Summary
Vi beskriver och beskriver användningen av det translaminära autonoma systemet. Detta system använder det mänskliga bakre segmentet för att självständigt reglera trycket inuti segmentet (intraokulära) och omgivande optik nerv (intrakraniell) för att generera en translaminär tryck gradient som efterliknar funktioner av glaucomatous optik neurotoxiskt.
Abstract
Det finns ett aktuellt ouppfyllt behov av en ny preklinisk mänsklig modell som kan rikta in sig på sjukdom etiologi ex vivo med hjälp av intrakraniellt tryck (ICP) och intraokulära tryck (IOP) som kan identifiera olika patogena paradigm relaterade till glaukom patogenesen. Ex vivo mänskliga främre segment perfusion organ kultur modeller har tidigare framgångsrikt utnyttjats och tillämpas som effektiv teknik för upptäckt av glaukom patogenes och testning av terapier. Preklinisk läkemedelsscreening och forskning som utförs på ex vivo mänskliga organsystem kan vara mer översättbara till klinisk forskning. Denna artikel beskriver i detalj genereringen och driften av en ny ex vivo mänsklig translaminär tryckmodell som kallas det translaminära autonoma systemet (TAS). TAS-modellen kan självständigt reglera ICP och IOP med hjälp av mänskliga donator bakre segment. Modellen gör det möjligt att studera patogenes på ett prekliniskt sätt. Det kan minska användningen av levande djur i oftalmisk forskning. I motsats till in vitro-experimentella modeller kan optisk nervhuvud (ONH) vävnad struktur, komplexitet och integritet också upprätthållas inom ex vivo TAS-modellen.
Introduction
Globala uppskattningar i nyligen genomförda undersökningar tyder på att 285 miljoner människor lever med synnedsättning, inklusive 39 miljoner som är blinda1. År 2010 dokumenterade Världshälsoorganisationen att tre av de nio listade ledande orsakerna till blindhet förekommer i det bakre segmentet av ögat1. Bakre segment ögonsjukdomar involverar näthinnan, choroid och optik nerv2. Näthinnan och synnerven är centrala nervsystemet (CNS) förlängningar av hjärnan. Retinal ganglion cell (RGC) axons är sårbara för skador eftersom de lämnar ögat genom optik nerv huvudet (ONH) för att bilda optik nerv3. ONH är fortfarande den mest sårbara punkten för RGC axons på grund av 3D meshwork av bindväv strålar kallas lamina cribrosa (LC)4. ONH är den första platsen för förolämpning mot RGC axons i glaukom5,6,7, och genuttryck förändringar inom ONH har studerats i okulär hypertoni och glaukom modeller8,9,10. RGC axons är mottagliga vid ONH på grund av tryckskillnader mellan intraokulära facket, kallas intraokulärt tryck (IOP), och inom det yttre perioptiska subarachnoid utrymmet, kallas intrakraniellt tryck (ICP)11. LC-regionen separerar båda områdena och upprätthåller normala tryckskillnader, med IOP från 10-21 mmHg och ICP från 5-15 mmHg12. Tryckskillnaden genom laminan mellan de två kamrarna kallas translaminär tryckgradient (TLPG)13. En stor riskfaktor för glaukom är förhöjd IOP14.
Ökad IOP ökar belastningen inom och över laminärregionen6,15,16. Experimentella observationer hos människor och djurmodeller presenterar ONH som den ursprungliga platsen för axonal skada17,18. Det biomekaniska paradigmet för IOP-relaterad stress och stam som orsakar glauomatiska skador vid ONH påverkar också patofysiologin av glaukom19,20,21. Även om hos människor tryck-inducerade förändringar mekaniskt skada RGC axons22, gnagare som saknar kollagen plattor inom lamina kan också utveckla glaukom7,23. Dessutom är förhöjda IOP fortfarande den mest framträdande riskfaktorn i primära öppna vinkel glaukom patienter, medan normala spänning glaukom patienter utveckla glauomatous optik neurotoxiskt även utan förhöjda IOP. Dessutom finns det också en delmängd av okulär hypertensiva patienter som visar inga optik nerv skador. det har också föreslagits att ryggmärgsvätskan tryck (CSFp) kan spela en roll i glaukom patogenes. Bevis tyder på att ICP sänks till ~ 5 mmHg hos glaukom patienter jämfört med normala individer, vilket orsakar ökat translaminärt tryck och spelar en avgörande roll i sjukdom24,25. Tidigare visades det i en hundmodell, att genom att kontrollera IOP- och CSFp-förändringar kan det finnas stora förskjutningar av den optiska skivan26. Höja GSFp i svin ögon har också visat ökad huvudstam inom LC regionen och retrolaminar neural vävnad. Ökad belastning på RGCs och LC-regionen bidrar till axonal transport blockering och förlust av RGCs27. Progressiv degeneration av RGCs har associerats med förlust av trofiskt stöd28,29, stimulering av inflammatoriska processer/immunreglering30,31 och apoptotiska effektorer29,32,33,34,35. Dessutom orsakar axonal skada (figur 3) skadliga effekter på RGCs, vilket utlöser regenerativa fel36,37,38,39. Även om effekterna av IOP har studerats väl, har minimal forskning utförts på onormala translaminära tryckförändringar. De flesta behandlingar för glaukom fokuserar på att stabilisera IOP. Men även om sänkning av IOP saktar utvecklingen av sjukdomen, det inte vända synfält förlust och förhindra fullständig förlust av RGCs. Förstå tryck-relaterade neurodegenerativa förändringar i glaukom kommer att vara avgörande för att förhindra RGC död.
Aktuella bevis tyder på att translaminar tryck modulering på grund av att olika mekaniska, biologiska eller fysiologiska förändringar hos patienter som lider av traumatiska eller neurodegenerativa synnedsättningar kan orsaka betydande synförlust. För närvarande finns det ingen sann preklinisk mänsklig bakre segmentmodell som kan tillåta studier av glauomatous biomekaniska skador inom ex vivo mänskliga ONH. Observation och behandling av det bakre segmentet av ögat är en enorm utmaning inom oftalmologi27. Det finns fysiska och biologiska hinder för att rikta in sig på det bakre ögat, inklusive höga elimineringshastigheter, blod-retinal barriär och potentiella immunologiska svar40. De flesta effekt- och säkerhetstester för nya läkemedelsmål uppnås med hjälp av in vitro cellulära och in vivo djurmodeller41. Okulär anatomi är komplex, och in vitro studier inte exakt efterlikna de anatomiska och fysiologiska barriärer som presenteras av vävnad modellsystem. Även om djurmodeller är en nödvändighet för farmakokinetiska studier, kan okulär fysiologin hos det mänskliga bakre ögat variera mellan olika djurarter, inklusive cellulär anatomi av näthinnan, vaskulaturen och ONH41,42.
Användningen av levande djur kräver intensiva och detaljerade etiska regler, högt ekonomiskt engagemang och effektiv reproducerbarhet43. Nyligen har flera andra riktlinjer följt för etisk användning av djur i experimentell forskning44,45,46. Ett alternativ till djurförsök är användningen av ex vivo mänskliga ögonmodeller för att undersöka sjukdomspatogenes och potentiell analys av läkemedel för att skydda ONH-skador. Mänsklig postmortemvävnad är en värdefull resurs för att studera mänskliga sjukdomsparadigm, särskilt när det gäller neurodegenerativa sjukdomar hos människor, eftersom identifiering av potentiella läkemedel som utvecklats i djurmodeller kräver behovet av att kunna översättas till människor47. Ex vivo mänskliga donator vävnad har använts i stor utsträckning för studier av mänskliga störningar47,48,49, och mänskliga främre segment perfusion organ kultursystem har tidigare gett en unik ex vivo modell för att studera patofysiologi av förhöjda IOP50,51,52.
För att studera translaminärt tryck relaterade till IOP och ICP i mänskliga ögon, utformade och utvecklade vi framgångsrikt ett tvåkammar translaminärt autonomt system (TAS) som självständigt kan reglera IOP och ICP med hjälp av bakre segment från mänskliga donatorögon. Det är den första ex vivo mänskliga modellen att studera translaminära tryck och utnyttja de biomekaniska effekterna av TLPG på ONH.
Denna ex vivo mänskliga TAS-modell kan användas för att upptäcka och klassificera cellulära och funktionella modifieringar som uppstår på grund av kronisk höjd av IOP eller ICP. I den här rapporten beskriver vi steg-för-steg-protokollet för dissekering, inställning och övervakning av TAS mänskliga bakre segmentmodellen. Protokollet kommer att göra det möjligt för andra forskare att effektivt reproducera denna nya ex vivo trycksatta mänskliga bakre segment modell för att studera biomekanisk sjukdom patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Enligt bestämmelserna i Helsingforsdeklarationen erhölls för forskning som rör mänsklig vävnad.
OBS: Ögon från välrenommerade ögonbanker (t.ex. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) skördades inom 6–12 timmar från döden och donatorserum testades för hepatit B, hepatit C och humant immunbristvirus 1 och 2. När de togs emot dissekerades ögonen och sattes upp i TAS-modellen inom 24 timmar. Uteslutningskriterier ingår alla okulär patologi. Ögon uteslöts inte baserat på ålder, ras eller kön. För att säkerställa näthinnans livskraft vid mottagandet skördades näthinneexplanter från vävnadsdonatorerna och odlades i 7 och 14 dagar (kompletterande figur 1). Dessa näthinnor var också dissociated och växte friska RGCs i kultur för 7 dagar med positiva färgning för RGC markör, RNA-bindande protein med flera splitsning (RBPMS), samt positiva neurofilament ljus kedjan (NEFL) färgning i deras neurofilaments (kompletterande figur 2). .
1. Beredning och sterilisering av utrustning och förnödenheter
- Se materialförteckningen för en fullständig förteckning över nödvändiga leveranser samt leverantörs- och katalognummer.
- Sterilisera all utrustning och alla instrument före användning genom autoklavering eller användning av etylenoxidambuler.
2. Beredning av perfusionsmedium
- Tillsätt 1% penicillin streptomycin (10 000 U/mL penicillin, 10 000 μg/mL streptomycin i 0,85% NaCl) och 1% L-glutamin (200 mM) till 1 000 mL hög glukos Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM).
- Sterilisera perfusionsmediet genom att passera genom ett 0,22 μm-filter.
3. Installation av translaminar autonomt system (TAS)
- Ställ in inflödessprutor (IOP- och ICP-reservoarer).
- Tillsätt 30 ml perfusionsmedium (sektion 2) till en 30 ml spruta. Fäst en 3-vägs kran på 30 ml sprutan. Fäst ett 0,22 μm hydrofilt filter på 3-vägs kranen. Anslut en 15 G Luer stub adapter till 0,22 μm hydrofila filter.
- Ta bort luftbubblor från sprutinställningen. Fäst slangar på 15 G Luer stub adaptern. Stäng sidoporten på kranen med ett oinventerat universellt låslock. Upprepa för totalt två inställningar.
- Märk den ena sprutan som kanal 1 intrakraniellt tryck (CH1 ICP) och den andra sprutan som kanal 2 intraokulärt tryck (CH2 IOP).
- Ställ in utflödessprutor (IOP- och ICP-reservoarer).
- Fäst en 3-vägs kran på en 30 ml spruta. Anslut en 15 G Luer stub adapter till 3-vägs kranen. Fäst slangar på 15 G Luer stub adaptern.
- Stäng sidoporten på kranen med ett oinventerat universellt låslock. Upprepa för totalt två inställningar. Märk den ena sprutan som CH1 ICP och den andra sprutan som CH2 IOP.
4. Förberedelse av människans hela ögonglober
OBS: Om hela ögon tas emot, följ proceduren nedan för att separera det främre segmentet från det bakre segmentet av ögat. Om ögonen tas emot bisected, börja på steg 4.4.
- Placera ett helt öga i povidone-jodlösning i 2 min.
- Skölj ögat i steril fosfatbuffrad lösning (PBS) för att skölja av povidonjod. Upprepa 2 gånger.
- Ta bort adnexa från hela ögongloben med tång och sax. Bisect ögat vid ekvatorn för att separera de främre och bakre segmenten av ögat.
- Ta bort synnerven. Ta bort glaskroppen från det bakre segmentet.
- Trimma ytterligare sclera från bakre segmentet, om det behövs, för att säkerställa en bra passform på den runda kupolen i IOP-kammaren (botten). Med tång, se till att näthinnan sprids jämnt över segmentets bakre del.
- IOP-kammare (nederkant)
- Placera det mänskliga bakre segmentet i TAS:s IOP-kammare (nedre) över den runda kupolen med synnerven vänd mot toppen.
- Försegla det bakre segmentet med epoxiharts O-ringen med fyra skruvar, vilket säkerställer en tät tätning.
- Sätt in slangen i IN- och UT-portarna i IOP-kammaren (nedre) kammaren. IOP-inflödesspruta med slang som innehåller medium sätts in i IN-porten och den tomma IOP-utflödesspruten med slangar sätts in i OUT-porten.
- Använd push/pull-metoden för att långsamt infusera perfusionsmediet i inflödesporten för att fylla den bakre ögonkoppen samtidigt som du långsamt drar ut perfusionsmediet genom utflödesspruten för att avlägsna eventuella luftbubblor från linjerna. Sluta ingjuta medium när både IN- och OUT-rören är tomma på luftbubblor.
- Lås kranarna i avläge. Ta bort 30 ml sprutan från IOP IN-portfilterenheten och fyll på med totalt 30 ml medium. Sätt tillbaka 30 ml-sprutan på filterenheten.
-
ICP-kammare (överst)
- Placera ICP-kammaren (övre) kammaren/locket över baksidan av det bakre segmentet. Se till att synnerven är i den övre kammaren. Försegla den övre kammaren med fyra skruvar.
- Sätt in slangarna i IN- och OUT-portarna i ICP-kammaren (överst). ICP-inflödesspruta med slangar som innehåller medium sätts in i IN-porten och den tomma ICP-utflödesspruten med slangar sätts in i OUT-porten.
- Infusera försiktigt och långsamt mediet i IN-porten för att fylla ICP-kammaren och avlägsna luftbubblor från linjerna med hjälp av push/pull-metoden. Sluta ingjuta medium när ICP-kammaren samt både IN- och OUT-slangarna är tomma på luftbubblor.
- Lås kranarna i avläge. Ta bort 30 ml-sprutan från ICP i portfiltermonteringen och fyll på med totalt 30 ml medium. Sätt tillbaka 30 ml-sprutan på filterenheten.
5. Installation av datainspelningssystem
OBS: Datainspelningssystemet består av en 8-kanals strömkälla, flerkanalsbryggförstärkare, hydrostatiska tryckgivare och en dator med programvara för datainsamling (se Materialtabell). Nedan beskrivs hur du konfigurerar och kalibrerar systemet.
- Anslut nätsladden till baksidan av den 8-kanaliga strömkällan och anslut till en batteriback-up-enhet.
- Anslut USB-kabeln från den 8-kanaliga strömkällan till datorns baksida.
- Anslut den 8-kanaliga strömkällan till flerkanalsbryggförstärkaren med den medföljande I2C-sladden.
- Anslut Bayonet Neill-Concelman (BNC) kablar till kanalingångarna framför 8-kanals strömkällan och slutet av kablarna till motsvarande kanaler på baksidan av flerkanalsförstärkaren.
- Anslut givarens kablar till framsidan av flerkanalsförstärkaren.
- Installera programvaran för datainsamling på datorn.
- Kör installationsprogrammet för dataförvärvsprogram från den medföljande programvaru-CD:n.
- Följ anvisningarna på datorskärmen.
- När installationen är klar väljer du Slutför.
- Slå på den 8-kanaliga strömkällan.
- Slå på datorn och initiera programvaran för datainsamling.
- Välj arkiv | Ny.
- Välj installation | Kanalinställningar. Välj tre kanaler (längst ned till vänster på skärmen). Byt namn på kanalerna enligt följande: CH1 ICP i kolumnen Kanaltitel . CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Välj 2 mV för intervallet på alla kanaler. Välj Ingen beräkning för kanalerna 1 och 2 i kolumnen Beräkning.
- Välj Aritmetik för kanal 3 i kolumnen Beräkning. I avsnittet Formel: Välj kanaler/CH2; Välj aritmetisk "-"; Välj kanaler/CH1. Välj mmHg i utdatasektionen. Välj OK. Välj OK igen.
- Ställ in och kalibrera de hydrostatiska tryckgivare.
OBS: Hydrostatiska tryckgivare måste kalibreras före experiment med följande metod.- Anslut de hydrostatiska tryckgivare till givarens linjer som är fästa vid flerkanalsbryggförstärkaren.
- Fäst en 30 ml spruta fylld med luft på sidoporten på CH1-tryckgivaren (ICP). Fäst sfygmomanometern på botten av CH1-tryckomvandlaren.
- I diagrammet visar du sidan för datainsamlingsprogramvaran, ställer in samplingshastigheten med vänster och klickar på pilen bredvid samplingstiden och väljer 100. Högerklicka sedan i området CH1 (ICP) på sidan.
- Välj Bryggförstärkare. Välj nätfilter. Välj Noll och vänta tills systemet nollställs, var noga med att inte flytta tryckomvandlaren.
- Nyp ihop tryckgivarens vita flikar och tryck in luft genom givaren tills 40 mmHg erhålls på sfygmomanometern. Släpp de vita flikarna och ta bort sprutan och sfygmomanometern.
- På sidan Enhetsomvandling väljer du "minus (-)"-tecknet. Markera den högsta platån för att indikera 40 mmHg. Klicka på Pilen för punkt 1 och ange 40.
- Markera den lägsta platån för att indikera 0 mmHg. Klicka på Pilen för punkt 2 och ange 0. Välj mmHg för enheterna. Välj OK.
- Välj OK (sidan Bridge Amp). Upprepa steg 9,1–9,7 för CH2 (IOP) med 100 mmHg för den högsta platån och 0 för den lägsta platån.
- Anslut TAS/posterior-segmentenheten till datainsamlingssystemet.
- Placera TAS/posterior-segmentenheten i en inkubator (37 °C, 5 % CO2). Fäst ICP-slangarna från OUT-porten till CH1-tryckgivaren (ICP).
- Fäst IOP-slangen från OUT-porten till CH2-tryckgivaren (IOP).
- Fäst sprutinställningarna (ICP och IOP) med medium från IN-portarna till ringstativet.
- Välj Starta sampling på sidan Diagramvy. Ställ in samplingshastigheten med vänsterklickning på pilen bredvid samplingstiden och välj Långsam och 1 min.
- Justera sprutorna på ringstället upp eller ner för att reglera ICP- och IOP-tryck till protokollkrav.
- Utför systemisk påfyllning av medium i systemet var 48-72 h genom push and pull-metoden.
6. Datahämtning och analys
- Öppna datafilen i datainsamlingsprogramvaran.
- Klicka på ikonen Lägg till i datafältet i avsnittet Data Pad. Ett nytt fönster visas.
- I avsnittet Sök efter väljer du Tid på den nedrullningsbara menyn.
- I avsnittet Välj väljer du 1 timme var 1 timme på de nedrullningsbara menyerna.
- I avsnittet Steg igenom väljer du Hel fil och klicka sedan på Lägg till.
- Klicka på ikonen Data Pad View i avsnittet Data Pad. Markera alla data och kopiera/klistra in i ett kalkylblad.
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelserna för IOP, ICP och TLPG för varje 24 timmar. Sortera data med hjälp av alternativet pivottabell i ett kalkylbladsprogram och diagram.
7. Immunohistokemi och hematoxylin och eosinfärgning av bakre segment
- Ta bort de bakre ögonsegmenten efter olika tidpunkter från TAS-modellen och fixera i formalin innan du paraffinerar.
- Sektion ögonen för att producera sagittal vävnad plan.
- Deparaffinisera de paraffininbäddade segmenten med en 100% xylen, 95% etanol, 50% etanollösning.
- Tvätta rutschkanorna med PBS i 10 min och blockera med en blockerande buffert vid rumstemperatur i 1 h.
- Etikettsektioner med primära antikroppar: anti-kollagen IV (Extracellulär Matrix (ECM) markör, NB120-6586, 1:100) och anti-laminin (ECM-markör, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC-markör), GTX118619, 1:50).
- Detektera de primära antikropparna med hjälp av Alexa Fluor sekundära antikroppar (Alexa Fluor 488 get anti-kanin, A11008, 1:500).
- Motbehåll cellkärnorna med DAPI anti-fade-lösning.
- Ta bilder av de färgade sektionerna och fasbilderna med 4x och 10x objektiv med hjälp av ett fluorescensmikroskop (se Materialförteckning).
- För hematoxylin- och eosinfärgning ,bearbeta sektionerna i ett automatiserat färgningssystem (se Tabell över material) för deparaffinering med en 100%, xylen 95% etanol, 50% etanollösning och fläck med H&E.
- Ta bilder med 4x- och 10x objektiven med ett mikroskop med en ljusfältsljuskälla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design och skapande av det translaminära autonoma systemet
Translaminära tryckdifferens är en potentiell nyckelmekanism i patogenesen vid olika sjukdomar, inklusive glaukom. Användningsområden för den beskrivna modellen inkluderar, men är inte begränsade till, studier av glaukom (förhöjd IOP, kanske minskad ICP), traumatisk hjärnskada (förhöjd ICP) och långvarig exponering för mikrogravitation-associerade synnedsättning (förhöjda ICP, förhöjda IOP). För att upptäcka molekylär patogenes riktad mot translaminärt tryck i det mänskliga ögat designade, skapade och validerade vi TAS-modellen. Vår nya ex vivo mänskliga modell ger ett unikt prekliniskt system för att självständigt studera ICP och IOP-associerade patogena förändringar. För att ta itu med mänskliga prekliniska tillämpningar ger vår modell ett ex vivo-paradigm för att studera patogenes på grund av translaminära tryckförändringar. Den förseglade modelldesignen är avbildad med solida fram- och genomskinliga vyer (figur 1A, 1B) med en detaljerad diagrammatisk vy av modellen för att avbilda alla in- och utflödesportar (figur 1C). Den färgtransparenta vyn med ett mänskligt bakre segment i en faktisk 3D-utskriven modell visas (bild 1D, 1E).
Translaminar Autonomous System: En ny ex vivo mänsklig translaminär tryckmodell
Vi genererade TAS-modellen med två autonoma kammare (dvs. IOP- och ICP-kammare). I den nedre basen av modellen placerades den mänskliga bakre koppen över toppen av den runda kupolen med den optiska nerven vänd mot toppen. När den bakre koppen placerades och förseglades i IOP-kammaren placerade vi ICP-kammaren ovanpå nerven. Vi behöll båda kamrarnas oberoende och en perfekt tätning med O-ringar som passar varje kammare exakt (figur 2A). Bottenkammaren eller IOP-kammaren fyllde och reglerat tryck i koppen, medan den övre kammaren passar runt synnerven och reglerade ICP runt nerven genom hydrostatiska tryckbehållare. Med hjälp av modellen reglerade vi självständigt IOP och ICP med hydrostatiskt tryck. Skillnaden mellan båda kamrarna identifierades som en förändring av translaminär tryckgradient (figur 2B). Modellen som avbildas med alla slutliga beslag på plats, inklusive in- och utflödesbehållaresprutorna anslutna visas i figur 2C.
Framgångsrikt kultur- och tryckunderhåll i det translaminära autonoma systemet
För att säkerställa att båda kamrarna fungerade självständigt i systemet reglerade vi flera tryckskillnader genom att hålla IOP-kammaren och ICP vid olika genomsnittliga tryckskillnader (normala TLPG: IOP: ICP, 15:5 mmHg; förhöjda TLPG >10 mmHg; förhöjda TLPG >20 mmHg). Vi testade inledningsvis upprätthållandet av genomsnittliga normala tryckskillnader i båda kamrarna (normala IOP/ICP) genom olika parametrar för IOP- och ICP-förhållanden: 1) normal IOP: minskad ICP (figur 3A); 2) Förhöjd IOP: minskad ICP (figur 3B); och 3) förhöjd IOP: förhöjd ICP (figur 3C). Den genomsnittliga normala IOP varierar från 10-21 mmHg (episcleral venous tryck inräknat) och normala ICP från 5-15 mmHg. I stället för begränsningen av att inte ha vaskulär tryck, behöll vi fortfarande trycket på dessa hastigheter, eftersom tanken var att utöva maximalt tryck vid ONH. Vi reglerade självständigt olika trycknivåer i båda kamrarna (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20–40 mmHg). För att säkerställa tryckunderhåll mellan båda kamrarna höll vi IOP under normala förhållanden (15 mmHg) och minskade ICP (4 mmHg) för att upprätthålla en TLPG (IOP-ICP) mellan LC på 11 mmHg (figur 3A). Vi förhöjde sedan IOP (43 mmHg) och minskade ICP (3 mmHg) (figur 3B) och slutligen förhöjda tryck i båda (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) för att generera den största nivån av TLPG vid 55 mmHg (figur 3C). För att säkerställa vävnadens livskraft (figur 4) utbyttes mediet i vävnaderna var 48: e timme genom att fästa en tom spruta på utflödeskranen och långsamt trycka cirka 5 ml perfusionsmedium genom inflödesporten med hjälp av push/pull-metoden. Minimala tryckökningar inträffade vid tidpunkten för medelutbyte (figur 4G) och påverkade inte morfologin hos ONH som visas i 14- och 30-dagars immunohistokemidata (figur 4A-F). För att bekräfta att vi kunde odla bakre segment för längre tidsramar med effektiv livskraft inom TAS-modellen analyserade vi tvärsnitt av ONH efter underhåll av normala IOP och ICP i 14 och 30 dagar. Vi kunde framgångsrikt odla dessa segment i modellen i 14 dagar (figur 4A, 4B) med friska ONH-celler och extracellulär matris uttryck av kollagen IV (COLIV) vid optik nerv huvudet (figur 4C). Liknande lönsamhet och underhåll av det bakre segmentet observerades också i 30 dagar (figur 4D, 4E) med uttryck för COLIV och DAPI (figur 4F). Den grafiska representationen av TLPG-värden (IOP-ICP) (figur 4G) visar ett konstant underhåll av IOP-värden över tid vid 15,6 ± 4,6 mmHg och ICP-medelvärde vid 11,0 ± 4,6 mmHg i 30 dagar med en TLPG på 4,6 ± 1,3 mmHg (tabell 1).
Morfologiska förändringar av ONH-postens förhöjda translaminära tryckgradient
En vanlig klinisk egenskap hos den åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomen glaukom är ONH cupping. Prelaminar cupping kännetecknas av progressiv förlust av havande neurala vävnader, vilket ökar både djupet och bredden på koppen och därmed ökar kopp-till-disk-förhållandet. Laminar cupping är bindvävsbaserad, med LC som rör sig bakre progressivt och gräver. Glaucomatous koppning är en kombination av dessa två komponenter, som återspeglar både skador och ombyggnad av laminära bindväv. Höjd i IOP leder till LC-förtjockning på grund av en ökning av kollagenfibrilmassan53. Med hjälp av TAS-modellen skapade vi en förhöjd TLPG genom att öka IOP eller minska ICP över olika tidpunkter. Vi behöll ett intervall av förhöjda TLPG i 7 dagar med genomsnittliga IOP-värden över tid vid 22,8 ± 18,6 mmHg och ICP-medelvärde vid 6,9 ± 7,6 mmHg med en TLPG på 15,9 ± 11,8 mmHg (tabell 2). De högsta TLPGs dokumenterades vid 36 mmHg. Mänskliga bakre segment analyserades sedan morfologiskt för progressiv förtjockning av laminära strålar och koppning vid ONH i H&E färgade sektioner som tiden gick mellan kontroll, 1 dag, 3 dagar och 7 dagar under förhöjda TLPG (figur 5A-D). Cupping och förtjockning observerades vid 7 dagar av förhöjda TLPG (figur 5D). Vidare visade COLIV-uttryck över tid mellan kontroll, 1 dag, 3 dagar och 7 dagar förtjockade balkar och ökat uttryck med 7 dagar (figur 5E-H). Fasbilder som jämför kontrollvävnad som inte odlas i TAS-modellen (figur 5I) och 7 dagar (figur 5J) av förhöjda TLPG inom TAS-modellen visar friska RGCs inom GCL (figur 5I) utan koppning (figur 5I) för kontrollen, medan bilderna under förhöjda TLPG-förhållanden visar omfattande koppning utan återstående RGC-markör (RBPMS-RGC-markör) i RNFL (figur 5J) och ökad ombyggnad av ECM som visas av ONH (figur 5J).
Figur 1: Translaminar autonomt system. Modellskildring. (A) Solid framifrån. B) Transparent vy. C) Diagrammatisk vy. (D) Färg transparent vy. (E) Faktisk 3D-utskriven modell. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Mekanik för det translaminära autonoma systemet. A) TAS-modellen med ICP- och IOP-kammare för reglering av translaminära tryckskillnader. B) Avbildning av TAS-modellen med autonom reglering av hydrostatiskt tryck i båda kamrarna genom reservoarhöjd. (C) Bild av TAS-modellen med alla beslag på plats och representation av inflödes- och utflödesbehållaresprutorna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Oberoende tryckunderhåll inom det translaminära autonoma systemet. Grafisk representation av tryck som är oberoende modulerade och stabila tryck upprätthålls i de övre (ICP) och botten (IOP) kamrarna med (A) normala IOP/minskad ICP (B) förhöjda IOP/minskad ICP och (C) förhöjda IOP/förhöjda ICP. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Underhåll och livskraft hos bakre segment inom det translaminära autonoma systemet. Mänskliga bakre segment odlades med TAS-modellen i 14 och 30 dagar under normala förhållanden av IOP och ICP. H&E färgade tvärsnitt av mänsklig ONH vid 14 dagar i (A) låg förstoring (40x) och (B) hög förstoring (100x). (C) COLIV immunostaining med DAPI uttryck (100x). Liknande skildringar av H&E färgning vid 30 dagar i (D) 40x och (E) 100x mikrografer och (F) COLIV immunostaining med DAPI uttryck (100x). G) Grafisk presentation av Δ i mmHg av IOP-ICP (TLPG) för mänskliga bakre segment som upprätthålls i 30 dagar i kultur. COLIV = grön; DAPI = blå; (A, infälld B). (D, infälld E). H&E = hematoxylin och eosinfläck. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Morfologisk omstrukturering av synnervens huvud efter förhöjd translaminär tryckgradient i det translaminära autonoma systemet. Mänskliga bakre segment odlades med tas-modellen för olika tidpunkter under förhöjda TLPG villkor. Tvärsnitt av mänsklig ONH som visar H&E färgning av (A) kontroll (B) 1 dag i TAS (C) 3 dagar i TAS, och (D) 7 dagars kultur. Uttryck av COLIV med DAPI i ONH av (E) kontroll (F) 1 dag i TAS (G) 3 dagar i TAS och (H) 7 dagar i kultur. Faskontrast ONH tvärsnittsbilder av (I) kontroll ONH som visar (I') näthinnefärgning av RBPMS och (I'') ONH färgning med COLIV och DAPI. Faskontrast av (J) 7 dagar av förhöjda TLPG i TAS med insets som visar (J') näthinne färgning av RBPMS och (J'') ONH färgning med COLIV och DAPI. COLIV, RBPMS = grön; DAPI = blå; (A–D) 40x förstoring; (E–H) 100x Förstoring; (I och J) 200x förstoring; J') 400x förstoring; (J'') 100x förstoring; (J, infälld J' och J''' ). H&E = hematoxylin och eosinfläck; TAS = Translaminar autonoma system. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Dagar | Genomsnittlig IOP på 24 timmar | Genomsnittlig ICP på 24 h | Genomsnittlig TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| STD | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabell 1: Underhåll av normal TLPG som upprätthålls i 30 dagar. Tabellvärden som visar IOP-, ICP- och TLPG-värden var 24:e timme med genomsnittlig avvikelse och standardavvikelse under hela tidskursen.
| Dagar | Genomsnittlig IOP på 24 timmar | Genomsnittlig ICP på 24 h | Genomsnittlig TLPG på 24 timmar |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| STD | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabell 2: Underhåll av en rad förhöjda TLPG som bibehålls i 7 dagar. Tabellvärden som visar IOP-, ICP- och TLPG-värden var 24:e timme med genomsnittlig avvikelse och standardavvikelse under hela tidskursen.
Kompletterande figur 1: Ex vivo human retinal explant kultur. Faskontrast, RGC positiva färgade (RBPMS-grön) och cellulära (DAPI-blå) färgade bilder av retinal explants i kultur för (A-C) 7 dagar och (D-F) 14 dagar (200x förstoring). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 2: Vuxna RGC-kulturer för vuxna. RGC-markör (RBPMS-grön) och DAPI (blå) färgade RGCs 7 dagar i kultur (A) 200x (B) 400x förstoring. C) RGCs färgade för NEFL (grön) och DAPI (blå) vid 400x förstoring. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mänskliga postmortemvävnader är en särskilt värdefull resurs för att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar eftersom identifiering av potentiella läkemedel som utvecklats i djurmodeller måste översättas till människor47. Effekterna av mänsklig IOP höjd är väletablerade, men minimal forskning har utförts på onormala ONH translaminära tryckförändringar. Även om det finns flera djurmodeller och finita modellering av mänsklig ONH finns det ingen ex vivo mänsklig modell för att studera translaminära tryckförändringar41,54,55,56,57. Det finns ett aktuellt ouppfyllt behov av en ny preklinisk mänsklig modell som kan rikta in sig på sjukdom etiologi ex vivo med hjälp av IOP och ICP och kan identifiera olika patogena paradigm relaterade till glaukom patogenes. Att förstå tryckrelaterade patologiska förändringar på ONH kommer att vara avgörande för att förhindra RGC död. Den kombinerade användningen av IOP, ICP och TLPG inom TAS-modellen är ett unikt tillvägagångssätt för att studera tryckberoende degeneration på ett prekliniskt sätt med hjälp av mänskliga bakre segment vävnad. I TAS-modellen kan vi odla bakre segment av mänskliga ögonkoppar för att studera förändringar av translaminärt tryck genom autonom reglering av IOP- och ICP-kamrarna. Det ger en grund för att utveckla ett nytt utbud av terapier som fokuserar på translaminärt tryck som en mekanism för degeneration.
Att ställa in TAS-modellen kräver uppmärksamhet på detaljer i många aspekter: korrekt dissekering av de mänskliga bakre segmenten, säkerställa att näthinnan är intakt och spridd över den bakre koppen, korrekt placering av segmentet över kupolen i IOP-kammaren, korrekt placera ICP-kammaren över ON, effektiv tätning av båda kamrarna, och upprätthållande av hydrostatiska tryck oberoende genom att reglera höjden på IOP- och ICP-reservoarer. Dissekering måste utföras i ögon som inte är mer än 24-36 h postmortem, eftersom näthinnan gradvis försämras om effektivt odlingsmedium inte fylls på. Systemisk påfyllning av medium utfördes i vårt system var 48-72 h. En annan viktig aspekt av systemet är längden på ON. Det är viktigt att se till att minst 0,5–1 cm ON lämnas kvar på det kadaveriska ögat. Donatorögon ska inte användas om de har korta ON, ON är skadad, jordgloben är komprometterad och deflaterad eller om ON-hysan lossnar. När det bakre segmentet placeras över kupolen måste O-ringen dessutom vara ordentligt monterad på plats och den övre ICP-kammaren korrekt förseglad med skruvar. Trycknålsbeslagen där slangen fästs på varje sida av modellens övre och nedre botten måste också testas för att säkerställa att slangen passar och låser sig på plats. Om slangen inte är ordentligt på plats kommer luftbubblor att observeras i slangen och äventyra tryckmätningarna i varje kammare.
Underhåll och livskraft av postmortem bakre segmenten i vår TAS-modell var en kritisk oro för detta protokoll. Mänsklig postmortemvävnad har tidigare studerats utförligt48,49, med en ny RNA-analysstudie av 1 068 postmortem donatorvävnader som bekräftar att postmortem mänsklig hjärnvävnad som samlats in under årtionden kan fungera som högkvalitativt material för studier av mänskliga störningar47. Dessutom har tidigare framgångsrika uttryck profilering av okulär mänskliga givaren öga vävnader postmortem utförts58. Genuttryck PLIER värden för apoptos gener var minimala eller obefintliga i denna data uppsättning för retinal vävnad 6 h postmortem58. Dessutom har det visat sig att hypotermisk lagring av ögonvävnad kan utföras effektivt59. Det har visat sig att ganglion cell aktivitet upprätthålls i 50 h när minipig ögon lagras vid ischemiska och hypotermiska förhållanden41,60. Därför använde vi 6 h-punkten som våra inklusionskriterier för insamling av donatorögoncup. Hastigheten på postmortem försämring av bakre segment och retinal avskildhet saknas i litteraturen, men vår enucleation inom 6 h, leverans över is och kultur inställning av maximal 36 h är väl inom intervallet av vävnad livskraft som beskrivs i kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2. Med hjälp av TAS-modellen uppnådde vi framgångsrikt hälsosamt underhåll av vävnad i 30 dagar.
En annan begränsning av TAS-modellen är vår nuvarande oförmåga att modellera de cykliska dygnsrytmen hos ICP och IOP som observeras under normala fysiologiska förhållanden. Detta kan åtgärdas i framtiden genom att använda en pump som kan reglera rytmisk IOP- och ICP-infusion. Vidare är en annan varning till modellen bristen på blodcirkulation i det kadaveriska ögat. Således kan effekterna av blodtrycket inte studeras, men detta gör det också möjligt för oss att specifikt avgränsa de patogena effekterna av endast TLPG-förändringar, inklusive IOP och ICP.
En framtida omfattning av modellen skulle omfatta automatisering av reservoarsystemen för hydrostatiska förändringar och perfusion av medium genom en infusionspump med en utgång tom spruta på givaren istället för de flera omgångar av medelförändring som implementerades i detta protokoll. Vätskan från IOP- och ICP-behållaren kunde också samlas in och analyseras. Medium kan samlas in för biomarköruttryck för att rikta in sig på framtida terapier. Vi kan också identifiera vägar eller molekyler som kan behandlas med läkemedel eller genterapi och testa dessa terapier i olika djurmodeller av ICP innan de översätts till kliniska prövningar på människa.
Sammanfattningsvis ger vår modell inte bara en mänsklig grund för testning, men den kan också användas för att validera terapier som kan rikta translaminära tryckförändringar i ögat. Det öppnar en väg för att utföra precisionsmedicin genom transplantation av patientstamceller på mänskliga donatorögonhål och trycksätta dem i TAS-modellen. Detta gör det möjligt för oss att testa terapier ex vivo med kapacitet att kunna översättas till kliniken och relateras till levande individer. Med vår modell kan vi nu bedöma de förändringar som sker i translaminärt tryck och hur det spelar en avgörande roll i patogenesen i samband med olika traumatiska och neurodegenerativa sjukdomar. Detta kommer att leda till en bättre förståelse av patogena molekylära mekanismer i ONH som är associerade med IOP och ICP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Manuskriptets författare har inga potentiella intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Finansieringen av detta projekt var genom diskretionära medel av Dr. Colleen M. McDowell. Detta arbete stöddes delvis av ett obegränsat anslag från Research to Prevent Blindness, Inc. till UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Vi tackar Drs. Abbot F. Clark och Weiming Mao för deras tekniska hjälp med modellen för perfusionsorgankultur. Vi tackar Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) för att ha försett de mänskliga donatorögonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R.
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R.
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
