Summary
Мы описываем и детализируем использование трансламинарной автономной системы. Эта система использует задний сегмент человека для независимого регулирования давления внутри сегмента (внутриглазного) и окружающего зрительного нерва (внутричерепного) для создания трансламинального градиента давления, который имитирует особенности глаукоматозной оптической невропатии.
Abstract
В настоящее время существует неудовлетворенная потребность в новой доклинической модели человека, которая может быть нацелена на этиологию заболевания ex vivo с использованием внутричерепного давления (ВЧД) и внутриглазного давления (ВГД), которые могут идентифицировать различные патогенные парадигмы, связанные с патогенезом глаукомы. Модели культуры органов переднего сегмента человека ex vivo ранее успешно использовались и применялись в качестве эффективных технологий для открытия патогенеза глаукомы и тестирования терапевтических средств. Доклинический скрининг лекарств и исследования, проводимые на системах органов человека ex vivo, могут быть более трансформируемыми для клинических исследований. В этой статье подробно описывается создание и эксплуатация новой модели трансламинального давления человека ex vivo, называемой трансламинальной автономной системой (TAS). Модель TAS может независимо регулировать ВЧД и ВГД с использованием задних сегментов донора человека. Модель позволяет изучать патогенез доклиническим способом. Это может уменьшить использование живых животных в офтальмологических исследованиях. В отличие от экспериментальных моделей in vitro, структура, сложность и целостность ткани головки зрительного нерва (ONH) также могут поддерживаться в рамках модели ex vivo TAS.
Introduction
Глобальные оценки в недавних опросах показывают, что 285 миллионов человек живут с нарушениями зрения, в том числе 39 миллионов слепых1. В 2010 году Всемирная организация здравоохранения задокументировала, что три из девяти перечисленных ведущих причин слепоты происходят в заднем сегменте глаза1. Заболевания заднего сегмента глаза включают сетчатку, сосудистую оболочку и зрительный нерв2. Сетчатка и зрительный нерв являются расширениями центральной нервной системы (ЦНС) мозга. Аксоны ганглиозных клеток сетчатки (RGC) уязвимы для повреждения, потому что они выходят из глаза через головку зрительного нерва (ONH) для формирования зрительного нерва3. ONH остается наиболее уязвимым местом для аксонов RGC из-за 3D-сетки пучков соединительной ткани, называемой lamina cribrosa (LC)4. ONH является начальным местом повреждения аксонов RGC при глаукоме5,6,7, а изменения экспрессии генов в ONH были изучены в моделях глазной гипертензии и глаукомы8,9,10. Аксоны RGC восприимчивы к ONH из-за перепадов давления между внутриглазным компартментом, называемым внутриглазным давлением (ВГД), и во внешнем периоптическом субарахноидальном пространстве, называемом внутричерепным давлением (ICP)11. Область LC разделяет обе области, поддерживая нормальные перепады давления, при этом ВГД колеблется от 10 до 21 мм рт.ст., а ВЧД от 5 до 15 мм рт.ст.12. Разность давлений через пластинку между двумя камерами называется трансламинарным градиентом давления (TLPG)13. Основным фактором риска глаукомы является повышенный IOP14.
Увеличение ВГД увеличивает нагрузку внутри и поперек ламинарной области6,15,16. Экспериментальные наблюдения на моделях людей и животных показывают, что ONH является начальным местом повреждения аксонов17,18. Биомеханическая парадигма стресса и деформации, связанных с ВГД, вызывающих глаукоматозное повреждение в ONH, также влияет на патофизиологию глаукомы19,20,21. Несмотря на то, что у людей изменения, вызванные давлением, механически повреждают аксоны RGC22, у грызунов, не имеющих коллагеновых пластин в ламине, также может развиться глаукома7,23. Кроме того, повышенное ВГД остается наиболее заметным фактором риска у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, в то время как у пациентов с нормальной напряженной глаукомой развивается глаукоматозная оптическая нейропатия даже без повышенного ВГД. Кроме того, есть также подмножество глазных гипертоников, которые не показывают повреждения зрительного нерва. Также было высказано предположение, что давление спинномозговой жидкости (CSFp) может играть роль в патогенезе глаукомы. Данные свидетельствуют о том, что ВЧД снижается до ~ 5 мм рт.ст. у пациентов с глаукомой по сравнению с нормальными людьми, тем самым вызывая повышенное трансламинарное давление и играя решающую роль в заболевании24,25. Ранее в собачьей модели было продемонстрировано, что, контролируя изменения ВГД и CSFp, могут быть большие смещения оптического диска26. Повышение CSFp в глазах свиней также показало увеличение основного напряжения в области LC и ретроламинальной нервной ткани. Повышенная нагрузка на RGC и регион LC способствует блокировке аксонального транспорта и потере RGC27. Прогрессирующая дегенерация RGC была связана с потерей трофической поддержки28,29, стимуляцией воспалительных процессов/иммунной регуляции30,31 и апоптотических эффекторов29,32,33,34,35. Кроме того, аксональное повреждение (рисунок 3) оказывает пагубное воздействие на RGC, вызывая регенеративную недостаточность36,37,38,39. Несмотря на то, что эффекты ВГД были хорошо изучены, были проведены минимальные исследования аномальных изменений трансламинального давления. Большинство методов лечения глаукомы сосредоточены на стабилизации ВГД. Однако, несмотря на то, что снижение ВГД замедляет прогрессирование заболевания, оно не обращает вспять потерю поля зрения и не предотвращает полную потерю RGC. Понимание нейродегенеративных изменений при глаукоме, связанных с давлением, будет иметь решающее значение для предотвращения смерти RGC.
Современные данные свидетельствуют о том, что трансламинарные модуляции давления из-за различных механических, биологических или физиологических изменений у пациентов, страдающих травматическими или нейродегенеративными нарушениями зрения, могут вызвать значительную потерю зрения. В настоящее время не существует истинной доклинической модели заднего сегмента человека, которая могла бы позволить изучать глаукоматозные биомеханические повреждения в EX VIVO человека ONH. Наблюдение и лечение заднего сегмента глаза является огромной проблемой в офтальмологии27. Существуют физические и биологические барьеры для нацеливания на задний глаз, включая высокие показатели элиминации, гемато-ретинальный барьер и потенциальные иммунологические реакции40. Большинство тестов эффективности и безопасности для новых мишеней лекарств проводятся с использованием клеточных моделей in vitro и in vivo на животных41. Глазная анатомия сложна, и исследования in vitro не точно имитируют анатомические и физиологические барьеры, представленные тканевыми модельными системами. Несмотря на то, что животные модели являются необходимостью для фармакокинетических исследований, глазная физиология заднего глаза человека может варьироваться между различными видами животных, включая клеточную анатомию сетчатки, сосудистой системы и ONH41,42.
Использование живых животных требует интенсивных и подробных этических норм, высокой финансовой приверженности и эффективной воспроизводимости43. В последнее время появилось множество других руководящих принципов этического использования животных в экспериментальных исследованиях44,45,46. Альтернативой испытаниям на животных является использование моделей человеческого глаза ex vivo для исследования патогенеза заболеваний и потенциального анализа лекарств для защиты повреждения ONH. Посмертная ткань человека является ценным ресурсом для изучения парадигм заболеваний человека, особенно в случае нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку идентификация потенциальных лекарств, разработанных на животных моделях, требует необходимости быть переведенной на людей47. Донорская ткань человека ex vivo широко использовалась для изучения расстройств человека47,48,49, а системы культуры органов переднего сегмента человека ранее предоставили уникальную модель ex vivo для изучения патофизиологии повышенного IOP50,51,52.
Для изучения трансламинального давления, связанного с ВГД и ВЧД в глазах человека, мы успешно спроектировали и разработали двухкамерную трансламинарную автономную систему (TAS), которая может независимо регулировать ВГД и ВЧД с использованием задних сегментов от глаз донора человека. Это первая человеческая модель ex vivo, изучающая трансламинарное давление и использующая биомеханическое воздействие TLPG на ONH.
Эта модель EX VIVO человека TAS может быть использована для обнаружения и классификации клеточных и функциональных модификаций, которые происходят из-за хронического повышения ВГД или ВЧД. В этом отчете мы подробно описываем пошаговый протокол препарирования, настройки и мониторинга модели заднего сегмента человека TAS. Протокол позволит другим исследователям эффективно воспроизвести эту новую модель заднего сегмента человека ex vivo под давлением для изучения патогенеза биомеханических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Глаза были получены в соответствии с положениями Хельсинкской декларации для исследований с участием тканей человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза из авторитетных глазных банков (например, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) были собраны в течение 6-12 часов после смерти, а донорская сыворотка была проверена на гепатит В, гепатит С и вирус иммунодефицита человека 1 и 2. После того, как они были получены, глаза были рассечены и установлены в модели TAS в течение 24 часов. Критерии исключения включали любую глазную патологию. Глаза не были исключены в зависимости от возраста, расы или пола. Чтобы обеспечить жизнеспособность сетчатки при поступлении, экспланты сетчатки собирали у доноров тканей и культивировали в течение 7 и 14 дней (дополнительный рисунок 1). Эти сетчатки также были диссоциированы и выращивали здоровые RGC в культуре в течение 7 дней с положительным окрашиванием для маркера RGC, РНК-связывающего белка с множественным сплайсингом (RBPMS), а также положительным окрашиванием легкой цепи нейрофиламента (NEFL) в их нейрофиламентах (Дополнительный рисунок 2). .
1. Подготовка и стерилизация оборудования и расходных материалов
- Обратитесь к Таблице материалов для получения полного списка необходимых расходных материалов, а также поставщиков и каталожных номеров.
- Перед использованием стерилизуйте все оборудование и инструменты путем автоклавирования или с использованием ампул окиси этилена.
2. Приготовление перфузионной среды
- Добавьте 1% пенициллина стрептомицина (10 000 Ед/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина в 0,85% NaCl) и 1% L-глутамина (200 мМ) к 1000 мл высокой глюкозы модифицированной среды Дульбекко (DMEM).
- Стерилизуйте перфузионную среду, проходя через фильтр 0,22 мкм.
3. Настройка трансламинарной автономной системы (ТАС)
- Установите приточные шприцы (резервуары ВГД и ПМС).
- Добавьте 30 мл перфузионной среды (раздел 2) в шприц объемом 30 мл. Прикрепите 3-позиционный запорный кран к шприцу объемом 30 мл. Прикрепите гидрофильный фильтр 0,22 мкм к 3-ходовому запорному крану. Подключите адаптер-заглушку 15 G Luer к гидрофильному фильтру 0,22 мкм.
- Удалите пузырьки воздуха из шприца. Прикрепите трубку к адаптеру заглушки 15 G Luer. Закройте боковой порт запорного крана невентилируемым универсальным замковым колпачком. Повторите в общей сложности две настройки.
- Пометьте один шприц как внутричерепное давление канала 1 (CH1 ICP), а другой шприц как канал 2 внутриглазного давления (CH2 IOP).
- Установка шприцев для оттока (резервуаров ВГД и ПМС).
- Прикрепите 3-позиционный запорный кран к шприцу объемом 30 мл. Прикрепите адаптер заглушки 15 G Luer к 3-позиционному запорному крану. Прикрепите трубку к адаптеру заглушки 15 G Luer.
- Закройте боковой порт запорного крана невентилируемым универсальным замковым колпачком. Повторите в общей сложности две настройки. Пометьте один шприц как CH1 ICP, а другой шприц как CH2 IOP.
4. Подготовка человеческого глазного шара
ПРИМЕЧАНИЕ: Если получены целые глаза, следуйте приведенной ниже процедуре, чтобы отделить передний сегмент от заднего сегмента глаза. Если глаза получены пополам, начните с шага 4.4.
- Поместите целый глаз в раствор повидона-йода на 2 мин.
- Промыть глаз стерильным фосфатно-буферным раствором (PBS) для смывания повидона-йода. Повторите 2 раза.
- Удалите придатки со всего глазного шара с помощью щипцов и ножниц. Разделите глаз пополам на экваторе, чтобы разделить передний и задний сегменты глаза.
- Снимите оболочку зрительного нерва. Удалите стекловидное тело из заднего сегмента.
- При необходимости обрежьте дополнительные склеры из заднего сегмента, чтобы обеспечить хорошую посадку на круглом куполе ВГД (нижней) камеры. Используя щипцы, убедитесь, что сетчатка равномерно распределена по задней части сегмента.
- Установка камеры ВГД (нижняя)
- Поместите задний сегмент человека в ВГД (нижнюю) камеру TAS над круглым куполом с зрительным нервом, обращенным к верху.
- Запечатайте задний сегмент с помощью уплотнительного кольца из эпоксидной смолы с четырьмя винтами, обеспечив плотное уплотнение.
- Вставьте трубку в отверстия IN и OUT камеры ВГД (нижняя). Приточный шприц ВГД со средой, содержащей трубку, вставляется в входное отверстие, а пустой шприц для выхода ВГД с трубкой вставляется в выходной порт.
- Используйте метод push/pull, чтобы медленно вливать перфузионную среду в порт притока, чтобы заполнить заднюю глазную чашку, одновременно медленно вытягивая перфузионную среду через шприц оттока, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из линий. Прекратите вливать среду, как только трубки IN и OUT будут лишены пузырьков воздуха.
- Зафиксируйте запорные краны в выключенном положении. Извлеките шприц объемом 30 мл из узла фильтра порта IOP IN и заправьте в общей сложности 30 мл среды. Замените шприц объемом 30 мл на фильтр в сборе.
-
Установка камеры ICP (верхняя)
- Поместите камеру/крышку ICP (верхнюю) над задней частью заднего сегмента. Убедитесь, что зрительный нерв находится в верхней камере. Запечатайте верхнюю камеру четырьмя винтами.
- Вставьте трубку в отверстия IN и OUT камеры ICP (верхней). Приточный шприц ICP со средой, содержащей трубку, вставляется в in-порт, а пустой выходной шприц ICP с трубкой вставляется в out-порт.
- Осторожно и медленно вливайте среду в in-порт, чтобы заполнить камеру ICP и удалить пузырьки воздуха из линий с помощью метода push/pull. Прекратите вливание среды, как только камера ICP, а также трубки IN и OUT будут лишены пузырьков воздуха.
- Зафиксируйте запорные краны в выключенном положении. Извлеките шприц объемом 30 мл из ICP в узел портового фильтра и заправьте в общей сложности 30 мл среды. Замените шприц объемом 30 мл на фильтр в сборе.
5. Настройка системы записи данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Система регистрации данных состоит из 8-канального источника питания, многоканального мостового усилителя, гидростатических преобразователей давления и компьютера с программным обеспечением для сбора данных (см. Таблицу материалов). Ниже описано, как настроить и откалибровать систему.
- Подключите кабель питания к задней панели 8-канального источника питания и подключите к резервному устройству аккумулятора.
- Подключите кабель USB от 8-канального источника питания к задней панели компьютера.
- Подключите 8-канальный источник питания к многоканальному мостовому усилителю с помощью прилагаемого шнура I2C.
- Подключите кабели Байонета Нила-Консельмана (BNC) к канальным входам перед 8-канальным источником питания и конец кабелей к соответствующим каналам в задней части многоканального усилителя.
- Подключите кабели преобразователя к передней панели многоканального усилителя.
- Установите программное обеспечение для сбора данных на компьютер.
- Запустите установщик программы установки программного обеспечения для сбора данных с прилагаемого компакт-диска с программным обеспечением.
- Следуйте инструкциям на экране компьютера.
- После завершения установки нажмите кнопку Готово.
- Включите 8-канальный источник питания.
- Включите компьютер и запустите программное обеспечение для сбора данных.
- Выберите | файлов Новые функции.
- Выберите установочный | Настройки канала. Выберите три канала (в левом нижнем углу экрана). В столбце Название канала переименуйте каналы следующим образом: CH1 ICP; CH2 ВГД; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Выберите 2 мВ для параметра Диапазон на всех каналах. В столбце Расчет выберите Нет вычисления для каналов 1 и 2.
- В столбце Расчет выберите Арифметика для канала 3. В разделе Формула : Выберите каналы/CH2; Выберите арифметику "-"; Выберите каналы/CH1. В разделе Вывод выберите мм рт.ст. Нажмите кнопку ОК. Нажмите кнопку ОК еще раз.
- Настройте и откалибруйте гидростатические преобразователи давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидростатические преобразователи давления должны быть откалиброваны перед экспериментами с использованием следующего метода.- Подключите гидростатические преобразователи давления к линиям преобразователя, прикрепленным к многоканальному мостовому усилителю.
- Прикрепите шприц объемом 30 мл, наполненный воздухом, к боковому порту датчика давления CH1 (ICP). Прикрепите сфигмоманометр к нижней части датчика давления CH1 (ICP).
- На графике просмотрите страницу программного обеспечения для сбора данных, установите скорость выборки, щелкнув левой кнопкой мыши стрелку рядом со временем выборки и выберите 100. Затем щелкните правой кнопкой мыши в области CH1 (ICP) страницы.
- Выберите Мостовой усилитель. Выберите Фильтр сети. Выберите Zero и подождите, пока система обнулится, следя за тем, чтобы датчик давления не перемещался.
- Зажмите белые вкладки датчика давления и протолкните воздух через датчик до тех пор, пока на сфигмоманометре не будет получено 40 мм рт.ст. Отпустите белые вкладки и снимите шприц и сфигмоманометр.
- На странице Преобразование единиц измерения выберите знак «минус (-)». Выделите самое высокое плато, чтобы указать 40 мм рт.ст. Щелкните стрелку для точки 1 и введите 40.
- Выделите самое низкое плато, чтобы указать 0 мм рт.ст. Щелкните стрелку для точки 2 и введите 0. Выберите мм рт.ст. для устройств. Нажмите кнопку ОК.
- Нажмите кнопку ОК (страница Мостовой усилитель). Повторите шаги 9,1–9,7 для CH2 (ВГД), используя 100 мм рт.ст. для самого высокого плато и 0 для самого низкого плато.
- Подключите блок TAS/задний сегмент к системе сбора данных.
- Поместите блок TAS/задний сегмент в инкубатор (37 °C, 5% CO2). Подключите трубку ICP от порта OUT к датчику давления CH1 (ICP).
- Подключите трубку ВГД от порта OUT к датчику давления CH2 (IOP).
- Подключите шприцевые установки (ICP и IOP) со средой от IN-портов к кольцевой подставке.
- На странице Представление диаграммы выберите Начать выборку. Установите скорость выборки, щелкнув левой кнопкой мыши стрелку рядом со временем выборки и выбрав Медленно и 1 минута.
- Отрегулируйте шприцы на кольцевой стойке вверх или вниз, чтобы регулировать давление ICP и IOP в соответствии с требованиями протокола.
- Выполняют системное пополнение среды в системе каждые 48–72 ч методом push and pull.
6. Поиск и анализ данных
- Откройте файл данных в программном обеспечении для сбора данных.
- В разделе Панель данных щелкните значок Множественное добавление в панель данных . Появится новое окно.
- В разделе Найти с помощью выберите в раскрывающемся меню пункт Время .
- В разделе Выбор выберите 1 час каждые 1 час из выпадающих меню.
- В разделе Пошаговое выполнение выберите Весь файл и нажмите кнопку Добавить.
- В разделе Панель данных щелкните значок Представление панели данных . Выделите все данные и скопируйте/вставьте в электронную таблицу.
- Рассчитайте средние и стандартные отклонения для ВГД, ВЧП и ТЛПГ за каждые 24 ч. Сопоставьте данные с помощью параметра сводной таблицы в программе для работы с электронными таблицами и графике.
7. Иммуногистохимия и окрашивание задних сегментов гематоксилином и эозином
- Удалите задние сегменты глаза после различных временных точек из модели TAS и зафиксируйте в формалине перед парафинизацией.
- Разрезание глаз для получения сагиттальных тканевых плоскостей.
- Депарафинизируйте парафиновые сегменты 100% ксилолом, 95% этанолом, 50% раствором этанола.
- Мойте горки с PBS в течение 10 мин и блокируйте блокирующим буфером при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Участки этикетки с первичными антителами: антиколлаген IV (маркер внеклеточного матрикса (ECM), NB120-6586, 1:100) и антиламинин (маркер ECM, NB300-144, 1:100, анти-RBPMS (маркер RGC), GTX118619, 1:50).
- Обнаружение первичных антител с помощью вторичных антител Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 козий анти-кролик, A11008, 1:500).
- Противодействует окрашиванию клеточных ядер с помощью антивядающего раствора DAPI.
- Захват изображений окрашенных участков и фазовых изображений с помощью объективов 4x и 10x с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).
- Для окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) обработайте участки в автоматизированной системе окрашивания (см. Таблицу материалов) для депарафинизации с использованием 100%, ксилола 95% этанола, 50% раствора этанола и окрашивания h &E.
- Делайте снимки с помощью объективов 4x и 10x с помощью микроскопа с ярким полевым источником света.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проектирование и создание трансламинарной автономной системы
Трансламинарный перепад давления является потенциальным ключевым механизмом в патогенезе различных заболеваний, в том числе глаукомы. Использование описанной модели включает, но не ограничивается этим, изучение глаукомы (повышенное ВГД, возможно, снижение ВЧД), черепно-мозговой травмы (повышенное ВЧД) и долгосрочное воздействие связанных с микрогравитацией нарушений зрения (повышенный ВЧД, повышенный ВГД). Чтобы помочь обнаружить молекулярный патогенез, нацеленный на трансламинарное давление в человеческом глазу, мы разработали, создали и подтвердили модель TAS. Наша новая модель человека ex vivo дает уникальную доклиническую систему для независимого изучения патогенных изменений, связанных с ВЧД и ВГД. Для решения доклинических применений человека наша модель обеспечивает парадигму ex vivo изучения патогенеза из-за трансламинарных изменений давления. Герметичный дизайн модели изображен с сплошным фронтальным и прозрачным видами (рисунок 1A, 1B) с подробным схематическим представлением модели для отображения всех портов притока и оттока (рисунок 1C). Показан цветной прозрачный вид с задним сегментом человека в реальной 3D-печатной модели (рисунок 1D, 1E).
Трансламинарная автономная система: новая модель трансламинального давления человека ex vivo
Мы сгенерировали модель TAS с двумя автономными камерами (т.е. камерами IOP и ICP). В нижнем основании модели задняя чашка человека была помещена над верхней частью круглого купола с зрительным нервом, обращенным сверху. После того, как задняя чашка была помещена и запечатана в камере ВГД, мы поместили камеру ВЧП поверх нерва. Мы сохранили независимость обеих камер и идеальное уплотнение с помощью уплотнительных колец, которые точно подходят к каждой камере (рисунок 2A). Нижняя камера или камера ВГД заполнялась и регулировала давление в чашке, в то время как верхняя камера помещалась вокруг зрительного нерва и регулировала ВЧД вокруг нерва через гидростатические резервуары давления. Используя модель, мы самостоятельно регулировали ВГД и ВЧД с помощью гидростатического давления. Разница между обеими камерами была идентифицирована как изменение трансламинального градиента давления (рисунок 2B). Модель, изображенная со всеми конечными фитингами на месте, включая шприцы резервуара притока и оттока, показана на рисунке 2C.
Успешное поддержание культуры и давления в трансламинарной автономной системе
Чтобы обе камеры работали независимо в системе, мы регулировали несколько перепадов давления, сохраняя камеру ВГД и ВЧД при разных средних перепадах давления (нормальный TLPG: IOP: ICP, 15:5 мм рт.ст.; повышенный TLPG >10 мм рт.ст.; повышенный TLPG >20 мм рт.ст.). Первоначально мы проверили поддержание средних нормальных перепадов давления в обеих камерах (нормальный ВГД/ВЧП) с помощью различных параметров ВГД и условий ВЧД: 1) нормальное ВГД: снижение ВЧД (рисунок 3А); 2) повышенное ВГД: снижение ВЧД (рисунок 3В); и 3) повышенная ВГД: повышенная ВЧД (рисунок 3С). Среднее нормальное ВГД колеблется от 10 до 21 мм рт.ст. (учитывая эписклеральное венозное давление) и нормальное ВЧД от 5 до 15 мм рт.ст. Вместо ограничения отсутствия сосудистого давления мы по-прежнему поддерживали давление на эти скорости, поскольку идея заключалась в том, чтобы оказать максимальное давление на ONH. Мы независимо регулировали различные уровни давления в обеих камерах (ICP, 5–10 мм рт.ст.; ВГД, 20–40 мм рт.ст.). Чтобы обеспечить поддержание давления между обеими камерами, мы поддерживали ВГД в нормальных условиях (15 мм рт.ст.) и снижали ВЧД (4 мм рт.ст.) для поддержания TLPG (ВГД-ВГС) между ЛК 11 мм рт.ст. (рисунок 3А). Затем мы повысили ВГД (43 мм рт.ст.) и уменьшили ВЧД (3 мм рт.ст.) (рисунок 3В) и, наконец, повысили давление в обоих случаях (ВГД, 64 мм рт.ст.; ICP, 9 мм рт.ст.) для получения наибольшего уровня TLPG при 55 мм рт.ст. (рисунок 3C). Для обеспечения жизнеспособности ткани (фиг.4) среду в тканях обменивали каждые 48 ч, прикрепляя пустой шприц к отточному запорному крану и медленно проталкивая примерно 5 мл перфузионной среды через приточный порт с использованием метода push/pull. Минимальное повышение давления происходило во время обмена средой (рисунок 4G) и не влияло на морфологию ONH, как показано в 14- и 30-дневных данных иммуногистохимии (рисунок 4A-F). Чтобы подтвердить, что мы можем культивировать задние сегменты в течение длительных периодов времени с эффективной жизнеспособностью в рамках модели TAS, мы проанализировали поперечные сечения ONH после поддержания нормального ВГД и ВЧД в течение 14 и 30 дней. Мы смогли успешно культивировать эти сегменты в модели в течение 14 дней (рисунок 4A, 4B) со здоровыми клетками ONH и экспрессией внеклеточного матрикса коллагена IV (COLIV) в головке зрительного нерва (рисунок 4C). Аналогичная жизнеспособность и поддержание заднего сегмента наблюдались также в течение 30 дней (рисунок 4D, 4E) с экспрессией COLIV и DAPI (рисунок 4F). Графическое представление значений TLPG (IOP-ICP) (рисунок 4G) изображает постоянное поддержание значений ВГД с течением времени на уровне 15,6 ± 4,6 мм рт.ст. и среднего значения ICP при 11,0 ± 4,6 мм рт.ст. в течение 30 дней при TLPG 4,6 ± 1,3 мм рт.ст. (таблица 1).
Морфологические изменения градиента трансламинального давления ONH после повышенного трансламинального давления
Общей клинической особенностью возрастного нейродегенеративного заболевания глаукомой является купирование ОНГ. Преламинарное купирование отличается прогрессирующей потерей преламинарных нервных тканей, что увеличивает как глубину, так и ширину чашки и, таким образом, увеличивает отношение чашки к диску. Ламинарное купирование основано на соединительной ткани, при этом LC движется кзади прогрессивно и выкапывается. Глаукоматозное купирование представляет собой комбинацию этих двух компонентов, отражающих как повреждение, так и ремоделирование ламинарной соединительной ткани. Повышение ВГД приводит к утолщению ЛК из-за увеличения массы коллагеновой фибрилла53. Используя модель TAS, мы создали повышенный TLPG путем увеличения ВГД или уменьшения ICP в течение различных временных точек. Мы поддерживали диапазон повышенных TLPG в течение 7 дней со средними значениями ВГД с течением времени на уровне 22,8 ± 18,6 мм рт.ст. и средним значением ICP на уровне 6,9 ± 7,6 мм рт.ст. с TLPG 15,9 ± 11,8 мм рт.ст. (таблица 2). Самые высокие TLPG были задокументированы на уровне 36 мм рт.ст. Затем задние сегменты человека были морфологически проанализированы на предмет прогрессирующего утолщения ламинарного пучка и купирования в ONH в окрашенных участках H & E по мере продвижения времени между контролем, 1 днем, 3 днями и 7 днями при повышенном TLPG (рисунок 5A-D). Купирование и утолщение наблюдались через 7 дней повышенного TLPG (рисунок 5D). Кроме того, экспрессия COLIV в течение времени между контролем, 1 день, 3 дня и 7 дней, показала утолщение пучков и увеличение экспрессии на 7 дней (рисунок 5E–H). Фазовые изображения, сравнивающие контрольную ткань, не культивированную в модели TAS (рисунок 5I) и 7 дней (рисунок 5J) повышенного TLPG в модели TAS, показывают здоровые RGC в пределах GCL (Рисунок 5I) без купирования (Рисунок 5I) для контроля, в то время как в условиях повышенного TLPG изображения показывают обширное купирование без оставшихся RGC (маркер RBPMS-RGC) в RNFL (Рисунок 5J) и повышенное ремоделирование ECM, как показано повышенным COLIV в пределах ONH (рисунок 5J).
Рисунок 1: Трансламинарная автономная система. Изображение модели. (A) Сплошной вид спереди. (B) Прозрачный вид. (C) Диаграммный вид. (D) Цветной прозрачный вид. (E) Фактическая 3D-печатная модель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Механика трансламинальной автономной системы. А) Модель ТАС с камерами ВМС и ВГД для регулирования трансламинарных перепадов давления. (B) Изображение модели TAS с автономным регулированием гидростатического давления в обеих камерах через возвышение резервуаров. (C) Изображение модели TAS со всеми приспособлениями на месте и представлением шприцев для резервуаров притока и оттока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Независимое поддержание давления в трансламинальной автономной системе. Графическое представление независимо модулируемых давлений и стабильных давлений, поддерживаемых в верхней (ВСД) и нижней (ВГД) камерах с (А) нормальным ВГД/пониженным ВЧД (В) повышенным ВГД/пониженным ВЧД и (С) повышенным ВГД/повышенным ВЧД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Поддержание и жизнеспособность задних сегментов в трансламинальной автономной системе. Задние сегменты человека культивировали с использованием модели TAS в течение 14 и 30 дней в нормальных условиях ВГД и ВЧД. H&E окрашивает поперечные сечения человеческого ONH через 14 дней в (A) низком увеличении (40x) и (B) высоком увеличении (100x). (C) Иммуноокрашивание COLIV с экспрессией DAPI (100x). Аналогичные изображения окрашивания H&E через 30 дней на микроснимках (D) 40x и (E) 100x и иммуноокрашивания (F) COLIV с экспрессией DAPI (100x). G) Графическое представление Δ в мм рт.ст. ВГД-ВГС (ТЛПГ) для задних сегментов человека, сохраняющееся в течение 30 дней в культуре. КОЛИВ = зеленый; DAPI = синий; (А, вставка В); (D, вставка E); H&E = пятно гематоксилина и эозина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Морфологическая перестройка головки зрительного нерва после повышенного градиента трансламинарного давления в Трансламинальной автономной системе. Задние сегменты человека культивировали с использованием модели TAS для различных временных точек в условиях повышенного TLPG. Поперечные сечения ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ОНГ, изображающие окрашивание H&E (A) контрольного (B) 1 день в TAS (C) 3 дня в TAS и (D) 7 дней культивирования. Экспрессия КОЛИВА с DAPI в ONH (E) контроля (F) 1 день в TAS (G) 3 дня в TAS и (H) 7 дней в культуре. Изображения поперечного сечения фазового контраста ONH (I) контроля ONH, изображающие (I') окрашивание сетчатки RBPMS и (I'') окрашивание ONH с помощью COLIV и DAPI. Фазовый контраст (J) 7 дней повышенного TLPG в TAS со вставками, изображающими (J') окрашивание сетчатки RBPMS и (J'') окрашивание ONH coliv и DAPI. КОЛИВ, РБПМС = зеленый; DAPI = синий; (A–D) 40-кратное увеличение; (E–H) 100-кратное увеличение; (I и J) 200-кратное увеличение; (J') 400-кратное увеличение; (J'') 100-кратное увеличение; (J, вставка J' и J''); H&E = пятно гематоксилина и эозина; TAS = Трансламинарная автономная система. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Дни недели | Среднее значение ВГД 24 ч | Среднее значение ВМС составляет 24 ч. | Среднее значение TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| СРЕДНЯЯ | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| ЗППП | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Таблица 1: Поддержание нормального TLPG сохраняется в течение 30 дней. Табличные значения, отображающие значения ВГД, ВЧД и ТЛПГ каждые 24 ч со средним и стандартным отклонением по всему временному ходу.
| Дни недели | Среднее значение ВГД 24 ч | Среднее значение ВМС составляет 24 ч. | Среднее значение TLPG 24 ч |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| СРЕДНЯЯ | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| ЗППП | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Таблица 2: Поддержание диапазона повышенного TLPG, поддерживаемого в течение 7 дней. Табличные значения, отображающие значения ВГД, ВЧД и ТЛПГ каждые 24 ч со средним и стандартным отклонением по всему временному ходу.
Дополнительный рисунок 1: Ex vivo культура экспланта сетчатки человека. Фазовый контраст, RGC-положительные окрашенные (RBPMS-зеленый) и клеточные (DAPI-синий) окрашенные изображения эксплантов сетчатки в культуре в течение (A-C) 7 дней и (D-F) 14 дней (200-кратное увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 2: Взрослые культуры RGC человека. Маркер RGC (RBPMS-зеленый) и DAPI (синий) окрашенные RGC 7 дней в культуре (A) 200x (B) 400x увеличение. (C) RGC окрашены для NEFL (зеленый) и DAPI (синий) при 400-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Посмертные ткани человека являются особенно ценным ресурсом для изучения нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку идентификация потенциальных лекарств, разработанных на животных моделях, должна быть переведена на людей47. Эффекты повышения ВГД человека хорошо известны, но минимальные исследования были проведены для аномальных изменений трансламинального давления ONH. Несмотря на то, что существует несколько животных моделей и конечное моделирование ONH человека, не существует модели ex vivo для изучения изменений трансламинального давления41,54,55,56,57. В настоящее время существует неудовлетворенная потребность в новой доклинической модели человека, которая может быть нацелена на этиологию заболевания ex vivo с использованием ВГД и ВЧД и может идентифицировать различные патогенные парадигмы, связанные с патогенезом глаукомы. Понимание патологических изменений, связанных с давлением, в ONH будет иметь решающее значение для предотвращения смерти RGC. Комбинированное использование ВГД, ВЧД и TLPG в рамках модели TAS является уникальным подходом к изучению зависящей от давления дегенерации доклиническим образом с использованием ткани заднего сегмента человека. В модели TAS мы можем культивировать задние сегменты человеческих глазных чашек для изучения изменений трансламинального давления посредством автономной регуляции камер ВГД и ВЧД. Это обеспечивает основу для разработки нового спектра терапевтических средств, которые фокусируются на трансламинарном давлении как механизме дегенерации.
Настройка модели TAS требует внимания к деталям во многих аспектах: правильное рассечение задних сегментов человека, обеспечение того, чтобы сетчатка была неповрежденной и распространилась по задней чашке, правильное размещение сегмента над куполом камеры ВГД, точное размещение камеры ICP над ON, эффективное уплотнение обеих камер, и независимое поддержание гидростатического давления путем регулирования высоты резервуаров ВГД и КИП. Рассечение необходимо проводить в глазах, которые находятся не более 24–36 ч после вскрытия, потому что сетчатка прогрессивно ухудшается, если эффективная культуральная среда не пополняется. Системное пополнение среды проводилось в нашей системе каждые 48–72 ч. Другим важным аспектом системы является длина ON. Очень важно убедиться, что на трупном глазу остается не менее 0,5–1 см ON. Донорские глаза не должны использоваться, если у них короткие ON, ON поврежден, глобус скомпрометирован и спущен, или оболочка ON отсоединена. Кроме того, при размещении заднего сегмента над куполом уплотнительное кольцо должно быть плотно прилегать к месту, а верхняя камера ICP правильно герметизирована винтами. Фитинги, где трубка крепится с каждой стороны верхнего и нижнего основания модели, также должны быть протестированы, чтобы убедиться, что трубка подходит и фиксируется на месте. Если трубка не установлена должным образом, пузырьки воздуха будут наблюдаться внутри трубки и ставить под угрозу измерения давления в каждой камере.
Поддержание и жизнеспособность посмертных задних сегментов в нашей модели TAS были критически важной проблемой для этого протокола. Посмертная ткань человека ранее была широко изучена48,49, а недавнее исследование анализа РНК 1068 посмертных донорских тканей подтвердило, что посмертная ткань головного мозга человека, собранная в течение десятилетий, может служить высококачественным материалом для изучения расстройств человека47. Кроме того, ранее было выполнено успешное профилирование выражений глазных донорских тканей глаза человека посмертно58. Значения экспрессии генов PLIER для генов апоптоза были минимальными или отсутствовали в этом наборе данных для ткани сетчатки 6 ч посмертного вскрытия58. Кроме того, было показано, что гипотермическое хранение тканей глаза может быть выполнено эффективно59. Показано, что активность ганглиозных клеток сохраняется в течение 50 ч при хранении минипиговых глаз при ишемических и гипотермических условиях41,60. Поэтому мы использовали 6-часовую временную точку в качестве критериев включения в коллекцию донорских наглазников. Скорость посмертного ухудшения задних сегментов и отслоения сетчатки отсутствует в литературе, но наша энуклеация в течение 6 ч, доставка по льду и культуральная установка максимум 36 ч находятся в пределах диапазона жизнеспособности тканей, как показано на дополнительном рисунке 1 и дополнительном рисунке 2. Используя модель TAS, мы успешно добились здорового поддержания тканей в течение 30 дней.
Другим ограничением модели TAS является наша текущая неспособность моделировать циклические циркадные ритмы ВЧД и ВГД, которые наблюдаются в нормальных физиологических условиях. Это может быть решено в будущем с помощью насоса, который может регулировать ритмическое ВГД и инфузию ВЧД. Кроме того, еще одним предостережением к модели является отсутствие кровообращения в трупном глазу. Таким образом, влияние артериального давления не может быть изучено, но это также позволяет нам конкретно очертить патогенные эффекты только изменений TLPG, включая ВГД и ВЧД.
Будущая область применения модели будет включать автоматизацию резервуарных систем для гидростатических изменений и перфузии среды через инфузионный насос с выходным пустым шприцем на преобразователе вместо нескольких раундов изменения среды, которые были реализованы в этом протоколе. Жидкость из резервуара ВГД и МСП также может быть собрана и проанализирована. Среда может быть собрана для экспрессии биомаркеров для нацеливания на будущие методы лечения. Мы также можем идентифицировать пути или молекулы, которые можно лечить лекарствами или генной терапией, и тестировать эти методы лечения на различных животных моделях ВЧД перед переводом в клинические испытания на людях.
В заключение, наша модель не только обеспечивает человеческую основу для тестирования, но также может быть использована для проверки методов лечения, которые могут быть нацелены на изменения трансламинального давления в глазу. Это открывает возможности для выполнения прецизионной медицины путем трансплантации стволовых клеток пациента на глазные чашки донора человека и давления на них в модели TAS. Это позволяет нам тестировать терапию ex vivo с возможностью быть переведенной в клинику и относящейся к живым людям. С помощью нашей модели мы теперь можем оценить изменения, происходящие в трансламинарном давлении, и то, как оно играет решающую роль в патогенезе, связанном с различными травматическими и нейродегенеративными заболеваниями. Это приведет к лучшему пониманию патогенных молекулярных механизмов в ONH, которые связаны с ВГД и ВЧД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы рукописи не имеют потенциальных конфликтов интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Финансирование этого проекта осуществлялось за счет дискреционных средств д-ра Коллин М. Макдауэлл. Эта работа была частично поддержана неограниченным грантом от Research to Prevent Blindness, Inc. департаменту офтальмологии и визуальных наук UW Madison. Мы благодарим д-ра Эббота Ф. Кларка и Веймин Мао за их техническую помощь с моделью культуры перфузионных органов. Мы благодарим Институт трансплантации и исследований Lions Eye (Тампа, Флорида) за предоставление глаз донора человека.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R.
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R.
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
