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Neuroscience

मानव दाता पश्चवर्ती खंडों में इंट्राओकुलर और इंट्राक्रैनियल दबाव के मॉडुलन के लिए ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली मॉडल

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61006
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

Summary

हम ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली के उपयोग का वर्णन और विस्तार करते हैं। यह प्रणाली मानव पश्चवर्ती खंड का उपयोग स्वतंत्र रूप से खंड (इंट्राओकुलर) के अंदर दबाव को विनियमित करने के लिए करती है और ऑप्टिक तंत्रिका (इंट्राक्रैनियल) के आसपास एक ट्रांसलैमिनर दबाव ढाल उत्पन्न करने के लिए जो ग्लूकोमाटस ऑप्टिक न्यूरोपैथी की विशेषताओं की नकल करती है।

Abstract

एक नए प्रीक्लिनिकल मानव मॉडल के लिए एक वर्तमान अपूर्ण आवश्यकता है जो इंट्राक्रैनियल दबाव (आईसीपी) और इंट्राओकुलर दबाव (आईओपी) का उपयोग करके रोग एटियलजि पूर्व विवो को लक्षित कर सकता है जो ग्लूकोमा रोगजनन से संबंधित विभिन्न रोगजनक प्रतिमानों की पहचान कर सकता है। पूर्व विवो मानव पूर्वकाल खंड परफ्यूजन अंग संस्कृति मॉडल को पहले सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और डॉडरामस रोगजनन की खोज और चिकित्सीय के परीक्षण के लिए प्रभावी प्रौद्योगिकियों के रूप में लागू किया गया है। प्रीक्लिनिकल ड्रग स्क्रीनिंग और पूर्व विवो मानव अंग प्रणालियों पर किए गए शोध नैदानिक अनुसंधान के लिए अधिक ट्रांसलेटेबल हो सकते हैं। यह लेख विस्तार से एक उपन्यास पूर्व विवो मानव ट्रांसलैमिनर दबाव मॉडल की पीढ़ी और संचालन का वर्णन करता है जिसे ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली (टीएएस) कहा जाता है। टीएएस मॉडल स्वतंत्र रूप से मानव दाता के पीछे के खंडों का उपयोग करके आईसीपी और आईओपी को विनियमित कर सकता है। मॉडल एक प्रीक्लिनिकल तरीके से रोगजनन का अध्ययन करने की अनुमति देता है। यह नेत्र अनुसंधान में जीवित जानवरों के उपयोग को कम कर सकता है। इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल के विपरीत, ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ओएनएच) ऊतक संरचना, जटिलता और अखंडता को पूर्व विवो टीएएस मॉडल के भीतर भी बनाए रखा जा सकता है।

Introduction

हाल के सर्वेक्षणों में वैश्विक अनुमान बताते हैं कि 285 मिलियन लोग दृश्य हानि के साथ रहते हैं, जिनमें से 39 मिलियन अंधे हैं। 2010 में, विश्व स्वास्थ्य संगठन ने दस्तावेज किया कि अंधापन के नौ सूचीबद्ध प्रमुख कारणों में से तीन आंखों के पीछे के खंड में होते हैं। पश्चवर्ती खंड आंखों की बीमारियों में रेटिना, कोरॉइड और ऑप्टिक तंत्रिका 2 शामिल हैं। रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका मस्तिष्क के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक्सटेंशन हैं। रेटिना गैंग्लियन सेल (आरजीसी) अक्षतंतु क्षति के लिए कमजोर होते हैं क्योंकि वे ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ओएनएच) के माध्यम से आंख से बाहर निकलते हैं ताकि ऑप्टिक तंत्रिका 3 का निर्माण किया जा सके। ONH आरजीसी अक्षतंतुओं के लिए सबसे कमजोर बिंदु बना हुआ है क्योंकि संयोजी ऊतक बीम के 3 डी मेशवर्क के कारण लामिना क्रिब्रोसा (एलसी) 4 कहा जाता है। ओएनएच डॉडरामस 5,6,7 में आरजीसी अक्षतंतुओं के अपमान की प्रारंभिक साइट है, और ओएनएच के भीतर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का अध्ययन ओकुलर हाइपरटेंशन और डॉडरामस मॉडल 8,9,10 में किया गया है। आरजीसी अक्षतंतु इंट्राओकुलर डिब्बे के बीच दबाव अंतर के कारण ओएनएच पर अतिसंवेदनशील होते हैं, जिसे इंट्राओकुलर दबाव (आईओपी) कहा जाता है, और बाहरी पेरिओप्टिक सबरैक्नोइड स्पेस के भीतर, जिसे इंट्राक्रैनियल प्रेशर (आईसीपी) 11 कहा जाता है। एलसी क्षेत्र दोनों क्षेत्रों को अलग करता है, सामान्य दबाव अंतर को बनाए रखता है, आईओपी 10-21 एमएमएचजी और आईसीपी से 5-15 एमएमएचजी 12 तक होता है। दो कक्षों के बीच लामिना के माध्यम से दबाव अंतर को ट्रांसलैमिनर दबाव ढाल (टीएलपीजी) 13 कहा जाता है। ग्लूकोमा का एक प्रमुख जोखिम कारक ऊंचा IOP14 है।

बढ़ी हुई आईओपी के भीतर और लैमिनर क्षेत्र में तनाव को बढ़ाता है6,15,16. मनुष्यों और पशु मॉडल में प्रयोगात्मक अवलोकन ONH को अक्षीय क्षति 17,18 की प्रारंभिक साइट के रूप में प्रस्तुत करते हैं। आईओपी से संबंधित तनाव और तनाव के बायोमैकेनिकल प्रतिमान के कारण ओएनएच में ग्लूकोमाटस क्षति का कारण बनता है, यह भी डॉडरामस 19,20,21 के पैथोफिजियोलॉजी को प्रभावित करता है। भले ही मनुष्यों में दबाव-प्रेरित परिवर्तन यंत्रवत् रूप से RGC अक्षतंतुओं को नुकसान पहुंचाते हैं, लेकिन लामिना के भीतर कोलेजनस प्लेटों की कमी वाले कृन्तकों को भी ग्लूकोमा 7,23 विकसित किया जा सकता है। इसके अलावा, उन्नत आईओपी प्राथमिक खुले कोण ग्लूकोमा रोगियों में सबसे प्रमुख जोखिम कारक बना हुआ है, जबकि सामान्य तनाव ग्लूकोमा रोगियों को उन्नत आईओपी के बिना भी ग्लूकोमाटस ऑप्टिक न्यूरोपैथी विकसित होती है। इसके अलावा, ओकुलर हाइपरटेंसिव रोगियों का एक सबसेट भी है जो कोई ऑप्टिक तंत्रिका क्षति नहीं दिखाता है। यह भी सुझाव दिया गया है कि मस्तिष्कमेरु द्रव दबाव (सीएसएफपी) ग्लूकोमा रोगजनन में भूमिका निभा सकता है। साक्ष्य इंगित करता है कि आईसीपी को सामान्य व्यक्तियों की तुलना में ग्लूकोमा रोगियों में ~ 5 एमएमएचजी तक कम कर दिया जाता है, जिससे ट्रांसलैमिनर दबाव बढ़ जाता है और रोग 24,25 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इससे पहले, यह एक कैनाइन मॉडल में प्रदर्शित किया गया था, कि आईओपी और सीएसएफपी परिवर्तनों को नियंत्रित करके, ऑप्टिक डिस्क 26 के बड़े विस्थापन हो सकते हैं। पोर्सिनी आंखों में सीएसएफपी को ऊपर उठाने से एलसी क्षेत्र और रेट्रोलैमिनर तंत्रिका ऊतक के भीतर भी प्रमुख तनाव में वृद्धि हुई है। आरजीसी और एलसी क्षेत्र पर बढ़ा हुआ तनाव अक्षीय परिवहन रुकावट और आरजीसी 27 के नुकसान में योगदान देता है। आरजीसी के प्रगतिशील अध: पतन को ट्रॉफिक समर्थन 28,29 के नुकसान, भड़काऊ प्रक्रियाओं / प्रतिरक्षा विनियमन 30,31 की उत्तेजना और एपोप्टोटिक प्रभावकों 29,32,33,34,35 के नुकसान के साथ जोड़ा गया है। इसके अतिरिक्त, क्षैतिज चोट (चित्रा 3) आरजीसी पर हानिकारक प्रभाव का कारण बनती है, जो पुनर्योजी विफलता 36,37,38,39 को ट्रिगर करती है। भले ही आईओपी के प्रभावों का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, असामान्य ट्रांसलैमिनर दबाव परिवर्तनों पर न्यूनतम शोध किया गया है। ग्लूकोमा के लिए अधिकांश उपचार आईओपी को स्थिर करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, भले ही आईओपी को कम करने से बीमारी की प्रगति धीमी हो जाती है, लेकिन यह दृश्य क्षेत्र के नुकसान को उलट नहीं देता है और आरजीसी के पूर्ण नुकसान को रोकता है। ग्लूकोमा में दबाव से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव परिवर्तनों को समझना आरजीसी की मृत्यु को रोकने के लिए महत्वपूर्ण होगा।

वर्तमान साक्ष्य इंगित करता है कि दर्दनाक या न्यूरोडीजेनेरेटिव दृश्य हानि से पीड़ित रोगियों में विभिन्न यांत्रिक, जैविक या शारीरिक परिवर्तनों के कारण ट्रांसलैमिनर दबाव मॉडुलन महत्वपूर्ण दृष्टि हानि का कारण बन सकता है। वर्तमान में, कोई भी सच्चा प्रीक्लिनिकल मानव पश्चवर्ती खंड मॉडल मौजूद नहीं है जो पूर्व विवो मानव ओएनएच के भीतर ग्लूकोमाटस बायोमैकेनिकल क्षति के अध्ययन की अनुमति दे सकता है। नेत्र विज्ञान 27 में आंख के पीछे के खंड का अवलोकन और उपचार एक बड़ी चुनौती है। पीछे की आंख को लक्षित करने के लिए भौतिक और जैविक बाधाएं हैं, जिनमें उच्च उन्मूलन दर, रक्त-रेटिना बाधा और संभावित प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। उपन्यास दवा लक्ष्यों के लिए अधिकांश प्रभावकारिता और सुरक्षा परीक्षण इन विट्रो सेलुलर और विवो पशु मॉडल 41 में उपयोग करके पूरा किया जाता है। ओकुलर एनाटॉमी जटिल है, और इन विट्रो अध्ययन ऊतक मॉडल सिस्टम द्वारा प्रस्तुत शारीरिक और शारीरिक बाधाओं की सटीक नकल नहीं करते हैं। भले ही पशु मॉडल फार्माकोकाइनेटिक अध्ययन के लिए एक आवश्यकता है, मानव पीछे की आंख का ओकुलर फिजियोलॉजी विभिन्न जानवरों की प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकता है, जिसमें रेटिना, वास्कुलचर और ओएनएच 41,42 की सेलुलर शरीर रचना शामिल है।

जीवित जानवरों के उपयोग के लिए गहन और विस्तृत नैतिक नियमों, उच्च वित्तीय प्रतिबद्धता और प्रभावी पुनरुत्पादन की आवश्यकता होती है। हाल ही में, प्रयोगात्मक अनुसंधान 44,45,46 में जानवरों के नैतिक उपयोग के लिए कई अन्य दिशानिर्देश सामने आए हैं। पशु परीक्षण के लिए एक विकल्प रोग रोगजनन और ONH क्षति की रक्षा के लिए दवाओं के संभावित विश्लेषण की जांच करने के लिए पूर्व विवो मानव आंख मॉडल का उपयोग है। मानव पोस्टमॉर्टम ऊतक मानव रोग प्रतिमानों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन है, विशेष रूप से मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के मामले में, क्योंकि पशु मॉडल में विकसित संभावित दवाओं की पहचान के लिए मनुष्यों के लिए अनुवाद योग्य होने की आवश्यकता होती है। पूर्व विवो मानव दाता ऊतक का उपयोग मानव विकारों के अध्ययन के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है47,48,49, और मानव पूर्वकाल खंड परफ्यूजन अंग संस्कृति प्रणालियों ने पहले उन्नत आईओपी 50,51,52 के पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय पूर्व विवो मॉडल प्रदान किया है।

मानव आंखों में आईओपी और आईसीपी से संबंधित ट्रांसलैमिनर दबाव का अध्ययन करने के लिए, हमने सफलतापूर्वक एक दो-कक्ष ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली (टीएएस) को डिजाइन और विकसित किया है जो मानव दाता आंखों से पीछे के खंडों का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से आईओपी और आईसीपी को विनियमित कर सकता है। यह पहला पूर्व विवो मानव मॉडल है जो ट्रांसलैमिनर दबाव का अध्ययन करता है और ओएनएच पर टीएलपीजी के बायोमैकेनिकल प्रभावों का शोषण करता है।

इस पूर्व विवो मानव टीएएस मॉडल का उपयोग सेलुलर और कार्यात्मक संशोधनों को खोजने और वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है जो आईओपी या आईसीपी के पुराने उन्नयन के कारण होते हैं। इस रिपोर्ट में, हम टीएएस मानव पश्चवर्ती खंड मॉडल को विच्छेदन, स्थापित करने और निगरानी करने के चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। प्रोटोकॉल अन्य शोधकर्ताओं को बायोमैकेनिकल रोग रोगजनन का अध्ययन करने के लिए इस उपन्यास पूर्व विवो दबाव वाले मानव पश्चवर्ती खंड मॉडल को प्रभावी ढंग से पुन: पेश करने की अनुमति देगा।

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Protocol

आंखें मानव ऊतक ों को शामिल करने वाले अनुसंधान के लिए हेलसिंकी की घोषणा के प्रावधानों के अनुसार प्राप्त की गई थीं।

नोट: सम्मानित आंखों के बैंकों (उदाहरण के लिए, लायंस आई इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसप्लांट, रिसर्च, टैम्पा एफएल) की आंखों को मृत्यु के 6-12 घंटे के भीतर काटा गया था और दाता सीरम को हेपेटाइटिस बी, हेपेटाइटिस सी और मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस 1 और 2 के लिए परीक्षण किया गया था। एक बार जब वे प्राप्त हो गए, तो आंखों को विच्छेदित किया गया और 24 घंटे के भीतर टीएएस मॉडल में स्थापित किया गया। बहिष्करण मानदंड में किसी भी ओकुलर पैथोलॉजी शामिल थी। उम्र, जाति या लिंग के आधार पर आंखों को बाहर नहीं रखा गया था। रसीद पर रेटिना की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, रेटिना स्पष्टीकरण ऊतक दाताओं से काटा गया था और 7 और 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था (पूरक चित्रा 1)। इन रेटिना को भी अलग कर दिया गया था और आरजीसी मार्कर के लिए सकारात्मक धुंधला होने के साथ 7 दिनों के लिए संस्कृति में स्वस्थ आरजीसी, कई स्प्लिसिंग (आरबीपीएमएस) के साथ आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन, साथ ही साथ सकारात्मक न्यूरोफिलामेंट लाइट चेन (एनईएफएल) उनके न्यूरोफिलामेंट्स (पूरक चित्रा 2) में धुंधला हो गया था। .

1. तैयारी और उपकरण और आपूर्ति की नसबंदी

  1. आवश्यक आपूर्ति के साथ-साथ आपूर्तिकर्ता और कैटलॉग संख्याओं की पूरी सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. उपयोग करने से पहले, ऑटोक्लेविंग या एथिलीन ऑक्साइड एम्प्यूल्स का उपयोग करके सभी उपकरणों और उपकरणों को निष्फल करें।

2. परफ्यूजन माध्यम की तैयारी

  1. 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन, 10,000 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन 0.85% NaCl में) और 1% एल-ग्लूटामाइन (200 mM) को 1,000 mL उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में जोड़ें।
  2. एक 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से पारित करके परफ्यूजन माध्यम sterilize.

3. ट्रांसलैमिनार स्वायत्त प्रणाली (टीएएस) सेटअप

  1. इनफ्लो सिरिंज (आईओपी और आईसीपी जलाशय) स्थापित करें।
    1. एक 30 mL सिरिंज के लिए परफ्यूजन माध्यम (अनुभाग 2) के 30 mL जोड़ें। 30 mL सिरिंज के लिए एक 3-तरफ़ा stopcock संलग्न करें। 3-वे स्टॉपकॉक के लिए एक 0.22 μm हाइड्रोफिलिक फ़िल्टर संलग्न करें। 0.22 μm हाइड्रोफिलिक फ़िल्टर के लिए एक 15 G Luer स्टब एडाप्टर संलग्न करें।
    2. सिरिंज सेटअप से हवा के बुलबुले निकालें। 15 जी Luer स्टब एडाप्टर के लिए टयूबिंग संलग्न करें. एक अविष्कृत सार्वभौमिक लॉक कैप के साथ स्टॉपकॉक के साइड पोर्ट को बंद करें। कुल दो सेटअप के लिए दोहराएँ.
    3. एक सिरिंज को चैनल 1 इंट्राक्रैनियल दबाव (CH1 ICP) और दूसरे सिरिंज को चैनल 2 इंट्राओकुलर दबाव (CH2 IOP) के रूप में लेबल करें।
  2. बहिर्वाह सिरिंज (आईओपी और आईसीपी जलाशय) स्थापित करें।
    1. एक 30 mL सिरिंज के लिए एक 3-तरफ़ा stopcock संलग्न करें। 3-way stopcock करने के लिए एक 15 जी Luer स्टब एडाप्टर संलग्न करें। 15 जी Luer स्टब एडाप्टर के लिए टयूबिंग संलग्न करें.
    2. एक अविष्कृत सार्वभौमिक लॉक कैप के साथ स्टॉपकॉक के साइड पोर्ट को बंद करें। कुल दो सेटअप के लिए दोहराएँ. एक सिरिंज को CH1 ICP और दूसरे सिरिंज को CH2 IOP के रूप में लेबल करें।

4. मानव पूरी आंख दुनिया की तैयारी

नोट: यदि पूरी आंखें प्राप्त होती हैं, तो आंख के पीछे के खंड से पूर्वकाल खंड को अलग करने के लिए नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करें। यदि आंखें विभाजित प्राप्त होती हैं, तो चरण 4.4 से शुरू करें।

  1. 2 मिनट के लिए पोविडोन-आयोडीन समाधान में एक पूरी आंख रखें।
  2. पोविडोन-आयोडीन को कुल्ला करने के लिए बाँझ फॉस्फेट बफ़र्ड समाधान (पीबीएस) में आंख को कुल्ला करें। 2 बार दोहराएं।
  3. संदंश और कैंची का उपयोग करके पूरे आंखों के ग्लोब से एडनेक्सा को हटा दें। आंख के पूर्वकाल और पीछे के खंडों को अलग करने के लिए भूमध्य रेखा पर आंख को विभाजित करें।
  4. ऑप्टिक तंत्रिका म्यान निकालें। पीछे के खंड से विट्रियस हास्य को हटा दें।
  5. आईओपी (नीचे) कक्ष के गोल गुंबद पर एक अच्छा फिट सुनिश्चित करने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो पीछे के खंड से अतिरिक्त स्क्लेरा ट्रिम करें। संदंश का उपयोग करके, सुनिश्चित करें कि रेटिना खंड के पीछे समान रूप से फैला हुआ है।
  6. IOP (नीचे) कक्ष सेटअप
    1. शीर्ष का सामना करने वाले ऑप्टिक तंत्रिका के साथ गोल गुंबद पर टीएएस के आईओपी (नीचे) कक्ष में मानव पश्च खंड को रखें।
    2. चार शिकंजा के साथ epoxy राल ओ-अंगूठी का उपयोग कर पीछे के खंड सील, एक तंग सील सुनिश्चित.
    3. IOP (नीचे) कक्ष के IN और OUT पोर्ट में टयूबिंग सम्मिलित करें. माध्यम युक्त टयूबिंग के साथ आईओपी प्रवाह सिरिंज को इन पोर्ट में डाला जाता है और टयूबिंग के साथ खाली आईओपी बहिर्वाह सिरिंज को आउट पोर्ट में डाला जाता है।
    4. पुश / पुल विधि का उपयोग धीरे-धीरे पीछे की आंखों के कप को भरने के लिए इनफ्लो पोर्ट में परफ्यूजन माध्यम को शामिल करने के लिए करें, जबकि साथ ही साथ लाइनों से किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए बहिर्वाह सिरिंज के माध्यम से धीरे-धीरे परफ्यूजन माध्यम को बाहर निकालते हैं। एक बार जब दोनों में और बाहर ट्यूब हवा के बुलबुले के शून्य हैं, तो माध्यम को इनफ्यूज करना बंद करें।
    5. बंद स्थिति में stopcocks लॉक. आईओपी इन पोर्ट फ़िल्टर असेंबली से 30 एमएल सिरिंज को निकालें और माध्यम के कुल 30 एमएल के साथ फिर से भरें। फ़िल्टर असेंबली पर 30 mL सिरिंज बदलें।
  7. ICP (शीर्ष) कक्ष सेटअप
    1. आईसीपी (शीर्ष) कक्ष / ढक्कन को पीछे के खंड के पीछे रखें। सुनिश्चित करें कि ऑप्टिक तंत्रिका शीर्ष कक्ष के भीतर है। चार शिकंजा के साथ शीर्ष कक्ष सील.
    2. आईसीपी (शीर्ष) कक्ष के इन और आउट पोर्ट में टयूबिंग डालें। माध्यम युक्त टयूबिंग के साथ आईसीपी इनफ्लो सिरिंज को आईएन पोर्ट में डाला जाता है और टयूबिंग के साथ खाली आईसीपी बहिर्वाह सिरिंज को आउट पोर्ट में डाला जाता है।
    3. धीरे से और धीरे-धीरे आईसीपी कक्ष को भरने और पुश / पुल विधि का उपयोग करके लाइनों से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए आईएन पोर्ट में माध्यम को शामिल करें। एक बार आईसीपी कक्ष के साथ-साथ इन और आउट ट्यूबिंग दोनों हवा के बुलबुले के शून्य होने के बाद माध्यम को शामिल करना बंद कर दें।
    4. बंद स्थिति में stopcocks लॉक. पोर्ट फ़िल्टर असेंबली में आईसीपी से 30 एमएल सिरिंज को हटा दें और माध्यम के कुल 30 एमएल के साथ फिर से भरें। फ़िल्टर असेंबली पर 30 mL सिरिंज बदलें।

5. डेटा रिकॉर्डिंग सिस्टम सेटअप

नोट: डेटा रिकॉर्डिंग सिस्टम में एक 8-चैनल पावर स्रोत, मल्टीचैनल ब्रिज एम्पलीफायर, हाइड्रोस्टेटिक प्रेशर ट्रांसड्यूसर और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर शामिल है ( सामग्री की तालिका देखें)। निम्न वर्णन करता है कि सिस्टम को सेट अप और कैलिब्रेट करने के लिए कैसे करें।

  1. पावर कॉर्ड को 8-चैनल पावर स्रोत के पीछे से कनेक्ट करें और बैटरी बैक-अप डिवाइस में प्लग करें।
  2. USB केबल को कंप्यूटर के पीछे 8-चैनल पावर स्रोत से कनेक्ट करें।
  3. आपूर्ति की गई I2C कॉर्ड का उपयोग करके मल्टीचैनल ब्रिज एम्पलीफायर के लिए 8-चैनल पावर स्रोत को कनेक्ट करें।
  4. Bayonet Neill-Concelman (BNC) केबलों को 8-चैनल पावर स्रोत के सामने चैनल इनपुट में कनेक्ट करें और केबलों के अंत को मल्टीचैनल एम्पलीफायर के पीछे इसी चैनल में जोड़ें।
  5. ट्रांसड्यूसर केबलों को मल्टीचैनल एम्पलीफायर के सामने से कनेक्ट करें।
  6. कंप्यूटर पर डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर स्थापित करें।
    1. आपूर्ति किए गए सॉफ़्टवेयर CD से डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर सेटअप इंस्टॉलर चलाएँ।
    2. कंप्यूटर स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें।
    3. जब स्थापना पूर्ण हो जाए, तो समाप्त का चयन करें.
  7. 8-चैनल पावर स्रोत चालू करें.
  8. कंप्यूटर को चालू करें और डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें.
    1. फ़ाइल | का चयन करें नया।
    2. सेटअप | का चयन करें चैनल सेटिंग्स. तीन चैनलों का चयन करें (स्क्रीन के नीचे बाईं ओर)। चैनल शीर्षक स्तंभ में चैनलों का नाम निम्नानुसार बदलें: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP)
    3. सभी चैनलों पर श्रेणी के लिए 2 mV का चयन करें. परिकलन स्तंभ में चैनल 1 और 2 के लिए कोई परिकलन नहीं का चयन करें.
    4. परिकलन स्तंभ में चैनल 3 के लिए अंकगणित का चयन करें। सूत्र अनुभाग में: चैनल/CH2 का चयन करें; अंकगणितीय "-" का चयन करें; चैनल/CH1 का चयन करें. आउटपुट अनुभाग में mmHg का चयन करें। ठीक का चयन करें। फिर से ठीक का चयन करें।
  9. सेट अप और hydrostatic दबाव transducers कैलिब्रेट.
    नोट:: हाइड्रोस्टेटिक दबाव ट्रांसड्यूसर निम्न विधि का उपयोग कर प्रयोगों से पहले कैलिब्रेट किया जाना चाहिए।
    1. मल्टीचैनल ब्रिज एम्पलीफायर से जुड़ी ट्रांसड्यूसर लाइनों के लिए हाइड्रोस्टेटिक दबाव ट्रांसड्यूसर को कनेक्ट करें।
    2. CH1 (ICP) दबाव ट्रांसड्यूसर के साइड पोर्ट पर हवा से भरे 30 एमएल सिरिंज संलग्न करें। CH1 (ICP) दबाव ट्रांसड्यूसर के नीचे sphygmomanometer संलग्न करें।
    3. चार्ट पर, डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का पृष्ठ देखें, नमूना समय के बगल में तीर पर क्लिक करके बाएँ क्लिक करके नमूना गति सेट करें और 100 का चयन करें. फिर पृष्ठ के CH1 (ICP) क्षेत्र में राइट क्लिक करें।
    4. ब्रिज Amp का चयन करें। मेन फ़िल्टर का चयन करें. शून्य का चयन करें और सिस्टम को शून्य करने के लिए प्रतीक्षा करें, दबाव ट्रांसड्यूसर को स्थानांतरित न करने का ध्यान रखें।
    5. दबाव ट्रांसड्यूसर के सफेद टैब को पिंच करें और ट्रांसड्यूसर के माध्यम से हवा को धक्का दें जब तक कि 40 mmHg sphygmomanometer पर प्राप्त न हो। सफेद टैब जारी करें और सिरिंज और स्फिग्मोमैनोमीटर को हटा दें।
    6. इकाइयाँ कनवर्ज़न पृष्ठ पर, 'माइनस (-)' चिह्न का चयन करें. 40 mmHg को इंगित करने के लिए उच्चतम पठार को हाइलाइट करें। बिंदु 1 के लिए तीर क्लिक करें और 40 दर्ज करें.
    7. 0 mmHg को इंगित करने के लिए सबसे कम पठार को हाइलाइट करें। बिंदु 2 के लिए तीर क्लिक करें और 0 दर्ज करें. इकाइयों के लिए mmHg का चयन करें। ठीक का चयन करें।
    8. ठीक (ब्रिज एम्प पृष्ठ) का चयन करें। CH2 (IOP) के लिए चरण 9.1-9.7 को उच्चतम पठार के लिए 100 mmHg और सबसे कम पठार के लिए 0 का उपयोग करके दोहराएँ।
  10. डेटा अधिग्रहण प्रणाली पर TAS/posterior सेगमेंट यूनिट कनेक्ट करें।
    1. टीएएस / पश्चवर्ती खंड इकाई को एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रखें। बाहर पोर्ट से CH1 (ICP) दबाव ट्रांसड्यूसर के लिए ICP टयूबिंग अनुलग्न करें।
    2. बाहर पोर्ट से CH2 (IOP) दबाव ट्रांसड्यूसर के लिए IOP टयूबिंग अनुलग्न करें।
    3. सिरिंज सेटअप (ICP और IOP) को इन पोर्ट से रिंग स्टैंड तक माध्यम के साथ अनुलग्न करें.
    4. चार्ट दृश्य पृष्ठ पर नमूना प्रारंभ करें का चयन करें. नमूना समय के बगल में तीर पर क्लिक करके नमूने की गति सेट करें और धीमी गति से और 1 मिनट का चयन करें।
    5. प्रोटोकॉल आवश्यकताओं के लिए आईसीपी और आईओपी दबावों को विनियमित करने के लिए रिंग स्टैंड अप या डाउन पर सिरिंज को समायोजित करें।
    6. पुश और पुल विधि के माध्यम से हर 48-72 घंटे में सिस्टम में माध्यम की प्रणालीगत पुनःपूर्ति करें।

6. डेटा पुनर्प्राप्ति और विश्लेषण

  1. डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में डेटा फ़ाइल खोलें.
  2. डेटा पैड अनुभाग में, एकाधिक जोड़ें डेटा पैड आइकन पर क्लिक करें। एक नई विंडो दिखाई देगी।
    1. उपयोग ढूँढें अनुभाग में ड्रॉप-डाउन मेनू से समय का चयन करें.
    2. चयन करें अनुभाग में ड्रॉप-डाउन मेनू से हर 1 घंटे में 1 घंटे का चयन करें।
    3. चरण के माध्यम से अनुभाग में संपूर्ण फ़ाइल का चयन करें फिर जोड़ें क्लिक करें.
  3. डेटा पैड अनुभाग में डेटा पैड दृश्य आइकन पर क्लिक करें। सभी डेटा को हाइलाइट करें और स्प्रेडशीट में कॉपी / पेस्ट करें।
  4. प्रत्येक 24 घंटे के लिए IOP, ICP और TLPG के लिए माध्य और मानक विचलन की गणना करें। किसी स्प्रेडशीट प्रोग्राम और ग्राफ़ में पिवट तालिका विकल्प का उपयोग करके डेटा को एकत्रित करें.

7. Immunohistochemistry और hematoxylin और पीछे के खंडों के eosin धुंधला

  1. टीएएस मॉडल से विभिन्न टाइमपॉइंट्स के बाद पीछे की आंखों के खंडों को हटा दें और पैराफिनाइज़िंग से पहले फॉर्मेलिन में ठीक करें।
  2. सैगिटल ऊतक विमानों का उत्पादन करने के लिए आंखों को अनुभाग करें।
  3. एक 100% xylene, 95% इथेनॉल, 50% इथेनॉल समाधान के साथ पैराफिन एम्बेडेड खंडों deparaffinize.
  4. 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड को धोएं और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक अवरुद्ध बफर के साथ ब्लॉक करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल अनुभाग: एंटी-कोलेजन IV (एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) मार्कर, NB120-6586, 1: 100) और एंटी-लैमिनिन (ईसीएम मार्कर, NB300-144, 1: 100, एंटी-आरबीपीएमएस (आरजीसी मार्कर), जीटीएक्स 1118619, 1: 50)।
  6. एलेक्सा फ्लोर माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लोर 488 बकरी विरोधी खरगोश, A11008, 1: 500) का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाएं।
  7. DAPI विरोधी फीका समाधान का उपयोग कर सेल नाभिक counterstain.
  8. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 4x और 10x उद्देश्य लेंस के साथ दाग वर्गों और चरण छवियों की छवियों को कैप्चर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  9. Hematoxylin और eosin (H &E) धुंधला करने के लिए, एक स्वचालित धुंधला प्रणाली में वर्गों को संसाधित करें ( सामग्री की तालिका देखें) 100%, xylene 95% इथेनॉल, 50% इथेनॉल समाधान और एच एंड ई के साथ दाग का उपयोग करके deparaffinization के लिए।
  10. एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 4x और 10x उद्देश्य लेंस के साथ छवियों पर कब्जा।

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Representative Results

डिजाइन और ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली का निर्माण
ट्रांसलैमिनर दबाव अंतर ग्लूकोमा सहित विभिन्न बीमारियों के रोगजनन में एक संभावित महत्वपूर्ण तंत्र है। वर्णित मॉडल के लिए उपयोग में शामिल हैं, लेकिन डॉडरामस (ऊंचा आईओपी, शायद आईसीपी में कमी), दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (ऊंचा आईसीपी), और माइक्रोग्रैविटी से जुड़े दृश्य हानि (ऊंचा आईसीपी, ऊंचा आईओपी) के दीर्घकालिक जोखिम का अध्ययन शामिल है, लेकिन सीमित नहीं है। मानव आंख में ट्रांसलैमिनर दबाव को लक्षित करने वाले आणविक रोगजनन की खोज में मदद करने के लिए, हमने टीएएस मॉडल को डिजाइन, बनाया और मान्य किया। हमारा उपन्यास पूर्व विवो मानव मॉडल स्वतंत्र रूप से आईसीपी और आईओपी से जुड़े रोगजनक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय प्रीक्लिनिकल सिस्टम देता है। मानव प्रीक्लिनिकल अनुप्रयोगों को संबोधित करने के लिए, हमारा मॉडल ट्रांसलैमिनर दबाव परिवर्तनों के कारण रोगजनन का अध्ययन करने का एक पूर्व विवो प्रतिमान प्रदान करता है। सील किए गए मॉडल डिजाइन को सभी प्रवाह और बहिर्वाह बंदरगाहों (चित्रा 1 सी) को दर्शाने के लिए मॉडल के विस्तृत आरेखीय दृश्य के साथ ठोस सामने और पारदर्शी दृश्य (चित्रा 1 ए, 1 बी) के साथ चित्रित किया गया है। एक वास्तविक 3 डी मुद्रित मॉडल में एक मानव पश्च खंड के साथ रंग पारदर्शी दृश्य दिखाया गया है (चित्रा 1 डी, 1ई)।

ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली: एक उपन्यास पूर्व विवो मानव ट्रांसलैमिनर दबाव मॉडल
हमने दो स्वायत्त कक्षों (यानी, आईओपी और आईसीपी कक्षों) के साथ टीएएस मॉडल उत्पन्न किया। मॉडल के निचले आधार में, मानव पश्च कप को गोल गुंबद के शीर्ष पर रखा गया था, जिसमें ऑप्टिक तंत्रिका शीर्ष का सामना कर रही थी। एक बार जब पीछे के कप को रखा गया था और आईओपी कक्ष में सील कर दिया गया था, तो हमने तंत्रिका के शीर्ष पर आईसीपी कक्ष रखा। हमने दोनों कक्षों की स्वतंत्रता और ओ-रिंग्स का उपयोग करके एक आदर्श सील बनाए रखा जो प्रत्येक कक्ष को ठीक से फिट करता है (चित्रा 2 ए)। नीचे के कक्ष या आईओपी कक्ष ने कप में दबाव को भरा और विनियमित किया, जबकि शीर्ष कक्ष ऑप्टिक तंत्रिका के चारों ओर फिट होता है और हाइड्रोस्टेटिक दबाव जलाशयों के माध्यम से तंत्रिका के चारों ओर आईसीपी को विनियमित करता है। मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने स्वतंत्र रूप से हाइड्रोस्टेटिक दबाव का उपयोग करके आईओपी और आईसीपी को विनियमित किया। दोनों कक्षों के बीच के अंतर को ट्रांसलैमिनर दबाव ढाल (चित्रा 2 बी) में बदलाव के रूप में पहचाना गया था। इनफ्लो और बहिर्वाह जलाशय सिरिंज सहित सभी अंतिम फिटिंग के साथ चित्रित मॉडल को चित्र 2 सी में दिखाया गया है।

ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली में सफल संस्कृति और दबाव रखरखाव
यह सुनिश्चित करने के लिए कि दोनों कक्षों ने सिस्टम में स्वतंत्र रूप से काम किया है, हमने आईओपी चैंबर और आईसीपी को अलग-अलग औसत दबाव अंतर (सामान्य टीएलपीजी: आईओपी: आईसीपी, 15: 5 एमएमएचजी; ऊंचा टीएलपीजी >10 एमएमएचजी; ऊंचा टीएलपीजी >20 एमएमएचजी) पर रखकर कई दबाव अंतरों को विनियमित किया। हमने शुरू में आईओपी और आईसीपी स्थितियों के विभिन्न अलग-अलग मापदंडों के माध्यम से दोनों कक्षों (सामान्य आईओपी / आईसीपी) में औसत सामान्य दबाव अंतर के रखरखाव का परीक्षण किया: 1) सामान्य आईओपी: आईसीपी (चित्रा 3 ए) में कमी; 2) ऊंचा आईओपी: आईसीपी में कमी (चित्रा 3 बी); और 3) ऊंचा आईओपी: उन्नत आईसीपी (चित्रा 3 सी)। औसत सामान्य आईओपी 10-21 mmHg (episcleral शिरापरक दबाव) और 5-15 mmHg से सामान्य ICP से होता है। संवहनी दबाव नहीं होने की सीमा के बदले में, हमने अभी भी इन दरों पर दबाव बनाए रखा, क्योंकि विचार ओएनएच पर अधिकतम दबाव डालना था। हमने स्वतंत्र रूप से दोनों कक्षों (आईसीपी, 5-10 एमएमएचजी) में विभिन्न दबाव स्तरों को विनियमित किया; आईओपी, 20-40 एमएमएचजी)। दोनों कक्षों के बीच दबाव रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए, हमने आईओपी को सामान्य परिस्थितियों (15 एमएमएचजी) के तहत रखा और 11 एमएमएचजी (चित्रा 3 ए) के एलसी के बीच टीएलपीजी (आईओपी-आईसीपी) को बनाए रखने के लिए आईसीपी (4 एमएमएचजी) को कम कर दिया। फिर हमने आईओपी (43 एमएमएचजी) को ऊंचा किया और आईसीपी (3 एमएमएचजी) (चित्रा 3 बी) को कम कर दिया और अंत में दोनों (आईओपी, 64 एमएमएचजी) में ऊंचा दबाव; आईसीपी, 9 एमएमएचजी) 55 एमएमएचजी (चित्रा 3 सी) पर टीएलपीजी का सबसे बड़ा स्तर उत्पन्न करने के लिए। ऊतक (चित्रा 4) की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, ऊतकों में माध्यम को बहिर्वाह स्टॉपकॉक में एक खाली सिरिंज संलग्न करके और धीरे-धीरे पुश / पुल विधि का उपयोग करके इनफ्लो पोर्ट के माध्यम से लगभग 5 मिलीलीटर परफ्यूजन माध्यम को धक्का देकर हर 48 घंटे में आदान-प्रदान किया गया था। मध्यम विनिमय (चित्रा 4 जी) के समय न्यूनतम दबाव वृद्धि हुई और ओएनएच की आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं किया जैसा कि 14- और 30 दिन के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री डेटा (चित्रा 4 ए-एफ) में दिखाया गया है। यह पुष्टि करने के लिए कि हम टीएएस मॉडल के भीतर प्रभावी व्यवहार्यता के साथ विस्तारित समय सीमा के लिए पीछे के खंडों को संस्कृति कर सकते हैं, हमने 14 और 30 दिनों के लिए सामान्य आईओपी और आईसीपी के रखरखाव के बाद ओएनएच के क्रॉस सेक्शन का विश्लेषण किया। हम 14 दिनों (चित्रा 4 ए, 4 बी) के लिए मॉडल में इन खंडों को स्वस्थ ओएनएच कोशिकाओं और ऑप्टिक तंत्रिका सिर (चित्रा 4 सी) पर कोलेजन IV (COLIV) की बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स अभिव्यक्ति के साथ सफलतापूर्वक संस्कृति करने में सक्षम थे। इसी तरह की व्यवहार्यता और पीछे के खंड के रखरखाव को भी 30 दिनों (चित्रा 4 डी, 4 ई) के लिए COLIV और DAPI (चित्रा 4F) की अभिव्यक्ति के साथ देखा गया था। TLPG (IOP-ICP) मानों (चित्रा 4G) का आरेखीय निरूपण 15.6 ± 4.6 mmHg पर समय के साथ IOP मानों के निरंतर रखरखाव को दर्शाता है और ICP का अर्थ 30 दिनों के लिए 11.0 ± 4.6 mmHg पर 4.6 ± 1.3 mmHg (तालिका 1) के TLPG के साथ 30 दिनों के लिए है।

ONH पोस्ट उन्नत ट्रांसलैमिनर दबाव ढाल के लिए रूपात्मक परिवर्तन
उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग ग्लूकोमा की एक आम नैदानिक विशेषता ओएनएच कपिंग है। प्रीलैमिनर कपिंग को प्रीलैमिनर तंत्रिका ऊतकों के प्रगतिशील नुकसान से प्रतिष्ठित किया जाता है, जो कप की गहराई और चौड़ाई दोनों को बढ़ाता है और इस प्रकार कप-टू-डिस्क अनुपात को बढ़ाता है। लैमिनर कपिंग संयोजी ऊतक-आधारित है, जिसमें एलसी उत्तरोत्तर रूप से आगे बढ़ रहा है और खुदाई कर रहा है। Glaucomatous cupping इन दो घटकों का एक संयोजन है, जो लैमिनर संयोजी ऊतकों की क्षति और रीमॉडलिंग दोनों को दर्शाता है। आईओपी में ऊंचाई कोलेजन फाइब्रिल द्रव्यमान 53 में वृद्धि के कारण एलसी मोटा होने की ओर जाता है। टीएएस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने आईओपी को बढ़ाकर या विभिन्न टाइमपॉइंट्स पर आईसीपी को कम करके एक ऊंचा टीएलपीजी बनाया। हमने 7 दिनों के लिए उन्नत टीएलपीजी की एक श्रृंखला को बनाए रखा, जिसमें समय के साथ औसत आईओपी मान 22.8 ± 18.6 mmHg और ICP का मतलब 6.9 ± 7.6 mmHg पर 15.9 ± 11.8 mmHg (तालिका 2) के TLPG के साथ है। उच्चतम टीएलपीजी को 36 एमएमएचजी पर प्रलेखित किया गया था। मानव पश्चवर्ती खंडों को तब एलेमिनर बीम के प्रगतिशील गाढ़ा होने और एच एंड ई दाग वर्गों में ओएनएच पर कपिंग के लिए रूपात्मक रूप से विश्लेषण किया गया था क्योंकि नियंत्रण, 1 दिन, 3 दिन और 7 दिनों के बीच ऊंचा टीएलपीजी (चित्रा 5 ए-डी) के तहत समय आगे बढ़ा था। ऊंचा टीएलपीजी (चित्रा 5 डी) के 7 दिनों में कपिंग और मोटा होना देखा गया था। इसके अलावा, नियंत्रण, 1 दिन, 3 दिन और 7 दिनों के बीच समय के साथ COLIV अभिव्यक्ति ने गाढ़ा बीम दिखाया और 7 दिनों (चित्रा 5E-H) द्वारा अभिव्यक्ति में वृद्धि की। टीएएस मॉडल के भीतर उन्नत टीएलपीजी के नियंत्रण ऊतक (चित्रा 5I) और 7 दिनों (चित्रा 5J) में सुसंस्कृत नहीं किए गए नियंत्रण ऊतक की तुलना करने वाली चरण छवियां नियंत्रण के लिए कोई कपिंग (चित्रा 5I) के साथ जीसीएल (चित्रा 5I) के भीतर स्वस्थ आरजीसी दिखाती हैं, जबकि उन्नत टीएलपीजी की शर्तों के तहत छवियां आरएनएफएल (चित्रा 5 जे) में कोई शेष आरजीसी (आरबीपीएमएस-आरजीसी मार्कर) के साथ व्यापक कपिंग दिखाती हैं और ईसीएम के रीमॉडलिंग में वृद्धि हुई है जैसा कि ऊंचा सीओलिव द्वारा दिखाया गया है। ONH (चित्रा 5J)।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसलैमिनार स्वायत्त प्रणाली। मॉडल चित्रण. (ए) ठोस सामने का दृश्य। (ख) पारदर्शी दृश्य। (ग) आरेखीय दृश्य। (डी) रंग पारदर्शी दृश्य. (ई) वास्तविक 3 डी मुद्रित मॉडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली के यांत्रिकी। (ए) ट्रांसलैमिनर दबाव अंतर को विनियमित करने के लिए आईसीपी और आईओपी कक्षों के साथ टीएएस मॉडल। (ख) जलाशयों की ऊँचाई के माध्यम से दोनों कक्षों में हाइड्रोस्टेटिक दाब के स्वायत्त विनियमन के साथ टीएएस मॉडल का चित्रण। (सी) जगह में सभी फिटिंग और प्रवाह और बहिर्वाह जलाशय सिरिंज के प्रतिनिधित्व के साथ टीएएस मॉडल की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली के भीतर स्वतंत्र दबाव रखरखाव। स्वतंत्र रूप से मॉडुलित किए जा रहे दबावों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व, और स्थिर दबावों को शीर्ष (आईसीपी) और नीचे (आईओपी) कक्षों में बनाए रखा जा रहा है, जिसमें (ए) सामान्य आईओपी / कम आईसीपी (बी) ऊंचा आईओपी / आईसीपी / कम हो गया है, और (सी) ऊंचा आईओपी / ऊंचा आईसीपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली के भीतर पीछे के खंडों का रखरखाव और व्यवहार्यता। आईओपी और आईसीपी की सामान्य परिस्थितियों में 14 और 30 दिनों के लिए टीएएस मॉडल का उपयोग करके मानव पश्चवर्ती खंडों को सुसंस्कृत किया गया था। एच एंड ई (ए) कम आवर्धन (40x) और (बी) उच्च आवर्धन (100x) में 14 दिनों में मानव ओएनएच के क्रॉस सेक्शन को दाग देता है। (सी) डीएपीआई अभिव्यक्ति (100x) के साथ कोलिव इम्युनोस्टेनिंग। (डी) 40x और (E) 100x माइक्रोग्राफ और (F) DAPI अभिव्यक्ति (100x) के साथ COLIV immunostaining में 30 दिनों में H & E धुंधला के समान चित्रण। G) संस्कृति में 30 दिनों के लिए बनाए रखे गए मानव पश्चवर्ती खंडों के लिए IOP-ICP (TLPG) के mmHg में Π की आरेखीय प्रस्तुति। COLIV = हरा; DAPI = नीला; (ए, इनसेट बी); (डी, इनसेट ई); H &E = hematoxylin और eosin दाग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली में ऊंचा ट्रांसलैमिनर दबाव ढाल के बाद ऑप्टिक तंत्रिका सिर का रूपात्मक पुनर्गठन। उन्नत टीएलपीजी स्थितियों के तहत विभिन्न समय बिंदुओं के लिए टीएएस मॉडल का उपयोग करके मानव पश्चवर्ती खंडों को सुसंस्कृत किया गया था। मानव ओएनएच के क्रॉस सेक्शन एच एंड ई स्टेनिंग को दर्शाते हैं (ए) नियंत्रण (बी) टीएएस में 1 दिन (सी) टीएएस में 3 दिन, और (डी) 7 दिन की संस्कृति। (ई) नियंत्रण (एफ) के ओएनएच में डीएपीआई के साथ कोलिव की अभिव्यक्ति टीएएस (जी) में 1 दिन टीएएस में 3 दिन, और (एच) संस्कृति में 7 दिन। चरण कंट्रास्ट ONH क्रॉस सेक्शन छवियों (I) नियंत्रण ONH (I') RBPMS के रेटिना धुंधला और (I') COLIV और DAPI के साथ ONH धुंधला चित्रण. (जे) के चरण विपरीत टीएएस में ऊंचा टीएलपीजी के 7 दिनों के साथ इनसेट (जे') आरबीपीएमएस के रेटिना स्टेनिंग और (जे') कोलिव और डीएपीआई के साथ ओएनएच धुंधला। COLIV, RBPMS = हरा; DAPI = नीला; (ए-डी) 40x आवर्धन; (ई-एच) 100x आवर्धन; (I और J) 200x आवर्धन; (जे') 400x आवर्धन; (जे') 100x आवर्धन; (जे, इनसेट जे और जे '); एच एंड ई = हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन दाग; TAS = Translaminar Autonomous System कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

दिन 24 घंटे का माध्य IOP 24 घंटे का माध्य ICP मतलब TLPG (IOP-ICP)
1 17.7 12.1 5.7
2 20.0 15.0 5.0
3 13.4 9.6 3.7
4 15.1 10.5 4.5
5 11.6 8.3 3.3
6 14.0 9.5 4.5
7 17.2 13.8 3.4
8 19.3 16.1 3.2
9 17.7 15.0 2.8
10 10.9 8.0 2.9
11 16.3 10.2 6.1
12 14.7 11.8 2.9
13 7.5 4.5 3.0
14 5.5 1.4 4.1
15 13.5 8.3 5.2
16 15.4 10.3 5.1
17 11.7 4.5 7.3
18 13.3 9.3 4.0
19 23.5 19.7 3.8
20 20.3 14.5 5.7
21 12.8 5.8 7.0
22 25.8 19.9 5.9
23 19.3 13.5 5.8
24 18.8 15.1 3.7
25 14.4 8.9 5.5
औसत 15.6 11.0 4.6
एसटीडी 4.6 4.6 1.3

तालिका 1: सामान्य टीएलपीजी का रखरखाव 30 दिनों के लिए बनाए रखा गया। IOP, ICP, और TLPG मानों को दर्शाने वाले सारणीबद्ध मान पूर्ण समय पाठ्यक्रम पर औसत और मानक विचलन के साथ हर 24 घंटे में मान।

दिन 24 घंटे का माध्य IOP 24 घंटे का माध्य ICP 24 घंटे का औसत TLPG
1 4.1 -1.0 5.1
2 6.3 1.1 5.3
3 13.4 4.0 9.4
4 19.0 1.1 17.9
5 55.6 19.5 36.2
6 39.5 12.8 26.7
7 21.5 10.8 10.6
औसत 22.8 6.9 15.9
एसटीडी 18.6 7.6 11.8

तालिका 2: 7 दिनों के लिए बनाए रखा ऊंचा TLPG की एक सीमा का रखरखाव. IOP, ICP, और TLPG मानों को दर्शाने वाले सारणीबद्ध मान पूर्ण समय पाठ्यक्रम पर औसत और मानक विचलन के साथ हर 24 घंटे में मान।

पूरक चित्रा 1: पूर्व विवो मानव रेटिना स्पष्टीकरण संस्कृति। चरण कंट्रास्ट, आरजीसी सकारात्मक दाग (RBPMS-हरा), और सेलुलर (DAPI-नीले) (DAPI-नीले) (ए-सी) 7 दिनों और (डी-एफ) 14 दिनों (200x आवर्धन) के लिए संस्कृति में रेटिना स्पष्टीकरण की सना हुआ छवियों। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: मानव वयस्क आरजीसी संस्कृतियों। आरजीसी मार्कर (RBPMS-हरा) और DAPI (नीला) सना हुआ RGCs संस्कृति में 7 दिन (ए) 200x (बी) 400x आवर्धन। (ग) एनईएफएल (हरे) और डीएपीआई (नीले) के लिए 400x आवर्धन पर आरजीसी दाग। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मानव पोस्टमॉर्टम ऊतक मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से मूल्यवान संसाधन हैं क्योंकि पशु मॉडल में विकसित संभावित दवाओं की पहचान को मनुष्यों के लिए अनुवाद योग्य होना चाहिए। मानव आईओपी ऊंचाई के प्रभाव अच्छी तरह से स्थापित हैं, लेकिन असामान्य ONH ट्रांसलैमिनर दबाव परिवर्तनों पर न्यूनतम शोध किया गया है। भले ही कई पशु मॉडल और मानव ओएनएच के परिमित मॉडलिंग मौजूद हैं, ट्रांसलैमिनर दबाव परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए कोई पूर्व विवो मानव मॉडल नहीं है41,54,55,56,57। एक नए प्रीक्लिनिकल मानव मॉडल के लिए एक वर्तमान अपूर्ण आवश्यकता मौजूद है जो आईओपी और आईसीपी का उपयोग करके रोग एटियलजि पूर्व विवो को लक्षित कर सकती है और ग्लूकोमा रोगजनन से संबंधित विभिन्न रोगजनक प्रतिमानों की पहचान कर सकती है। ओएनएच में दबाव से संबंधित पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को समझना आरजीसी की मृत्यु को रोकने के लिए महत्वपूर्ण होगा। टीएएस मॉडल के भीतर आईओपी, आईसीपी और टीएलपीजी का संयुक्त उपयोग मानव पश्चवर्ती खंड ऊतक का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल तरीके से दबाव-निर्भर अध: पतन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण है। टीएएस मॉडल में, हम आईओपी और आईसीपी कक्षों के स्वायत्त विनियमन के माध्यम से ट्रांसलैमिनर दबाव के परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए मानव आंखों के कप के पीछे के खंडों को संस्कृति कर सकते हैं। यह चिकित्सीय की एक नई श्रृंखला विकसित करने के लिए एक नींव प्रदान करता है जो अध: पतन के तंत्र के रूप में ट्रांसलैमिनर दबाव पर ध्यान केंद्रित करता है।

टीएएस मॉडल की स्थापना के लिए कई पहलुओं में विस्तार पर ध्यान देने की आवश्यकता होती है: मानव पश्चवर्ती खंडों का सही विच्छेदन, यह सुनिश्चित करना कि रेटिना बरकरार है और पीछे के कप में फैला हुआ है, आईओपी कक्ष के गुंबद पर खंड का उचित प्लेसमेंट, आईओपी कक्ष के गुंबद पर सटीक रूप से आईसीपी कक्ष की स्थिति, दोनों कक्षों की प्रभावी सीलिंग, और आईओपी और आईसीपी जलाशयों की ऊंचाई को विनियमित करके स्वतंत्र रूप से हाइड्रोस्टेटिक दबावों का रखरखाव। विच्छेदन को उन आंखों में किया जाना चाहिए जो 24-36 घंटे से अधिक पोस्टमॉर्टम नहीं हैं, क्योंकि रेटिना उत्तरोत्तर खराब हो जाता है यदि प्रभावी संस्कृति माध्यम को फिर से नहीं भरा जाता है। माध्यम की प्रणालीगत पुनःपूर्ति हमारे सिस्टम में हर 48-72 घंटे में की गई थी। सिस्टम का एक और महत्वपूर्ण पहलू ऑन की लंबाई है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कम से कम 0.5-1 सेमी ऑन को कैडेवरिक आंख पर छोड़ दिया जाए। दाता आंखों का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए यदि उनके पास छोटे ओएन हैं, तो ऑन क्षतिग्रस्त हो गया है, ग्लोब से समझौता किया गया है और डिफ्लेटेड किया गया है, या ऑन म्यान अलग हो गया है। इसके अलावा, गुंबद पर पीछे के खंड को रखते समय, ओ-रिंग को कसकर फिट होना चाहिए और शीर्ष आईसीपी कक्ष को सही ढंग से शिकंजा के साथ सील कर दिया जाना चाहिए। पुशपिन फिटिंग जहां मॉडल के ऊपर और नीचे के आधार के प्रत्येक तरफ टयूबिंग संलग्न होती है, यह सुनिश्चित करने के लिए भी परीक्षण करने की आवश्यकता होती है कि टयूबिंग फिट बैठता है और जगह में ताले। यदि टयूबिंग ठीक से जगह में नहीं है, तो हवा के बुलबुले टयूबिंग के भीतर देखे जाएंगे और प्रत्येक कक्ष के भीतर दबाव माप से समझौता करेंगे।

हमारे टीएएस मॉडल में पोस्टमॉर्टम पोस्टीरियर सेगमेंट का रखरखाव और व्यवहार्यता इस प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय था। मानव पोस्टमॉर्टम ऊतक का पहले बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है48,49, 1,068 पोस्टमॉर्टम दाता ऊतकों के हाल के आरएनए विश्लेषण अध्ययन के साथ पुष्टि करता है कि दशकों से एकत्र किए गए पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क के ऊतक मानव विकारों के अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता वाली सामग्री के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, ओकुलर मानव दाता आंखों के ऊतकों की पहले से सफल अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग का पोस्टमार्टम किया गया है58। एपोप्टोसिस जीन के लिए जीन अभिव्यक्ति PLIER मान रेटिना ऊतक 6 h postmortem58 के लिए इस डेटासेट में न्यूनतम या nonexistent थे। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि आंखों के ऊतकों के हाइपोथर्मिक भंडारण को प्रभावी ढंग से किया जा सकता है59। यह दिखाया गया है कि गैंग्लियन सेल गतिविधि को 50 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है जब मिनीपिग आंखों को इस्केमिक और हाइपोथर्मिक स्थितियों 41,60 पर संग्रहीत किया जाता है। इसलिए, हमने दाता आईकप संग्रह के लिए हमारे शामिल मानदंडों के रूप में 6 ज समय बिंदु का उपयोग किया। पीछे के खंडों और रेटिना टुकड़ी के पोस्टमॉर्टम गिरावट की गति साहित्य में कमी है, लेकिन 6 घंटे के भीतर हमारे enucleation, बर्फ पर वितरण, और अधिकतम 36 ज की संस्कृति सेटअप ऊतक व्यवहार्यता की सीमा के भीतर अच्छी तरह से है जैसा कि पूरक चित्रा 1 और पूरक चित्रा 2 में दर्शाया गया है। टीएएस मॉडल का उपयोग करके, हमने सफलतापूर्वक 30 दिनों के लिए ऊतक के स्वस्थ रखरखाव को प्राप्त किया।

टीएएस मॉडल की एक और सीमा आईसीपी और आईओपी के चक्रीय सर्कैडियन लय को मॉडल करने में हमारी वर्तमान अक्षमता है जो सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में देखी जाती है। यह भविष्य में एक पंप का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है जो लयबद्ध आईओपी और आईसीपी जलसेक को विनियमित कर सकता है। इसके अलावा, मॉडल के लिए एक और चेतावनी कैडेवरिक आंख के भीतर रक्त परिसंचरण की कमी है। इस प्रकार, रक्तचाप के प्रभावों का अध्ययन नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह हमें आईओपी और आईसीपी सहित केवल टीएलपीजी परिवर्तनों के रोगजनक प्रभावों को विशेष रूप से चित्रित करने की भी अनुमति देता है।

मॉडल के एक भविष्य के दायरे में हाइड्रोस्टेटिक परिवर्तनों के लिए जलाशय प्रणालियों के स्वचालन और इस प्रोटोकॉल में लागू किए गए मध्यम परिवर्तन के कई दौरों के बजाय ट्रांसड्यूसर पर एक निकास खाली सिरिंज के साथ एक जलसेक पंप के माध्यम से माध्यम के छिड़काव को शामिल किया जाएगा। आईओपी और आईसीपी जलाशय से तरल पदार्थ को भी एकत्र और विश्लेषण किया जा सकता है। भविष्य के उपचारों को लक्षित करने के लिए बायोमार्कर अभिव्यक्ति के लिए माध्यम एकत्र किया जा सकता है। हम उन मार्गों या अणुओं की भी पहचान कर सकते हैं जिन्हें दवाओं या जीन थेरेपी के साथ इलाज किया जा सकता है और मानव नैदानिक परीक्षणों के अनुवाद से पहले आईसीपी के विभिन्न पशु मॉडलों में इन उपचारों का परीक्षण किया जा सकता है।

अंत में, हमारा मॉडल न केवल परीक्षण का एक मानवीय आधार प्रदान करता है, बल्कि इसका उपयोग उन उपचारों को मान्य करने के लिए भी किया जा सकता है जो आंखों में ट्रांसलैमिनर दबाव परिवर्तनों को लक्षित कर सकते हैं। यह मानव दाता eyecups पर रोगी स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के माध्यम से सटीक दवा प्रदर्शन करने के लिए एक एवेन्यू खोलता है और टीएएस मॉडल में उन पर दबाव डालता है। यह हमें क्लिनिक में अनुवाद योग्य होने और जीवित व्यक्तियों से संबंधित होने की क्षमता के साथ पूर्व विवो उपचारों का परीक्षण करने की अनुमति देता है। हमारे मॉडल के साथ अब हम ट्रांसलैमिनर दबाव में होने वाले परिवर्तनों का आकलन कर सकते हैं और यह विभिन्न दर्दनाक और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से जुड़े रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका कैसे निभाता है। यह ओएनएच में रोगजनक आणविक तंत्र की बेहतर समझ का कारण बनेगा जो आईओपी और आईसीपी से जुड़े हैं।

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Disclosures

पांडुलिपि के लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संभावित संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए वित्त पोषण डॉ. कोलीन एम मैकडॉवेल के विवेकाधीन निधियों के माध्यम से किया गया था। इस काम को दृष्टिहीनता को रोकने के लिए अनुसंधान से एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, इंक को ओप्थाल्मोलॉजी और दृश्य विज्ञान के यूडब्ल्यू मैडिसन विभाग के लिए। हम Drs. Abbot F. Clark और Weiming Mao को परफ्यूजन अंग संस्कृति मॉडल के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम मानव दाता आंखें प्रदान करने के लिए लायंस आई इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसप्लांट एंड रिसर्च (टैम्पा, एफएल) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		 Amazon B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) Amazon B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle Vitality Medical 302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap QOSINA 2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver Brikksen Stainless Steel Fastners PPMSSSCH4C.5  
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE Fisher Scientific NC9085343  
Betadine Purdue PUR1815001EACH  
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167-100EA  
Corning L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS Med Plus Medical Supply COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) Katena K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps F.S.T. 11254-20
Eye Scissors Standard Curved Katena K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes Capitol Scientific 351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers Fisher Scientific 16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium Fisher Scientific SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution Fisher Scientific SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear Qosina 28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate AD instruments DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box Jenson Global JG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscope Keyence B2-X710
LabChart 8 AD instruments LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer Leica ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White QOSINA 65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228) AD instruments FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508) AD instruments PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male McMAster-Carr 7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe McMAster-Carr 51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. Fisher Scientific 14-171-268
Superblock T20 Fisher Scientific PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T. 14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved Katena K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS) University of North Texas Health Science Center N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		 Marco Rubber & Plastics B1000-030

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तंत्रिका विज्ञान अंक 158 इंट्राओकुलर दबाव इंट्राक्रैनियल दबाव ट्रांसलैमिनर दबाव ढाल रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं ऑप्टिक तंत्रिका सिर परफ्यूजन अंग संस्कृति
मानव दाता पश्चवर्ती खंडों में इंट्राओकुलर और इंट्राक्रैनियल दबाव के मॉडुलन के लिए ट्रांसलैमिनर स्वायत्त प्रणाली मॉडल
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Sharma, T. P., Curry, S. M.,… More

Sharma, T. P., Curry, S. M., Lohawala, H., McDowell, C. Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments. J. Vis. Exp. (158), e61006, doi:10.3791/61006 (2020).

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