Summary
Wir beschreiben und beschreiben die Verwendung des translaminaren autonomen Systems. Dieses System nutzt das menschliche hintere Segment, um den Druck innerhalb des Segments (intraokular) und um den Sehnerv (intrakranial) unabhängig zu regulieren, um einen translaminaren Druckgradienten zu erzeugen, der Merkmale der glaukomatösen Optikusneuropathie nachahmt.
Abstract
Es besteht derzeit ein ungedeckter Bedarf an einem neuen präklinischen Humanmodell, das die Ätiologie der Krankheit ex vivo unter Verwendung von intrakraniellem Druck (ICP) und Intraokulardruck (IOP) anvisieren kann, die verschiedene pathogene Paradigmen im Zusammenhang mit der Glaukompathogenese identifizieren können. Ex-vivo-Modelle der Perfusionsorgankultur des menschlichen vorderen Segments wurden bisher erfolgreich eingesetzt und als wirksame Technologien für die Entdeckung der Glaukompathogenese und die Erprobung von Therapeutika eingesetzt. Präklinisches Arzneimittelscreening und Forschung an menschlichen Ex-vivo-Organsystemen können besser auf die klinische Forschung übertragbar sein. Dieser Artikel beschreibt detailliert die Erzeugung und den Betrieb eines neuartigen ex vivo menschlichen translaminaren Druckmodells, das als translaminares autonomes System (TAS) bezeichnet wird. Das TAS-Modell kann ICP und IOP unabhängig voneinander regulieren, indem es posteriore Segmente des menschlichen Spenders verwendet. Das Modell ermöglicht es, die Pathogenese präklinisch zu untersuchen. Es kann den Einsatz lebender Tiere in der ophthalmologischen Forschung reduzieren. Im Gegensatz zu experimentellen In-vitro-Modellen können auch die Gewebestruktur, -komplexität und -integrität des Sehnervenkopfes (ONH) innerhalb des ex vivo TAS-Modells aufrechterhalten werden.
Introduction
Globale Schätzungen in jüngsten Umfragen deuten darauf hin, dass 285 Millionen Menschen mit Sehbehinderung leben, darunter 39 Millionen, die blind sind1. Im Jahr 2010 dokumentierte die Weltgesundheitsorganisation, dass drei der neun aufgeführten Hauptursachen für Erblindung im hinteren Segment des Auges auftreten1. Augenerkrankungen des hinteren Segments betreffen die Netzhaut, die Aderhaut und den Sehnerv2. Die Netzhaut und der Sehnerv sind Erweiterungen des Gehirns des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Axone der retinalen Ganglienzellen (RGC) sind anfällig für Schäden, da sie das Auge durch den Sehnervenkopf (ONH) verlassen, um den Sehnerv zu bilden3. Das ONH bleibt der anfälligste Punkt für die RGC-Axone aufgrund des 3D-Geflechts von Bindegewebsstrahlen, die als Lamina cribrosa (LC)4 bezeichnet werden. Das ONH ist der erste Ort der Beleidigung von RGC-Axonen bei Glaukom5,6,7, und Genexpressionsänderungen innerhalb des ONH wurden in okulären Hypertonie- und Glaukommodellen untersucht8,9,10. Die RGC-Axone sind am ONH aufgrund von Druckunterschieden zwischen dem intraokularen Kompartiment, dem sogenannten Augeninnendruck (IOP), und innerhalb des externen perioptischen Subarachnoidalraums, dem sogenannten intrakraniellen Druck (ICP)11, anfällig. Der LC-Bereich trennt beide Bereiche unter Beibehaltung der normalen Druckunterschiede, wobei der IOD zwischen 10 und 21 mmHg und der ICP zwischen 5 und 15 mmHg12 liegt. Die Druckdifferenz durch die Lamelle zwischen den beiden Kammern wird als translaminarer Druckgradient (TLPG)13 bezeichnet. Ein Hauptrisikofaktor des Glaukoms ist ein erhöhter IOP14.
Ein erhöhter IOD erhöht die Belastung innerhalb und über die laminare Region6,15,16. Experimentelle Beobachtungen in Menschen- und Tiermodellen stellen das ONH als den ersten Ort axonaler Schäden dar17,18. Das biomechanische Paradigma des IOD-bedingten Stresses und der Belastung, die am ONH glaukomatöse Schäden verursachen, beeinflusst auch die Pathophysiologie des Glaukoms19,20,21. Obwohl beim Menschen druckbedingte Veränderungen die RGC-Axone mechanisch schädigen22, können Nagetiere, denen kollagene Platten in der Lamina fehlen, auch ein Glaukom entwickeln7,23. Darüber hinaus bleibt ein erhöhter IOD der prominenteste Risikofaktor bei Patienten mit primärem Offenwinkelglaukom, während normale Spannungsglaukompatienten auch ohne erhöhten IOD eine glaukomatöse Optikusneuropathie entwickeln. Darüber hinaus gibt es auch eine Untergruppe von okulären hypertensiven Patienten, die keine Sehnervenschädigung zeigen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass der Liquordruck (CSFp) eine Rolle bei der Glaukompathogenese spielen kann. Es gibt Hinweise darauf, dass der ICP bei Glaukompatienten im Vergleich zu normalen Personen auf ~ 5 mmHg gesenkt wird, wodurch ein erhöhter translaminarer Druck verursacht wird und eine entscheidende Rolle bei der Erkrankung spielt24,25. Zuvor wurde in einem Hundemodell gezeigt, dass es durch die Kontrolle von IOP- und CSFp-Änderungen zu großen Verschiebungen der optischen Disc26 kommen kann. Die Erhöhung des LIQUOR in den Augen von Schweinen hat auch eine erhöhte Hauptbelastung innerhalb der LC-Region und des retrolaminaren Nervengewebes gezeigt. Eine erhöhte Belastung der RGCs und der LC-Region trägt zur axonalen Transportblockade und zum Verlust von RGCs bei27. Die fortschreitende Degeneration von RGCs wurde mit dem Verlust der trophischen Unterstützung28,29, der Stimulation von Entzündungsprozessen/Immunregulation30,31 und apoptotischen Effektoren in Verbindung gebracht29,32,33,34,35. Darüber hinaus verursacht eine axonale Verletzung (Abbildung 3) schädliche Auswirkungen auf die RGCs und löst ein regeneratives Versagen aus36,37,38,39. Obwohl die Auswirkungen von IOD gut untersucht wurden, wurden nur minimale Untersuchungen zu abnormalen translaminaren Druckänderungen durchgeführt. Die meisten Behandlungen für Glaukom konzentrieren sich auf die Stabilisierung des IOD. Obwohl die Senkung des IOD das Fortschreiten der Krankheit verlangsamt, kehrt sie den Gesichtsfeldverlust nicht um und verhindert den vollständigen Verlust von RGCs. Das Verständnis druckbedingter neurodegenerativer Veränderungen des Glaukoms wird entscheidend sein, um den Tod durch RGC zu verhindern.
Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass translaminare Druckmodulationen aufgrund verschiedener mechanischer, biologischer oder physiologischer Veränderungen bei Patienten mit traumatischen oder neurodegenerativen Sehstörungen zu einem erheblichen Sehverlust führen können. Derzeit existiert kein echtes präklinisches modell für das menschliche hintere Segment, das die Untersuchung von glaukomatösen biomechanischen Schäden innerhalb des ex vivo humanen ONH ermöglichen könnte. Die Beobachtung und Behandlung des hinteren Augenabschnitts ist eine große Herausforderung in der Augenheilkunde27. Es gibt physikalische und biologische Barrieren, die auf das hintere Auge abzielen, einschließlich hoher Eliminationsraten, Blut-Netzhaut-Barriere und potenzieller immunologischer Reaktionen40. Die meisten Wirksamkeits- und Sicherheitstests für neuartige Wirkstoffziele werden unter Verwendung von In-vitro-Zell- und In-vivo-Tiermodellen durchgeführt41. Die Augenanatomie ist komplex, und In-vitro-Studien ahmen die anatomischen und physiologischen Barrieren von Gewebemodellsystemen nicht genau nach. Obwohl Tiermodelle eine Notwendigkeit für pharmakokinetische Studien sind, kann die Augenphysiologie des menschlichen hinteren Auges zwischen verschiedenen Tierarten variieren, einschließlich der zellulären Anatomie der Netzhaut, des Gefäßsystems und ONH41,42.
Die Verwendung lebender Tiere erfordert intensive und detaillierte ethische Vorschriften, ein hohes finanzielles Engagement und eine effektive Reproduzierbarkeit43. In jüngster Zeit sind mehrere weitere Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren in der experimentellen Forschung entstanden44,45,46. Eine Alternative zu Tierversuchen ist die Verwendung von Ex-vivo-Modellen des menschlichen Auges zur Untersuchung der Krankheitspathogenese und der Potenzialanalyse von Arzneimitteln zum Schutz von ONH-Schäden. Menschliches postmortales Gewebe ist eine wertvolle Ressource für die Untersuchung menschlicher Krankheitsparadigmen, insbesondere im Fall von humanen neurodegenerativen Erkrankungen, da die Identifizierung potenzieller Medikamente, die in Tiermodellen entwickelt wurden, die Notwendigkeit erfordert, auf den Menschen übertragbar zu sein47. Das menschliche Ex-vivo-Spendergewebe wurde umfassend für die Untersuchung menschlicher Störungen verwendet47,48,49, und menschliche Perfusionsorgankultursysteme für das vordere Segment haben zuvor ein einzigartiges Ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie von erhöhtem IOP50,51,52 bereitgestellt.
Um den translaminaren Druck im Zusammenhang mit IOD und ICP im menschlichen Auge zu untersuchen, haben wir erfolgreich ein translaminares autonomes Zweikammersystem (TAS) entworfen und entwickelt, das IOD und ICP unabhängig voneinander regulieren kann, indem wir posteriore Segmente von menschlichen Spenderaugen verwenden. Es ist das erste Ex-vivo-Humanmodell, das den translaminaren Druck untersucht und die biomechanischen Wirkungen von TLPG auf das ONH nutzt.
Dieses ex vivo humane TAS-Modell kann verwendet werden, um zelluläre und funktionelle Modifikationen zu entdecken und zu klassifizieren, die aufgrund einer chronischen Erhöhung von IOD oder ICP auftreten. In diesem Bericht beschreiben wir das Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Sezieren, Einrichten und Überwachen des TAS-Modells des menschlichen hinteren Segments. Das Protokoll wird es anderen Forschern ermöglichen, dieses neuartige Ex-vivo-Druckmodell des menschlichen hinteren Segments effektiv zu reproduzieren, um die pathogenese biomechanischer Erkrankungen zu untersuchen.
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Protocol
Die Augen wurden gemäß den Bestimmungen der Deklaration von Helsinki für die Forschung mit menschlichem Gewebe gewonnen.
HINWEIS: Augen aus seriösen Augenbanken (z. B. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) wurden innerhalb von 6-12 Stunden nach dem Tod geerntet und Spenderserum wurde auf Hepatitis B, Hepatitis C und das humane Immunschwächevirus 1 und 2 getestet. Sobald sie eingegangen waren, wurden die Augen innerhalb von 24 Stunden im TAS-Modell seziert und eingerichtet. Zu den Ausschlusskriterien gehörte jede Augenpathologie. Augen wurden nicht aufgrund von Alter, Rasse oder Geschlecht ausgeschlossen. Um die Lebensfähigkeit der Netzhaut nach Erhalt zu gewährleisten, wurden retinale Explantate von den Gewebespendern geerntet und 7 und 14 Tage lang kultiviert (ergänzende Abbildung 1). Diese Netzhäute wurden ebenfalls dissoziiert und züchteten gesunde RGCs in Kultur für 7 Tage mit positiver Färbung für RGC-Marker, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) sowie positiver Neurofilament-Leichtkettenfärbung (NEFL) in ihren Neurofilamenten (Ergänzende Abbildung 2). .
1. Vorbereitung und Sterilisation von Geräten und Zubehör
- Eine vollständige Liste der benötigten Verbrauchsmaterialien sowie Lieferanten- und Katalognummern finden Sie in der Materialtabelle.
- Vor dem Gebrauch sterilisieren Sie alle Geräte und Instrumente durch Autoklavieren oder verwenden Sie Ethylenoxidampullen.
2. Vorbereitung des Perfusionsmediums
- Fügen Sie 1% Penicillin Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin, 10.000 μg/ml Streptomycin in 0,85% NaCl) und 1% L-Glutamin (200 mM) auf 1.000 ml hohe Glucose Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) hinzu.
- Sterilisieren Sie das Perfusionsmedium, indem Sie es durch einen 0,22 μm-Filter führen.
3. Einrichtung des translaminaren autonomen Systems (TAS)
- Richten Sie Zulaufspritzen (IOP- und ICP-Reservoirs) ein.
- 30 ml des Perfusionsmediums (Abschnitt 2) in eine 30 ml Spritze geben. Befestigen Sie einen 3-Wege-Absperrhahn an der 30 ml Spritze. Befestigen Sie einen 0,22 μm hydrophilen Filter am 3-Wege-Absperrhahn. Schließen Sie einen 15 G Luer Stummeladapter an den hydrophilen 0,22 μm-Filter an.
- Entfernen Sie Luftblasen aus dem Spritzenaufbau. Befestigen Sie den Schlauch am 15 G Luer Stummeladapter. Schließen Sie den seitlichen Anschluss des Absperrhahns mit einem unbelüfteten Universalverschluss. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Setups.
- Kennzeichnen Sie eine Spritze als intrakraniellen Druck (CH1 ICP) und die andere Spritze als Kanal 2 Augeninnendruck (CH2 IOP).
- Richten Sie Ausflussspritzen (IOP- und ICP-Reservoirs) ein.
- Befestigen Sie einen 3-Wege-Absperrhahn an einer 30 ml Spritze. Befestigen Sie einen 15 G Luer-Stummeladapter am 3-Wege-Absperrhahn. Befestigen Sie den Schlauch am 15 G Luer Stummeladapter.
- Schließen Sie den seitlichen Anschluss des Absperrhahns mit einem unbelüfteten Universalverschluss. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Setups. Kennzeichnen Sie eine Spritze als CH1 ICP und die andere Spritze als CH2 IOP.
4. Vorbereitung der menschlichen Ganzaugenkugel
HINWEIS: Wenn ganze Augen empfangen werden, befolgen Sie das folgende Verfahren, um das vordere Segment vom hinteren Segment des Auges zu trennen. Wenn die Augen halbiert empfangen werden, beginnen Sie mit Schritt 4.4.
- Legen Sie ein ganzes Auge für 2 min in Povidon-Jod-Lösung.
- Spülen Sie das Auge in steriler phosphatgepufferter Lösung (PBS), um das Povidon-Jod abzuspülen. Wiederholen Sie dies 2 Mal.
- Entfernen Sie die Adnexa mit einer Pinzette und einer Schere von der gesamten Augenkugel. Halbieren Sie das Auge am Äquator, um das vordere und hintere Segment des Auges zu trennen.
- Entfernen Sie die Sehnervenscheide. Entfernen Sie den Glaskörper aus dem hinteren Segment.
- Schneiden Sie bei Bedarf zusätzliche Sklera aus dem hinteren Segment ab, um eine gute Passform auf der runden Kuppel der IOP-Kammer (unten) zu gewährleisten. Stellen Sie mit einer Pinzette sicher, dass die Netzhaut gleichmäßig über die Rückseite des Segments verteilt ist.
- Einrichtung der IOP-Kammer (unten)
- Platzieren Sie das menschliche hintere Segment in der IOP-Kammer (untere) Kammer des TAS über der runden Kuppel mit dem Sehnerv nach oben.
- Versiegeln Sie das hintere Segment mit dem Epoxidharz-O-Ring mit vier Schrauben und sorgen Sie so für eine dichte Abdichtung.
- Setzen Sie den Schlauch in die IN- und OUT-Ports der IOP-Kammer (unten) ein. Die IOP-Zulaufspritze mit mediumhaltigem Schlauch wird in den IN-Anschluss und die leere IOP-Auslaufspritze mit Schlauch in den OUT-Anschluss eingesetzt.
- Verwenden Sie die Push/Pull-Methode, um das Perfusionsmedium langsam in den Einströmanschluss zu infundieren, um die hintere Augenmuschel zu füllen, während Sie gleichzeitig das Perfusionsmedium langsam durch die Ausflussspritze herausziehen, um Luftblasen aus den Leitungen zu entfernen. Hören Sie auf, Medium zu infundieren, sobald sowohl die IN- als auch die OUT-Röhren frei von Luftblasen sind.
- Verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Position. Entfernen Sie die 30-ml-Spritze aus der IOP IN-Anschlussfilterbaugruppe und füllen Sie sie mit insgesamt 30 ml Medium nach. Setzen Sie die 30-ml-Spritze wieder in die Filtereinheit ein.
-
Aufbau der ICP-Kammer (oben)
- Platzieren Sie die ICP-Kammer /den Deckel über der Rückseite des hinteren Segments. Stellen Sie sicher, dass sich der Sehnerv in der oberen Kammer befindet. Verschließen Sie die obere Kammer mit vier Schrauben.
- Setzen Sie den Schlauch in die IN- und OUT-Ports der ICP-Kammer (oben) ein. Die ICP-Zulaufspritze mit mediumhaltigem Schlauch wird in den IN-Anschluss und die leere ICP-Auslaufspritze mit Schlauch in den OUT-Anschluss eingesetzt.
- Ziehen Sie das Medium vorsichtig und langsam in den IN-Anschluss, um die ICP-Kammer zu füllen und Luftblasen mit der Push/Pull-Methode aus den Leitungen zu entfernen. Stoppen Sie das Infusionsmedium, sobald die ICP-Kammer sowie der IN- und OUT-Schlauch frei von Luftblasen sind.
- Verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Position. Entfernen Sie die 30-ml-Spritze aus dem ICP in der Portfilterbaugruppe und füllen Sie sie mit insgesamt 30 ml Medium nach. Setzen Sie die 30-ml-Spritze wieder in die Filtereinheit ein.
5. Einrichtung des Datenaufzeichnungssystems
HINWEIS: Das Datenaufzeichnungssystem besteht aus einer 8-Kanal-Stromquelle, einem Mehrkanal-Brückenverstärker, hydrostatischen Druckmessumformern und einem Computer mit Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle). Im Folgenden wird beschrieben, wie Sie das System einrichten und kalibrieren.
- Schließen Sie das Netzkabel an die Rückseite der 8-Kanal-Stromquelle an und schließen Sie es an ein Batteriesicherungsgerät an.
- Schließen Sie das USB-Kabel von der 8-Kanal-Stromquelle an die Rückseite des Computers an.
- Schließen Sie die 8-Kanal-Stromquelle über das mitgelieferte I2C-Kabel an den Mehrkanal-Bridge-Verstärker an.
- Verbinden Sie die Bajonett Neill-Concelman (BNC) Kabel mit den Kanaleingängen vor der 8-Kanal-Stromquelle und dem Ende der Kabel mit den entsprechenden Kanälen auf der Rückseite des Mehrkanalverstärkers.
- Schließen Sie die Wandlerkabel an die Vorderseite des Mehrkanalverstärkers an.
- Installieren Sie die Datenerfassungssoftware auf dem Computer.
- Führen Sie das Installationsprogramm für die Datenerfassungssoftware von der mitgelieferten Software-CD aus.
- Folgen Sie den Anweisungen auf dem Computerbildschirm.
- Wenn die Installation abgeschlossen ist, wählen Sie Fertig stellen aus.
- Schalten Sie die 8-Kanal-Stromquelle ein.
- Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Datenerfassungssoftware.
- Wählen Sie Datei | Neu.
- Wählen Sie Setup- | Kanaleinstellungen. Wählen Sie drei Kanäle aus (unten links auf dem Bildschirm). Benennen Sie in der Spalte Kanaltitel die Kanäle wie folgt um: CH1 ICP; CH2-IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Wählen Sie 2 mV für den Bereich auf allen Kanälen. Wählen Sie in der Spalte Berechnung die Option Keine Berechnung für die Kanäle 1 und 2 aus.
- Wählen Sie in der Spalte Berechnung die Option Arithmetik für Kanal 3 aus. Im Abschnitt Formel : Wählen Sie Kanäle/CH2; Wählen Sie arithmetisch "-"; Wählen Sie Kanäle/CH1. Wählen Sie im Abschnitt Ausgabe die Option mmHg aus. Wählen Sie OK aus. Wählen Sie erneut OK aus.
- Richten Sie die hydrostatischen Druckmessumformer ein und kalibrieren Sie sie.
ANMERKUNG: Hydrostatische Druckmessumformer müssen vor Versuchen mit der folgenden Methode kalibriert werden.- Schließen Sie die hydrostatischen Druckmessumformer an die Wandlerleitungen an, die am Mehrkanal-Brückenverstärker befestigt sind.
- Befestigen Sie eine mit Luft gefüllte 30-ml-Spritze an der Seitenöffnung des CH1-Druckmessumformers (ICP). Befestigen Sie das Blutdruckmessgerät an der Unterseite des CH1 (ICP) Druckmessumformers.
- Zeigen Sie im Diagramm die Seite der Datenerfassungssoftware an, stellen Sie die Abtastgeschwindigkeit ein, indem Sie mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben der Abtastzeit klicken und 100 auswählen. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in den Bereich CH1 (ICP) der Seite.
- Wählen Sie Bridge Amp. Wählen Sie Netzfilter. Wählen Sie Null und warten Sie, bis das System auf Null gesetzt ist, und achten Sie darauf, den Druckmessumformer nicht zu bewegen.
- Drücken Sie die weißen Laschen des Druckmessumformers zusammen und drücken Sie Luft durch den Messumformer, bis 40 mmHg auf dem Blutdruckmessgerät erhalten sind. Lassen Sie die weißen Laschen los, und entfernen Sie die Spritze und das Blutdruckmessgerät.
- Wählen Sie auf der Seite Einheitenumrechnung das Zeichen "Minus (-)" aus. Markieren Sie das höchste Plateau, um 40 mmHg anzuzeigen. Klicken Sie auf den Pfeil für Punkt 1, und geben Sie 40 ein.
- Markieren Sie das unterste Plateau, um 0 mmHg anzuzeigen. Klicken Sie auf den Pfeil für Punkt 2, und geben Sie 0 ein. Wählen Sie mmHg für die Einheiten aus. Wählen Sie OK aus.
- Wählen Sie OK (Bridge Amp Seite). Wiederholen Sie die Schritte 9.1–9.7 für CH2 (IOP) mit 100 mmHg für das höchste Plateau und 0 für das unterste Plateau.
- Schließen Sie die TAS/posteriore Segmenteinheit an das Datenerfassungssystem an.
- Legen Sie die TAS/posteriore Segmenteinheit in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2). Schließen Sie den ICP-Schlauch vom OUT-Anschluss an den CH1 (ICP)-Druckmessumformer an.
- Schließen Sie den IOP-Schlauch vom OUT-Anschluss an den CH2-Druckmessumformer (IOP) an.
- Befestigen Sie die Spritzen-Setups (ICP und IOP) mit Medium von den IN-Ports am Ringständer.
- Wählen Sie auf der Seite Diagrammansicht die Option Stichprobe starten aus. Stellen Sie die Sampling-Geschwindigkeit ein, indem Sie mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben der Sampling-Zeit klicken und Slow und 1 min auswählen.
- Stellen Sie die Spritzen am Ringständer nach oben oder unten ein, um den ICP- und IOP-Druck entsprechend den Protokollanforderungen zu regulieren.
- Führen Sie alle 48-72 h eine systemische Auffüllung des Mediums im System durch die Push-and-Pull-Methode durch.
6. Datenabruf und -analyse
- Öffnen Sie die Datendatei in der Datenerfassungssoftware.
- Klicken Sie im Abschnitt Data Pad auf das Symbol Mehrere zu Data Pad hinzufügen . Ein neues Fenster wird angezeigt.
- Wählen Sie im Abschnitt Suchen mit die Option Zeit aus dem Dropdown-Menü aus.
- Wählen Sie im Abschnitt Auswählen alle 1 Stunde aus den Dropdown-Menüs aus.
- Wählen Sie im Abschnitt Schritt durch die Option Gesamte Datei aus, und klicken Sie dann auf Hinzufügen.
- Klicken Sie im Abschnitt Data Pad auf das Symbol Data Pad View . Markieren Sie alle Daten und kopieren Sie sie in eine Tabelle.
- Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichungen für IOP, ICP und TLPG pro 24 h. Ordnen Sie die Daten mithilfe der Pivot-Tabellenoption in einem Tabellenkalkulationsprogramm und einem Diagramm zusammen.
7. Immunhistochemie und Hämatoxylin- und Eosinfärbung der hinteren Segmente
- Entfernen Sie die hinteren Augensegmente nach verschiedenen Zeitpunkten aus dem TAS-Modell und fixieren Sie formalin vor der Paraffinisierung.
- Schneiden Sie die Augen, um sagittale Gewebeebenen zu erzeugen.
- Deparaffinisieren Sie die paraffin-eingebetteten Segmente mit einer 100% Xylol, 95% Ethanol, 50% Ethanol Lösung.
- Waschen Sie die Objektträger mit PBS für 10 min und blockieren Sie sie mit einem Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 1 h.
- Markierungsabschnitte mit primären Antikörpern: Anti-Kollagen IV (Extrazelluläre Matrix (ECM) Marker, NB120-6586, 1:100) und Anti-Laminin (ECM-Marker, NB300-144, 1:100, Anti-RBPMS (RGC-Marker), GTX118619, 1:50).
- Nachweis der primären Antikörper mit Alexa Fluor sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen, A11008, 1:500).
- Halten Sie die Zellkerne mit DAPI-Anti-Fade-Lösung auf.
- Erfassen Sie Bilder der gefärbten Schnitte und Phasenbilder mit 4x- und 10x-Objektivlinsen mit einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle).
- Für die Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung verarbeiten Sie die Abschnitte in einem automatisierten Färbesystem (siehe Materialtabelle) zur Deparaffinisierung mit einem 100%, Xylol 95% Ethanol, 50% Ethanollösung und färben Sie es mit H & E.
- Nehmen Sie Bilder mit den 4x- und 10x-Objektivlinsen mit einem Mikroskop mit einer Hellfeldlichtquelle auf.
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Representative Results
Design und Kreation des translaminaren autonomen Systems
Die translaminare Druckdifferenz ist ein potenzieller Schlüsselmechanismus in der Pathogenese verschiedener Krankheiten, einschließlich glaukom. Zu den Anwendungen des beschriebenen Modells gehören unter anderem die Untersuchung von Glaukom (erhöhter IOD, möglicherweise verminderter ICP), traumatischer Hirnverletzung (erhöhter ICP) und langfristiger Exposition gegenüber schwerelosigkeitsassoziierter Sehbehinderung (erhöhter ICP, erhöhter IOD). Um die molekulare Pathogenese zu entdecken, die auf den translaminaren Druck im menschlichen Auge abzielt, haben wir das TAS-Modell entworfen, erstellt und validiert. Unser neuartiges Ex-vivo-Humanmodell bietet ein einzigartiges präklinisches System zur unabhängigen Untersuchung von ICP- und IOP-assoziierten pathogenen Veränderungen. Um präklinische Anwendungen am Menschen zu adressieren, bietet unser Modell ein Ex-vivo-Paradigma zur Untersuchung der Pathogenese aufgrund translaminarer Druckänderungen. Der Entwurf des abgedichteten Modells wird mit einfarbigen Frontansichten und transparenten Ansichten (Abbildung 1A, 1B) mit einer detaillierten diagrammatischen Ansicht des Modells dargestellt, um alle Zu- und Abflusskanäle darzustellen (Abbildung 1C). Die farbtransparente Ansicht mit einem menschlichen hinteren Segment in einem tatsächlichen 3D-gedruckten Modell wird gezeigt (Abbildung 1D, 1E).
Translaminares Autonomes System: Ein neuartiges ex vivo menschliches translaminares Druckmodell
Wir haben das TAS-Modell mit zwei autonomen Kammern (d.h. IOP- und ICP-Kammern) erstellt. In der unteren Basis des Modells wurde der menschliche hintere Becher über die Oberseite der runden Kuppel gelegt, wobei der Sehnerv nach oben zeigte. Nachdem der hintere Becher in der IOP-Kammer platziert und versiegelt war, platzierten wir die ICP-Kammer auf dem Nerv. Wir haben die Unabhängigkeit beider Kammern und eine perfekte Abdichtung mit O-Ringen beibehalten, die genau in jede Kammer passen (Abbildung 2A). Die untere Kammer oder die IOP-Kammer füllte und regulierte den Druck in der Tasse, während die obere Kammer um den Sehnerv passte und den ICP um den Nerv durch hydrostatische Druckreservoirs regulierte. Mit dem Modell haben wir IOD und ICP unabhängig voneinander mit hydrostatischem Druck reguliert. Der Unterschied zwischen beiden Kammern wurde als Veränderung des translaminaren Druckgradienten identifiziert (Abbildung 2B). Das dargestellte Modell mit allen endgültigen Formstücken, einschließlich der angeschlossenen An- und Abflussbehälterspritzen, ist in Abbildung 2C dargestellt.
Erfolgreiche Kultur- und Druckerhaltung im translaminaren autonomen System
Um sicherzustellen, dass beide Kammern unabhängig voneinander im System arbeiteten, regulierten wir mehrere Druckdifferenzen, indem wir die IOP-Kammer und den ICP auf unterschiedlichen durchschnittlichen Druckdifferenzen hielten (normal TLPG: IOP: ICP, 15:5 mmHg; erhöhtes TLPG >10 mmHg; erhöhtes TLPG >20 mmHg). Wir testeten zunächst die Aufrechterhaltung der durchschnittlichen Normaldruckdifferenzen in beiden Kammern (normaler IOD/ICP) durch verschiedene Parameter von IOP- und ICP-Bedingungen: 1) normaler IOD: verminderter ICP (Abbildung 3A); 2) erhöhter IOD: verminderter ICP (Abbildung 3B); und 3) erhöhter IOP: erhöhter ICP (Abbildung 3C). Der durchschnittliche normale IOD liegt zwischen 10 und 21 mmHg (episkleraler Venendruck berücksichtigt) und der normale ICP zwischen 5 und 15 mmHg. Anstelle der Einschränkung, keinen Gefäßdruck zu haben, haben wir immer noch den Druck auf diese Raten beibehalten, da die Idee war, den maximalen Druck am ONH auszuüben. Wir regulierten unabhängig voneinander verschiedene Druckstufen in beiden Kammern (ICP, 5–10 mmHg; IOP, 20–40 mmHg). Um die Druckerhaltung zwischen beiden Kammern zu gewährleisten, hielten wir den IOD unter normalen Bedingungen (15 mmHg) und verringerten den ICP (4 mmHg), um ein TLPG (IOP-ICP) zwischen dem LC von 11 mmHg aufrechtzuerhalten (Abbildung 3A). Wir erhöhten dann den IOD (43 mmHg) und verringerten den ICP (3 mmHg) (Abbildung 3B) und schließlich erhöhte Drücke in beiden (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg), um den größten TLPG-Gehalt bei 55 mmHg zu erzeugen (Abbildung 3C). Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten (Abbildung 4), wurde das Medium in den Geweben alle 48 h ausgetauscht, indem eine leere Spritze an den Abflusshahn befestigt und etwa 5 ml Perfusionsmedium mit der Push/Pull-Methode langsam durch den Zulaufkanal gedrückt wurden. Minimale Druckerhöhungen traten zum Zeitpunkt des Mittelaustauschs auf (Abbildung 4G) und beeinflussten nicht die Morphologie des ONH, wie in den 14- und 30-tägigen immunhistochemischen Daten gezeigt (Abbildung 4A-F). Um zu bestätigen, dass wir posteriore Segmente für längere Zeiträume mit effektiver Lebensfähigkeit innerhalb des TAS-Modells kultivieren konnten, analysierten wir Querschnitte des ONH nach Aufrechterhaltung des normalen IOD und ICP für 14 und 30 Tage. Wir konnten diese Segmente im Modell 14 Tage lang erfolgreich kultivieren (Abbildung 4A, 4B) mit gesunden ONH-Zellen und extrazellulärer Matrixexpression von Kollagen IV (COLIV) am Sehnervenkopf (Abbildung 4C). Eine ähnliche Lebensfähigkeit und Aufrechterhaltung des hinteren Segments wurde auch für 30 Tage beobachtet (Abbildung 4D, 4E) mit Expression von COLIV und DAPI (Abbildung 4F). Die grafische Darstellung der TLPG-Werte (IOP-ICP) (Abbildung 4G) zeigt eine konstante Aufrechterhaltung der IOD-Werte über die Zeit bei 15,6 ± 4,6 mmHg und des ICP-Mittelwerts bei 11,0 ± 4,6 mmHg für 30 Tage mit einem TLPG von 4,6 ± 1,3 mmHg (Tabelle 1).
Morphologische Veränderungen des ONH nach erhöhtem translaminaren Druckgradienten
Ein häufiges klinisches Merkmal der altersbedingten neurodegenerativen Erkrankung Glaukom ist das ONH-Schröpfen. Prälaminares Schröpfen zeichnet sich durch einen fortschreitenden Verlust von prälaminarem Nervengewebe aus, was sowohl die Tiefe als auch die Breite der Tasse erhöht und somit das Verhältnis von Tasse zu Bandscheibe erhöht. Das laminare Schröpfen basiert auf dem Bindegewebe, wobei sich das LC progressiv nach hinten bewegt und ausgräbt. Glaukomatöses Schröpfen ist eine Kombination dieser beiden Komponenten, die sowohl die Schädigung als auch den Umbau des laminaren Bindegewebes widerspiegeln. Eine Erhöhung des IOD führt zu einer LC-Verdickung aufgrund einer Zunahme der Kollagenfibrillenmasse53. Unter Verwendung des TAS-Modells haben wir ein erhöhtes TLPG erstellt, indem wir den IOD erhöht oder den ICP über verschiedene Zeitpunkte verringert haben. Wir hielten einen Bereich von erhöhtem TLPG für 7 Tage mit durchschnittlichen IOD-Werten im Laufe der Zeit bei 22,8 ± 18,6 mmHg und ICP-Mittelwert bei 6,9 ± 7,6 mmHg mit einem TLPG von 15,9 ± 11,8 mmHg aufrecht (Tabelle 2). Die höchsten TLPGs wurden bei 36 mmHg dokumentiert. Menschliche hintere Segmente wurden dann morphologisch auf fortschreitende Verdickung von laminaren Strahlen und Schröpfen am ONH in H & E-gefärbten Abschnitten analysiert, während die Zeit zwischen der Kontrolle, 1 Tag, 3 Tagen und 7 Tagen unter erhöhtem TLPG verschritt (Abbildung 5A-D). Schröpfen und Verdickung wurden nach 7 Tagen erhöhter TLPG beobachtet (Abbildung 5D). Darüber hinaus zeigte die COLIV-Expression im Laufe der Zeit zwischen der Kontrolle, 1 Tag, 3 Tagen und 7 Tagen verdickte Strahlen und eine erhöhte Expression um 7 Tage (Abbildung 5E-H). Phasenbilder, die Kontrollgewebe vergleichen, das im TAS-Modell nicht kultiviert wurde (Abbildung 5I) und 7 Tage (Abbildung 5J) erhöhter TLPG innerhalb des TAS-Modells zeigen gesunde RGCs innerhalb der GCL (Abbildung 5I) ohne Schröpfen (Abbildung 5I) für die Kontrolle, während die Bilder unter Bedingungen erhöhter TLPG-Bedingungen ein ausgedehntes Schröpfen ohne verbleibende RGCs (RBPMS-RGC-Marker) in der RNFL (Abbildung 5J) und ein erhöhtes Remodeling von ECM zeigen, wie es durch erhöhtes COLIV innerhalb des ONH (Abbildung 5J).
Abbildung 1: Translaminares autonomes System. Modelldarstellung. (A) Solide Vorderansicht. (B) Transparente Ansicht. (C) Schematische Ansicht. (D) Transparente Farbansicht. (E) Tatsächliches 3D-gedrucktes Modell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mechanik des translaminaren autonomen Systems. (A) Das TAS-Modell mit ICP- und IOP-Kammern zur Regelung translaminarer Druckdifferenzen. (B) Darstellung des TAS-Modells mit autonomer Regelung des hydrostatischen Drucks in beiden Kammern durch Erhöhung von Reservoirs. (C) Abbildung des TAS-Modells mit allen Angebrachten und Darstellung der Spritzen des Zu- und Abflussbehälters. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Unabhängige Druckerhaltung innerhalb des translaminaren autonomen Systems. Grafische Darstellung der unabhängig modulierten Drücke und der Aufrechterhaltung stabiler Drücke in den oberen (ICP) und unteren (IOP) Kammern mit (A) normalem IOD/vermindertem ICP (B) erhöhtem IOP/vermindertem ICP und (C) erhöhtem IOP/erhöhtem ICP. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Aufrechterhaltung und Lebensfähigkeit der hinteren Segmente innerhalb des translaminaren autonomen Systems. Menschliche hintere Segmente wurden mit dem TAS-Modell für 14 und 30 Tage unter normalen Bedingungen von IOP und ICP kultiviert. H&E färbte Querschnitte von menschlichem ONH nach 14 Tagen in (A) geringer Vergrößerung (40x) und (B) hoher Vergrößerung (100x). (C) COLIV-Immunfärbung mit DAPI-Expression (100x). Ähnliche Darstellungen der H&E-Färbung nach 30 Tagen in (D) 40x und (E) 100x Mikroaufnahmen und (F) COLIV Immunostaining mit DAPI Expression (100x). G) Grafische Darstellung von Δ in mmHg von IOP-ICP (TLPG) für menschliche posteriore Segmente, die 30 Tage lang in Kultur gehalten werden. COLIV = grün; DAPI = blau; (A, Einschub B); (D, Einschub E); H & E = Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Morphologische Umstrukturierung des Sehnervenkopfes nach erhöhtem translaminarem Druckgradienten im Translaminar autonomen System. Menschliche hintere Segmente wurden mit dem TAS-Modell für verschiedene Zeitpunkte unter erhöhten TLPG-Bedingungen kultiviert. Querschnitte des menschlichen ONH, die die H & E-Färbung von (A) Kontrolle (B) 1 Tag in TAS (C) 3 Tage in TAS und (D) 7 Tage Kultur darstellen. Expression von COLIV mit DAPI in der ONH von (E) Kontrolle (F) 1 Tag in TAS (G) 3 Tage in TAS und (H) 7 Tage in Kultur. Phasenkontrast ONH-Querschnittsbilder von (I) Kontroll-ONH, die (I') Netzhautfärbung von RBPMS und (I'') ONH-Färbung mit COLIV und DAPI darstellen. Phasenkontrast von (J) 7 Tagen erhöhter TLPG in TAS mit Insets, die (J') Netzhautfärbung von RBPMS und (J'') ONH-Färbung mit COLIV und DAPI darstellen. COLIV, RBPMS = grün; DAPI = blau; (A–D) 40-fache Vergrößerung; (E–H) 100-fache Vergrößerung; (I und J) 200-fache Vergrößerung; (J') 400-fache Vergrößerung; (J'') 100-fache Vergrößerung; (J, Einschub J' und J''); H & E = Hämatoxylin- und Eosin-Färbung; TAS = Translaminares Autonomes System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Tage | Mittlerer IOP von 24 h | Mittlerer ICP von 24 h | Mittlere tLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| GESCHLECHTSKRANKHEIT | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabelle 1: Aufrechterhaltung des normalen TLPG für 30 Tage. Tabellarische Werte, die IOP-, ICP- und TLPG-Werte alle 24 h mit Mittlerer und Standardabweichung über den gesamten Zeitverlauf darstellen.
| Tage | Mittlerer IOP von 24 h | Mittlerer ICP von 24 h | Mittlere tLPG von 24 h |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| GESCHLECHTSKRANKHEIT | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabelle 2: Aufrechterhaltung eines Bereichs von erhöhtem TLPG, der für 7 Tage aufrechterhalten wird. Tabellarische Werte, die IOP-, ICP- und TLPG-Werte alle 24 h mit Mittlerer und Standardabweichung über den gesamten Zeitverlauf darstellen.
Ergänzende Abbildung 1: Ex vivo humane retinale Explantatkultur. Phasenkontrast, RGC-positiv gefärbte (RBPMS-grün) und zelluläre (DAPI-blau) gefärbte Bilder von netzhautexporteten Explantaten in Kultur für (A-C) 7 Tage und (D-F) 14 Tage (200-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Menschliche erwachsene RGC-Kulturen. RGC Marker (RBPMS-grün) und DAPI (blau) gefärbte RGCs 7 Tage in Kultur (A) 200x (B) 400x Vergrößerung. (C) RGCs gefärbt für NEFL (grün) und DAPI (blau) bei 400-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Menschliches postmortales Gewebe ist eine besonders wertvolle Ressource für die Erforschung humaner neurodegenerativer Erkrankungen, da die Identifizierung potenzieller Medikamente, die in Tiermodellen entwickelt wurden, auf den Menschen übertragbar sein muss47. Die Auswirkungen der menschlichen IOD-Erhöhung sind gut belegt, aber es wurden nur minimale Untersuchungen zu abnormalen ONH-translaminaren Druckänderungen durchgeführt. Obwohl mehrere Tiermodelle und endliche Modelle des menschlichen ONH existieren, gibt es kein menschliches Ex-vivo-Modell zur Untersuchung translaminarer Druckänderungen41,54,55,56,57. Derzeit besteht ein ungedeckter Bedarf an einem neuen präklinischen Humanmodell, das die Ätiologie der Krankheit ex vivo unter Verwendung von IOP und ICP anvisieren und verschiedene pathogene Paradigmen im Zusammenhang mit der Glaukompathogenese identifizieren kann. Das Verständnis druckbedingter pathologischer Veränderungen am ONH wird entscheidend sein, um den Tod von RGC zu verhindern. Die kombinierte Verwendung von IOP, ICP und TLPG innerhalb des TAS-Modells ist ein einzigartiger Ansatz, um druckabhängige Degeneration präklinisch unter Verwendung von menschlichem hinterem Segmentgewebe zu untersuchen. Im TAS-Modell können wir posteriore Segmente menschlicher Augenmuscheln kultivieren, um Veränderungen des translaminaren Drucks durch autonome Regulierung der IOP- und ICP-Kammern zu untersuchen. Es bietet eine Grundlage für die Entwicklung einer neuen Reihe von Therapeutika, die sich auf den translaminaren Druck als Mechanismus der Degeneration konzentrieren.
Die Einrichtung des TAS-Modells erfordert in vielerlei Hinsicht Liebe zum Detail: die korrekte Sezierung der menschlichen hinteren Segmente, die Sicherstellung, dass die Netzhaut intakt und über den hinteren Becher verteilt ist, die richtige Platzierung des Segments über der Kuppel der IOP-Kammer, die genaue Platzierung der ICP-Kammer über dem ON, die effektive Abdichtung beider Kammern, und Aufrechterhaltung der hydrostatischen Drücke unabhängig voneinander durch Regulierung der Höhe von IOP- und ICP-Reservoirs. Die Dissektion muss in Augen durchgeführt werden, die nicht länger als 24-36 h postmortal sind, da sich die Netzhaut progressiv verschlechtert, wenn das wirksame Kulturmedium nicht aufgefüllt wird. Die systemische Auffüllung des Mediums wurde in unserem System alle 48–72 h durchgeführt. Ein weiterer entscheidender Aspekt des Systems ist die Länge des ON. Es ist wichtig sicherzustellen, dass mindestens 0,5–1 cm ON auf dem Leichenauge verbleiben. Spenderaugen sollten nicht verwendet werden, wenn sie kurze ONs haben, der ON beschädigt ist, der Globus kompromittiert und entleert ist oder die ON-Hülle abgelöst ist. Wenn Sie das hintere Segment über der Kuppel platzieren, muss der O-Ring fest sitzen und die obere ICP-Kammer korrekt mit Schrauben abgedichtet sein. Die Stecknadelbeschläge, an denen der Schlauch auf jeder Seite der oberen und unteren Basis des Modells befestigt wird, müssen ebenfalls getestet werden, um sicherzustellen, dass der Schlauch passt und einrastet. Wenn der Schlauch nicht richtig an Seinem Platz ist, werden Luftblasen innerhalb des Schlauches beobachtet und beeinträchtigen die Druckmessungen in jeder Kammer.
Die Wartung und Lebensfähigkeit der postmortalen hinteren Segmente in unserem TAS-Modell war ein kritisches Anliegen für dieses Protokoll. Menschliches postmortales Gewebe wurde zuvor umfassend untersucht48,49, wobei eine kürzlich durchgeführte RNA-Analysestudie mit 1.068 postmortalen Spendergeweben bestätigte, dass postmortales menschliches Hirngewebe, das über Jahrzehnte gesammelt wurde, als hochwertiges Material für die Untersuchung menschlicher Störungen dienen kann47. Darüber hinaus wurde zuvor eine erfolgreiche Expressionsprofilierung von augenärztlichem menschlichem Spenderaugengewebe nach der Obduktion durchgeführt58. Genexpressions-PLIER-Werte für Apoptose-Gene waren in diesem Datensatz für Netzhautgewebe 6 h postmortem58 minimal oder nicht vorhanden. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine hypotherme Lagerung von Augengewebe effektiv durchgeführt werden kann59. Es hat sich gezeigt, dass die Ganglienzellaktivität für 50 h aufrechterhalten wird, wenn Minipig-Augen unter ischämischen und hypothermen Bedingungen gelagert werden41,60. Daher haben wir den 6-Stunden-Zeitpunkt als Einschlusskriterium für die Spender-Augenmuschel-Entnahme verwendet. Die Geschwindigkeit der postmortalen Verschlechterung der hinteren Segmente und der Netzhautablösung fehlt in der Literatur, aber unsere Enukleation innerhalb von 6 h, die Abgabe über Eis und der Kulturaufbau von maximal 36 h liegen deutlich im Bereich der Gewebelebensfähigkeit, wie in Supplemental Figure 1 und Supplemental Figure 2 dargestellt. Mit dem TAS-Modell gelang es uns, 30 Tage lang eine gesunde Erhaltung des Gewebes zu erreichen.
Eine weitere Einschränkung des TAS-Modells ist unsere derzeitige Unfähigkeit, die zyklischen circadianen Rhythmen von ICP und IOP zu modellieren, die unter normalen physiologischen Bedingungen beobachtet werden. Dies kann in Zukunft durch die Verwendung einer Pumpe angegangen werden, die die rhythmische IOD- und ICP-Infusion regulieren kann. Ein weiterer Vorbehalt des Modells ist die mangelnde Durchblutung des Leichenauges. Somit können die Auswirkungen des Blutdrucks nicht untersucht werden, aber dies ermöglicht es uns auch, die pathogenen Auswirkungen von nur TLPG-Veränderungen, einschließlich IOP und ICP, spezifisch abzugrenzen.
Ein zukünftiger Umfang des Modells würde die Automatisierung der Reservoirsysteme für hydrostatische Änderungen und die Perfusion des Mediums durch eine Infusionspumpe mit einer austrittsleeren Spritze auf dem Wandler anstelle der mehreren Runden des Mediumwechsels, die in diesem Protokoll implementiert wurden, umfassen. Die Flüssigkeit aus dem IOP- und ICP-Reservoir konnte ebenfalls gesammelt und analysiert werden. Medium kann für die Biomarkerexpression gesammelt werden, um zukünftige Therapien anzusprechen. Wir können auch Signalwege oder Moleküle identifizieren, die mit Medikamenten oder Gentherapie behandelt werden können, und diese Therapien in verschiedenen Tiermodellen von ICP testen, bevor sie in klinische Studien am Menschen überführt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Modell nicht nur eine menschliche Testbasis bietet, sondern auch zur Validierung von Therapien verwendet werden kann, die auf translaminare Druckänderungen im Auge abzielen können. Es eröffnet einen Weg, Präzisionsmedizin durch Transplantation von Patientenstammzellen auf menschliche Spenderaugenmuscheln durchzuführen und sie im TAS-Modell unter Druck zu setzen. Dies ermöglicht es uns, Therapien ex vivo zu testen, die in der Lage sind, auf die Klinik übertragbar und auf lebende Individuen zurückzuführen. Mit unserem Modell können wir nun die Veränderungen des translaminaren Drucks beurteilen und wie er eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielt, die mit verschiedenen traumatischen und neurodegenerativen Erkrankungen einhergeht. Dies wird zu einem besseren Verständnis pathogener molekularer Mechanismen im ONH führen, die mit IOP und ICP assoziiert sind.
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Disclosures
Die Autoren des Manuskripts haben keine potenziellen Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Finanzierung dieses Projekts erfolgte durch Ermessensfonds von Dr. Colleen M. McDowell. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, Inc. an das UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences unterstützt. Wir danken Drs. Abt F. Clark und Weiming Mao für ihre technische Unterstützung mit dem Perfusionsorgankulturmodell. Wir danken dem Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) für die Bereitstellung der menschlichen Spenderaugen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
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