH-translaminartrykkendringer. Selv om det finnes flere dyremodeller og endelig modellering av menneskelig ONH, finnes det ingen ex vivo menneskelig modell for å studere translaminartrykkendringer41,54,55,56,57. Et nåværende udekket behov eksisterer for en ny preklinisk menneskelig modell som kan målrette sykdomsetiologi ex vivo ved hjelp av IOP og ICP og kan identifisere ulike patogene paradigmer relatert til glaukompatogenese. Å forstå trykkrelaterte patologiske endringer ved ONH vil være avgjørende for å forhindre RGC-død. Den kombinerte bruken av IOP, ICP og TLPG i TAS-modellen er en unik tilnærming for å studere trykkavhengig degenerasjon på en preklinisk måte ved bruk av humant bakre segmentvev. I TAS-modellen kan vi dyrke bakre segmenter av menneskelige øyekopper for å studere endringer i translaminartrykk gjennom autonom regulering av IOP- og ICP-kamrene. Det gir grunnlag for å utvikle et nytt utvalg av terapeutiske stoffer som fokuserer på translaminartrykk som en mekanisme for degenerasjon.

Å sette opp TAS-modellen krever oppmerksomhet på detaljer i mange aspekter: riktig disseksjon av de menneskelige bakre segmentene, og sikrer at netthinnen er intakt og spredt over den bakre koppen, riktig plassering av segmentet over kuppelen til IOP-kammeret, nøyaktig plassere ICP-kammeret over PÅ, effektiv forsegling av begge kamrene, vedlikehold av hydrostatiske trykk uavhengig av regulerende høyde på IOP- og ICP-reservoarer. Disseksjon må utføres i øyne som ikke er mer enn 24-36 h postmortem, fordi netthinnen gradvis forverres hvis effektivt kulturmedium ikke etterfylles. Systemisk etterfylling av medium ble utført i vårt system hver 48-72 timer. Et annet viktig aspekt ved systemet er lengden på ON. Det er viktig å sikre at minst 0,5–1 cm PÅ blir liggende på kadaverøyet. Donorøyne bør ikke brukes hvis de har korte ONer, ON er skadet, kloden er kompromittert og deflatert, eller PÅ hylsen er løsrevet. Videre, når du plasserer det bakre segmentet over kuppelen, må O-ringen være tett på plass og det øverste ICP-kammeret riktig forseglet med skruer. Stiftebeslagene der slangen festes på hver side av topp- og bunnbunnen på modellen, må også testes for å sikre at slangen passer og låses på plass. Hvis slangen ikke er riktig på plass, vil luftbobler bli observert i slangen og kompromittere trykkmålingene i hvert kammer.

Vedlikehold og levedyktighet av postmortem posterior segmenter i vår TAS-modell var en kritisk bekymring for denne protokollen. Humant postmortem vev har tidligere blitt grundig studert48,49, med en nylig RNA analyse studie av 1,068 postmortem donor vev som bekrefter at postmortem menneskelig hjernevev samlet over flere tiår kan tjene som høy kvalitet materiale for studie av menneskelige lidelser47. I tillegg har tidligere vellykket uttrykksprofilering av okulært humant donor øyevev postmortem blitt utført58. Genuttrykk PLIER-verdier for apoptosegener var minimale eller ikke-eksisterende i dette datasettet for netthinnevev 6 h postmortem58. Videre har det vist seg at hypotermisk lagring av øyevev kan utføres effektivt59. Det har vist seg at ganglioncelleaktivitet opprettholdes i 50 timer når minipig øyne lagres ved iskemiske og hypotermiske forhold41,60. Derfor brukte vi 6 h-tidspunktet som våre inklusjonskriterier for donor eyecup-innsamling. Hastigheten på postmortem forverring av bakre segmenter og netthinneavløsning mangler i litteraturen, men vår enucleation innen 6 h, levering over is, og kulturoppsett av maksimal 36 h er godt innenfor området vev levedyktighet som avbildet i Supplerende figur 1 og Supplerende figur 2. Ved hjelp av TAS-modellen oppnådde vi vellykket sunt vedlikehold av vev i 30 dager.

En annen begrensning i TAS-modellen er vår nåværende manglende evne til å modellere de sykliske døgnrytmene til ICP og IOP som observeres under normale fysiologiske forhold. Dette kan løses i fremtiden ved å bruke en pumpe som kan regulere rytmisk IOP- og ICP-infusjon. Videre er en annen advarsel til modellen mangelen på blodsirkulasjon i kadaverøyet. Dermed kan effekten av blodtrykk ikke studeres, men dette gjør det også mulig for oss å spesifikt avgrense de patogene effektene av bare TLPG-endringer, inkludert IOP og ICP.

Et fremtidig omfang av modellen vil inkludere automatisering av reservoarsystemene for hydrostatiske endringer og perfusjon av medium gjennom en infusjonspumpe med en tom sprøyte på transduseren i stedet for flere runder med middels endring som ble implementert i denne protokollen. Væsken fra IOP- og ICP-reservoaret kan også samles inn og analyseres. Medium kan samles inn for biomarkøruttrykk for å målrette fremtidige terapier. Vi kan også identifisere veier eller molekyler som kan behandles med legemidler eller genterapi og teste disse terapiene i ulike dyremodeller av ICP før oversettelse til menneskelige kliniske studier.

Til slutt gir vår modell ikke bare et menneskelig grunnlag for testing, men den kan også brukes til å validere terapier som kan målrette translaminartrykkendringer i øyet. Det åpner en mulighet til å utføre presisjonsmedisin gjennom transplantasjon av pasientstammeceller på menneskelige donorøyekopper og presse dem i TAS-modellen. Dette gjør at vi kan teste terapier ex vivo med kapasitet til å være oversettbar til klinikken og relatable til levende individer. Med vår modell kan vi nå vurdere endringene som skjer i translaminartrykk og hvordan det spiller en avgjørende rolle i patogenesen forbundet med ulike traumatiske og nevrodegenerative sykdommer. Dette vil føre til en bedre forståelse av patogene molekylære mekanismer i ONH som er forbundet med IOP og ICP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne av manuskriptet har ingen potensielle interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Støtten til dette prosjektet var gjennom skjønnsmessige midler fra Dr. Colleen M. McDowell. Dette arbeidet ble delvis støttet av et ubegrenset tilskudd fra Research to Prevent Blindness, Inc. til UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Vi takker Dr. Abbot F. Clark og Weiming Mao for deres tekniske hjelp med perfusjonsorgankulturmodellen. Vi takker Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) for å ha gitt de menneskelige donorøyne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		 Amazon B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) Amazon B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle Vitality Medical 302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap QOSINA 2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver Brikksen Stainless Steel Fastners PPMSSSCH4C.5  
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE Fisher Scientific NC9085343  
Betadine Purdue PUR1815001EACH  
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167-100EA  
Corning L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS Med Plus Medical Supply COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) Katena K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps F.S.T. 11254-20
Eye Scissors Standard Curved Katena K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes Capitol Scientific 351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers Fisher Scientific 16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium Fisher Scientific SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution Fisher Scientific SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear Qosina 28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate AD instruments DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box Jenson Global JG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscope Keyence B2-X710
LabChart 8 AD instruments LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer Leica ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White QOSINA 65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228) AD instruments FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508) AD instruments PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male McMAster-Carr 7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe McMAster-Carr 51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. Fisher Scientific 14-171-268
Superblock T20 Fisher Scientific PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T. 14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved Katena K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS) University of North Texas Health Science Center N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		 Marco Rubber & Plastics B1000-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 158 intraokulært trykk intrakranielt trykk translaminartrykkgradient retinal ganglionceller optisk nervehode perfusjonsorgankultur
Translaminar autonom systemmodell for modulering av intraokulært og intrakranielt trykk i humane donorplakatsegmenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, T. P., Curry, S. M.,… More

Sharma, T. P., Curry, S. M., Lohawala, H., McDowell, C. Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments. J. Vis. Exp. (158), e61006, doi:10.3791/61006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter