Summary
トランスラミナー自律システムの使用について説明し、詳細を説明する。このシステムは、ヒト後部セグメントを利用して、セグメント内の圧力(眼内)および周囲の視神経(頭蓋内)を独立して調節し、緑内障視神経障害の特徴を模倣する経層圧勾配を生成する。
Abstract
緑内障病原性に関連する様々な病原性パラダイムを同定できる頭蓋内圧(ICP)および眼内圧(IOP)を用いて、疾患の病因を標的とすることができる新しい前臨床ヒトモデルに対する現在のアンメットニーズがある。エキビボヒト前部灌流器官培養モデルは、緑内障の病態の発見および治療薬の試験に有効な技術として、これまで利用され、応用されてきた。前臨床薬物スクリーニングおよびヒト臓器系の前臨床研究は、臨床研究により翻訳可能である。本稿では、トランスラミナー自律システム(TAS)と呼ばれる新しいex vivoヒト経層圧モデルの生成と動作について詳細に説明する。TASモデルは、ヒトドナー後部セグメントを使用して、ICPとIOPを独立して規制することができます。このモデルは、前臨床的な方法で病因を研究することを可能にする。それは眼科の研究で生きている動物の使用を減らすことができます。.インビトロ実験モデルとは対照的に、視神経ヘッド(ONH)組織構造、複雑性、完全性もex vivo TASモデル内で維持することができます。
Introduction
最近の調査の世界的な推計によると、2億8,500万人が視覚障害を持ち、そのうち3,900万人が視覚障害を持っています1。2010年、世界保健機関(WHO)は、目の後部セグメントに記載されている9つの主要な失明原因のうちの3つが発生することを文書化しました。後部眼疾患は、レチナ、脈絡膜、視神経2を含む。レティナと視神経は脳の中枢神経系(CNS)の拡張である。眼球神経節細胞(RGC)軸索は視神経を通って眼を出て視神経を形成するため損傷を受けやすい3。ONHは、ラミネラクリプロサ(LC)4と呼ばれる結合組織ビームの3Dメッシュワークのために、RGC軸索にとって最も脆弱な点であり続けます。ONHは緑内障5,6,7のRGC軸索に対する侮辱の初期部位であり、ONH内の遺伝子発現変化は眼圧および緑内障モデル8,9,10で研究されている。RGC軸索は、眼内圧(IOP)と呼ばれる眼内区画間の圧力差と、頭蓋内圧(ICP)11と呼ばれる眼内膜膜下腔内の圧力差のためにONHで感受性を有する。LC領域は両方の領域を分離し、通常の圧力差を維持し、IOPは10~21mmHg、ICPは5~15mmHg12の範囲です。2つのチャンバー間の層間の圧力差は、経層圧勾配(TLPG)13と呼ばれる。緑内障の主な危険因子は、IOP14の上昇である。
IOPが増加すると、層内および層領域全体の歪が増加する6,15,16。ヒトおよび動物モデルにおける実験的観測は、軸索損傷の初期部位であるONHを17,18個としている。ONHで緑内障損傷を引き起こすIOP関連ストレスおよびひずみの生体力学的パラダイムは、緑内障19,20,21の病態生理学にも影響を及ぼす。ヒトの圧力誘発変化が機械的にRGC軸索22に損傷を与えるにもかかわらず、薄層内にコラーゲン状のプレートを欠いているげっ歯類も緑内障7,23を発症する可能性がある。さらに、IOPの上昇は、一次開放的な角緑内障患者の最も顕著な危険因子であり、正常な緊張緑内障患者はIOPが上昇しなくても緑内障の視神経障害を発症する。さらに、視神経損傷を示さない眼圧症患者のサブセットもあります。また、脳脊髄液圧(CSFp)が緑内障の病態に役割を果たす可能性も示唆されている。この証拠は、緑内障患者では正常な個体に比べてICPが〜5mmHgに低下し、それによって経層圧の上昇を引き起こし、疾患24,25において重要な役割を果たすことを示している。以前は、イヌモデルで、IOPおよびCSFpの変化を制御することによって、視ディスク26の大きな変位が存在することが実証された。ブタの目にCSFpを上昇させることはまた、LC領域およびレトロ層神経組織内の増加した主な緊張を示している。RgcsとLC領域への負担の増加は、軸索輸送の閉塞およびRGCs27の損失に寄与します。RGCの進行性変性は、栄養性サポート28,29の喪失、炎症過程/免疫調節30,31の刺激、およびアポトーシスエフェクター29,32,33,34,35と関連している。さらに、軸索損傷(図3)は、RGCに有害な影響を及ぼし、回生障害36,37,38,39を引き起こします。IOPの効果はよく研究されているにもかかわらず、異常な経層圧変化に対して最小限の研究が行われてきた。緑内障のほとんどの治療法は、IOPの安定化に焦点を当てています。しかし、IOPの低下は病気の進行を遅らせるが、視野の喪失を逆転させ、RGCの完全な喪失を防ぐものではない。
現在の証拠は、外傷性または神経変性視覚障害に苦しむ患者の様々な機械的、生物学的、または生理学的変化による経層圧調節が重大な視力低下を引き起こす可能性があることを示している。現在、元生体内ヒトONH内の緑内生体損傷の研究を可能にする真の前臨床ヒト後部セグメントモデルは存在しない。眼科27では眼の後部の観察と治療は大きな課題です。後眼を標的とする物理的および生物学的障壁は、高い排除率、血液性バリア、および潜在的な免疫学的応答40を含む。新しい薬剤標的に対するほとんどの有効性および安全性試験は、生体外細胞および生体内動物モデル41を利用して達成される。眼の解剖学は複雑であり、インビトロ研究は組織モデルシステムによって提示される解剖学的および生理的障壁を正確に模倣しない。動物モデルは薬物動態学的研究の必需品ですが、ヒト後眼の眼生理は、眼の細胞構造、脈管系、ONH41,42など様々な動物種によって異なる可能性があります。
生きている動物の使用は、集中的かつ詳細な倫理規則、高い財政的コミットメント、および効果的な再現性43を必要とします。最近、実験研究における動物の倫理的使用に関する他のガイドライン44,45,46が制定されました。動物実験の代わりに、病気の病因を調査し、ONHの損傷を保護するための薬物の潜在的な分析を調査するために、ex vivoヒトの目のモデルを使用しています。ヒト死後組織は、ヒト疾患パラダイム、特にヒト神経変性疾患の場合、動物モデルで開発された潜在的な薬物の同定にはヒト47に翻訳可能である必要があるため、ヒト疾患パラダイムを研究するための貴重なリソースである。このエクスビボヒトドナー組織は、ヒト障害47,48,49の研究に広く利用されており、ヒト前セグメント灌流器官培養系は以前、IOP50,51,52の上昇の病態生理学を研究するユニークなex vivoモデルを提供してきました。
ヒトの目のIOPとICPに関連する経層圧を研究するために、我々は、ヒトドナーの眼の後部セグメントを用いてIOPとICPを独立して調節できる2室のトランスラミナー自律システム(TAS)の設計と開発に成功した。これは、経層圧を研究し、ONHに対するTLPGの生体力学的効果を利用する最初のex vivoヒトモデルです。
このex vivoヒトTASモデルは、IOPまたはICPの慢性的な上昇のために起こる細胞および機能性の修飾を発見し、分類するために使用することができる。本レポートでは、TASヒト後部セグメントモデルの解剖、設定、モニタリングのステップバイステップのプロトコルについて詳述する。このプロトコルは、他の研究者が生体機械疾患の病因を研究するために、この新しいex vivo加圧ヒト後部セグメントモデルを効果的に再現することを可能にする。
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Protocol
ヒト組織を含む研究のためにヘルシンキ宣言の規定に従って目を得た。
注:評判の良い眼球バンク(例えば、ライオンズ眼移植研究所、研究センター、タンパFL)からの目は死亡の6〜12時間以内に収穫され、ドナー血清はB型肝炎、C型肝炎、およびヒト免疫不全ウイルス1および2について試験された。彼らが受け取られたら、目は解剖され、24時間以内にTASモデルに設定されました。除外基準には、眼病理学が含まれていた。年齢、人種、性別に基づいて目が除外されませんでした。レティナの生存率を確認するために、組織ドナーからレチンの外植物を採取し、7日および14日間培養した(補足図1)。これらのレチナはまた解光し、RGCマーカー、多発スプライシングを有するRNA結合タンパク質(RBPMS)、ならびにそれらの神経フィラメントにおける正のニューロフィラメント軽鎖(NEFL)染色を有する培養中の健康なGLCを7日間成長させた(補足図2)。.
1. 設備・消耗品の製造・殺菌
- 必要な供給の完全なリスト、サプライヤー番号、カタログ番号については、 資料表 をご覧ください。
- 使用する前に、オートクレーブまたはエチレンオキシドアンプルを使用して、すべての機器や器具を殺菌してください。
2. 灌流媒体の調製
- 1%ペニシリンストレプトマイシン(10,000 U/mLペニシリン、0.85%NaClで10,000 μg/mLレンサプトマイシン)、1%L-グルタミン(200mM)を1,000 mLの高グルコースダルベックコのイーグル改変のミディアム(DM)に加えます。
- 0.22 μmフィルターを通過して、灌流媒体を殺菌します。
3. トランスラミナー自律システム(TAS)の設定
- 流入シリンジ(IOP および ICP リザーバ)を設定します。
- 30 mL のシリンジに、30 mL の灌流媒体(セクション 2)を加えます。30 mLのシリンジに3ウェイストップコックを取り付けます。3ウェイストップコックに0.22 μmの親水性フィルターを取り付けます。15 G Luer スタブ アダプターを 0.22 μm 親水性フィルターに取り付けます。
- シリンジの設定から気泡を取り除く。15 G Luer スタブ アダプタにチューブを取り付けます。未発明のユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 つの設定について、この手順を繰り返します。
- 1つのシリンジをチャネル1頭蓋内圧(CH1 ICP)、もう一方のシリンジをチャネル2眼圧(CH2 IOP)としてラベル付けする。
- 流出シリンジ(IOP および ICP リザーバ)を設定します。
- 30 mL のシリンジに3ウェイストップコックを取り付けます。3ウェイストップコックに15 G Luerスタブアダプタを取り付けます。15 G Luer スタブ アダプタにチューブを取り付けます。
- 未発明のユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 つの設定について、この手順を繰り返します。1 つのシリンジを CH1 ICP、もう 1 つのシリンジを CH2 IOP とラベル付けします。
4. 人間の目全体の地球儀の準備
注:目全体が受け取られた場合は、以下の手順に従って、前部セグメントと眼の後部セグメントを分離します。目が二分された場合は、ステップ4.4から始めます。
- ポビドネ-ヨウ素溶液に目全体を2分間入れる。
- ステリン酸緩衝液(PBS)で目をすすいで、ポビドネヨウ素をすすい取ります。2回繰り返します。
- 鉗子とはさみを使用して、目の地球全体からアドナキサを取り除きます。赤道で目を二分して、眼の前部と後部のセグメントを分離する。
- 視神経鞘を取り外します。後部セグメントからビトレウス・ユーモアを除去します。
- 必要に応じて後部セグメントから追加のスクレラをトリムし、IOP(下部)チャンバーの円形ドームに適しています。鉗子を使用して、レチナがセグメントの後部に均等に広がっていることを確認します。
- IOP (下部) チャンバーのセットアップ
- 視神経が上に向いている円形ドームの上に、TASのIOP(下)室に人間の後部セグメントを置きます。
- エポキシ樹脂Oリングを4本のネジで使用して後部セグメントをシールし、密閉を確保します。
- チューブを IOP (下部) チャンバの IN ポートと OUT ポートに挿入します。チューブを含む媒体を持つIOP流入シリンジがINポートに挿入され、チューブ付きの空のIOP流出シリンジがOUTポートに挿入されます。
- プッシュ/プル方式を使用して、灌流媒体を流入口にゆっくりと注入して後部アイカップを満たす一方で、流出注射器を通して灌流媒体をゆっくりと引き出してラインから気泡を取り除きます。INチューブとOUTチューブの両方が気泡を空隙したら、培地を注入しないでください。
- オフの位置にストップコックをロックします。IOP INポートフィルタアセンブリから30 mLのシリンジを取り出し、合計30 mLの培地で補充します。30 mLのシリンジをフィルターアセンブリに交換します。
-
ICP(上)チャンバーのセットアップ
- ICP(上)のチャンバー/蓋を後部セグメントの背面に置きます。視神経が最上部の部屋の中にあることを確認します。4本のネジで上部チャンバーをシールします。
- チューブを ICP(上部)チャンバーの IN ポートと OUT ポートに挿入します。チューブを含む ICP インフロー シリンジは、イン ポートに挿入され、チューブ付きの空の ICP 流出シリンジが OUT ポートに挿入されます。
- ICPチャンバーを充填するために、INポートにゆっくりとゆっくりと注入し、プッシュ/プル法を使用してラインから気泡を除去します。ICPチャンバーとINとOUTの両方のチューブが気泡の空隙になったら、媒体を注入しないでください。
- オフの位置にストップコックをロックします。ポートフィルターアセンブリのICPから30 mLのシリンジを取り出し、合計30 mLの媒体で補充します。30 mLのシリンジをフィルターアセンブリに交換します。
5. データ記録システムのセットアップ
注:データ記録システムは、8チャンネル電源、マルチチャンネルブリッジアンプ、静水圧トランスデューサ、およびデータ取得ソフトウェアを搭載したコンピュータで構成されています( 材料表を参照)。以下は、システムの設定および調整の方法を説明します。
- 電源コードを8チャンネル電源の背面に接続し、バッテリバックアップデバイスに接続します。
- 8 チャンネルの電源からコンピュータの背面に USB ケーブルを接続します。
- 付属のI2Cコードを使用して、8チャンネルの電源をマルチチャンネルブリッジアンプに接続します。
- 8 チャンネル電源の前のチャネル入力に、ケーブルの端部にバイオレット ニール・コンセルマン(BNC)ケーブルをマルチチャンネルアンプの背面にある対応するチャネルに接続します。
- トランスデューサケーブルをマルチチャンネルアンプの前面に接続します。
- コンピュータにデータ収集ソフトウェアをインストールします。
- 提供されたソフトウェア CD からデータ収集ソフトウェアセットアップインストーラを実行します。
- コンピュータの画面の指示に従います。
- インストールが完了したら、[ 完了] を選択します。
- 8チャンネルの電源をオンにします。
- コンピュータの電源を入れ、データ収集ソフトウェアを起動します。
- ファイル |の選択新機能。
- セットアップ |の選択チャンネル設定。3 つのチャンネルを選択します (画面の左下)。チャネルタイトル列で、チャネルの名前を次のように変更します。CH2 IOP;CH3 TLPG (IOP-ICP)。
- すべてのチャンネルの 範囲 として 2 mV を選択します。[ 計算 ]列で、チャンネル1と2の 計算なし を選択します。
- [ 計算 ] 列で、チャネル 3 の [算術] を選択します。[ 式 ] セクションで、 チャネル/CH2 を選択します。 算術 "-" を選択します。 チャンネル/CH1を選択します。 出力 セクションで mmHg を選択します。[ OK] を選択します。もう一度 [OK] を選択します 。
- 静水圧トランスデューサを設定し、較正します。
注:静水圧トランスデューサは、次の方法を使用して実験する前に較正する必要があります。- 静水圧トランスデューサをマルチチャンネルブリッジアンプに接続されたトランスデューサラインに接続します。
- 空気で満たされた30 mLのシリンジをCH1(ICP)圧力トランスデューサの側面ポートに取り付けます。CH1(ICP)圧力トランスデューサの底部にスフィモマノメーターを取り付けます。
- グラフで、データ取得ソフトウェアのページを表示し、サンプリング時間の横にある矢印を左クリックしてサンプリング速度を設定し、 100 を選択します。次に、ページの CH1 (ICP) 領域を右クリックします。
- ブリッジアンプを選択します。[メイン フィルタ] を選択します。ゼロを選択し、圧力トランスデューサを動かさないためにシステムがゼロになるまで待ちます。
- 圧力トランスデューサの白いタブをつまみ、40 mmHgが血圧計で得られるまでトランスデューサを通して空気を押します。白いタブを放し、注射器と血圧計を取り外します。
- [ 単位変換] ページで、[マイナス (-)] 記号を選択します。40 mmHg を示す最も高い高原を強調表示します。点 1 の 矢印 をクリックし、40 と入力します。
- 0 mmHg を示す最下層をハイライトします。点 2 の 矢印 をクリックし、0 と入力します。単位として mmHg を選択します。[ OK] を選択します。
- [OK](ブリッジアンプページ)を選択します。最高の高原では 100 mmHg、最下層部では 0 を使用して、CH2 (IOP) の場合は手順 9.1 ~ 9.7 を繰り返します。
- TAS/後部セグメントユニットをデータ収集システムに接続します。
- TAS/後部セグメントユニットをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。OUT ポートから CH1(ICP)圧力トランスデューサに ICP チューブを取り付けます。
- OUT ポートから CH2(IOP)圧力トランスデューサに IOP チューブを取り付けます。
- インポートからリングスタンドに、インディアを使用してシリンジのセットアップ(ICPおよびIOP)を取り付けます。
- [ チャート ビュー ] ページで、[ サンプリングの開始] を選択します。サンプリング時間の横にある矢印を左クリックしてサンプリング速度を設定し、[ 低速 ] および [ 1 分] を選択します。
- リングスタンドのシリンジを上下に調整して、プロトコル要件に合わせてICPおよびIOP圧力を調整します。
- プッシュとプル方式を使用して、システム内の培地の全身補充を48~72時間ごとに行います。
6. データの取得と分析
- データ取得ソフトウェアでデータファイルを開きます。
- [ データ パッド] セクションで、[ データ パッドに複数 追加] アイコンをクリックします。新しいウィンドウが表示されます。
- [ 検索方法 ] セクションで、ドロップダウン メニューから [時間 ] を選択します。
- [ 選択 ] セクションで、ドロップダウン メニューから 1 時間 ごとに 1 時間 を選択します。
- [ ステップスルー ] セクションで[ ファイル全体 ]を選択し、[ 追加]をクリックします。
- [データ パッド] セクションで、[データ パッド表示] アイコンをクリックします。すべてのデータをハイライト表示し、スプレッドシートにコピー/ペーストします。
- 24 時間ごとに IOP、ICP、および TLPG の平均と標準偏差を計算します。スプレッドシート プログラムおよびグラフでピボットテーブル オプションを使用してデータを照合します。
7. 後部セグメントの免疫染色とヘマトキシリンとエオシン染色
- TASモデルから様々なタイムポイントに続く後眼部を取り除き、パラフィンをする前にホルマリンで固定します。
- 目を切って矢状組織面を作り出す。
- パラフィン埋め込みセグメントを100%キシレン、95%エタノール、50%エタノール溶液でデパラフィン化します。
- PBSでスライドを10分間洗浄し、1時間室温でブロッキングバッファでブロックします。
- 一次抗体を有する標識切片:抗コラーゲンIV(細胞外マトリックス(ECM)マーカー、NB120-6586、1:100)および抗ラミニン(ECMマーカー、NB300-144、1:100、抗RBPMS(RGCマーカー)、GTX118619、1:50)。
- Alexa Fluor二次抗体を用いて一次抗体を検出する(アレクサフルオール488ヤギ抗ウサギ、A11008、1:500)。
- DAPI抗フェード溶液を用いて細胞核に対抗する。
- 蛍光顕微鏡を使用して、4xおよび10x対物レンズで染色されたセクションと位相画像の画像をキャプチャします( 材料表を参照)。
- ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の場合、100%、キシレン95%エタノール、50%エタノール溶液およびH&Eとの染色を使用して、デパラフィン化のための自動染色システム( 材料表を参照)でセクションを処理します。
- 明視野光源を持つ顕微鏡を使用して、4xと10x対物レンズで画像をキャプチャします。
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Representative Results
トランスラミナー自律システムの設計と作成
トランスラミナー圧差は、緑内障を含む様々な疾患の病因における潜在的な重要なメカニズムである。記載されたモデルの用途には、緑内障(IOPの上昇、ICPの低下)、外傷性脳損傷(高いICP)、微小重力関連視覚障害(ICPの上昇、IOPの上昇)への長期暴露の研究が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトの眼の経層圧を標的とする分子病原体を発見するために、TASモデルを設計、作成、検証しました。我々の新しいex vivoヒトモデルは、ICPおよびIOP関連病原性変化を独立して研究するユニークな前臨床システムを提供する。ヒトの前臨床応用に取り組むために、我々のモデルは経層圧変化による病因を研究するex vivoパラダイムを提供する。シールされたモデル設計は、すべての流入ポートと流出ポートを示すモデルの詳細な図示図と、平面正面および透明ビュー(図1A、 1B)で描かれています(図1C)。実際の3Dプリントモデルにおける人間の後部セグメントを持つ色の透明なビューを示します(図1D、 1E)。
トランスラミナー自律システム:新しいex vivoヒトトランスラミナー圧モデル
我々は、2つの自律室(すなわち、IOPおよびICPチャンバー)を備えたTASモデルを生成した。モデルの底部では、人間の後部カップを円形ドームの上部に置き、視神経を上に向けた。後部カップをIOPチャンバーに入れ、密封したら、ICPチャンバーを神経の上に置いた。各チャンバにぴったり合うOリングを用いて、両チャンバーの独立性と完璧なシールを維持しました(図2A)。一方、最下部チャンバーまたはIOPチャンバーはカップ内の圧力を満たし、調整し、上部チャンバーは視神経の周りに収まり、静水圧貯留層を通して神経の周りのICPを調節した。このモデルを用いて、静水圧を用いてIOPとICPを独立して調整しました。両チャンバ間の差は、経層圧勾配の変化として同定された(図2B)。インフローと流出貯留器のシリンジを含む、すべての最終継手で描かれたモデルを 図2Cに示します。
トランスラミナー自律システムにおける培養と圧力維持に成功
両方のチャンバーがシステム内で独立して機能することを保証するために、我々は異なる平均圧力差でIOPチャンバーとICPを維持することによっていくつかの圧力差を調節しました(通常のTLPG:IOP:ICP、15:5 mmHg;上昇TLPG>10 mmHg;上昇TLPG>20 mmHg)。我々は当初、IOPおよびICP条件の様々な異なるパラメータを介して両方のチャンバー(正常IOP / ICP)の平均正常圧力差の維持をテストしました:1)正常IOP:減少したICP(図3A)。2) IOP の上昇: ICP の減少 (図 3B);3)上昇したIOP:上昇したICP(図3C)。平均正常IOPは10~21mmHg(エピスクレル静脈圧因子)、通常ICPは5~15mmHgの範囲です。血管圧を持たないという制限の代わりに、ONHで最大の圧力を発揮するという考え方だったので、我々はまだこれらの速度への圧力を維持しました。我々は独立して両方の部屋の様々な圧力レベルを調整した(ICP、5-10 mmHg;IOP、20-40 mmHg)。両チャンバ間の圧力維持を確実にするために、IOPを正常な状態(15mmHg)下げ、ICP(4mmHg)を減少させ、11mmHgのLC間でTLPG(IOP-ICP)を維持しました(図3A)。その後、IOP(43 mmHg)を上昇させ、ICP(3 mmHg)を減少させ(図3B)、最後に両方の圧力(IOP、64 mmHg)の圧力を上昇させました。ICP、9 mmHg)で最大レベルのTLPGを生成する(図3C)。組織の生存率を確保するため(図4)、組織中の培地は、流出栓孔に空の注射器を取り付け、プッシュ/プル法を用いて流入口を通して約5mLの灌流媒体をゆっくりと押し出すことによって、48時間ごとに交換した。最小圧力上昇は、媒体交換時(図4G)に起こり、14日および30日間の免疫組織化学データ(図4A–F)に示すようにONHの形態に影響を与えなかった。TASモデル内で有効な生存率を有する延長時間枠の後部セグメントを培養できることを確認するために、通常のIOPおよびICPの維持後にONHの断面を14日および30日間分析した。これらのセグメントを14日間モデルで培養することができました(図4A,4B)は、視神経ヘッドでの健常なONH細胞と細胞外細胞外マトリックス発現(図4C)を用いて行うことができました。後部セグメントの同様の生存率および維持も、COLIVおよびDAPIの発現を伴う30日間(図4D、4E)であった(図4F)。TLPG (IOP-ICP) 値のグラフィカルな表現 (図 4G) は、15.6 ± 4.6 mmHg で IOP 値を一定に維持し、ICP 平均値を 4.6 ± 1.3 mmHg で 30 日間 4.6 mmHg ± 11.0 で示しています (表 1)。
ONH後高い経層圧勾配の形態変化
一般的な臨床特徴は、緑内障の関連神経変性疾患です。プレラミナーカッピングは、カップの深さと幅の両方を増加させ、カップ対ディスク比を増加させる前層神経組織の進行性損失によって区別されます。ラミナーカッピングは結合組織ベースで、LCは後進的に進行的に移動し、発掘します。緑内障カッピングは、これらの2つの成分の組み合わせであり、ラミナー結合組織の損傷および改造の両方を反映する。IOPの上昇は、コラーゲン線維質量53の増加によるLC肥厚をもたらす。TASモデルを利用して、さまざまなタイムポイントにわたってIOPを増やすか、ICPを減少させることによって、高いTLPGを作成しました。18.6 mmHgの平均IOP値±18.6mmHg、ICP平均値が11.8mmHgのTLPGで6.9±7.6mmHgで、7日間の上昇tlPGの範囲 ±を維持しました(表2)。最高のTLPGsは36 mmHgで文書化された。その後、ヒトの後部セグメントを形態学的に分析し、制御、1日、3日、7日間の間に制御が進むにつれて、H&E染色されたセクションのONHでの層ビームの漸進的な肥厚とカッピングを、高いTLPGの下で1日、3日、7日間進んだ(図5A–D)。7日間の高いTLPGでカッピング及び肥厚が観察された(図5D)。また、制御間の時間経過に伴うCOLIV発現は、1日、3日、7日間、ビームが肥厚し、発現が7日増加した(図5E–H)。TASモデルで培養されていない制御組織(図5I)と7日間(図5J)のTASモデル内での高いTLPGの相画像は、コントロール用のカッピングなしのGCL内の健全なGCL(図5I)を示し(図5I)、 高いTLPGの条件下では、画像はRNFL(図5J)に残っているGGC(RBPMS-RGCマーカー)のない広範なカッピングを示し、ECMのリモデリングが増加したONH(図5J)。
図1:トランスラミナー自律システム モデルの描写。(A) ソリッドフロントビュー。(B) 透明なビュー。(C) 図表ビュー。(D) 透明なカラービュー。(E) 実際の3Dプリントモデル。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:トランスラミナー自律システムの力学 (A) 経層圧差を調節するためのICPおよびIOPチャンバを備えたTASモデル。(B) 貯留槽の上昇を通して両方の部屋の静水圧の自律的な調節を持つTASモデルの描写。(C) すべての継ぎ手を配置したTASモデルの画像と、流入および流出貯留層のシリンジの表現。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:トランスラミナー自律システム内の独立した圧力維持。 圧力が独立して変調され、(A)正常IOP/減少ICP(B)上昇ICP、および(C)上昇IOP/上昇ICPを有する上部(ICP)および底部(IOP)チャンバーで安定した圧力が維持されるグラフィカル表現。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:経層自律システム内の後部セグメントの維持と生存可能性 ヒト後部セグメントは、IOPおよびICPの通常の条件下で14日および30日間TASモデルを用いて培養した。H&Eは、(A)低倍率(40x)および(B)高倍率(100x)で14日でヒトONHの断面を染色した。(C)DAPI発現を用いたCOLIV免疫染色(100x)。H&E染色の同様の描写は、(D)40xおよび(E)100x顕微鏡写真および(F)DAPI発現を有するCOLIV免疫染色(100x)における30日での染色である。 G)培養で30日間維持されたヒト後部セグメントのIOP-ICP(TLPG)のmmHgにおけるΔのグラフィカルなプレゼンテーション。COLIV = 緑;DAPI = 青;(A、インセット B);(D、差し込み E);H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン染色 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:トランスラミナー自律システムにおける経層圧勾配上昇後の視神経頭部の形態学的再構成 ヒト後部セグメントは、TASモデルを用いて、TLPG条件の上昇下で様々な時点で培養した。(A)コントロール(B)のH&E染色を1日間TAS(C)TAS(C)3日間でTASで、(D)培養7日間を描いたヒトONHの断面。(E)コントロール(F)のONHにおけるDAPIを用いたCOLIVの発現(F)TAS(G)3日間でTAS(G)3日目、培養7日目。(I)コントロールONHの位相コントラストONH断面画像は、RBPMSの(I')レティナ染色と(I')COLIVおよびDAPIによるONH染色を描写する。(J)TASにおけるTLPGの7日間の上昇の位相コントラストは、RBPMSの(J')レティナ染色および(J')COLIVおよびDAPIでの(J')ONH染色を描写する。COLIV、RBPMS = 緑;DAPI = 青;(A-D) 40倍の倍率;(E–H) 100倍の倍率;(IとJ)200倍の倍率。(J')400倍の倍率。(J')100倍倍。(J、インセットJ'とJ');H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン染色;TAS = トランスラミナー自律システムこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 日 | 平均 IOP 24 時間 | 平均 ICP 24 時間 | 平均 TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| 平均 | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| STD | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
表1:30日間維持された通常TLPGのメンテナンスIOP、ICP、TLPG 値を表す表形式の値は、24 時間ごとに、完全なタイム コースの平均と標準偏差を持ちます。
| 日 | 平均 IOP 24 時間 | 平均 ICP 24 時間 | 平均TLPGの24時間 |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| 平均 | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| STD | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
表2:7日間維持される高いTLPGの範囲の維持。 IOP、ICP、TLPG 値を表す表形式の値は、24 時間ごとに、完全なタイム コースの平均と標準偏差を持ちます。
補足図1:ヒト外発培養の元生体外培養位相コントラスト、RGC陽性染色(RBPMS-緑色)、および細胞(DAPI-青色)は、(A–C)7日間および(D-F)14日間(200倍倍率)の培養中のレチナル外植物の染色画像である。こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
補足図2:ヒト成人RGC培養 RGCマーカー(RBPMS-緑色)及びDAPI(青色)染色されたRgcs7日間培養(A)200x(B)400x倍率。(C) 400倍倍でNEFL(緑)とDAPI(青)に染色されたRGC。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
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Discussion
ヒト死後組織は、動物モデルで開発された潜在的な薬物の同定がヒト47に翻訳可能である必要があるため、ヒト神経変性疾患を研究するための特に貴重なリソースである。ヒトIOP上昇の効果は確立されているが、異常なONH経層圧変化に対して最小限の研究が行われている。複数の動物モデルとヒトONHの有限モデリングが存在するにもかかわらず、経層圧変化41,54,55,56,57を研究するex vivo人体モデルはありません。IOPとICPを使用して疾患病因を標的とし、緑内障病原論に関連する様々な病原性パラダイムを同定できる新しい前臨床ヒトモデルに対する現在のアンメットニーズが存在する。ONHにおける圧力関連の病理学的変化を理解することは、RGC死亡を防ぐために重要である。TASモデル内でのIOP、ICP、およびTLPGの併用は、ヒト後部セグメント組織を利用した前臨床的方法で圧力依存性変性を研究するためのユニークなアプローチです。TASモデルでは、人間の眼球カップの後部セグメントを培養して、IOPおよびICPチャンバーの自律的な調節を通じて経層圧の変化を研究することができます。変性のメカニズムとして経層圧に焦点を当てた新しい範囲の治療薬を開発するための基盤を提供します。
TASモデルの設定には、多くの側面で細部に注意する必要があります:人間の後部セグメントの正しい解剖、レチナが無傷で後部カップの上に広がっていることを保証し、IOPチャンバーのドームの上にセグメントを適切に配置し、ICPチャンバーをONの上に正確に配置し、両方のチャンバーの効果的なシール、 IOPおよびICP貯留層の高さを調節することによって独立して静水圧の維持。有効な培養培地が補充されないと、レチナは徐々に悪化するため、24~36時間以下の目で解剖を行う必要がある。培地の全身補充は、48〜72時間ごとに当社のシステムで行われました。システムのもう一つの重要な側面は、オンの長さです。少なくとも0.5~1cmのONがカダベリスの目に残っていることを確認することが重要です。ドナーの目は、短いINを持っている場合、ONが損傷している場合、地球が危険にさらされ、膨張している場合、またはONシースが切り離されている場合は使用しないでください。さらに、後部セグメントをドームの上に配置する場合、Oリングはしっかりと所定の位置に収まっており、上部ICPチャンバはネジで正しく密封されなければなりません。モデルの上下のベースの両側にチューブが取り付けるプッシュピン継手も、チューブが適合し、所定の位置にロックされていることを確認するためにテストする必要があります。チューブが適切に配置されていない場合、チューブ内に気泡が観察され、各チャンバー内の圧力測定値が損なわれます。
TASモデルにおける死後の事後セグメントの維持と実行可能性は、このプロトコルにとって重大な懸念事項でした。ヒト死後組織は以前に48,49の広範な研究を行っており、最近の1,068個の死後ドナー組織のRNA分析研究では、数十年にわたって収集された死後のヒト脳組織がヒト障害の研究のための高品質な材料として役立つことを確認した。また、これまで成功したヒトドナー眼組織の発現プロファイリングが死後に行われている。アポトーシス遺伝子の遺伝子発現PLIER値は、このデータセットにおいて、6時間死後の組織に対して最小または存在しなかった。さらに、眼組織の低体温保存が効果的に行われることが示された59。小脳および低体温条件でミニピッグの目が保存されると、ガングリ細胞活性が50時間維持される41,60が示されている。そこで、6時間のタイムポイントをドナーアイカップコレクションの包含基準として使用しました。後部セグメントの死後の悪化の速度と網膜剥離は文献に欠けているが、6時間以内の我々の核分裂、氷上の送達、及び最大36時間の培養セットアップは、補足図1および補足図2に示すように組織生存率の範囲内にある。TASモデルを用いて、30日間の組織の健全な維持に成功しました。
TASモデルのもう一つの制限は、正常な生理学的条件下で観察されるICPおよびIOPの周期的概日リズムをモデル化できないことです。これは、リズミカルなIOPとICPの注入を調節することができるポンプを使用して、将来的に対処することができます。さらに、モデルに対するもう一つの注意点は、カダビリック眼の中の血液循環の欠如である。したがって、血圧の影響は研究できませんが、IOPやICPを含むTLPG変化のみの病原性効果を具体的に説明することもできます。
モデルの将来の範囲は、このプロトコルで実装された媒体変更の複数のラウンドの代わりに、トランスデューサー上の出口空の注射器を備えた注入ポンプを介して流体静力学変化と媒体の灌流のための貯水池システムの自動化を組み込むだろう。IOPおよびICP貯留層からの流体も収集し、分析することができる。培地は、将来の治療法を標的とするバイオマーカー発現のために収集することができる。また、薬物療法や遺伝子治療で治療できる経路や分子を特定し、ヒト臨床試験への翻訳前にICPの様々な動物モデルでこれらの治療法をテストすることもできます。
結論として、我々のモデルは、検査の人間の基礎を提供するだけでなく、眼の経層圧変化を標的にすることができる治療法を検証するためにも利用することができる。これは、ヒトドナーの眼球に患者幹細胞を移植し、TASモデルでそれらを加圧して精密医療を行う道を開きます。これにより、クリニックに翻訳可能で、生きている個人に関連する能力を持つex vivo療法をテストすることができます。我々のモデルを用いて、経層圧で起こる変化と、それが様々な外傷性および神経変性疾患に関連する病因においてどのように重要な役割を果たすかを評価することができる。これは、IOPおよびICPに関連するONHの病原性分子メカニズムのより良い理解につながります。
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Disclosures
原稿の著者は、開示する潜在的な利益相反を持っていません。
Acknowledgments
このプロジェクトの資金は、コリーン・M・マクダウェル博士の裁量的資金を通じて行われました。この研究は、失明を防ぐための研究からUWマディソン眼科視覚科学科への無制限の助成金によって部分的に支えられた。アボット・F・クラーク博士とワイミング・マオ博士が灌流器官培養モデルに関する技術支援をしてくれたことに感謝します。ライオンズ・アイ移植・研究研究所(フロリダ州タンパ)が、人間のドナーの目を提供してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
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