Summary
Vi beskriver og beskriver brugen af det translaminar autonome system. Dette system udnytter det menneskelige bageste segment til selvstændigt at regulere trykket inde i segmentet (intraokulær) og omkring synsnerven (intrakraniel) til at generere en translaminar trykgradient, der efterligner træk ved glaukomet optisk neuropati.
Abstract
Der er et aktuelt uopfyldt behov for en ny præklinisk human model, der kan målrette sygdom ætiologi ex vivo ved hjælp af intrakranielt tryk (ICP) og intraokulært tryk (IOP), som kan identificere forskellige patogene paradigmer relateret til grøn stær patogenese. Ex vivo menneskelige forreste segment perfusion organ kultur modeller er tidligere blevet udnyttet og anvendt som effektive teknologier til opdagelsen af grøn stær patogenese og test af therapeutics. Præklinisk lægemiddelscreening og forskning udført på ex vivo menneskelige organsystemer kan mere oversættes til klinisk forskning. Denne artikel beskriver i detaljer dannelsen og driften af en ny ex vivo human translaminar trykmodel kaldet translaminar autonome system (TAS). TAS-modellen kan uafhængigt regulere ICP og IOP ved hjælp af menneskelige donor posterior segmenter. Modellen giver mulighed for at studere patogenese på en præklinisk måde. Det kan reducere brugen af levende dyr i oftalmologisk forskning. I modsætning til in vitro eksperimentelle modeller kan synsnervehoved (ONH) vævsstruktur, kompleksitet og integritet også opretholdes inden for ex vivo TAS-modellen.
Introduction
Globale skøn i de seneste undersøgelser tyder på, at 285 millioner mennesker lever med synshandicap, herunder 39 millioner, der er blinde1. I 2010 dokumenterede Verdenssundhedsorganisationen, at tre af de ni anførte førende årsager til blindhed forekommer i det bageste segment af øjet1. Posterior segment øjensygdomme involverer nethinden, choroid, og synsnerven2. Nethinden og synsnerven er centralnervesystemet (CNS) udvidelser af hjernen. Den retinale ganglion celle (RGC) axoner er sårbare over for skader, fordi de forlader øjet gennem synsnerven hovedet (ONH) til at danne synsnerven3. ONH er fortsat det mest sårbare punkt for RGC axons på grund af 3D meshwork af bindevævsbjælker kaldet lamina cribrosa (LC)4. ONH er det første sted for fornærmelse mod RGC axoner i glaukom5,6,7, og genekspression ændringer i ONH er blevet undersøgt i okulær hypertension og grøn stær modeller8,9,10. RGC-axonerne er modtagelige på ONH på grund af trykforskelle mellem det intraokulære rum, kaldet intraokulært tryk (IOP), og inden for det ydre peroptiske subarabiske rum, kaldet intrakranielt tryk (ICP)11. LC-regionen adskiller begge områder og opretholder normale trykforskelle med IOP fra 10-21 mmHg og ICP fra 5-15 mmHg12. Trykforskellen gennem laminaen mellem de to kamre kaldes translaminartrykgradienten (TLPG)13. En væsentlig risikofaktor for grøn stær er forhøjet IOP14.
Øget IOP øger belastningen i og på tværs af laminarregionen6,15,16. Eksperimentelle observationer hos mennesker og dyremodeller præsenterer ONH som det oprindelige sted for axonal skade17,18. Det biomekaniske paradigme for IOP-relateret stress og stamme, der forårsager grøn stær skade på ONH, påvirker også glauologien af grøn stær19,20,21. Selv om der hos mennesker tryk-induceret ændringer mekanisk skade RGC axons22, gnavere mangler kollagen plader i lamina kan også udvikle grøn stær7,23. Derudover er forhøjet IOP fortsat den mest fremtrædende risikofaktor hos primære åbne glaukompatienter, mens patienter med normal spændings glaukom udvikler glaukomisk optisk neuropati selv uden forhøjet IOP. Desuden er der også en delmængde af okulær hypertensive patienter, der viser ingen synsnerveskader. Det er også blevet foreslået, at cerebrospinalvæsketryk (CSFp) kan spille en rolle i glaukompatogenese. Beviser tyder på, at ICP sænkes til ~ 5 mmHg hos glaukompatienter sammenlignet med normale individer, hvilket forårsager øget translaminartryk og spiller en afgørende rolle i sygdom24,25. Tidligere blev det påvist i en hundemodel, at ved at kontrollere IOP- og CSFp-ændringer kan der være store forskydninger af den optiske disk26. Opløftende CSFp i porcine øjne har også vist øget hovedbelastning inden for LC-regionen og retrolaminar neurale væv. Øget belastning af de RGC'er og LC-regionen bidrager til axonal transport blokering og tab af RGCs27. Progressiv degeneration af RGCs har været forbundet med tab af trofisk støtte28,29, stimulering af inflammatoriske processer / immunregulering30,31, og apoptotiske effektorer29,32,33,34,35. Derudover forårsager axonal skade (figur 3) skadelige virkninger på RGCs, hvilket udløser regenerativ fiasko36,37,38,39. Selv om virkningerne af IOP er blevet godt undersøgt, minimal forskning er blevet udført på unormale translaminar trykændringer. De fleste behandlinger for grøn stær fokuserer på at stabilisere IOP. Men selv om sænkning af IOP bremser udviklingen af sygdommen, det ikke vende synsfelt tab og forhindre fuldstændig tab af RGCs. Forståelse tryk-relaterede neurodegenerative ændringer i grøn stær vil være afgørende for at forhindre RGC død.
Nuværende beviser tyder på, at translaminar trykmodulationer på grund af forskellige mekaniske, biologiske eller fysiologiske ændringer hos patienter, der lider af traumatiske eller neurodegenerative synshandicap kan forårsage betydelige synstab. I øjeblikket findes der ingen ægte præklinisk human posterior segmentmodel, der kan tillade undersøgelse af glaukomet biomekanisk skade inden for den ex vivo menneskelige ONH. Observation og behandling af det bageste segment af øjet er en enorm udfordring i oftalmologi27. Der er fysiske og biologiske barrierer for at målrette det bageste øje, herunder høje elimineringshastigheder, blod retinal barriere og potentielle immunologiske reaktioner40. De fleste effekt- og sikkerhedstest for nye lægemiddelmål udføres ved hjælp af in vitro cellulære og in vivo dyremodeller41. Okulær anatomi er kompleks, og in vitro-undersøgelser efterligner ikke nøjagtigt de anatomiske og fysiologiske barrierer, der præsenteres af vævsmodelsystemer. Selv om dyremodeller er en nødvendighed for farmakokinetiske undersøgelser, okulær fysiologi af det menneskelige bageste øje kan variere mellem forskellige dyrearter, herunder cellulære anatomi af nethinden, vaskulatur, og ONH41,42.
Brugen af levende dyr kræver intensive og detaljerede etiske regler, et stort økonomisk engagement og effektiv reproducerbarhed43. For nylig har der fulgt flere andre retningslinjer for etisk brug af dyr i eksperimentel forskning44,45,46. Et alternativ til dyreforsøg er brugen af ex vivo menneskelige øjenmodeller til at undersøge sygdomspatogenese og potentiel analyse af lægemidler til beskyttelse af ONH-skader. Human postmortem væv er en værdifuld ressource til at studere menneskelige sygdom paradigmer, især i tilfælde af menneskelige neurodegenerative sygdomme, fordi identifikation af potentielle lægemidler udviklet i dyremodeller kræver behovet for at kunne oversættes til mennesker47. Ex vivo humane donorvæv er blevet flittigt udnyttet til undersøgelse af menneskelige lidelser47,48,49, og menneskelige forreste segment perfusion organkultur systemer har tidligere givet en unik ex vivo model til at studere patofysiologi af forhøjet IOP50,51,52.
For at studere translaminartryk relateret til IOP og ICP i menneskelige øjne designede og udviklede vi med succes et tokammertranslaminar autonomt system (TAS), der uafhængigt kan regulere IOP og ICP ved hjælp af posterior segmenter fra menneskelige donorøjne. Det er den første ex vivo menneskelige model til at studere translaminar tryk og udnytte de biomekaniske virkninger af TLPG på ONH.
Denne ex vivo menneskelige TAS model kan bruges til at opdage og klassificere cellulære og funktionelle ændringer, der opstår på grund af kronisk højde af IOP eller ICP. I denne rapport beskriver vi den trinvise protokol for dissekering, opsætning og overvågning af TAS-segmentmodellen for menneskelige posterior. Protokollen vil gøre det muligt for andre forskere effektivt at reproducere denne nye ex vivo tryk humane posterior segment model til at studere biomekaniske sygdom patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev opnået øjne i henhold til bestemmelserne i Helsinki-erklæringen til forskning i humant væv.
BEMÆRK: Øjne fra velrenommerede øjenbanker (f.eks Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) blev høstet inden for 6-12 timer af død og donor serum blev testet for hepatitis B, hepatitis C, og human immundefekt virus 1 og 2. Når de blev modtaget, blev øjnene dissekeret og sat op i TAS-modellen inden for 24 timer. Udelukkelseskriterierne omfattede enhver okulær patologi. Øjne blev ikke udelukket baseret på alder, race eller køn. For at sikre nethindens levedygtighed ved modtagelsen blev retinale explants høstet fra vævsdonorerne og dyrket i 7 og 14 dage (supplerende figur 1). Disse nethinder blev også adskilt og voksede sunde RGCs i kultur i 7 dage med positiv farvning til RGC-markør, RNA-bindende protein med flere splejsning (RBPMS) samt positiv neurofilament lyskæde (NEFL) farvning i deres neurofilamenter (supplerende figur 2). .
1. Forberedelse og sterilisering af udstyr og forsyninger
- Se materialetabellen for at få en komplet liste over de nødvendige forsyninger samt leverandør- og katalognumre.
- Før brug steriliseres alt udstyr og instrumenter ved autoklavering eller ved hjælp af ethylenoxid ampule.
2. Fremstilling af perfusion medium
- Tilsæt 1% penicillin streptomycin (10.000 U/mL penicillin, 10.000 μg/mL streptomycin i 0,85% NaCl) og 1% L-glutamin (200 mM) til 1.000 mL høj glukose Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM).
- Sterilisere perfusionsmediet ved at passere gennem et 0,22 μm filter.
3. Opsætning af translaminar autonome system (TAS)
- Konfigurer indløbssprøjter (IOP- og ICP-reservoirer).
- Der tilsættes 30 mL af perfusionsmediet (afsnit 2) til en 30 mL sprøjte. Fastgør en 3-vejs stophane til 30 mL sprøjten. Fastgør et 0,22 μm hydrofilt filter til den 3-vejs stophane. Fastgør en 15 G Luer stubadapter på 0,22 μm hydrofilfilteret.
- Fjern luftbobler fra sprøjteopsætningen. Fastgør slangen til 15 G Luer stubadapteren. Luk stophanens sideport med en uudfundet universel låsehætte. Gentag for i alt to opsætninger.
- Mærk den ene sprøjte som kanal 1 intrakranielt tryk (CH1 ICP) og den anden sprøjte som kanal 2 intraokulært tryk (CH2 IOP).
- Konfigurer udstrømningssprøjter (IOP- og ICP-reservoirer).
- Fastgør en 3-vejs stophane til en 30 mL sprøjte. Fastgør en 15 G Luer stub adapter til 3-vejs stophane. Fastgør slangen til 15 G Luer stubadapteren.
- Luk stophanens sideport med en uudfundet universel låsehætte. Gentag for i alt to opsætninger. Mærk den ene sprøjte som CH1 ICP og den anden sprøjte som CH2 IOP.
4. Forberedelse af hele menneskesigtet globus
BEMÆRK: Hvis hele øjne modtages, skal du følge nedenstående procedure for at adskille det forreste segment fra det bageste segment af øjet. Hvis øjnene modtages delt, skal du starte ved trin 4.4.
- Placer et helt øje i povidone-jodopløsning i 2 min.
- Skyl øjet i steril fosfat buffered opløsning (PBS) for at skylle povidone-jod. Gentag 2 gange.
- Fjern adnexa fra hele øjet kloden ved hjælp af sammentak og saks. Halvskær øjet ved ækvator for at adskille de forreste og bageste segmenter af øjet.
- Fjern synsnerven kappe. Fjern glaslegemet fra det bageste segment.
- Trim yderligere sclera fra posterior segment, hvis det er nødvendigt, for at sikre en god pasform på den runde kuppel af IOP (nederst) kammer. Brug sammentak, sikre, at nethinden er spredt jævnt over den bageste del af segmentet.
- Opsætning af IOP-kammer (nederst)
- Placer det menneskelige bageste segment i TAS'ens IOP-kammer (nederst) over den runde kuppel med synsnerven mod toppen.
- Forsegl det bageste segment ved hjælp af epoxyharpiks O-ringen med fire skruer, hvilket sikrer en tæt forsegling.
- Sæt slangen ind i ind- og ud-portene i IOP-kammeret (nederst). IOP-indløbssprøjten med slange, der indeholder medium, indsættes i IN-porten, og den tomme IOP-udstrømningssprøjte med slange indsættes i OUT-porten.
- Brug push/pull-metoden til langsomt at indgyde perfusionsmediet ind i indstrømningsporten for at fylde den bageste øjenkop, samtidig med at perfusionsmediet langsomt trækkes ud gennem udstrømningssprøjten for at fjerne eventuelle luftbobler fra linjerne. Stop infusing medium, når både IN og OUT rør er ugyldige af luftbobler.
- Lås stophanerne i off position. Fjern 30 mL sprøjten fra IOP IN-portfiltersamlingen, og genopfyld med i alt 30 mL medium. Sæt 30 mL sprøjten på filtersamlingen.
-
Opsætning af ICP-kammer (øverst)
- Placer ICP-kammeret (top) over bagsiden af det bageste segment. Sørg for, at synsnerven er inden for det øverste kammer. Forsegl det øverste kammer med fire skruer.
- Sæt slangen i ind- og ud-portene i ICP-kammeret (top). ICP-indløbssprøjten med slange, der indeholder medium, indsættes i IN-porten, og den tomme ICP-udstrømningssprøjte med slange indsættes i OUT-porten.
- Indgyde forsigtigt og langsomt mediet ind i IN-porten for at fylde ICP-kammeret og fjerne luftbobler fra linjerne ved hjælp af tryk-/trækmetoden. Stop infusing medium, når ICP-kammeret samt både IN og OUT slangen er ugyldige af luftbobler.
- Lås stophanerne i off position. Fjern 30 ML-sprøjten fra ICP'et i portfiltersamlingen, og genopfyld med i alt 30 mL medium. Sæt 30 mL sprøjten på filtersamlingen.
5. Opsætning af dataregistreringssystem
BEMÆRK: Dataregistreringssystemet består af en 8-kanals strømkilde, multikanalbroforstærker, hydrostatiske tryktransducere og en computer med dataindsamlingssoftware (se Materialetabel). I det følgende beskrives, hvordan systemet konfigureres og kalibreres.
- Tilslut netledningen på bagsiden af 8-kanals strømkilden, og tilslut den til en batteriback-enhed.
- Tilslut USB-kablet fra 8-kanals strømkilden til bagsiden af computeren.
- Tilslut 8-kanals strømkilden til multikanalbroforstærkeren ved hjælp af den medfølgende I2C-ledning.
- Tilslut Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabler i kanalen indgange foran 8-kanals strømkilde og slutningen af kablerne i de tilsvarende kanaler på bagsiden af multikanalen forstærker.
- Tilslut transducerkablerne til forsiden af multikanalforstærkeren.
- Installer dataindsamlingssoftwaren på computeren.
- Kør installationsprogrammet til installationsprogrammet til dataindsamlingssoftwaren fra den medfølgende software-cd.
- Følg vejledningen på computerskærmen.
- Når installationen er fuldført, skal du vælge Udfør.
- Tænd for strømkilden på 8 kanaler.
- Tænd computeren og start dataindsamlingssoftwaren.
- Vælg | Ny.
- Vælg | Kanalindstillinger. Vælg tre kanaler (nederst til venstre på skærmen). Omdøb kanalerne på følgende måde i kolonnen Kanaltitel : CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Vælg 2 mV for området på alle kanaler. Vælg Ingen beregning for kanal 1 og 2 i kolonnen Beregning.
- Vælg Aritmetik til kanal 3 i kolonnen Beregning. Vælg kanaler/CH2; Vælg aritmetisk "-"; Vælg kanaler/CH1. Vælg mmHg i sektionen Output. Vælg OK. Vælg OK igen.
- Opsætning og kalibrering af hydrostatiske tryktransducere.
BEMÆRK: Hydrostatiske tryktransducere skal kalibreres før forsøg ved hjælp af følgende metode.- Tilslut hydrostatiske tryktransducere til transducer linjer knyttet til multikanalen bro forstærker.
- Fastgør en 30 mL sprøjte fyldt med luft til sideporten på CH1 (ICP) tryktransducer. Fastgør sphygmomanometeret til bunden af CH1 (ICP) tryktransducer.
- Se siden i dataindsamlingssoftwaren i diagrammet, angiv prøveudtagningshastigheden ved at venstre klikke på pilen ud for prøvetagningstiden, og vælg 100. Højreklik derefter i området CH1 (ICP) på siden.
- Vælg Broforstærker. Vælg Netfilter. Vælg Nul og vent på, at systemet nulstilles, og pas på ikke at flytte tryktransduceren.
- Klem de hvide faner af tryktransduceren og skub luften gennem transduceren, indtil der opnås 40 mmHg på sphygmomanometeret. Slip de hvide faner og fjern sprøjten og sphygmomanometeret.
- Vælg 'minus (-)' -tegn på siden Enhedskonvertering. Fremhæv det højeste plateau for at angive 40 mmHg. Klik på pilen for punkt 1, og skriv 40.
- Fremhæv det laveste plateau for at angive 0 mmHg. Klik på pilen for punkt 2, og skriv 0. Vælg mmHg til enhederne. Vælg OK.
- Vælg OK (siden Broforstærker). Gentag trin 9.1-9.7 for CH2 (IOP) ved hjælp af 100 mmHg for det højeste plateau og 0 for det laveste plateau.
- Tilslut TAS/posterior-segmentenheden til dataindsamlingssystemet.
- Anbring TAS/posteriorsegmentenheden i en inkubator (37 °C, 5 % CO2). Fastgør ICP-slangen fra OUT-porten til CH1-tryktransduceren.
- Fastgør IOP-slangen fra OUT-porten til CH2-tryktransduceren.
- Sæt sprøjteopsætningerne (ICP og IOP) på med medium fra IN-portene til ringstativet.
- Vælg Start prøveudtagning på siden Diagramvisning. Indstil prøveudtagningshastigheden ved at venstre klikke på pilen ud for prøveudtagningstiden, og vælg Langsom og 1 min.
- Juster sprøjterne på ringstativet op eller ned for at regulere ICP- og IOP-trykket til protokolkravene.
- Udfør systemisk genopfyldning af medium i systemet hver 48-72 timer gennem push and pull-metoden.
6. Datahentning og -analyse
- Åbn datafilen i dataindsamlingssoftwaren.
- Klik på ikonet Tilføj til Data pad i sektionen Data pad. Der vises et nyt vindue.
- Vælg Tid i rullemenuen i sektionen Søg efter brug.
- Vælg 1 time hver time i rullemenuerne i sektionen Vælg.
- Vælg Hele filen i sektionen Gennem gennem, og klik derefter på Tilføj.
- Klik på ikonet Data padvisning i sektionen Data pad. Marker alle data, og kopier/indsæt i et regneark.
- Beregn middel- og standardafvigelserne for IOP, ICP og TLPG for hver 24 timer. Sortere dataene ved hjælp af pivottabelindstillingen i et regnearksprogram og en graf.
7. Immunohistochemistry og hæmatoxylin og eosin farvning af posterior segmenter
- Fjern de bageste øjensegmenter efter forskellige tidspunkter fra TAS-modellen, og fastgør i formalin før paraffinering.
- Afsnit øjnene til at producere sagittal væv fly.
- Deparaffinisere paraffin-indlejrede segmenter med en 100% xylen, 95% ethanol, 50% ethanolopløsning.
- Vask rutsjebanerne med PBS i 10 min og bloker med en blokerende buffer ved stuetemperatur i 1 time.
- Etiketafsnit med primære antistoffer: anti-kollagen IV (Extracellular Matrix (ECM) markør, NB120-6586, 1:100) og anti-laminin (ECM-markør, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC-markør), GTX118619, 1:50).
- Detekter de primære antistoffer ved hjælp af Alexa Fluor sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 ged anti-kanin, A11008, 1:500).
- Counterstain cellen kerner ved hjælp af DAPI anti-fade løsning.
- Fang billeder af de farvede sektioner og fasebilleder med 4x og 10x objektive linser ved hjælp af et fluorescensmikroskop (se Materialetabel).
- For farvning af hæmatoxylin og eosin (H&E) skal sektionerne i et automatiseret farvningssystem (se Materialetabel) til deparaffinisering ved hjælp af en 100%, xylen 95% ethanol, 50% ethanolopløsning og plet med H&E.
- Tag billeder med 4x og 10x objektive linser ved hjælp af et mikroskop med en lys felt lyskilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design og oprettelse af det autonome translaminar-system
Translaminar trykforskel er en potentiel nøglemekanisme i patogenesen af forskellige sygdomme, herunder grøn stær. Anvendelser for den beskrevne model omfatter, men er ikke begrænset til, studiet af grøn stær (forhøjet IOP, måske nedsat ICP), traumatisk hjerneskade (forhøjet ICP) og langvarig eksponering for mikrogravitet-associeret synshandicap (forhøjet ICP, forhøjet IOP). For at hjælpe med at opdage molekylær patogenese rettet mod translaminartryk i det menneskelige øje designede, skabte og validerede vi TAS-modellen. Vores nye ex vivo menneskelige model giver et unikt præklinisk system til selvstændigt at studere ICP og IOP-associerede patogene ændringer. For at imødekomme menneskelige prækliniske anvendelser giver vores model et ex vivo paradigme for at studere patogenese på grund af translaminar trykændringer. Det forseglede modeldesign er afbildet med solide front- og gennemsigtige visninger (figur 1A, 1B) med en detaljeret diagrammatisk visning af modellen for at skildre alle ind- og udstrømningsporte (Figur 1C). Den farvegennemsigtige visning med et menneskeligt posteriorsegment i en faktisk 3D-printet model vises (Figur 1D, 1E).
Translaminar autonome system: en ny ex vivo menneskelige translaminar tryk model
Vi genererede TAS-modellen med to autonome kamre (dvs. IOP- og ICP-kamre). I den nederste del af modellen blev den menneskelige bageste kop placeret over toppen af den runde kuppel med synsnerven mod toppen. Når den bageste kop blev placeret og forseglet i IOP kammer, vi placerede ICP kammer på toppen af nerven. Vi opretholdt uafhængigheden af begge kamre og en perfekt forsegling ved hjælp af O-ringe, der passer til hvert kammer præcist (figur 2A). Det nederste kammer eller IOP-kammeret fyldte og regulerede trykket i koppen, mens det øverste kammer passer rundt om synsnerven og regulerede ICP'et omkring nerven gennem hydrostatiske trykbeholdere. Ved hjælp af modellen regulerede vi uafhængigt IOP og ICP ved hjælp af hydrostatisk tryk. Forskellen mellem de to kamre blev identificeret som en ændring i translaminartrykgradienten (figur 2B). Modellen, der er afbildet med alle endelige beslag på plads, herunder de tilsluttede ind- og udstrømningsbeholdersprøjter, er vist i figur 2C.
Succesfuld kultur- og trykvedligeholdelse i det translaminar autonome system
For at sikre, at begge kamre arbejdede uafhængigt i systemet, regulerede vi flere trykforskelle ved at holde IOP-kammeret og ICP ved forskellige gennemsnitlige trykforskelle (normal TLPG: IOP: ICP, 15:5 mmHg; forhøjet TLPG >10 mmHg; forhøjet TLPG >20 mmHg). Vi testede oprindeligt vedligeholdelsen af gennemsnitlige normale trykforskelle i begge kamre (normal IOP/ICP) gennem forskellige parametre for IOP- og ICP-forhold: 1) normal IOP: nedsat ICP (figur 3A); 2) forhøjet IOP: nedsat ICP (figur 3B); og 3) forhøjet IOP: forhøjet ICP (Figur 3C). Den gennemsnitlige normale IOP varierer fra 10-21 mmHg (episcleral venøs tryk indregnet) og normal ICP fra 5-15 mmHg. I stedet for begrænsningen af ikke at have vaskulært tryk opretholdt vi stadig presset på disse satser, da ideen var at udøve det maksimale pres på ONH. Vi regulerede uafhængigt forskellige trykniveauer i begge kamre (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20-40 mmHg). For at sikre trykvedligeholdelse mellem begge kamre holdt vi IOP under normale forhold (15 mmHg) og nedsat ICP (4 mmHg) for at opretholde en TLPG (IOP-ICP) mellem LC på 11 mmHg (Figur 3A). Vi løftede derefter IOP (43 mmHg) og reducerede ICP (3 mmHg) (Figur 3B) og til sidst forhøjede tryk i begge (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) til at generere det største niveau af TLPG ved 55 mmHg (Figur 3C). For at sikre vævets levedygtighed (figur 4) blev mediet i vævene udskiftet hver 48. time ved at fastgøre en tom sprøjte til udstrømningsstophanen og langsomt skubbe ca. 5 mL perfusionsmedium gennem indstrømningsporten ved hjælp af push/pull-metoden. Minimale trykstigninger fandt sted på tidspunktet for medium udveksling (figur 4G) og påvirkede ikke ONH's morfologi som vist i de 14- og 30-dages immunohistokemidata (figur 4A-F). For at bekræfte, at vi kunne dyrke posterior segmenter for længere tidsrammer med effektiv levedygtighed inden for TAS-modellen, analyserede vi tværsnit af ONH efter vedligeholdelse af normal IOP og ICP i 14 og 30 dage. Vi var i stand til at kulturen disse segmenter i modellen i 14 dage (Figur 4A, 4B) med sunde ONH-celler og ekstracellulært matrix udtryk for kollagen IV (COLIV) ved synsnerven hoved (Figur 4C). Lignende levedygtighed og vedligeholdelse af det bageste segment blev også observeret i 30 dage (figur 4D, 4E) med udtryk for COLIV og DAPI (figur 4F). Den grafiske repræsentation af TLPG-værdier (IOP-ICP) (figur 4G) viser en konstant vedligeholdelse af IOP-værdier over tid ved 15,6 ± 4,6 mmHg og ICP betyder ved 11,0 ± 4,6 mmHg i 30 dage med en TLPG på 4,6 ± 1,3 mmHg (tabel 1).
Morfologiske ændringer i ONH post forhøjet translaminar trykgradient
Et fælles klinisk træk ved den aldersrelaterede neurodegenerative sygdom glaukom er ONH cupping. Prelaminar cupping er kendetegnet ved progressiv tab af prælaminar neurale væv, hvilket øger både dybden og bredden af koppen og dermed øger kop-til-disk forholdet. Laminar cupping er bindevæv-baseret, med LC bevæger sig posteriorly gradvist og udgravning. Glaukomisk cupping er en kombination af disse to komponenter, der afspejler både skader og remodeling af laminar bindevæv. Elevation i IOP fører til LC fortykkelse på grund af en stigning i kollagen fibril masse53. Ved hjælp af TAS-modellen skabte vi en forhøjet TLPG ved at øge IOP eller reducere ICP over forskellige tidspunkter. Vi opretholdt en række forhøjede TLPG i 7 dage med gennemsnitlige IOP-værdier over tid ved 22,8 ± 18,6 mmHg og ICP gennemsnit ved 6,9 ± 7,6 mmHg med en TLPG på 15,9 ± 11,8 mmHg (tabel 2). De højeste TLPG'er blev dokumenteret ved 36 mmHg. Menneskelige posterior segmenter blev derefter analyseret morfologisk for progressiv fortykkelse af laminar bjælker og cupping på ONH i H &E farvede sektioner som tiden skred frem mellem kontrol, 1 dag, 3 dage, og 7 dage under forhøjet TLPG (Figur 5A-D). Cupping og fortykkelse blev observeret ved 7 dage med forhøjet TLPG (figur 5D). Desuden viste COLIV-udtryk over tid mellem kontrol, 1 dag, 3 dage og 7 dage fortykkede bjælker og øget udtryk med 7 dage (Figur 5E-H). Fasebilleder, der sammenligner kontrolvæv, der ikke er kultiveret i TAS-modellen (figur 5I) og 7 dage (figur 5J) af forhøjet TLPG inden for TAS-modellen, viser sunde RGCs inden for GCL (figur 5I) uden cupping (figur 5I) til kontrol, mens billederne under forhold med forhøjet TLPG viser omfattende cupping uden resterende RGCs (RBPMS-RGC-markør) i RNFL (figur 5J) og øget ombygning af ECM som vist ved forhøjet COLIV inden for ONH (figur 5J).
Figur 1: Translaminar autonomt system. Model skildring. (A) Solid frontvisning. (B) Gennemsigtig visning. (C) Diagrammatisk visning. (D) Farvegennemsigtig visning. (E) Faktisk 3D-printet model. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mekanik i det autonome translaminarsystem. A) TAS-modellen med ICP- og IOP-kamre til regulering af trykforskelle med translaminar. (B) Skildring af TAS-modellen med autonom regulering af hydrostatisk tryk i begge kamre gennem højde af reservoirer. (C) Billede af TAS-modellen med alle beslag på plads og repræsentation af ind- og udstrømningsbeholdersprøjterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Uafhængig trykvedligeholdelse i det translaminar autonome system. Grafisk repræsentation af tryk, der moduleres uafhængigt, og stabilt tryk opretholdes i topkamrene (ICP) og bunden (IOP) med (A) normalt IOP/nedsat ICP (B) forhøjet IOP/nedsat ICP og (C) forhøjet IOP/forhøjet ICP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Vedligeholdelse og levedygtighed af posteriorsegmenter i det autonome translaminarsystem. Menneskelige posterior segmenter blev kultiveret ved hjælp af TAS-modellen i 14 og 30 dage under normale forhold i IOP og ICP. H&E farvede tværsnit af human ONH efter 14 dage i (A) lav forstørrelse (40x) og (B) høj forstørrelse (100x). (C) COLIV immunstaining med DAPI-udtryk (100x). Lignende skildringer af H&E farvning ved 30 dage i (D) 40x og (E) 100x mikrografer og (F) COLIV immunstaining med DAPI udtryk (100x). G) Grafisk præsentation af Δ i mmHg af IOP-ICP (TLPG) for menneskelige posterior segmenter vedligeholdes i 30 dage i kultur. COLIV = grøn; DAPI = blå; (A, indsat B) D, indsat E) H&E = hæmatoxylin og eosin plet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Morfologisk omstrukturering af synsnervehovedet efter forhøjet translaminartrykgradient i det autonome translaminarsystem. Menneskelige posterior segmenter blev kultiveret ved hjælp af TAS-modellen i forskellige tidspunkter under forhøjede TLPG-forhold. Tværsnit af human ONH, der skildrer H&E farvning af (A) kontrol (B) 1 dag i TAS (C) 3 dage i TAS og (D) 7 dages kultur. Udtryk for COLIV med DAPI i ONH af (E) kontrol (F) 1 dag i TAS (G) 3 dage i TAS, og (H) 7 dage i kultur. Fase kontrast ONH tværsnit billeder af (I) kontrol ONH skildrer (I') nethinden farvning af RBPMS og (I'') ONH farvning med COLIV og DAPI. Fasekontrast af (J) 7 dages forhøjet TLPG i TAS med insets, der skildrer (J') nethindefarvning af RBPMS og (J'') ONH-farvning med COLIV og DAPI. COLIV, RBPMS = grøn; DAPI = blå; (A-D) 40x forstørrelse; (E-H) 100x Forstørrelse; (I og J) 200x forstørrelse; J') 400x forstørrelse (J'') 100x forstørrelse; (J, indsat J' og J'') H&E = hæmatoxylin og eosin plet; TAS = Translaminar Autonomt system. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Dage | Gennemsnitlig IOP på 24 timer | Gennemsnitligt ICP på 24 timer | Gennemsnitlig TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| STD | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabel 1: Vedligeholdelse af normal TLPG opretholdes i 30 dage. Tabelværdier, der viser IOP-, ICP- og TLPG-værdier hver 24. time med gennemsnitlig og standardafvigelse over hele tiden.
| Dage | Gennemsnitlig IOP på 24 timer | Gennemsnitligt ICP på 24 timer | Gennemsnitlig TLPG på 24 timer |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| STD | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabel 2: Vedligeholdelse af en række forhøjede TLPG vedligeholdes i 7 dage. Tabelværdier, der viser IOP-, ICP- og TLPG-værdier hver 24. time med gennemsnitlig og standardafvigelse over hele tiden.
Supplerende figur 1: Ex vivo human retinal explant kultur. Fase kontrast, RGC positive farves (RBPMS-grøn), og cellulære (DAPI-blå) farvede billeder af retinale explants i kultur for (A-C) 7 dage og (D-F) 14 dage (200x forstørrelse). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Menneskelige voksne RGC kulturer. RGC-markør (RBPMS-grøn) og DAPI (blå) farvede RGCs 7 dage i kultur (A) 200x (B) 400x forstørrelse. (C) RGCs farves til NEFL (grøn) og DAPI (blå) ved 400x forstørrelse. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Human postmortem væv er en særlig værdifuld ressource til at studere menneskelige neurodegenerative sygdomme, fordi identifikation af potentielle lægemidler udviklet i dyremodeller skal oversættes til mennesker47. Virkningerne af human IOP elevation er veletablerede, men minimal forskning er blevet udført på unormale ONH translaminar trykændringer. Selv om der findes flere dyremodeller og finite modellering af human ONH, findes der ingen ex vivo human model til at studere translaminar trykændringer41,54,55,56,57. Der er et aktuelt uopfyldt behov for en ny præklinisk human model, der kan målrette sygdomsetiologi ex vivo ved hjælp af IOP og ICP og kan identificere forskellige patogene paradigmer relateret til glaukompatogenese. Forståelse af trykrelaterede patologiske ændringer på ONH vil være afgørende for at forhindre RGC-død. Den kombinerede brug af IOP, ICP og TLPG inden for TAS-modellen er en unik tilgang til at studere trykafhængig degeneration på en præklinisk måde ved hjælp af humane bageste segmentvæv. I TAS-modellen kan vi dyrke posteriorsegmenter af menneskelige øjenkopper for at studere ændringer af translaminartryk gennem autonom regulering af IOP- og ICP-kamrene. Det giver et fundament for at udvikle en ny serie af terapi, der fokuserer på translaminar pres som en mekanisme for degeneration.
Opsætning af TAS-modellen kræver opmærksomhed på detaljer i mange aspekter: korrekt dissektion af de menneskelige posterior segmenter, sikre, at nethinden er i intakt og spredt over den bageste kop, korrekt placering af segmentet over kuplen i IOP kammer, præcist placere ICP kammer over ON, effektiv forsegling af begge kamre, vedligeholdelse af hydrostatiske tryk uafhængigt ved at regulere højden af IOP- og ICP-reservoirer. Dissektion skal udføres i øjne, der ikke er mere end 24-36 h postmortem, fordi nethinden gradvist forringes, hvis effektiv kultur medium ikke genopfyldes. Systemisk genopfyldning af medium blev udført i vores system hver 48-72 timer. Et andet afgørende aspekt af systemet er længden af ON. Det er afgørende at sikre, at mindst 0,5-1 cm ON efterlades på det kadaveriske øje. Donorøjne bør ikke anvendes, hvis de har korte ONs, ON er beskadiget, kloden er kompromitteret og deflateret, eller ON-kappen er løsrevet. Når det bageste segment placeres over kuplen, skal O-ringen desuden være tæt på plads, og det øverste ICP-kammer skal være korrekt forseglet med skruer. Pushpin fittings, hvor slangen fastgøres på hver side af modellens top- og bundbase, skal også testes for at sikre, at slangen passer og låser på plads. Hvis slangen ikke er korrekt på plads, vil luftbobler blive observeret i slangen og kompromittere trykmålingerne i hvert kammer.
Vedligeholdelse og levedygtighed af postmortem posterior segmenter i vores TAS model var en kritisk bekymring for denne protokol. Human postmortem væv er tidligere blevet grundigt undersøgt48,49, med en nylig RNA analyse undersøgelse af 1,068 postmortem donor væv bekræfter, at postmortem human hjernevæv indsamlet over årtier kan tjene som høj kvalitet materiale til undersøgelse af menneskelige lidelser47. Hertil kommer, tidligere vellykket udtryk profilering af okulære menneskelige donor øjenvæv postmortem er blevet udført58. Genekspression PLIER værdier for apoptose gener var minimal eller ikke-eksisterende i dette datasæt for retinal væv 6 h postmortem58. Desuden har det vist sig, at hypotermisk opbevaring af øjenvæv kan udføres effektivt59. Det har vist sig, at ganglion celle aktivitet opretholdes i 50 timer, når minipig øjne opbevares på iskæmiske og hypotermiske forhold41,60. Derfor brugte vi 6 timers tidspunktet som vores inklusionskriterier for donor eyecup-indsamling. Hastigheden af postmortem forringelse af posterior segmenter og retinal løsrivelse mangler i litteraturen, men vores enucleation inden for 6 timer, levering over is, og kultur opsætning af maksimal 36 h er godt inden for området af væv levedygtighed som afbildet i supplerende figur 1 og supplerende figur 2. Ved hjælp af TAS-modellen opnåede vi med succes en sund vedligeholdelse af væv i 30 dage.
En anden begrænsning af TAS-modellen er vores nuværende manglende evne til at modellere de cykliske døgnrytmer i ICP og IOP, der observeres under normale fysiologiske forhold. Dette kan løses i fremtiden ved hjælp af en pumpe, der kan regulere rytmisk IOP og ICP infusion. Desuden er en anden advarsel til modellen manglen på blodcirkulation i det kadaveriske øje. Således kan virkningerne af blodtrykket ikke undersøges, men dette giver os også mulighed for specifikt at afgrænse de patogene virkninger af kun TLPG-ændringer, herunder IOP og ICP.
Et fremtidigt omfang af modellen vil omfatte automatisering af reservoirsystemerne til hydrostatiske ændringer og perfusion af medium gennem en infusionspumpe med en udgang tom sprøjte på transduceren i stedet for de mange runder af medium forandring, der blev gennemført i denne protokol. Væsken fra IOP- og ICP-reservoiret kunne også opsamles og analyseres. Medium kan indsamles til biomarkør udtryk til at målrette fremtidige behandlinger. Vi kan også identificere veje eller molekyler, der kan behandles med lægemidler eller genterapi og teste disse behandlinger i forskellige dyremodeller af ICP før oversættelse til humane kliniske forsøg.
Afslutningsvis giver vores model ikke kun et menneskeligt grundlag for testning, men det kan også bruges til at validere behandlinger, der kan målrette translaminar trykændringer i øjet. Det åbner en mulighed for at udføre præcisionsmedicin gennem transplantation af patientens stamceller på menneskelige donorøjekopper og tryk dem i TAS-modellen. Dette giver os mulighed for at teste behandlinger ex vivo med kapacitet til at kunne oversættes til klinikken og relatable til levende individer. Med vores model kan vi nu vurdere de ændringer, der sker i translaminartryk, og hvordan det spiller en afgørende rolle i patogenesen forbundet med forskellige traumatiske og neurodegenerative sygdomme. Dette vil føre til en bedre forståelse af patogene molekylære mekanismer i ONH, der er forbundet med IOP og ICP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Manuskriptets forfattere har ingen potentielle interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Finansieringen af dette projekt var gennem diskretionære midler fra Dr. Colleen M. McDowell. Dette arbejde blev delvist støttet af en ubegrænset bevilling fra Research to Prevent Blindness, Inc. til UW Madison Department of Oftalmologi og Visual Sciences. Vi takker Drs. Abbot F. Clark og Weiming Mao for deres tekniske bistand med perfusion organ kultur model. Vi takker Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) for at give den menneskelige donor øjne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R.
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R.
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
