Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

İnsan Donör Arka Segmentlerinde Göz İçi ve İntrakraniyal Basıncın Modülasyonu için Translaminer Otonom Sistem Modeli

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61006
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

Summary

Translaminer otonom sistemin kullanımını açıklar ve detaylandırırız. Bu sistem, glaukomöz optik nöropatinin özelliklerini taklit eden translaminer basınç gradyanı oluşturmak için segmentin içindeki basıncı (göz içi) ve optik siniri (intrakraniyal) çevreleyen basıncı bağımsız olarak düzenlemek için insan arka segmentini kullanır.

Abstract

Glokom patogenez ile ilgili çeşitli patojenik paradigmaları tanımlayabilen intrakraniyal basınç (ICP) ve göz içi basıncı (Gİb) kullanarak hastalık etiyolojisi ex vivo'yu hedef alabilen yeni bir preklinik insan modeline karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Ex vivo insan ön segment perfüzyon organ kültürü modelleri daha önce glokom patogenezinin keşfi ve terapötiklerin test edilmesi için etkili teknolojiler olarak başarıyla kullanılmıştır ve uygulanmıştır. Ex vivo insan organ sistemleri üzerinde yapılan preklinik ilaç taraması ve araştırmaları klinik araştırmalara daha fazla çevrilebilir. Bu makalede translaminar otonom sistem (TAS) adı verilen yeni bir ex vivo insan translaminer basınç modelinin üretimi ve çalışması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. TAS modeli, insan donör arka segmentlerini kullanarak ICP ve Gİb'i bağımsız olarak düzenleyebilir. Model, patogenezin preklinik bir şekilde incelenmesine izin verir. Oftalmik araştırmalarda canlı hayvanların kullanımını azaltabilir. In vitro deneysel modellerin aksine, optik sinir kafası (ONH) doku yapısı, karmaşıklığı ve bütünlüğü ex vivo TAS modeli içinde de korunabilir.

Introduction

Son anketlerdeki küresel tahminler, 39 milyon'ı görme engelli olmak üzere 285 milyon kişinin görme bozukluğuyla yaşadığını gösteriyor1. 2010 yılında, Dünya Sağlık Örgütü, listelenen dokuz önde gelen körlük nedenlerinden üçünün gözün arka segmentinde meydana geldiğini belgeledi1. Arka segment göz hastalıkları retina, koroid ve optik siniri içerir2. Retina ve optik sinir beynin merkezi sinir sistemi (CNS) uzantılarıdır. Retina ganglion hücresi (RGC) aksonları, optik siniri oluşturmak için optik sinir başlığından (ONH) gözden çıktıkları için hasara karşı savunmasızdır3. ONH, lamina cribrosa (LC)4 adı verilen bağ dokusu ışınlarının 3D mesh çalışması nedeniyle RGC aksonları için en savunmasız nokta olmaya devam etmektedir. ONH, glokomda RGC aksonlarına hakaretin ilk yeridir5,6,7 ve ONH içindeki gen ekspresyon değişiklikleri oküler hipertansiyon ve glokom modellerinde çalışılmıştır8,9,10. RGC aksonları, göz içi basıncı (Gİb) olarak adlandırılan göz içi bölmesi arasındaki basınç farkları ve intrakraniyal basınç (ICP)11 adı verilen dış perioptik subaraknoid alanı içindeki basınç farkları nedeniyle ONH'de hassastır. LC bölgesi, 10-21 mmHg ve ICP arasında değişen Gİb ile normal basınç farklarını koruyarak her iki alanı da ayırır ve 5-15 mmHg12 arasında değişen bir değere sahiptir. İki oda arasındaki lamina arasındaki basınç farkına translaminer basınç gradyanı (TLPG)13 denir. Glokomun önemli bir risk faktörü yüksek IOP14'tür.

Artan Gİb, laminar bölge içindeki ve genelindeki gerginliği artırır6,15,16. İnsanlarda ve hayvan modellerinde deneysel gözlemler ONH'yi aksonal hasarın ilk bölgesi olarak göstermektedir17,18. ONH'de glaukom hasarına neden olan Gİb ile ilgili stres ve suşun biyomekanik paradigması da glokomun patofizyolojisini etkiler19,20,21. İnsanlarda basınç kaynaklı değişiklikler RGC axons22'ye mekanik olarak zarar verse de, lamina içinde kollajen plakaları olmayan kemirgenler de glokom geliştirebilir7,23. Ayrıca, yüksek Gİb primer açık açılı glokom hastalarında en belirgin risk faktörü olmaya devam ederken, normal gerilim glokom hastalarında yüksek Gİb olmasa bile glaukom optik nöropati gelişir. Ayrıca, optik sinir hasarı göstermeyen oküler hipertansif hastaların bir alt kümesi de vardır. Ayrıca beyin omurilik sıvı basıncının (CSFp) glokom patogenezinde rol oynayabileceği ileri sürülmektedir. Kanıtlar, GLOKOM hastalarında ICP'nin normal bireylere göre ~5 mmHg'ye düşürüldüğü ve böylece translaminer basıncın artmasına neden olduğu ve hastalıkta önemli bir rol oynadığı göstermektedir24,25. Daha önce, bir köpek modelinde, Gİb ve CSFp değişikliklerini kontrol ederek, optik diskin büyük yer değiştirmeleri olabileceği gösterilmiştir26. Porcine gözlerde CSFp'nin yükseltilmesi, LC bölgesi ve retrolaminer sinir dokusunda da artmış ana zorlanma göstermiştir. RGC'ler ve LC bölgesi üzerindeki artan yük, aksonal taşıma tıkanıklığı ve RGC'lerin kaybına katkıda bulunur27. RGC'lerin progresif dejenerasyonu trofik destek kaybı28,29, inflamatuar süreçlerin/immün regülasyonun uyarılması30,31 ve apoptotik efektörler29,32,33,34,35 ile ilişkilendirilmiştir. Ek olarak, aksonal yaralanma (Şekil 3) RPC'ler üzerinde zararlı etkilere neden olur ve rejeneratif başarısızlığı tetikler36,37,38,39. Gİb'in etkileri iyi çalışılmış olsa da anormal translaminer basınç değişimleri üzerinde minimal araştırma gerçeklenmiştir. Glokom için çoğu tedavi Gİb stabilize odaklanır. Bununla birlikte, Gİb'in düşürülmesi hastalığın ilerlemesini yavaşlatsa da, görme alanı kaybını tersine çevirmez ve RGC'lerin tam kaybını önlemez. Glokomda basınca bağlı nörodejeneratif değişiklikleri anlamak RGC ölümünü önlemek için çok önemli olacaktır.

Mevcut kanıtlar, travmatik veya nörodejeneratif görme bozukluklarından muzdarip hastalarda çeşitli mekanik, biyolojik veya fizyolojik değişikliklere bağlı translaminer basınç modülasyonlarının önemli görme kaybına neden olabileceğini göstermektedir. Şu anda, ex vivo insan ONH içinde glaukomöz biyomekanik hasarın incelenmesine izin verebilecek gerçek bir preklinik insan posterior segment modeli yoktur. Gözün arka segmentinin gözlemlenmesi ve tedavisi oftalmolojide büyük bir zorluktur27. Yüksek eliminasyon oranları, kan-retina bariyeri ve potansiyel immünolojik yanıtlar da dahil olmak üzere arka gözü hedeflemek için fiziksel ve biyolojik engeller vardır40. Yeni ilaç hedefleri için çoğu etkinlik ve güvenlik testi in vitro hücresel ve in vivo hayvan modelleri kullanılarak gerçekleştirilir41. Oküler anatomi karmaşıktır ve in vitro çalışmalar doku modeli sistemlerinin sunduğu anatomik ve fizyolojik engelleri doğru bir şekilde taklit etmez. Hayvan modelleri farmakokinetik çalışmalar için bir gereklilik olsa da, insan arka gözünün oküler fizyolojisi retinanın hücresel anatomisi, vaskülat ve ONH41,42 dahil olmak üzere çeşitli hayvan türleri arasında değişebilir.

Canlı hayvanların kullanımı yoğun ve ayrıntılı etik düzenlemeler, yüksek finansal bağlılık ve etkili tekrarlanabilirlik gerektirir43. Son zamanlarda, deneysel araştırmalarda hayvanların etik kullanımı için birden fazla kılavuz ortaya çıktı44,45,46. Hayvan testlerine bir alternatif, hastalık patogenezini araştırmak için ex vivo insan gözü modellerinin kullanılması ve ONH hasarını korumak için ilaçların potansiyel analizidir. İnsan ölüm sonrası dokusu, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları durumunda insan hastalığı paradigmalarını incelemek için değerli bir kaynaktır, çünkü hayvan modellerinde geliştirilen potansiyel ilaçların tanımlanması insanlara çevrilebilir olma ihtiyacını gerektirir47. Ex vivo insan donör dokusu, insan bozukluklarının incelenmesi için yoğun olarak kullanılmıştır47,48,49 ve insan ön segment perfüzyon organ kültürü sistemleri daha önce yükseltilmiş Gİb50,51,52 patofizyolojisini incelemek için benzersiz bir ex vivo modeli sağlamıştır.

İnsan gözünde Gİb ve ICP ile ilgili translaminer basıncı incelemek için, insan donör gözlerinden arka segmentleri kullanarak Gİb ve ICP'yi bağımsız olarak düzenleyebilen iki odalı bir translaminer otonom sistem (TAS) tasarladık ve geliştirdik. Translaminer basıncı inceleyen ve TLPG'nin ONH üzerindeki biyomekanik etkilerinden yararlanan ilk ex vivo insan modelidir.

Bu ex vivo insan TAS modeli keşfetmek ve IOP veya ICP kronik yükseklik nedeniyle meydana gelen hücresel ve fonksiyonel modifikasyonları sınıflandırmak için kullanılabilir. Bu raporda, TAS insan posterior segment modelinin parçalanması, kurulması ve izlenmesinin adım adım protokolünü detaylandırıyoruz. Protokol, diğer araştırmacıların biyomekanik hastalık patogenezini incelemek için bu yeni eks vivo basınçlı insan posterior segment modelini etkili bir şekilde yeniden üretmelerine izin verecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gözler, insan dokusunu içeren araştırmalar için Helsinki Bildirgesi hükümlerine göre elde edildi.

NOT: Saygın göz bankalarının gözleri (örneğin, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) 6-12 saat içinde hasat edildi ve donör serum hepatit B, hepatit C ve insan immün yetmezlik virüsü 1 ve 2 için test edildi. Alındıktan sonra, gözler 24 saat içinde TAS modelinde parçalandı ve kuruldu. Dışlama kriterleri herhangi bir oküler patolojiyi içeriyordu. Gözler yaşa, ırka veya cinsiyete göre dışlanmadı. Retinanın alındıktan sonra yaşayabilirliğini sağlamak için doku donörlerinden retina eksplantları toplanmış ve 7 ve 14 gün boyunca kültüre edilmiştir (Ek Şekil 1). Bu retinalar ayrıca RGC belirteci için pozitif lekelenme, çoklu birleştirme (RBPMS) ile RNA bağlayıcı protein ve nörofilamentlerinde pozitif nörofilament ışık zinciri (NEFL) lekelenmesi ile 7 gün boyunca kültürde sağlıklı RGC'ler uzadı ve büyüdü (Ek Şekil 2). .

1. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu

  1. Tedarikçi ve katalog numaralarının yanı sıra gerekli malzemelerin tam listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
  2. Kullanmadan önce, etilen oksit ampulleri otoklavlayarak veya kullanarak tüm ekipman ve aletleri sterilize edin.

2. Perfüzyon ortamının hazırlanması

  1. 1.000 mL yüksek glikoz Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'una (DMEM) %1 penisilin streptomisin (10.000 U/mL penisilin, %0.85 NaCl'de 10.000 μg/mL streptomisin) ve %1 L-glutamin (200 mM) ekleyin.
  2. Perfüzyon ortamını 0,22 μm filtreden geçirerek sterilize edin.

3. Translaminar otonom sistem (TAS) kurulumu

  1. Giriş şırınglarını (Gİb ve ICP rezervuarları) ayarlayın.
    1. 30 mL şırındıya 30 mL perfüzyon ortamı (bölüm 2) ekleyin. 30 mL şırınna 3 yönlü bir stopcock takın. 3 yönlü stopcock'a 0,22 μm hidrofilik filtre takın. 0,22 μm hidrofilik filtreye 15 G Luer saplama adaptörü takın.
    2. Şırınd kurulumundan hava kabarcıklarını çıkarın. Boruyu 15 G Luer saplama adaptörüne takın. Stopcock'un yan portunun yanını düzensiz bir evrensel kilit kapağı ile kapatın. Toplam iki kurulum için yineleyin.
    3. Bir şırıng kanal 1 intrakraniyal basınç (CH1 ICP) ve diğer şırıng kanal 2 göz içi basıncı (CH2 Gİb) olarak etiketlenin.
  2. Çıkış şırıngırlarını (Gİb ve ICP rezervuarları) ayarlayın.
    1. 30 mL şırınna 3 yönlü bir stopcock takın. 3 yönlü stopcock'a 15 G Luer saplama adaptörü takın. Boruyu 15 G Luer saplama adaptörüne takın.
    2. Stopcock'un yan portunun yanını düzensiz bir evrensel kilit kapağı ile kapatın. Toplam iki kurulum için yineleyin. Bir şırınnayı CH1 ICP, diğer şırındıcıyı CH2 Gİb olarak etiketle.

4. İnsan tüm göz küresinin hazırlanması

NOT: Tüm gözler alınırsa, ön segmenti gözün arka kısmından ayırmak için aşağıdaki prosedürü izleyin. Gözler ikiye bölünmüş olarak alınırsa, 4.4.

  1. Tüm bir gözü 2 dakika boyunca povidone-iyot çözeltisine yerleştirin.
  2. Povidon-iyotunu durulamak için gözü steril fosfat tamponlu çözeltide (PBS) durulayın. 2 kez tekrarlayın.
  3. Apartma ve makas kullanarak adnexa'yı tüm göz küresinden çıkarın. Gözün ön ve arka bölümlerini ayırmak için ekvatorda gözü ikiye ayırın.
  4. Optik sinir kılımını çıkarın. Vitreus mizahını arka segmentten çıkarın.
  5. Gİb (alt) odasının yuvarlak kubbesine iyi bir uyum sağlamak için gerekirse arka segmentten ek sklera kırpın. Forseps kullanarak, retinanın segmentin arka kısmına eşit olarak yayıldığından emin olun.
  6. Gİb (alt) oda yapısı
    1. İnsan arka segmentini, optik sinir üstte olacak şekilde yuvarlak kubbenin üzerindeki TAS'ın Gİb (alt) odasına yerleştirin.
    2. Epoksi reçine O-halkasını kullanarak arka segmenti dört vida ile kapatın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
    3. Boruyu Gİb (alt) haznesinin IN ve OUT bağlantı noktalarına yerleştirin. Orta içeren borulu Gİb giriş şırınnası IN portuna, boş Gİb çıkış şırınnası ise borulu outflow şırınnası OUT portuna yerleştirilir.
    4. Perfüzyon ortamını giriş noktasına yavaşça demlenerek arka göz kabını doldurmak için itme/çekme yöntemini kullanın, aynı zamanda perfüzyon ortamını çıkış şırıncığından yavaşça çekerek hatlardan hava kabarcıklarını çıkarın. Hem IN hem de OUT tüpleri hava kabarcıkları boşluğuna girdikten sonra ortam infüze etmeyi bırakın.
    5. Stopcock'ları kapalı konuma kilitleyin. 30 mL şırınnayı IOP IN port filtre tertibatından çıkarın ve toplam 30 mL orta ile yeniden doldurun. 30 mL şırınnayı filtre tertibatına değiştirin.
  7. ICP (üst) oda kurulumu
    1. ICP (üst) haznesini/kapağı arka segmentin arkasına yerleştirin. Optik sinirin üst bölmede olduğundan emin olun. Üst hazneyi dört vida ile kapatın.
    2. Boruyu ICP (üst) haznesinin IN ve OUT bağlantı noktalarına yerleştirin. Orta içeren borulu ICP giriş şırınnası IN portuna, boş ICP çıkış şırınnası ise out portuna yerleştirilir.
    3. ICP haznesini doldurmak ve itme/çekme yöntemini kullanarak hava kabarcıklarını hatlardan çıkarmak için ortamı IN bağlantı noktasına hafifçe ve yavaşça demleyin. ICP odasının yanı sıra hem IN hem de OUT boruları hava kabarcıkları geçersiz olduğunda orta demlemeyi durdurun.
    4. Stopcock'ları kapalı konuma kilitleyin. 30 mL şırınnayı bağlantı noktası filtre tertibatında ICP'den çıkarın ve toplam 30 mL orta ile yeniden doldurun. 30 mL şırınnayı filtre tertibatına değiştirin.

5. Veri kayıt sistemi kurulumu

NOT: Veri kayıt sistemi 8 kanallı bir güç kaynağı, çok kanallı köprü amplifikatörü, hidrostatik basınç dönüştürücüleri ve veri toplama yazılımına sahip bir bilgisayardan oluşur (bkz. Malzeme Tablosu). Aşağıda sistemin nasıl ayarlandırılacağı ve kalibreılacağı açıklanmaktadır.

  1. Güç kablosunu 8 kanallı güç kaynağının arkasına bağlayın ve bir pil yedekleme cihazına takın.
  2. USB kablosunu 8 kanallı güç kaynağından bilgisayarın arkasına bağlayın.
  3. Birlikte verilen I2C kablosunu kullanarak 8 kanallı güç kaynağını çok kanallı köprü amplifikatörüne bağlayın.
  4. Bayonet Neill-Concelman (BNC) kablolarını 8 kanallı güç kaynağının önündeki kanal girişlerine ve kabloların ucunun ucuna çok kanallı amplifikatörün arkadaki ilgili kanallara bağlayın.
  5. Dönüştürücü kablolarını çok kanallı amplifikatörün önüne bağlayın.
  6. Veri toplama yazılımını bilgisayara yükleyin.
    1. Veri alma yazılımı kurulum yükleyicisini sağlanan yazılım CD'sinden çalıştırın.
    2. Bilgisayar ekranındaki yönergeleri izleyin.
    3. Yükleme tamamlandığında Son'u seçin.
  7. 8 kanallı güç kaynağını açın.
  8. Bilgisayarı açın ve veri toplama yazılımını başlatın.
    1. Dosya | Seç Yeni.
    2. Kur | Seç Kanal Ayarları. Üç kanal seçin (ekranın sol alt kısmı). Kanal Başlığı sütununda kanalları aşağıdaki gibi yeniden adlandırın: CH1 ICP; CH2 Gİb; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Tüm kanallarda Aralık için 2 mV seçin. Hesaplama sütununda 1 ve 2 numaralı kanallar için Hesaplama Yok'u seçin.
    4. Hesaplama sütununda Kanal 3 için Aritmetik'i seçin. Formül bölümünde: Kanalları/CH2'yi seçin; Aritmetik "-" seçeneğini belirleyin; Kanalları/CH1'i seçin. Çıktı bölümünde mmHg'yi seçin. Tamam'ı seçin. Yeniden Tamam'ı seçin.
  9. Hidrostatik basınç dönüştürücülerini kurun ve kalibre edin.
    NOT: Hidrostatik basınç dönüştürücüleri deneylerden önce aşağıdaki yöntem kullanılarak kalibre edilmelidir.
    1. Hidrostatik basınç dönüştürücülerini çok kanallı köprü amplifikatörüne bağlı dönüştürücü hatlarına bağlayın.
    2. CH1 (ICP) basınç dönüştürücüsün yan bağlantı noktasına hava dolu 30 mL şırınna takın. Sfigmomanometreyi CH1 (ICP) basınç dönüştürücüsunun altına takın.
    3. Grafikte, veri toplama yazılımının sayfasını görüntüleyin, örnekleme süresinin yanındaki oku sol tıklatarak örnekleme hızını ayarlayın ve 100'ü seçin. Ardından sayfanın CH1 (ICP) alanını sağ tıklatın.
    4. Köprü Amplifiktörü'nü seçin. Şebeke Filtresi'ni seçin. Sıfır'ı seçin ve basınç dönüştürücüslerini hareket ettirmemeye dikkat ederek sistemin sıfıra inmesini bekleyin.
    5. Basınç dönüştürücüslerinin beyaz sekmelerini sıkıştırın ve sfigmomanometrede 40 mmHg elde edilene kadar havayı dönüştürücüden geçirin. Beyaz sekmeleri bırakın ve şırınnak ve sfigmomanometreyi çıkarın.
    6. Birim Dönüştürme sayfasında 'eksi (-)' işaretini seçin. 40 mmHg'yi göstermek için en yüksek platoyu vurgulayın. Nokta 1 için Ok'a tıklayın ve 40 girin.
    7. 0 mmHg'yi belirtmek için en düşük platoyu vurgulayın. Nokta 2 için Ok'a tıklayın ve 0 girin. Birimler için mmHg'yi seçin. Tamam'ı seçin.
    8. Tamam'ı seçin (Köprü Amp sayfası). En yüksek plato için 100 mmHg ve en düşük plato için 0 kullanarak CH2 (Gİb) için 9,1–9,7 adımlarını yineleyin.
  10. TAS/posterior segment birimini veri toplama sistemine bağlayın.
    1. TAS/posterior segment ünitesini bir inkübatöre yerleştirin (%37 °C, %5 CO2). ICP boruyu OUT bağlantı noktasından CH1 (ICP) basınç dönüştürücüse takın.
    2. Gİb borularını OUT bağlantı noktasından CH2 (Gİb) basınç dönüştürücüse takın.
    3. Şırınd kurulumlarını (ICP ve Gİb) IN bağlantı noktalarından halka standına orta ile takın.
    4. Grafik görünümü sayfasında Örneklemesi Başlat'ı seçin. Örnekleme süresinin yanındaki oku sol tıklatarak örnekleme hızını ayarlayın ve Yavaş ve 1 dk'yı seçin.
    5. ICP ve Gİb basınçlarını protokol gereksinimlerine göre düzenlemek için halka standındaki şırınnaları yukarı veya aşağı ayarlayın.
    6. İtme ve çekme yöntemiyle her 48-72 saat içinde sistemdeki ortamın sistemik ikmalini gerçekleştirin.

6. Veri alma ve analiz

  1. Veri toplama yazılımında veri dosyasını açın.
  2. Veri Defteri bölümünde, Veri Defterine Çoklu Ekle simgesine tıklayın. Yeni bir pencere görünecektir.
    1. Kullanarak Bul bölümünde, açılan menüden Zaman'ı seçin.
    2. Seç bölümünde açılır menülerden her 1 saatte bir 1 saat seçin.
    3. Adım Adım bölümünde Tüm Dosya'yı seçin ve Ekle'yi tıklatın.
  3. Veri Defteri bölümünde Veri Defteri Görünümü simgesine tıklayın. Tüm verileri vurgulayın ve elektronik tabloya kopyala/yapıştır.
  4. Her 24 saat için Gİb, ICP ve TLPG için ortalama ve standart sapmaları hesaplayın. Elektronik tablo programındaki ve grafiğindeki özet tablo seçeneğini kullanarak verileri harmanlama.

7. İmmünohistokimya ve hematoksilin ve arka segmentlerin eozin lekesi

  1. TAS modelinden çeşitli zaman noktalarını takip eden arka göz segmentlerini çıkarın ve paraffinizlemeden önce formalin olarak düzeltin.
  2. Sagittal doku düzlemleri üretmek için gözleri bölümle.
  3. Parafin gömülü segmentleri %100 ksilen, %95 etanol, %50 etanol çözeltisi ile deparaffinize edin.
  4. Slaytları PBS ile 10 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir engelleme tamponu ile engelleyin.
  5. Birincil antikorları olan etiket bölümleri: anti-kollajen IV (Hücre Dışı Matris (ECM) işaretleyici, NB120-6586, 1:100) ve anti-laminin (ECM işaretleyici, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC işaretleyici), GTX118619, 1:50).
  6. Alexa Fluor ikincil antikorlarını kullanarak birincil antikorları tespit edin (Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan, A11008, 1:500).
  7. DAPI solmaya karşı çözüm kullanarak hücre çekirdeğine karşı koyma.
  8. Floresan mikroskop kullanarak 4x ve 10x objektif lenslerle lekeli bölümlerin ve faz görüntülerinin görüntülerini yakalayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  9. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama için, bölümleri otomatik bir boyama sisteminde işleyin (bkz. Malzeme Tablosu) %100, ksilen %95 etanol, %50 etanol çözeltisi ve H&E ile leke kullanarak deparaffinizasyon için.
  10. Parlak alan ışık kaynağına sahip bir mikroskop kullanarak 4x ve 10x objektif lenslerle görüntü yakalayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Translaminer otonom sistemin tasarımı ve oluşturulması
Translaminer basınç diferansiyel, glokom da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patogenezinde potansiyel bir anahtar mekanizmadır. Açıklanan modelin kullanım alanları arasında glokom (yüksek Gİb, belki de azalmış ICP), travmatik beyin hasarı (yüksek ICP) ve mikro yerçekimi ile ilişkili görme bozukluğuna (yükseltilmiş ICP, yükseltilmiş Gİb) uzun süreli maruz kalma çalışması yer almaktadır, ancak bunlarla sınırlı değildir. İnsan gözündeki translaminer basıncı hedefleyen moleküler patogenezin keşfedilmeye yardımcı olmak için TAS modelini tasarladık, oluşturduk ve doğruladık. Yeni ex vivo insan modelimiz, ICP ve Gİb ile ilişkili patojenik değişiklikleri bağımsız olarak incelemek için benzersiz bir preklinik sistem sunar. İnsan preklinik uygulamalarını ele almak için modelimiz, translaminer basınç değişiklikleri nedeniyle patogenez üzerinde çalışmanın ex vivo paradigmasını sağlar. Sızdırmaz model tasarımı, tüm giriş ve çıkış bağlantı noktalarını (Şekil 1C) tasvir etmek için modelin ayrıntılı bir diyagram görünümü ile düz ön ve şeffaf görünümlerle (Şekil 1A, 1B) tasvir edilir. Gerçek bir 3B baskılı modelde insan posterior segmenti olan renkli saydam görünüm gösterilir (Şekil 1D, 1E).

Translaminar Otonom Sistem: Yeni bir ex vivo insan translaminer basınç modeli
TAS modelini iki özerk oda (yani Gİb ve ICP odaları) ile oluşturduk. Modelin alt tabanında, insan arka kabı, optik sinir üstte olacak şekilde yuvarlak kubbenin üstüne yerleştirildi. Arka kap Gİb odasına yerleştirildikten ve mühürlendikten sonra, ICP odasını sinirin üstüne yerleştirdik. Her iki odanın bağımsızlığını ve her odaya tam olarak uyan O halkalarını kullanarak mükemmel bir contayı koruduk (Şekil 2A). Alt oda veya Gİb odası fincandaki basıncı doldurdu ve düzenledi, üst oda ise optik sinirin etrafına oturdu ve ICP'yi hidrostatik basınç rezervuarları aracılığıyla sinirin etrafına düzenledi. Modeli kullanarak, hidrostatik basınç kullanarak Gİb ve ICP'yi bağımsız olarak düzenledik. Her iki oda arasındaki fark translaminer basınç gradyanındaki bir değişiklik olarak tanımlanmıştır (Şekil 2B). Giriş ve çıkış rezervuar şırınnaları da dahil olmak üzere tüm son bağlantı parçaları ile gösterilen model Şekil 2C'de gösterilmiştir.

Translaminer otonom sistemde başarılı kültür ve basınç bakımı
Her iki odanın da sistemde bağımsız olarak çalışmasını sağlamak için, Gİb odasını ve ICP'yi farklı ortalama basınç farklarında tutarak birkaç basınç farkını düzenledik (normal TLPG: Gİb: ICP, 15:5 mmHg; yükseltilmiş TLPG >10 mmHg; yükseltilmiş TLPG >20 mmHg). Başlangıçta her iki odadaki (normal Gİb/ICP) ortalama normal basınç farklarının bakımını IOP ve ICP koşullarının çeşitli farklı parametreleri aracılığıyla test ettik: 1) normal Gİb: azalmış ICP (Şekil 3A); 2) yükseltilmiş Gİb: azalmış ICP (Şekil 3B); ve 3) yükseltilmiş Gİb: yükseltilmiş ICP (Şekil 3C). Ortalama normal Gİb 10-21 mmHg (episkleral venöz basınç faktörlü) ve normal ICP 5-15 mmHg arasında değişmektedir. Damar basıncına sahip olmamak yerine, ONH'de maksimum basıncı uygulamak olduğu için bu oranlara olan baskıyı sürdürdük. Her iki odada da çeşitli basınç seviyelerini bağımsız olarak düzenledik (ICP, 5-10 mmHg; Gİb, 20–40 mmHg). Her iki oda arasında basınç bakımı sağlamak için, Gİb'i normal koşullarda (15 mmHg) tuttuk ve 11 mmHg LC arasında bir TLPG (IOP-ICP) sağlamak için ICP'yi (4 mmHg) azalttık (Şekil 3A). Daha sonra Gİb'i (43 mmHg) yükselttik ve ICP'yi (3 mmHg) (Şekil 3B) azalttık ve son olarak her ikisinde de yüksek basınçlar (Gİb, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) 55 mmHg'de en büyük TLPG seviyesini oluşturmak için (Şekil 3C). Dokunun canlılığını sağlamak için (Şekil 4), dokulardaki ortam, çıkış stopcock'una boş bir şırıng takılarak ve itme/çekme yöntemi kullanılarak giriş portu üzerinden yaklaşık 5 mL perfüzyon ortamını yavaşça iterek her 48 saatte bir değiştirildi. Orta değişim sırasında minimum basınç artışı meydana geldi (Şekil 4G) ve 14 ve 30 günlük immünhistokimya verilerinde gösterildiği gibi ONH'nin morfolojisini etkilemedi (Şekil 4A-F). TAS modelinde etkili canlılığa sahip genişletilmiş zaman dilimleri için arka segmentleri kültürleyebileceğimizi doğrulamak için, normal Gİb ve ICP'nin 14 ve 30 gün boyunca bakımından sonra ONH'nin kesitlerini analiz ettik. Bu segmentleri modelde 14 gün boyunca (Şekil 4A, 4B) sağlıklı ONH hücreleri ve optik sinir başında kollajen IV'ün (COLIV) hücre dışı matris ekspresyasyonu ile başarıyla kültürleyebildik (Şekil 4C). Arka segmentin benzer canlılığı ve bakımı da COLIV ve DAPI ekspresy ekspresyişi ile 30 gün boyunca (Şekil 4D, 4E) gözlenmiştir (Şekil 4F). TLPG (IOP-ICP) değerlerinin grafiksel gösterimi (Şekil 4G), Gİb değerlerinin zaman içinde 15,6 ± 4,6 mmHg'de sürekli olarak korunmasını ve ICP, 4,6 ± 1,3 mmHg TLPG ile 30 gün boyunca 11,0 ± 4,6 mmHg'de ortalamadır (Tablo 1).

ONH sonrası yüksek translaminer basınç gradyanındaki morfolojik değişiklikler
Yaşa bağlı nörodejeneratif hastalık glokomunun yaygın bir klinik özelliği ONH cupping'dir. Prelaminar bardaklama, kabın hem derinliğini hem de genişliğini artıran ve böylece fincan-disk oranını artıran prelaminar sinir dokularının ilerleyici kaybı ile ayırt edilir. Laminar bardaklama bağ dokusu bazlıdır, LC arka olarak aşamalı olarak hareket ettirilir ve kazılır. Glaucomatous cupping, laminar bağ dokularının hem hasarını hem de yeniden şekillendirilmesini yansıtan bu iki bileşenin bir kombinasyonudur. Gİb'de yükseklik, kollajen fibril kütlesinde artışa bağlı olarak LC kalınlaşmasına yol açar53. TAS modelini kullanarak, Gİb'i artırarak veya çeşitli zaman noktalarında ICP'yi azaltarak yükseltilmiş bir TLPG oluşturduk. Zaman içinde ortalama Gİb değerleri 22,8 ± 18,6 mmHg ve ICP ortalama 6,9 ± 7,6 mmHg'de 15,9 ± 11,8 mmHg TLPG ile 7 gün boyunca yüksek TLPG aralığını koruduk (Tablo 2). En yüksek TLPG'ler 36 mmHg olarak belgelendi. daha sonra insan posterior segmentleri, yüksek TLPG altında kontrol, 1 gün, 3 gün ve 7 gün arasında zaman ilerledikçe H&E lekeli bölümlerde laminar kirişlerin ve ONH'de cupping'in ilerleyici kalınlaşması için morfolojik olarak analiz edildi (Şekil 5A-D). 7 günlük yüksek TLPG'de tıkanma ve kalınlaşma gözlendi (Şekil 5D). Ayrıca, kontrol arasındaki zaman içinde COLIV ekspresy hızı, 1 gün, 3 gün ve 7 gün kalınlaşmış kirişler ve 7 gün artmış ifade göstermiştir (Şekil 5E-H). TAS modelinde kültüre edilmemiş kontrol dokusunu (Şekil 5I) ve TAS modelinde yükseltilmiş TLPG'nin 7 gününü (Şekil 5J) karşılaştıran faz görüntüleri, kontrol için hiçbir cupping (Şekil 5I) olmadan GCL içindeki sağlıklı RGC'leri gösterir, yükseltilmiş TLPG koşulları altında görüntüler, RNFL'de (Şekil 5J) kalan RGC'ler (RBPMS-RGC işaretleyicisi) olmadan kapsamlı bir cupping gösterir ve ECM'nin yüksek COLIV içinde gösterildiği gibi daha fazla yeniden şekillendirilir ONH (Şekil 5J).

Figure 1
Şekil 1: Translaminar otonom sistem. Model tasviri. (A) Düz ön görünüm. (B) Şeffaf görünüm. (C) Diyagram görünümü. (D) Renkli şeffaf görünüm. (E) Gerçek 3D baskılı model. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Translaminer otonom sistemin mekaniği. (A) Translaminer basınç farklarını düzenlemek için ICP ve Gİb odalarına sahip TAS modeli. (B) TAS modelinin, rezervuarların yükselmesi yoluyla her iki odadaki hidrostatik basıncın otonom olarak düzenlenmesi ile tasviri. (C) Giriş ve çıkış rezervuar şırıngalarının yerinde ve temsili ile TAS modelinin görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Translaminer otonom sistem içinde bağımsız basınç bakımı. Bağımsız olarak modüle edilen basınçların grafiksel gösterimi ve (A) normal Gİb/azalmış ICP (B) yükseltilmiş Gİb/azalmış ICP ve (C) yükseltilmiş Gİb/yükseltilmiş ICP ile üst (ICP) ve alt (Gİb) odalarında kararlı basınçlar korunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Translaminer otonom sistem içindeki arka segmentlerin bakımı ve uygulanabilirliği. İnsan posterior segmentleri, NORMAL Gİb ve ICP koşullarında 14 ve 30 gün boyunca TAS modeli kullanılarak kültürlendi. İnsan ONH'nin H&E lekeli kesitleri 14 günde (A) düşük büyütme (40x) ve (B) yüksek büyütme (100x). (C) DAPI ekspresyumu ile COLIV immünostaining (100x). Benzer H&E boyama tasvirleri 30 gün içinde (D) 40x ve (E) 100x mikrografiler ve (F) COLIV immünostaining DAPI ifadesi (100x). G) Kültürde 30 gün boyunca tutulan insan posterior segmentleri için mmHg IOP-ICP (TLPG) Δ'nin grafik sunumu. COLIV = yeşil; DAPI = mavi; (A, B içine); (D, E içine); H&E = hematoksilin ve eozin lekesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Translaminer Otonom Sistemde yüksek translaminer basınç gradyanı sonrasında optik sinir kafasının morfolojik olarak yeniden yapılandırılması. İnsan posterior segmentleri, yüksek TLPG koşulları altında çeşitli zaman noktaları için TAS modeli kullanılarak kültürlendi. İnsan ONH'nin (A) kontrolünün (B) 1 gün TAS (C) 3 gün TAS'ta ve (D) 7 günlük kültürün H&E lekesini gösteren kesitleri. (E) kontrolünün ONH'sinde (F) DAPI ile COLIV ekspresyâtı TAS 'ta (G) 3 gün ve (H) kültürde 7 gün. FAZ KONTRASTI ONH kesit görüntüleri (I) ONH'yi kontrol et RBPMS'nin retina lekelemeyi ve (I'') ONH boyamayı COLIV ve DAPI ile betimler. RBPMS'nin (J') retina lekesini ve COLIV ve DAPI ile (J'') ONH lekelerini gösteren insets ile TAS'ta (J) 7 günlük yüksek TLPG'nin faz kontrastı. COLIV, RBPMS = yeşil; DAPI = mavi; (A–D) 40x büyütme; (E–H) 100x Büyütme; (I ve J) 200x büyütme; (J') 400x büyütme; (J'') 100x büyütme; (J, J' ve J''nin içine); H&E = hematoksilin ve eozin lekesi; TAS = Translaminar Otonom Sistem. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gün Ortalama Gİb 24 saat Ortalama ICP 24 saat Ortalama TLPG (IOP-ICP)
1 17.7 12.1 5.7
2 20.0 15.0 5.0
3 13.4 9.6 3.7
4 15.1 10.5 4.5
5 11.6 8.3 3.3
6 14.0 9.5 4.5
7 17.2 13.8 3.4
8 19.3 16.1 3.2
9 17.7 15.0 2.8
10 10.9 8.0 2.9
11 16.3 10.2 6.1
12 14.7 11.8 2.9
13 7.5 4.5 3.0
14 5.5 1.4 4.1
15 13.5 8.3 5.2
16 15.4 10.3 5.1
17 11.7 4.5 7.3
18 13.3 9.3 4.0
19 23.5 19.7 3.8
20 20.3 14.5 5.7
21 12.8 5.8 7.0
22 25.8 19.9 5.9
23 19.3 13.5 5.8
24 18.8 15.1 3.7
25 14.4 8.9 5.5
AVG 15.6 11.0 4.6
CYBH 4.6 4.6 1.3

Tablo 1: Normal TLPG'nin bakımı 30 gün boyunca sürdürülür. Gİb, ICP ve TLPG değerlerini gösteren tablo değerleri, tam zaman kursu boyunca ortalama ve standart sapma ile her 24 saatte bir.

Gün Ortalama Gİb 24 saat Ortalama ICP 24 saat Ortalama TLPG 24 saat
1 4.1 -1.0 5.1
2 6.3 1.1 5.3
3 13.4 4.0 9.4
4 19.0 1.1 17.9
5 55.6 19.5 36.2
6 39.5 12.8 26.7
7 21.5 10.8 10.6
AVG 22.8 6.9 15.9
CYBH 18.6 7.6 11.8

Tablo 2: 7 gün boyunca yüksek TLPG aralığının bakımı sürdürülür. Gİb, ICP ve TLPG değerlerini gösteren tablo değerleri, tam zaman kursu boyunca ortalama ve standart sapma ile her 24 saatte bir.

Ek Şekil 1: Ex vivo insan retina explant kültürü. Faz kontrastı, RGC pozitif lekeli (RBPMS-yeşil) ve hücresel (DAPI-mavi) retina eksplantlarının hücresel (DAPI-mavi) lekeli görüntüleri (A-C) 7 gün ve (D-F) 14 gün (200x büyütme). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: İnsan yetişkin RGC kültürleri. RGC işaretleyici (RBPMS-yeşil) ve DAPI (mavi) 7 gün kültür (A) 200x (B) 400x büyütmede RGC'leri lekeledi. (C) 400x büyütmede NEFL (yeşil) ve DAPI (mavi) için lekeli RPC'ler. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan ölüm sonrası dokuları, insan nörodejeneratif hastalıklarının incelenmesi için özellikle değerli bir kaynaktır, çünkü hayvan modellerinde geliştirilen potansiyel ilaçların tanımlanmasının insanlara çevrilebilir olması gerekir47. İnsan Gİb yüksekliğinin etkileri iyi belirlenmiştir, ancak anormal ONH translaminer basınç değişiklikleri üzerinde minimum araştırma gerçekleşmiştir. Birden fazla hayvan modeli ve insan ONH'nin sonlu modellemesi mevcut olsa da, translaminer basınç değişikliklerini incelemek için eks vivo insan modeli yoktur41,54,55,56,57. IOP ve ICP kullanarak hastalık etiyolojisi ex vivo'yu hedef alabilen ve glokom patogenez ile ilgili çeşitli patojenik paradigmaları tanımlayabilen yeni bir preklinik insan modeli için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. ONH'deki basınçla ilgili patolojik değişiklikleri anlamak, RGC ölümünü önlemek için çok önemli olacaktır. TAS modelinde Gİb, ICP ve TLPG'nin birlikte kullanımı, basınç bağımlı dejenerasyonu insan arka segment dokusunu kullanarak preklinik bir şekilde incelemek için benzersiz bir yaklaşımdır. TAS modelinde, Gİb ve ICP odalarının otonom düzenlemesi yoluyla translaminer basınç değişikliklerini incelemek için insan göz kaplarının arka segmentlerini kültüre edebiliriz. Bir dejenerasyon mekanizması olarak translaminer basınca odaklanan yeni bir terapötik ürün yelpazesi geliştirmek için bir temel sağlar.

TAS modelinin kurulması birçok açıdan detaylara dikkat gerektirir: insan arka segmentlerinin doğru diseksiyonu, retinanın sağlam ve arka kap üzerine yayılmasını sağlamak, segmentin Gİb odasının kubbesi üzerine uygun şekilde yerleştirilmesi, ICP odasının ON üzerine doğru bir şekilde yerleştirilmesi, her iki odanın da etkili bir şekilde sızdırmazlığı, ve Gİb ve ICP rezervuarlarının yüksekliğini düzenleyerek hidrostatik basınçların bağımsız olarak bakımı. Diseksiyonun ölümden sonra 24-36 saatten fazla olmayan gözlerde yapılması gerekir, çünkü etkili kültür ortamı yenilenmezse retina giderek bozulur. Sistemimizde her 48-72 saat orta sistemik ikmal yapıldı. Sistemin bir diğer önemli yönü de ON uzunluğudur. Kadavra gözünde en az 0,5-1 cm ON kalmasını sağlamak önemlidir. Donör gözler kısa ON'leri varsa kullanılmamalıdır, ON hasarlıdır, dünya tehlikeye girer ve söndürülmüşse veya ON kılıfı ayrılmıştır. Ayrıca, arka segment kubbenin üzerine yerleştirilirken, O-halkası yerine sıkıca oturtmalı ve üst ICP odası vidalarla doğru bir şekilde kapatılmalıdır. Borunun modelin üst ve alt tabanının her iki tarafına takıldığı topin bağlantı parçalarının da borunun yerine oturduğundan ve kilitlendiğinden emin olmak için test edilmesi gerekir. Boru düzgün bir şekilde yerinde değilse, boru içinde hava kabarcıkları gözlenecek ve her odanın içindeki basınç ölçümlerini tehlikeye atacaktır.

TAS modelimizdeki ölüm sonrası posterior segmentlerin bakımı ve uygulanabilirliği bu protokol için kritik bir endişe kaynağıydı. İnsan ölüm sonrası dokusu daha önce kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır48,49, 1,068 ölüm sonrası donör doku üzerinde yapılan yeni bir RNA analiz çalışması, on yıllar boyunca toplanan ölüm sonrası insan beyin dokusunun insan bozukluklarının incelenmesi için yüksek kaliteli malzeme olarak hizmet olabileceğini doğrulamaya yöneliktir47. Ayrıca ölümden sonra oküler insan donör göz dokularının daha önce başarılı ekspresyon profillemesi yapılmıştır58. Apoptoz genleri için gen ekspresyözü PLIER değerleri retina dokusu için bu veri kümesinde minimal veya yok denecek kadar azdı 6 h postmortem58. Ayrıca göz dokusunun hipotermik depolanmasının etkili bir şekilde yapılabildiği gösterilmiştir59. Minipig gözler iskemik ve hipotermik koşullarda depolandığında ganglion hücre aktivitesinin 50 saat boyunca korunduğu gösterilmiştir41,60. Bu nedenle donör göz kapağı toplamada dahil etme kriterlerimiz olarak 6 saat zaman noktasını kullandık. Posterior segmentlerin ve retina dekolmanının ölüm sonrası bozulma hızı literatürde eksiktir, ancak 6 saat içindeki enükleasyonumuz, buz üzerinde teslimatımız ve maksimum 36 h'lik kültür kurulumumuz, Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'de gösterildiği gibi doku canlılığı aralığındadır. TAS modelini kullanarak 30 gün boyunca dokuların sağlıklı bakımını başarıyla sağladık.

TAS modelinin bir diğer sınırlaması, normal fizyolojik koşullar altında gözlenen ICP ve Gİb'in döngüsel sirkadiyen ritimlerini modelleyemememizdir. Bu, gelecekte ritmik Gİb ve ICP infüzyonunu düzenleyebilen bir pompa kullanılarak ele alınabilir. Ayrıca, modele bir başka uyarı, kadavra gözü içindeki kan dolaşımının olmamasıdır. Bu nedenle, kan basıncının etkileri incelenemez, ancak bu aynı zamanda Gİb ve ICP de dahil olmak üzere sadece TLPG değişikliklerinin patojenik etkilerini özellikle tanımlamamızı sağlar.

Modelin gelecekteki bir kapsamı, hidrostatik değişiklikler için rezervuar sistemlerinin otomasyonunu ve bu protokolde uygulanan çoklu orta değişim turları yerine dönüştürücü üzerinde bir çıkış boş şırınna sahip bir infüzyon pompası aracılığıyla ortamın perfüzyonunu içerecektir. Gİb ve ICP rezervuarından elde edilen sıvı da toplanıp analiz edilebilir. Gelecekteki tedavileri hedeflemek için biyobelirteç ekspresyumu için ortam toplanabilir. Ayrıca ilaçlar veya gen tedavisi ile tedavi edilebilen yolları veya molekülleri tanımlayabilir ve bu tedavileri insan klinik çalışmalarına çeviriden önce ICP'nin çeşitli hayvan modellerinde test edebiliriz.

Sonuç olarak, modelimiz sadece insanca bir test temeli sağlamakla kalmaz, aynı zamanda gözdeki translaminer basınç değişikliklerini hedef alabilen tedavileri doğrulamak için de kullanılabilir. Hasta kök hücrelerinin insan donör göz kapaklarına nakli yoluyla hassas tıbbı gerçekleştirmek ve TAS modelinde basınçlandırmak için bir yol açar. Bu, ek vivo tedavilerini kliniğe çevrilebilir ve yaşayan bireylerle ilişkilendirilebilir kapasitede test etmemizi sağlar. Modelimizle artık translaminer basınçta meydana gelen değişiklikleri ve çeşitli travmatik ve nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili patogenezde nasıl önemli bir rol oynadığını değerlendirebiliriz. Bu, ONH'de Gİb ve ICP ile ilişkili patojenik moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Makalenin yazarlarının açıklayacak potansiyel bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu projenin finansmanı Dr. Colleen M. McDowell'ın ihtiyati fonları aracılığıyla sağlandı. Bu çalışma kısmen Research to Prevent Blindness, Inc.'den UW Madison Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir. Dr. Abbot F. Clark ve Weiming Mao'ya perfüzyon organ kültürü modelindeki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Lions Göz Nakil ve Araştırma Enstitüsü'ne (Tampa, FL) insan donör gözlerini sağladığı için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		 Amazon B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) Amazon B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle Vitality Medical 302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap QOSINA 2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver Brikksen Stainless Steel Fastners PPMSSSCH4C.5  
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE Fisher Scientific NC9085343  
Betadine Purdue PUR1815001EACH  
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167-100EA  
Corning L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS Med Plus Medical Supply COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) Katena K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps F.S.T. 11254-20
Eye Scissors Standard Curved Katena K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes Capitol Scientific 351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers Fisher Scientific 16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium Fisher Scientific SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution Fisher Scientific SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear Qosina 28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate AD instruments DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box Jenson Global JG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscope Keyence B2-X710
LabChart 8 AD instruments LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer Leica ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White QOSINA 65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228) AD instruments FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508) AD instruments PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male McMAster-Carr 7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe McMAster-Carr 51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. Fisher Scientific 14-171-268
Superblock T20 Fisher Scientific PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T. 14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved Katena K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS) University of North Texas Health Science Center N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		 Marco Rubber & Plastics B1000-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Tags

Nörobilim Sayı 158 göz içi basıncı intrakraniyal basınç translaminer basınç gradyanı retina ganglion hücreleri optik sinir kafası perfüzyon organ kültürü
İnsan Donör Arka Segmentlerinde Göz İçi ve İntrakraniyal Basıncın Modülasyonu için Translaminer Otonom Sistem Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, T. P., Curry, S. M.,… More

Sharma, T. P., Curry, S. M., Lohawala, H., McDowell, C. Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments. J. Vis. Exp. (158), e61006, doi:10.3791/61006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter