Summary
Describimos y detallamos el uso del sistema autónomo translaminar. Este sistema utiliza el segmento posterior humano para regular independientemente la presión dentro del segmento (intraocular) y que rodea el nervio óptico (intracraneal) para generar un gradiente de presión translaminar que imita las características de la neuropatía óptica glaucomatosa.
Abstract
Existe una necesidad insatisfecha actual de un nuevo modelo humano preclínico que pueda dirigirse a la etiología de la enfermedad ex vivo utilizando la presión intracraneal (PIC) y la presión intraocular (PIO) que pueda identificar varios paradigmas patógenos relacionados con la patogénesis del glaucoma. Los modelos de cultivo de órganos de perfusión del segmento anterior humano ex vivo se han utilizado y aplicado con éxito como tecnologías efectivas para el descubrimiento de la patogénesis del glaucoma y las pruebas terapéuticas. El cribado preclínico de fármacos y la investigación realizada en sistemas de órganos humanos ex vivo pueden ser más traducibles a la investigación clínica. Este artículo describe en detalle la generación y el funcionamiento de un nuevo modelo de presión translaminar humana ex vivo llamado sistema autónomo translaminar (TAS). El modelo TAS puede regular de forma independiente la PIC y la PIO utilizando segmentos posteriores de donantes humanos. El modelo permite estudiar la patogénesis de manera preclínica. Puede reducir el uso de animales vivos en la investigación oftálmica. A diferencia de los modelos experimentales in vitro, la estructura, complejidad e integridad del tejido de la cabeza del nervio óptico (ONH) también se pueden mantener dentro del modelo TAS ex vivo.
Introduction
Las estimaciones mundiales en encuestas recientes sugieren que 285 millones de personas viven con discapacidad visual, incluidos 39 millones que son ciegos1. En 2010, la Organización Mundial de la Salud documentó que tres de las nueve principales causas de ceguera enumeradas ocurren en el segmento posterior del ojo1. Las enfermedades oculares del segmento posterior involucran la retina, la coroides y el nervio óptico2. La retina y el nervio óptico son extensiones del sistema nervioso central (SNC) del cerebro. Los axones de células ganglionares de la retina (RGC) son vulnerables al daño porque salen del ojo a través de la cabeza del nervio óptico (ONH) para formar el nervio óptico3. El ONH sigue siendo el punto más vulnerable para los axones RGC debido a la malla 3D de haces de tejido conectivo llamada lámina cribrosa (LC)4. La ONH es el sitio inicial de insulto a los axones RGC en glaucoma5,6,7, y se han estudiado cambios en la expresión génica dentro de la ONH en modelos de hipertensión ocular y glaucoma8,9,10. Los axones RGC son susceptibles en la ONH debido a los diferenciales de presión entre el compartimento intraocular, llamado presión intraocular (PIO), y dentro del espacio subaracnoideo perióptico externo, llamado presión intracraneal (ICP)11. La región LC separa ambas áreas, manteniendo diferenciales de presión normales, con PIO que oscila entre 10 y 21 mmHg y PIC desde 5-15 mmHg12. La diferencia de presión a través de la lámina entre las dos cámaras se denomina gradiente de presión translaminar (TLPG)13. Un factor de riesgo importante del glaucoma es la PIO14 elevada.
El aumento de la PIO aumenta la tensión dentro y a través de la región laminar6,15,16. Observaciones experimentales en humanos y modelos animales presentan la ONH como el sitio inicial del daño axonal17,18. El paradigma biomecánico del estrés y la tensión relacionados con la PIO que causan daños glaucomatosos en la ONH también influye en la fisiopatología del glaucoma19,20,21. Aunque en humanos los cambios inducidos por la presión dañan mecánicamente los axones RGC22, los roedores que carecen de placas colágenas dentro de la lámina también pueden desarrollar glaucoma7,23. Además, la PIO elevada sigue siendo el factor de riesgo más prominente en los pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto, mientras que los pacientes con glaucoma de tensión normal desarrollan neuropatía óptica glaucomatosa incluso sin PIO elevada. Además, también hay un subconjunto de pacientes hipertensos oculares que no muestran daño en el nervio óptico. También se ha sugerido que la presión del líquido cefalorraquídeo (CSFp) puede desempeñar un papel en la patogénesis del glaucoma. La evidencia indica que la PIC se reduce a ~5 mmHg en pacientes con glaucoma en comparación con individuos normales, lo que provoca un aumento de la presión translaminar y juega un papel crucial en la enfermedad24,25. Anteriormente, se demostró en un modelo canino, que al controlar los cambios de IOP y CSFp, puede haber grandes desplazamientos del disco óptico26. La elevación de la CSFp en los ojos porcinos también ha mostrado un aumento de la tensión principal dentro de la región LC y el tejido neural retrolaminar. El aumento de la tensión en los RGC y la región LC contribuye al bloqueo del transporte axonal y a la pérdida de RGC27. La degeneración progresiva de las RGC se ha asociado con pérdida de soporte trófico28,29, estimulación de procesos inflamatorios/regulación inmune30,31 y efectores apoptóticos29,32,33,34,35. Además, la lesión axonal (Figura 3) causa efectos perjudiciales sobre las RGC, desencadenando el fracaso regenerativo36,37,38,39. A pesar de que los efectos de la PIO han sido bien estudiados, se han realizado investigaciones mínimas sobre los cambios anormales de presión translaminar. La mayoría de los tratamientos para el glaucoma se centran en estabilizar la PIO. Sin embargo, a pesar de que la disminución de la PIO ralentiza la progresión de la enfermedad, no revierte la pérdida del campo visual y previene la pérdida completa de RGC. Comprender los cambios neurodegenerativos relacionados con la presión en el glaucoma será crucial para prevenir la muerte por RGC.
La evidencia actual indica que las modulaciones de presión translaminar debido a diversos cambios mecánicos, biológicos o fisiológicos en pacientes que sufren de discapacidades visuales traumáticas o neurodegenerativas pueden causar una pérdida significativa de la visión. Actualmente, no existe un verdadero modelo preclínico del segmento posterior humano que pueda permitir el estudio del daño biomecánico glaucomatoso dentro de la ONH humana ex vivo. La observación y el tratamiento del segmento posterior del ojo es un gran reto en oftalmología27. Existen barreras físicas y biológicas para atacar el ojo posterior, incluyendo altas tasas de eliminación, barrera sangre-retina y posibles respuestas inmunológicas40. La mayoría de las pruebas de eficacia y seguridad para nuevos objetivos farmacológicos se realizan utilizando modelos celulares e in vivo in vitro41. La anatomía ocular es compleja, y los estudios in vitro no imitan con precisión las barreras anatómicas y fisiológicas presentadas por los sistemas de modelos de tejidos. A pesar de que los modelos animales son una necesidad para los estudios farmacocinéticos, la fisiología ocular del ojo posterior humano puede variar entre varias especies animales, incluida la anatomía celular de la retina, la vasculatura y la ONH41,42.
El uso de animales vivos requiere regulaciones éticas intensivas y detalladas, un alto compromiso financiero y una reproducibilidad efectiva43. Recientemente, se han seguido muchas otras directrices para el uso ético de animales en la investigación experimental44,45,46. Una alternativa a las pruebas con animales es el uso de modelos de ojo humano ex vivo para investigar la patogénesis de la enfermedad y el análisis potencial de medicamentos para proteger el daño de LA ONH. El tejido postmortem humano es un recurso valioso para el estudio de los paradigmas de las enfermedades humanas, especialmente en el caso de las enfermedades neurodegenerativas humanas, porque la identificación de fármacos potenciales desarrollados en modelos animales requiere la necesidad de ser traducibles a los humanos47. El tejido donante humano ex vivo se ha utilizado ampliamente para el estudio de trastornos humanos47,48,49, y los sistemas de cultivo de órganos de perfusión del segmento anterior humano han proporcionado previamente un modelo ex vivo único para estudiar la fisiopatología de la PIO elevada50,51,52.
Para estudiar la presión translaminar relacionada con la PIO y la PIC en los ojos humanos, diseñamos y desarrollamos con éxito un sistema autónomo translaminar (TAS) de dos cámaras que puede regular de forma independiente la PIO y la PIC utilizando segmentos posteriores de los ojos de donantes humanos. Es el primer modelo humano ex vivo que estudia la presión translaminar y explota los efectos biomecánicos del TLPG en la ONH.
Este modelo de TAS humano ex vivo se puede utilizar para descubrir y clasificar las modificaciones celulares y funcionales que ocurren debido a la elevación crónica de la PIO o ICP. En este informe, detallamos el protocolo paso a paso de disección, configuración y monitoreo del modelo de segmento posterior humano TAS. El protocolo permitirá a otros investigadores reproducir eficazmente este nuevo modelo de segmento posterior humano presurizado ex vivo para estudiar la patogénesis de enfermedades biomecánicas.
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Protocol
Los ojos se obtuvieron de acuerdo con las disposiciones de la Declaración de Helsinki para la investigación con tejidos humanos.
NOTA: Los ojos de bancos de ojos de buena reputación (por ejemplo, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) se recolectaron dentro de las 6-12 h posteriores a la muerte y el suero del donante se analizó para detectar hepatitis B, hepatitis C y virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2. Una vez recibidos, los ojos fueron diseccionados y configurados en el modelo TAS dentro de las 24 h. Los criterios de exclusión incluyeron cualquier patología ocular. Los ojos no se excluyeron en función de la edad, la raza o el género. Para asegurar la viabilidad de la retina al recibirla, se recolectaron explantes de retina de los donantes de tejido y se cultivaron durante 7 y 14 días (Figura suplementaria 1). Estas retinas también se disociaron y crecieron RGC sanas en cultivo durante 7 días con tinción positiva para el marcador RGC, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), así como tinción positiva de cadena ligera de neurofilamentos (NEFL) en sus neurofilamentos (Figura suplementaria 2). .
1. Preparación y esterilización de equipos y suministros
- Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista completa de los suministros requeridos, así como los números de proveedor y catálogo.
- Antes de su uso, esterilice todos los equipos e instrumentos en autoclave o utilizando ampollas de óxido de etileno.
2. Preparación del medio de perfusión
- Agregue estreptomicina de penicilina al 1% (10,000 U/mL de penicilina, 10,000 μg/mL de estreptomicina en 0.85% de NaCl) y 1% de L-glutamina (200 mM) a 1,000 mL de glucosa alta en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco.
- Esterilizar el medio de perfusión pasando por un filtro de 0,22 μm.
3. Configuración del sistema autónomo translaminar (TAS)
- Instale jeringas de entrada (depósitos de PIO e ICP).
- Añadir 30 ml del medio de perfusión (sección 2) a una jeringa de 30 ml. Coloque una llave de paso de 3 vías a la jeringa de 30 ml. Conecte un filtro hidrófilo de 0,22 μm a la llave de paso de 3 vías. Conecte un adaptador de talón Luer de 15 G al filtro hidrófilo de 0,22 μm.
- Retire las burbujas de aire de la configuración de la jeringa. Conecte el tubo al adaptador de talón Luer de 15 G. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita el proceso para un total de dos configuraciones.
- Etiquete una jeringa como presión intracraneal del canal 1 (CH1 ICP) y la otra jeringa como presión intraocular del canal 2 (CH2 IOP).
- Instale jeringas de salida (depósitos de PIO e ICP).
- Coloque una llave de paso de 3 vías a una jeringa de 30 ml. Conecte un adaptador de talón Luer de 15 G a la llave de paso de 3 vías. Conecte el tubo al adaptador de talón Luer de 15 G.
- Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita el proceso para un total de dos configuraciones. Etiquete una jeringa como CH1 ICP y la otra jeringa como CH2 IOP.
4. Preparación del globo ocular completo humano
NOTA: Si se reciben ojos enteros, siga el procedimiento a continuación para separar el segmento anterior del segmento posterior del ojo. Si los ojos se reciben divididos en dos, comience en el paso 4.4.
- Coloque un ojo entero en la solución de povidona yodada durante 2 min.
- Enjuague el ojo en una solución tamponada con fosfato estéril (PBS) para enjuagar la povidona yodada. Repetir 2 veces.
- Retire los anexos de todo el globo ocular con fórceps y tijeras. Dividir el ojo en el ecuador para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.
- Retire la vaina del nervio óptico. Retire el humor vítreo del segmento posterior.
- Recorte la esclerótica adicional del segmento posterior, si es necesario, para garantizar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara IOP (inferior). Usando fórceps, asegúrese de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior del segmento.
- Configuración de la cámara IOP (inferior)
- Coloque el segmento posterior humano en la cámara IOP (inferior) del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico mirando hacia la parte superior.
- Selle el segmento posterior utilizando la junta tórica de resina epoxi con cuatro tornillos, asegurando un sellado hermético.
- Inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara IOP (inferior). La jeringa de entrada IOP con tubo que contiene medio se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida IOP vacía con tubo se inserta en el puerto OUT.
- Utilice el método push/pull para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior mientras que simultáneamente tira lentamente del medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar cualquier burbuja de aire de las líneas. Deje de infundir el medio una vez que los tubos DE ENTRADA y SALIDA estén vacíos de burbujas de aire.
- Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro del puerto IOP IN y vuelva a llenarla con un total de 30 ml de medio. Reemplace la jeringa de 30 ml en el conjunto del filtro.
-
Configuración de la cámara ICP (superior)
- Coloque la cámara/tapa ICP (superior) sobre la parte posterior del segmento posterior. Asegúrese de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior. Selle la cámara superior con cuatro tornillos.
- Inserte el tubo en los puertos DE ENTRADA y SALIDA de la cámara ICP (superior). La jeringa de entrada ICP con medio que contiene tubos se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida ICP vacía con tubos se inserta en el puerto OUT.
- Infunda suave y lentamente el medio en el puerto IN para llenar la cámara ICP y eliminar las burbujas de aire de las líneas utilizando el método push/pull. Deje de infundir el medio una vez que la cámara ICP, así como el tubo IN y OUT, estén vacíos de burbujas de aire.
- Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del ICP en el conjunto del filtro de puerto y vuelva a llenarla con un total de 30 ml de medio. Reemplace la jeringa de 30 ml en el conjunto del filtro.
5. Configuración del sistema de registro de datos
NOTA: El sistema de registro de datos se compone de una fuente de alimentación de 8 canales, un amplificador de puente multicanal, transductores de presión hidrostática y una computadora con software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales). A continuación se describe cómo configurar y calibrar el sistema.
- Conecte el cable de alimentación a la parte posterior de la fuente de alimentación de 8 canales y conéctelo a un dispositivo de respaldo de batería.
- Conecte el cable USB de la fuente de alimentación de 8 canales a la parte posterior del ordenador.
- Conecte la fuente de alimentación de 8 canales al amplificador de puente multicanal mediante el cable I2C suministrado.
- Conecte los cables Bayonet Neill-Concelman (BNC) a las entradas de canal frente a la fuente de alimentación de 8 canales y el extremo de los cables a los canales correspondientes en la parte posterior del amplificador multicanal.
- Conecte los cables del transductor a la parte frontal del amplificador multicanal.
- Instale el software de adquisición de datos en el equipo.
- Ejecute el instalador de configuración del software de adquisición de datos desde el CD de software suministrado.
- Siga las instrucciones en la pantalla de la computadora.
- Cuando se complete la instalación, seleccione Finalizar.
- Encienda la fuente de alimentación de 8 canales.
- Encienda la computadora e inicie el software de adquisición de datos.
- Seleccione archivo | Nuevo.
- Seleccione configuración | Configuración del canal. Seleccione tres canales (abajo a la izquierda de la pantalla). En la columna Título del canal , cambie el nombre de los canales de la siguiente manera: CH1 ICP; PIO CH2; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Seleccione 2 mV para el rango en todos los canales. En la columna Cálculo , seleccione Sin cálculo para los canales 1 y 2.
- En la columna Cálculo , seleccione Aritmética para el canal 3. En la sección Fórmula : Seleccionar canales/CH2; Seleccione aritmética "-"; Seleccione canales/CH1. En la sección Salida , seleccione mmHg. Seleccione Aceptar. Vuelva a seleccionar Aceptar .
- Configure y calibre los transductores de presión hidrostática.
NOTA: Los transductores de presión hidrostática deben calibrarse antes de los experimentos utilizando el siguiente método.- Conecte los transductores de presión hidrostática a las líneas de transductores conectadas al amplificador de puente multicanal.
- Conecte una jeringa de 30 ml llena de aire al puerto lateral del transductor de presión CH1 (ICP). Conecte el esfigmomanómetro a la parte inferior del transductor de presión CH1 (ICP).
- En el gráfico, vea la página del software de adquisición de datos, establezca la velocidad de muestreo haciendo clic con el botón izquierdo en la flecha junto al tiempo de muestreo y seleccione 100. A continuación, haga clic con el botón derecho en el área CH1 (ICP) de la página.
- Seleccione Amplificador de puente. Seleccione Filtro de red. Seleccione Cero y espere a que el sistema se ponga a cero, teniendo cuidado de no mover el transductor de presión.
- Pellizque las pestañas blancas del transductor de presión y empuje el aire a través del transductor hasta obtener 40 mmHg en el esfigmomanómetro. Suelte las pestañas blancas y retire la jeringa y el esfigmomanómetro.
- En la página Conversión de unidades , seleccione el signo 'menos (-)'. Resalte la meseta más alta para indicar 40 mmHg. Haga clic en la flecha del punto 1 e introduzca 40.
- Resalte la meseta más baja para indicar 0 mmHg. Haga clic en la flecha del punto 2 e introduzca 0. Seleccione mmHg para las unidades. Seleccione Aceptar.
- Seleccione Aceptar (página Amplificador de puente). Repita los pasos 9.1–9.7 para CH2 (IOP) usando 100 mmHg para la meseta más alta y 0 para la meseta más baja.
- Conecte la unidad de segmento TAS/posterior al sistema de adquisición de datos.
- Coloque la unidad TAS/segmento posterior en una incubadora (37 °C, 5% co2). Conecte el tubo ICP desde el puerto OUT al transductor de presión CH1 (ICP).
- Conecte el tubo IOP del puerto OUT al transductor de presión CH2 (IOP).
- Conecte las configuraciones de la jeringa (ICP e IOP) con medio desde los puertos IN hasta el soporte del anillo.
- En la página Vista de gráfico , seleccione Iniciar muestreo. Establezca la velocidad de muestreo haciendo clic con el botón izquierdo en la flecha junto al tiempo de muestreo y seleccione Lento y 1 min.
- Ajuste las jeringas en el soporte del anillo hacia arriba o hacia abajo para regular las presiones ICP e IOP según los requisitos del protocolo.
- Realice la reposición sistémica del medio en el sistema cada 48-72 h a través del método push and pull.
6. Recuperación y análisis de datos
- Abra el archivo de datos en el software de adquisición de datos.
- En la sección Data Pad , haga clic en el icono Agregar múltiples al DataPad . Aparecerá una nueva ventana.
- En la sección Buscar usando , seleccione Hora en el menú desplegable.
- En la sección Seleccionar , seleccione 1 hora cada 1 hora en los menús desplegables.
- En la sección Paso a paso , seleccione Todo el archivo y, a continuación, haga clic en Agregar.
- En la sección Data Pad , haga clic en el icono Data Pad View . Resalte todos los datos y copie / pegue en una hoja de cálculo.
- Calcule la media y las desviaciones estándar para IOP, ICP y TLPG cada 24 h. Recopile los datos utilizando la opción de tabla dinámica en un programa de hoja de cálculo y un gráfico.
7. Inmunohistoquímica y tinción de hematoxilina y eosina de segmentos posteriores
- Retire los segmentos oculares posteriores siguiendo varios puntos de tiempo del modelo TAS y fije la formalina antes de parafinar.
- Seccionar los ojos para producir planos de tejido sagital.
- Desparafinar los segmentos incrustados en parafina con una solución 100% xileno, 95% etanol, 50% etanol.
- Lave los portaobjetos con PBS durante 10 minutos y bloquee con un tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h.
- Etiquete las secciones con anticuerpos primarios: anticolágeno IV (marcador de matriz extracelular (ECM), NB120-6586, 1:100) y antilaminina (marcador ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcador RGC), GTX118619, 1:50).
- Detectar los anticuerpos primarios utilizando anticuerpos secundarios Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo, A11008, 1:500).
- Contramante los núcleos celulares utilizando la solución antidesvanecimiento DAPI.
- Capture imágenes de las secciones teñidas e imágenes de fase con lentes de objetivo 4x y 10x utilizando un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
- Para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E), procese las secciones en un sistema de tinción automatizado (consulte la Tabla de materiales) para la desparafinación utilizando una solución de etanol 100%, xileno al 95%, etanol al 50% y manche con H&E.
- Capture imágenes con las lentes de objetivos 4x y 10x utilizando un microscopio con una fuente de luz de campo brillante.
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Representative Results
Diseño y creación del sistema autónomo translaminar
El diferencial de presión translaminar es un mecanismo clave potencial en la patogénesis de diversas enfermedades, incluido el glaucoma. Los usos para el modelo descrito incluyen, pero no se limitan a, el estudio del glaucoma (PIO elevada, tal vez disminución de la PIC), lesión cerebral traumática (PIC elevada) y exposición a largo plazo a la discapacidad visual asociada a la microgravedad (PIC elevada, PIO elevada). Para ayudar a descubrir la patogénesis molecular dirigida a la presión translaminar en el ojo humano, diseñamos, creamos y validamos el modelo TAS. Nuestro nuevo modelo humano ex vivo proporciona un sistema preclínico único para estudiar de forma independiente la PIC y los cambios patógenos asociados a la PIO. Para abordar las aplicaciones preclínicas humanas, nuestro modelo proporciona un paradigma ex vivo de estudio de la patogénesis debido a los cambios de presión translaminar. El diseño del modelo sellado se representa con vistas frontales sólidas y transparentes (Figura 1A, 1B) con una vista esquemática detallada del modelo para representar todos los puertos de entrada y salida (Figura 1C). Se muestra la vista transparente en color con un segmento posterior humano en un modelo impreso en 3D real (Figura 1D, 1E).
Sistema autónomo translaminar: un nuevo modelo de presión translaminar humana ex vivo
Generamos el modelo TAS con dos cámaras autónomas (es decir, cámaras IOP e ICP). En la base inferior del modelo, la copa posterior humana se colocó sobre la parte superior de la cúpula redonda con el nervio óptico mirando hacia la parte superior. Una vez que la copa posterior se colocó y selló en la cámara de la PIO, colocamos la cámara de la PIC en la parte superior del nervio. Mantuvimos la independencia de ambas cámaras y un sellado perfecto utilizando juntas tóricas que se ajustan a cada cámara con precisión (Figura 2A). La cámara inferior o la cámara de PIO llenaba y regulaba la presión en la copa, mientras que la cámara superior encajaba alrededor del nervio óptico y regulaba la ICP alrededor del nervio a través de depósitos de presión hidrostática. Usando el modelo, regulamos de forma independiente la PIO y la PIC utilizando presión hidrostática. La diferencia entre ambas cámaras se identificó como un cambio en el gradiente de presión translaminar (Figura 2B). El modelo representado con todos los accesorios finales en su lugar, incluidas las jeringas del depósito de entrada y salida conectadas, se muestra en la Figura 2C.
Cultivo exitoso y mantenimiento de presión en el sistema autónomo translaminar
Para garantizar que ambas cámaras funcionaran de forma independiente en el sistema, regulamos varios diferenciales de presión manteniendo la cámara IOP y el ICP en diferentes diferenciales de presión promedio (TLPG normal: IOP: ICP, 15: 5 mmHg; TLPG elevado >10 mmHg; TLPG elevado >20 mmHg). Inicialmente probamos el mantenimiento de diferenciales de presión normal promedio en ambas cámaras (PIO/PIC normal) a través de varios parámetros diferentes de condiciones de PIO y PIC: 1) PIO normal: PIC disminuida (Figura 3A); 2) PIO elevada: disminución de la PIC (Figura 3B); y 3) PIO elevada: PIC elevada (Figura 3C). La PIO normal promedio varía de 10 a 21 mmHg (presión venosa epiescleral factorizada) y la PIC normal de 5 a 15 mmHg. En lugar de la limitación de no tener presión vascular, aún mantuvimos la presión a estas velocidades, ya que la idea era ejercer la presión máxima en la ONH. Regulamos de forma independiente varios niveles de presión en ambas cámaras (ICP, 5–10 mmHg; PIO, 20–40 mmHg). Para asegurar el mantenimiento de la presión entre ambas cámaras, mantuvimos la PIO en condiciones normales (15 mmHg) y disminuimos la ICP (4 mmHg) para sostener una TLPG (IOP-ICP) entre la LC de 11 mmHg (Figura 3A). Luego elevamos la PIO (43 mmHg) y disminuimos la PIC (3 mmHg) (Figura 3B) y finalmente elevamos las presiones en ambas (PIO, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) para generar el mayor nivel de TLPG a 55 mmHg (Figura 3C). Para garantizar la viabilidad del tejido (Figura 4), el medio en los tejidos se intercambió cada 48 h conectando una jeringa vacía a la llave de paso de salida y empujando lentamente aproximadamente 5 ml de medio de perfusión a través del puerto de entrada utilizando el método push/pull. Los aumentos mínimos de presión ocurrieron en el momento del intercambio medio (Figura 4G) y no afectaron la morfología de la ONH como se muestra en los datos de inmunohistoquímica de 14 y 30 días (Figura 4A-F). Para confirmar que podíamos cultivar segmentos posteriores durante períodos de tiempo prolongados con viabilidad efectiva dentro del modelo TAS, analizamos secciones transversales de la ONH después del mantenimiento de la PIO normal y la PIC durante 14 y 30 días. Pudimos cultivar con éxito estos segmentos en el modelo durante 14 días (Figura 4A, 4B) con células ONH sanas y expresión de la matriz extracelular de colágeno IV (COLIV) en la cabeza del nervio óptico (Figura 4C). También se observó una viabilidad y mantenimiento similares del segmento posterior durante 30 días (Figura 4D, 4E) con expresión de COLIV y DAPI (Figura 4F). La representación gráfica de los valores de TLPG (IOP-ICP) (Figura 4G) representa un mantenimiento constante de los valores de IOP a lo largo del tiempo a 15,6 ± 4,6 mmHg y la media de ICP a 11,0 ± 4,6 mmHg durante 30 días con un TLPG de 4,6 ± 1,3 mmHg (Tabla 1).
Cambios morfológicos en el gradiente de presión translaminar post elevado de onH
Una característica clínica común del glaucoma de enfermedad neurodegenerativa relacionada con la edad es la ventosa ONH. La ventosa prelaminar se distingue por la pérdida progresiva de los tejidos neurales prelaminares, lo que aumenta tanto la profundidad como el ancho de la copa y, por lo tanto, aumenta la relación copa-disco. La ventosa laminar se basa en el tejido conectivo, con el LC moviéndose hacia atrás progresivamente y excavando. Las ventosas glaucomatosas son una combinación de estos dos componentes, que reflejan tanto el daño como la remodelación de los tejidos conectivos laminares. La elevación de la PIO conduce al engrosamiento de la LC debido a un aumento de la masa de colágeno fibrilla53. Utilizando el modelo TAS, creamos un TLPG elevado al aumentar la PIO o disminuir la PIC en varios puntos de tiempo. Mantuvimos un rango de TLPG elevado durante 7 días con valores promedio de PIO a lo largo del tiempo de 22,8 ± 18,6 mmHg y media de PIC de 6,9 ± 7,6 mmHg con un TLPG de 15,9 ± 11,8 mmHg (Tabla 2). Las TLPG más altas se documentaron con 36 mmHg. Los segmentos posteriores humanos se analizaron morfológicamente para el engrosamiento progresivo de los haces laminares y las ventosas en la ONH en secciones teñidas de H &E a medida que avanzaba el tiempo entre el control, 1 día, 3 días y 7 días bajo TLPG elevado (Figura 5A-D). Se observaron ventosas y engrosamiento a los 7 días de TLPG elevado (Figura 5D). Además, la expresión de COLIV a lo largo del tiempo entre el control, 1 día, 3 días y 7 días mostró haces engrosados y aumento de la expresión en 7 días (Figura 5E-H). Las imágenes de fase que comparan el tejido de control no cultivado en el modelo TAS (Figura 5I) y 7 días (Figura 5J) de TLPG elevado dentro del modelo TAS muestran RGC sanos dentro del GCL (Figura 5I) sin ventosas (Figura 5I) para el control, mientras que en condiciones de TLPG elevado las imágenes muestran ventosas extensas sin RGC restantes (marcador RBPMS-RGC) en el RNFL (Figura 5J) y una mayor remodelación de ECM como se muestra por COLIV elevado dentro del ONH (Figura 5J).
Figura 1: Sistema autónomo translaminar. Representación del modelo. (A) Vista frontal sólida. B) Vista transparente. (C) Vista esquemática. (D) Vista transparente en color. (E) Modelo impreso en 3D real. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mecánica del sistema autónomo translaminar. (A) El modelo TAS con cámaras ICP e IOP para regular diferenciales de presión translaminar. (B) Representación del modelo TAS con regulación autónoma de la presión hidrostática en ambas cámaras a través de la elevación de los reservorios. (C) Imagen del modelo TAS con todos los accesorios en su lugar y representación de las jeringas del depósito de entrada y salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mantenimiento independiente de la presión dentro del sistema autónomo translaminar. Representación gráfica de las presiones que se modulan de forma independiente, y las presiones estables que se mantienen en las cámaras superior (ICP) e inferior (IOP) con (A) IOP normal / ICP disminuida (B) IOP elevada / ICP disminuida, y (C) IOP elevada / ICP elevada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mantenimiento y viabilidad de segmentos posteriores dentro del sistema autónomo translaminar. Los segmentos posteriores humanos se cultivaron utilizando el modelo TAS durante 14 y 30 días en condiciones normales de PIO e PIC. H&E tiñó secciones transversales de ONH humana a los 14 días en (A) bajo aumento (40x) y (B) alto aumento (100x). (C) Inmunotinción coliV con expresión DAPI (100x). Representaciones similares de tinción de H&E a los 30 días en micrografías (D) 40x y (E) 100x y (F) inmunotinción de COLIV con expresión de DAPI (100x). G) Presentación gráfica de Δ en mmHg de IOP-ICP (TLPG) para segmentos posteriores humanos mantenidos durante 30 días en cultivo. COLIV = verde; DAPI = azul; (A, recuadro B); D, recuadro E); H&E = tinción de hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Reestructuración morfológica de la cabeza del nervio óptico después de un gradiente de presión translaminar elevado en el Sistema Autónomo Translaminar. Los segmentos posteriores humanos se cultivaron utilizando el modelo TAS para varios puntos de tiempo en condiciones TLPG elevadas. Secciones transversales de ONH humana que representan tinción de H&E de (A) control (B) 1 día en TAS (C) 3 días en TAS, y (D) 7 días de cultivo. Expresión de COLIV con DAPI en la ONH de (E) control (F) 1 día en TAS (G) 3 días en TAS, y (H) 7 días en cultivo. Imágenes de sección transversal ONH de contraste de fase de (I) control ONH que representa (I') tinción de retina de RBPMS y (I'') tinción ONH con COLIV y DAPI. Contraste de fase de (J) 7 días de TLPG elevado en TAS con recuadros que representan (J') tinción de retina de RBPMS y (J'') tinción de ONH con COLIV y DAPI. COLIV, RBPMS = verde; DAPI = azul; (A–D) Aumento de 40x; (E–H) Aumento de 100x; (I y J) Aumento de 200x; (J') Aumento de 400x; (J'') Aumento de 100x; (J, recuadro J' y J''); H&E = tinción de hematoxilina y eosina; TAS = Sistema Autónomo Translaminar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Días | PIO media de 24 h | ICP medio de 24 h | TLPG medio (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| ETS | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabla 1: Mantenimiento del TLPG normal mantenido durante 30 días. Valores tabulares que representan valores de PIO, PIC y TLPG cada 24 h con desviación media y estándar durante todo el curso del tiempo.
| Días | PIO media de 24 h | ICP medio de 24 h | TLPG medio de 24 h |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| ETS | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabla 2: Mantenimiento de un rango de TLPG elevado mantenido durante 7 días. Valores tabulares que representan valores de PIO, PIC y TLPG cada 24 h con desviación media y estándar durante todo el curso del tiempo.
Figura suplementaria 1: Cultivo ex vivo de explante de retina humana. Contraste de fase, imágenes teñidas con RGC positivo (verde RBPMS) y celulares (azul DAPI) de explantes de retina en cultivo durante (A-C) 7 días y (D-F) 14 días (aumento de 200x). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Cultivos humanos adultos de RGC. RGC marcador (RBPMS-verde) y DAPI (azul) RGC teñidos 7 días en cultivo (A) 200x (B) 400x aumento. (C) RGC teñidos para NEFL (verde) y DAPI (azul) a un aumento de 400x. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Los tejidos postmortem humanos son un recurso especialmente valioso para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas humanas porque la identificación de posibles fármacos desarrollados en modelos animales debe ser traducible a humanos47. Los efectos de la elevación de la PIO humana están bien establecidos, pero se ha realizado una investigación mínima sobre los cambios anormales de presión translaminar de ONH. A pesar de que existen múltiples modelos animales y modelos finitos de ONH humana, no existe un modelo humano ex vivo para estudiar los cambios de presión translaminar41,54,55,56,57. Existe una necesidad insatisfecha actual de un nuevo modelo humano preclínico que pueda dirigirse a la etiología de la enfermedad ex vivo utilizando la PIO y la PIC y pueda identificar varios paradigmas patógenos relacionados con la patogénesis del glaucoma. Comprender los cambios patológicos relacionados con la presión en la ONH será crucial para prevenir la muerte por RGC. El uso combinado de PIO, PIC y TLPG dentro del modelo TAS es un enfoque único para estudiar la degeneración dependiente de la presión de manera preclínica utilizando tejido del segmento posterior humano. En el modelo TAS, podemos cultivar segmentos posteriores de copas del ojo humano para estudiar los cambios de la presión translaminar a través de la regulación autónoma de las cámaras IOP e ICP. Proporciona una base para desarrollar una nueva gama de terapias que se centran en la presión translaminar como mecanismo de degeneración.
La configuración del modelo TAS requiere atención al detalle en muchos aspectos: la disección correcta de los segmentos posteriores humanos, asegurando que la retina esté intacta y extendida sobre la copa posterior, la colocación adecuada del segmento sobre la cúpula de la cámara IOP, la ubicación precisa de la cámara ICP sobre el ON, el sellado efectivo de ambas cámaras, y el mantenimiento de las presiones hidrostáticas de forma independiente mediante la regulación de la altura de los reservorios de PIO e ICP. La disección debe realizarse en ojos que no están más de 24-36 h post mortem, porque la retina se deteriora progresivamente si no se repone el medio de cultivo efectivo. La reposición sistémica del medio se realizó en nuestro sistema cada 48-72 h. Otro aspecto crucial del sistema es la longitud del ON. Es fundamental asegurarse de que se dejen al menos 0,5–1 cm de ON en el ojo cadavérico. Los ojos del donante no deben usarse si tienen OZ cortos, el ON está dañado, el globo está comprometido y desinflado, o la vaina ON está desprendida. Además, al colocar el segmento posterior sobre la cúpula, la junta tórica debe ajustarse firmemente en su lugar y la cámara ICP superior debe sellarse correctamente con tornillos. Los accesorios de horquilla donde el tubo se fija a cada lado de la base superior e inferior del modelo también deben probarse para garantizar que el tubo se ajuste y se bloquee en su lugar. Si el tubo no está correctamente en su lugar, se observarán burbujas de aire dentro del tubo y comprometerán las mediciones de presión dentro de cada cámara.
El mantenimiento y la viabilidad de los segmentos posteriores postmortem en nuestro modelo TAS fue una preocupación crítica para este protocolo. El tejido postmortem humano ha sido previamente ampliamente estudiado48,49, con un reciente estudio de análisis de ARN de 1.068 tejidos donantes postmortem que confirman que el tejido cerebral humano postmortem recolectado durante décadas puede servir como material de alta calidad para el estudio de trastornos humanos47. Además, se ha realizado un perfil de expresión previamente exitoso de tejidos oculares oculares del ojo donante humano post mortem58. Los valores plier de expresión génica para los genes de apoptosis fueron mínimos o inexistentes en este conjunto de datos para el tejido retiniano 6 h postmortem58. Además, se ha demostrado que el almacenamiento hipotérmico del tejido ocular se puede realizar de forma eficaz59. Se ha demostrado que la actividad de las células ganglionares se mantiene durante 50 h cuando los ojos minipig se almacenan en condiciones isquémicas e hipotérmicas41,60. Por lo tanto, utilizamos el punto de tiempo de 6 h como nuestro criterio de inclusión para la recolección de oculares de donantes. La velocidad del deterioro postmortem de los segmentos posteriores y el desprendimiento de retina falta en la literatura, pero nuestra enucleación dentro de las 6 h, la entrega sobre hielo y la configuración del cultivo de 36 h máximas están dentro del rango de viabilidad del tejido como se muestra en la Figura Suplementaria 1 y la Figura Suplementaria 2. Utilizando el modelo TAS, logramos con éxito el mantenimiento saludable del tejido durante 30 días.
Otra limitación del modelo TAS es nuestra incapacidad actual para modelar los ritmos circadianos cíclicos de la PIC y la PIO que se observan en condiciones fisiológicas normales. Esto se puede abordar en el futuro mediante el uso de una bomba que puede regular la PIO rítmica y la infusión de ICP. Además, otra advertencia al modelo es la falta de circulación sanguínea dentro del ojo cadavérico. Por lo tanto, los efectos de la presión arterial no se pueden estudiar, pero esto también nos permite delinear específicamente los efectos patógenos de solo los cambios de TLPG, incluidos IOP e ICP.
Un alcance futuro del modelo incorporaría la automatización de los sistemas de reservorio para cambios hidrostáticos y perfusión de medio a través de una bomba de infusión con una jeringa vacía de salida en el transductor en lugar de las múltiples rondas de cambio de medio que se implementaron en este protocolo. El fluido del reservorio de PIO y PIC también podría ser recolectado y analizado. Se puede recolectar medio para la expresión de biomarcadores para dirigirse a futuras terapias. También podemos identificar vías o moléculas que pueden tratarse con medicamentos o terapia génica y probar estas terapias en varios modelos animales de PIC antes de traducirlas a ensayos clínicos en humanos.
En conclusión, nuestro modelo no solo proporciona una base humana de pruebas, sino que también se puede utilizar para validar terapias que pueden dirigirse a los cambios de presión translaminar en el ojo. Abre una vía para realizar medicina de precisión a través del trasplante de células madre de pacientes en oculares de donantes humanos y presurizarlos en el modelo TAS. Esto nos permite probar terapias ex vivo con la capacidad de ser traducibles a la clínica y relacionables con individuos vivos. Con nuestro modelo ahora podemos evaluar los cambios que ocurren en la presión translaminar y cómo juega un papel crucial en la patogénesis asociada con diversas enfermedades traumáticas y neurodegenerativas. Esto conducirá a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares patógenos en la ONH que están asociados con la PIO y la PIC.
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Disclosures
Los autores del manuscrito no tienen conflictos de intereses potenciales que revelar.
Acknowledgments
El financiamiento para este proyecto fue a través de fondos discrecionales de la Dra. Colleen M. McDowell. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Inc. al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de UW Madison. Agradecemos a los Dres. Abbot F. Clark y Weiming Mao por su asistencia técnica con el modelo de cultivo de órganos de perfusión. Agradecemos al Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) por proporcionar los ojos de donantes humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
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