Summary
Nous décrivons et détaillons l’utilisation du système autonome translaminaire. Ce système utilise le segment postérieur humain pour réguler indépendamment la pression à l’intérieur du segment (intraoculaire) et entourant le nerf optique (intracrânien) afin de générer un gradient de pression translaminaire qui imite les caractéristiques de la neuropathie optique glaucomateuse.
Abstract
Il existe actuellement un besoin non satisfait d’un nouveau modèle humain préclinique capable de cibler l’étiologie de la maladie ex vivo en utilisant la pression intracrânienne (PCI) et la pression intraoculaire (PIO) qui peuvent identifier divers paradigmes pathogènes liés à la pathogenèse du glaucome. Les modèles ex vivo de perfusion du segment antérieur humain ont déjà été utilisés et appliqués avec succès en tant que technologies efficaces pour la découverte de la pathogenèse du glaucome et l’essai de thérapies. Le dépistage préclinique des médicaments et la recherche effectuée sur les systèmes d’organes humains ex vivo peuvent être plus transposables à la recherche clinique. Cet article décrit en détail la génération et le fonctionnement d’un nouveau modèle de pression translaminaire humaine ex vivo appelé système autonome translaminaire (TAS). Le modèle TAS peut réguler indépendamment la PCI et la PIO à l’aide des segments postérieurs des donneurs humains. Le modèle permet d’étudier la pathogenèse de manière préclinique. Il peut réduire l’utilisation d’animaux vivants dans la recherche ophtalmique. Contrairement aux modèles expérimentaux in vitro, la structure, la complexité et l’intégrité des tissus de la tête du nerf optique (ONH) peuvent également être maintenues dans le modèle TAS ex vivo.
Introduction
Les estimations mondiales de sondages récents suggèrent que 285 millions de personnes vivent avec une déficience visuelle, dont 39 millions sont aveugles1. En 2010, l’Organisation mondiale de la santé a documenté que trois des neuf principales causes de cécité répertoriées se produisent dans le segment postérieur de l’œil1. Les maladies oculaires du segment postérieur impliquent la rétine, la choroïde et le nerf optique2. La rétine et le nerf optique sont des extensions du système nerveux central (SNC) du cerveau. Les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) sont vulnérables aux dommages parce qu’ils sortent de l’œil par la tête du nerf optique (ONH) pour former le nerf optique3. L’ONH reste le point le plus vulnérable pour les axones RGC en raison du maillage 3D de faisceaux de tissu conjonctif appelé lamina cribrosa (LC)4. L’ONH est le site initial d’insulte aux axones RGC dans le glaucome5,6,7, et les changements d’expression génique au sein de l’ONH ont été étudiés dans des modèles d’hypertension oculaire et de glaucome8,9,10. Les axones RGC sont sensibles à l’ONH en raison des différences de pression entre le compartiment intraoculaire, appelé pression intraoculaire (PIO), et dans l’espace sous-arachnoïdien périoptique externe, appelé pression intracrânienne (ICP)11. La région LC sépare les deux zones, maintenant des différentiels de pression normaux, avec une PIO allant de 10 à 21 mmHg et une ICP de 5 à 15 mmHg12. La différence de pression à travers la lame entre les deux chambres est appelée gradient de pression translaminaire (TLPG)13. Un facteur de risque majeur de glaucome est la PIO14 élevée.
L’augmentation de la PIO augmente la tension à l’intérieur et à travers la région laminaire6,15,16. Des observations expérimentales chez l’homme et des modèles animaux présentent l’ONH comme étant le site initial de lésions axonales17,18. Le paradigme biomécanique du stress et de la souche liés à la PIO causant des dommages glaucomateux à l’ONH influence également la physiopathologie du glaucome19,20,21. Même si chez l’homme, les changements induits par la pression endommagent mécaniquement les axones RGC22, les rongeurs dépourvus de plaques collagènes dans la lame peuvent également développer un glaucome7,23. En outre, une PIO élevée reste le facteur de risque le plus important chez les patients atteints de glaucome primaire à angle ouvert, tandis que les patients atteints de glaucome de tension normale développent une neuropathie optique glaucomateuse même sans PIO élevée. En outre, il existe également un sous-ensemble de patients hypertendus oculaires qui ne présentent aucune lésion du nerf optique. Il a également été suggéré que la pression du liquide céphalo-rachidien (CSFp) pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse du glaucome. Les preuves indiquent que la PCI est abaissée à environ 5 mmHg chez les patients atteints de glaucome par rapport aux individus normaux, provoquant ainsi une augmentation de la pression translaminaire et jouant un rôle crucial dans la maladie24,25. Auparavant, il a été démontré dans un modèle canin qu’en contrôlant les changements IOP et CSFp, il peut y avoir de grands déplacements du disque optique26. L’élévation du CSFp dans les yeux porcins a également montré une augmentation de la souche principale dans la région LC et le tissu neural rétrolaminaire. Une pression accrue sur les CGR et la région LC contribue au blocage du transport axonal et à la perte de CGR27. La dégénérescence progressive des CGR a été associée à la perte du soutien trophique28,29, à la stimulation des processus inflammatoires/ régulation immunitaire30,31 et aux effecteurs apoptotiques29,32,33,34,35. De plus, une lésion axonale (figure 3) provoque des effets néfastes sur les CGR, déclenchant une défaillance de la régénération36,37,38,39. Même si les effets de la PIO ont été bien étudiés, peu de recherches ont été effectuées sur les changements anormaux de pression translaminaire. La plupart des traitements du glaucome se concentrent sur la stabilisation de la PIO. Cependant, même si l’abaissement de la PIO ralentit la progression de la maladie, il n’inverse pas la perte de champ visuel et n’empêche pas la perte complète des CGR. Comprendre les changements neurodégénératifs liés à la pression dans le glaucome sera crucial pour prévenir la mort du RGC.
Les preuves actuelles indiquent que les modulations de pression translaminaire dues à divers changements mécaniques, biologiques ou physiologiques chez les patients souffrant de déficiences visuelles traumatiques ou neurodégénératives peuvent entraîner une perte de vision importante. À l’heure actuelle, il n’existe aucun véritable modèle préclinique de segment postérieur humain qui puisse permettre l’étude des dommages biomécaniques glaucomateux au sein de l’ONH humain ex vivo. L’observation et le traitement du segment postérieur de l’œil est un énorme défi en ophtalmologie27. Il existe des barrières physiques et biologiques pour cibler l’œil postérieur, notamment des taux d’élimination élevés, une barrière hémato-rétinienne et des réponses immunologiques potentielles40. La plupart des tests d’efficacité et d’innocuité pour les nouvelles cibles médicamenteuses sont réalisés à l’aide de modèles cellulaires in vitro et de modèles animaux in vivo41. L’anatomie oculaire est complexe et les études in vitro n’imitent pas avec précision les barrières anatomiques et physiologiques présentées par les systèmes de modèles tissulaires. Même si les modèles animaux sont une nécessité pour les études pharmacocinétiques, la physiologie oculaire de l’œil postérieur humain peut varier entre diverses espèces animales, y compris l’anatomie cellulaire de la rétine, le système vasculaire et l’ONH41,42.
L’utilisation d’animaux vivants nécessite des réglementations éthiques intensives et détaillées, un engagement financier élevé et une reproductibilité efficace43. Récemment, de nombreuses autres lignes directrices ont été suivies pour l’utilisation éthique des animaux dans la recherche expérimentale44,45,46. Une alternative à l’expérimentation animale est l’utilisation de modèles oculaires humains ex vivo pour étudier la pathogenèse de la maladie et l’analyse potentielle de médicaments pour protéger les dommages causés par les ONH. Le tissu post-mortem humain est une ressource précieuse pour étudier les paradigmes des maladies humaines, en particulier dans le cas des maladies neurodégénératives humaines, car l’identification des médicaments potentiels développés dans des modèles animaux nécessite la nécessité d’être traduisible à l’homme47. Le tissu de donneur humain ex vivo a été largement utilisé pour l’étude des troubles humains47,48,49, et les systèmes de culture d’organes de perfusion du segment antérieur humain ont déjà fourni un modèle ex vivo unique pour étudier la physiopathologie de la PIO50,51,52 élevée.
Pour étudier la pression translaminaire liée à la PIO et à la PCI dans les yeux humains, nous avons conçu et développé avec succès un système autonome translaminaire (TAS) à deux chambres qui peut réguler indépendamment la PIO et la PCI en utilisant les segments postérieurs des yeux de donneurs humains. Il s’agit du premier modèle humain ex vivo à étudier la pression translaminaire et à exploiter les effets biomécaniques du TLPG sur l’ONH.
Ce modèle TAS humain ex vivo peut être utilisé pour découvrir et classer les modifications cellulaires et fonctionnelles qui se produisent en raison d’une élévation chronique de la PIO ou de la PCI. Dans ce rapport, nous détaillons le protocole étape par étape de dissection, de configuration et de surveillance du modèle de segment postérieur humain TAS. Le protocole permettra à d’autres chercheurs de reproduire efficacement ce nouveau modèle de segment postérieur humain sous pression ex vivo pour étudier la pathogenèse des maladies biomécaniques.
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Protocol
Les yeux ont été obtenus conformément aux dispositions de la Déclaration d’Helsinki pour la recherche sur les tissus humains.
REMARQUE : Des yeux provenant de banques d’yeux réputées (p. ex., Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) ont été prélevés dans les 6 à 12 heures suivant le décès et le sérum du donneur a été testé pour l’hépatite B, l’hépatite C et les virus d’immunodéficience humaine 1 et 2. Une fois reçus, les yeux ont été disséqués et installés dans le modèle TAS dans les 24 heures. Les critères d’exclusion incluaient toute pathologie oculaire. Les yeux n’ont pas été exclus en fonction de l’âge, de la race ou du sexe. Pour assurer la viabilité de la rétine dès réception, des explantes rétiniennes ont été prélevées sur les donneurs de tissus et cultivées pendant 7 et 14 jours (figure supplémentaire 1). Ces rétines ont également été dissociées et ont développé des CGR sains en culture pendant 7 jours avec une coloration positive pour le marqueur RGC, une protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), ainsi qu’une coloration positive de la chaîne légère des neurofilaments (NEFL) dans leurs neurofilaments (figure supplémentaire 2). .
1. Préparation et stérilisation de l’équipement et des fournitures
- Reportez-vous à la Table des matériaux pour obtenir la liste complète des fournitures requises ainsi que les numéros de fournisseur et de catalogue.
- Avant utilisation, stériliser tout l’équipement et les instruments en autoclavant ou en utilisant des ampoules d’oxyde d’éthylène.
2. Préparation du milieu de perfusion
- Ajouter 1 % de streptomycine de pénicilline (10 000 U/mL de pénicilline, 10 000 μg/mL de streptomycine dans 0,85 % de NaCl) et 1 % de L-glutamine (200 mM) à 1 000 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à 1 000 mL de glucose élevé.
- Stériliser le milieu de perfusion en passant à travers un filtre de 0,22 μm.
3. Configuration du système autonome translaminaire (TAS)
- Mettre en place des seringues d’entrée (réservoirs IOP et ICP).
- Ajouter 30 mL du milieu de perfusion (rubrique 2) à une seringue de 30 mL. Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à la seringue de 30 mL. Fixez un filtre hydrophile de 0,22 μm au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez un adaptateur de stub Luer 15 G au filtre hydrophile de 0,22 μm.
- Retirez les bulles d’air de la configuration de la seringue. Fixez le tube à l’adaptateur de tige 15 G Luer. Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt à l’aide d’un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations.
- Étiqueter une seringue comme pression intracrânienne du canal 1 (CH1 ICP) et l’autre seringue comme pression intraoculaire du canal 2 (CH2 IOP).
- Mettre en place des seringues de sortie (réservoirs IOP et ICP).
- Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à une seringue de 30 mL. Fixez un adaptateur de stub Luer 15 G au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez le tube à l’adaptateur de tige 15 G Luer.
- Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt à l’aide d’un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations. Étiquetez une seringue comme CH1 ICP et l’autre seringue comme CH2 IOP.
4. Préparation du globe oculaire entier humain
REMARQUE: Si des yeux entiers sont reçus, suivez la procédure ci-dessous pour séparer le segment antérieur du segment postérieur de l’œil. Si les yeux sont coupés en deux, commencez à l’étape 4.4.
- Placer un œil entier dans une solution de povidone-iode pendant 2 min.
- Rincez l’œil dans une solution tamponnée stérile au phosphate (PBS) pour rincer la povidone-iode. Répétez 2 fois.
- Retirez l’annexée de tout le globe oculaire à l’aide d’une pince et de ciseaux. Coupez l’œil en deux à l’équateur pour séparer les segments antérieur et postérieur de l’œil.
- Retirez la gaine du nerf optique. Retirez l’humeur vitrée du segment postérieur.
- Coupez la sclérotique supplémentaire du segment postérieur, si nécessaire, pour assurer un bon ajustement sur le dôme rond de la chambre IOP (inférieure). À l’aide de pinces, assurez-vous que la rétine est répartie uniformément sur le postérieur du segment.
- Configuration de la chambre IOP (inférieure)
- Placez le segment postérieur humain dans la chambre IOP (inférieure) du TAS sur le dôme rond avec le nerf optique orienté vers le haut.
- Scellez le segment postérieur à l’aide du joint torique en résine époxy avec quatre vis, assurant une étanchéité étanche.
- Insérez le tuyau dans les orifices IN et OUT de la chambre IOP (inférieure). La seringue d’entrée IOP avec tube contenant un milieu est insérée dans le port IN et la seringue de sortie IOP vide avec tube est insérée dans le port OUT.
- Utilisez la méthode push/pull pour infuser lentement le milieu de perfusion dans l’orifice d’entrée pour remplir la coupe oculaire postérieure tout en tirant lentement le fluide de perfusion à travers la seringue d’écoulement pour éliminer les bulles d’air des lignes. Arrêtez d’infuser du milieu une fois que les tubes IN et OUT sont dépourvus de bulles d’air.
- Verrouillez les robinets d’arrêt en position off. Retirez la seringue de 30 mL de l’ensemble de filtre à orifice IOP IN et remplissez-la avec un total de 30 mL de milieu. Remplacez la seringue de 30 mL sur l’ensemble filtrant.
-
Configuration de la chambre ICP (en haut)
- Placez la chambre/le couvercle ICP (en haut) sur l’arrière du segment postérieur. Assurez-vous que le nerf optique se trouve dans la chambre supérieure. Scellez la chambre supérieure avec quatre vis.
- Insérez le tuyau dans les orifices IN et OUT de la chambre ICP (supérieure). La seringue d’entrée ICP avec tube contenant un milieu est insérée dans le port IN et la seringue de sortie ICP vide avec tube est insérée dans le port OUT.
- Infuser doucement et lentement le fluide dans le port IN pour remplir la chambre ICP et éliminer les bulles d’air des lignes à l’aide de la méthode push/pull. Arrêtez d’infuser le milieu une fois que la chambre ICP ainsi que les tubes IN et OUT sont dépourvus de bulles d’air.
- Verrouillez les robinets d’arrêt en position off. Retirez la seringue de 30 mL de l’ICP dans l’ensemble du filtre à orifice et remplissez-la avec un total de 30 mL de milieu. Remplacez la seringue de 30 mL sur l’ensemble filtrant.
5. Configuration du système d’enregistrement de données
REMARQUE: Le système d’enregistrement de données est composé d’une source d’alimentation à 8 canaux, d’un amplificateur de pont multicanal, de transducteurs de pression hydrostatiques et d’un ordinateur avec un logiciel d’acquisition de données (voir tableau des matériaux). Ce qui suit décrit comment configurer et calibrer le système.
- Connectez le cordon d’alimentation à l’arrière de la source d’alimentation à 8 canaux et branchez-le sur un périphérique de secours de batterie.
- Connectez le câble USB de la source d’alimentation à 8 canaux à l’arrière de l’ordinateur.
- Connectez la source d’alimentation à 8 canaux à l’amplificateur de pont multicanal à l’aide du cordon I2C fourni.
- Connectez les câbles BNC (Bayonet Neill-Concelman) aux entrées de canal devant la source d’alimentation à 8 canaux et l’extrémité des câbles aux canaux correspondants à l’arrière de l’amplificateur multicanal.
- Connectez les câbles du transducteur à l’avant de l’amplificateur multicanal.
- Installez le logiciel d’acquisition de données sur l’ordinateur.
- Exécutez le programme d’installation du logiciel d’acquisition de données à partir du CD du logiciel fourni.
- Suivez les instructions à l’écran de l’ordinateur.
- Une fois l’installation terminée, sélectionnez Terminer.
- Allumez la source d’alimentation à 8 canaux.
- Allumez l’ordinateur et lancez le logiciel d’acquisition de données.
- Sélectionnez | de fichier Nouveau.
- Sélectionnez | d’installation Paramètres de la chaîne. Sélectionnez trois canaux (en bas à gauche de l’écran). Dans la colonne Titre du canal, renommez les canaux comme suit : CH1 ICP ; CH2 PIO; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Sélectionnez 2 mV pour la portée sur tous les canaux. Dans la colonne Calcul, sélectionnez Aucun calcul pour les canaux 1 et 2.
- Dans la colonne Calcul, sélectionnez Arithmétique pour le canal 3. Dans la section Formule : Sélectionnez les canaux/CH2 ; Sélectionnez l’arithmétique « -« ; Sélectionnez les canaux/CH1. Dans la section Sortie, sélectionnez mmHg. Sélectionnez OK. Sélectionnez à nouveau OK .
- Installez et calibrez les transducteurs de pression hydrostatiques.
REMARQUE: Les transducteurs de pression hydrostatiques doivent être étalonnés avant les expériences en utilisant la méthode suivante.- Connectez les transducteurs de pression hydrostatiques aux lignes de transducteur attachées à l’amplificateur de pont multicanal.
- Fixez une seringue de 30 mL remplie d’air à l’orifice latéral du transducteur de pression CH1 (ICP). Fixez le sphygmomanomètre au bas du transducteur de pression CH1 (ICP).
- Sur le graphique, affichez la page du logiciel d’acquisition de données, définissez la vitesse d’échantillonnage en cliquant avec le bouton gauche de la flèche à côté du temps d’échantillonnage et sélectionnez 100. Cliquez ensuite avec le bouton droit de la souris dans la zone CH1 (ICP) de la page.
- Sélectionnez Bridge Amp. Sélectionnez Filtre secteur. Sélectionnez Zéro et attendez que le système soit à zéro, en prenant soin de ne pas déplacer le transducteur de pression.
- Pincez les languettes blanches du transducteur de pression et poussez l’air à travers le transducteur jusqu’à ce que 40 mmHg soient obtenus sur le sphygmomanomètre. Relâchez les languettes blanches et retirez la seringue et le sphygmomanomètre.
- Sur la page Conversion d’unités , sélectionnez le signe 'moins (-)'. Mettez en surbrillance le plateau le plus élevé pour indiquer 40 mmHg. Cliquez sur la flèche du point 1 et entrez 40.
- Mettez en surbrillance le plateau le plus bas pour indiquer 0 mmHg. Cliquez sur la flèche du point 2 et entrez 0. Sélectionnez mmHg pour les unités. Sélectionnez OK.
- Sélectionnez OK (page Bridge Amp). Répétez les étapes 9.1 à 9.7 pour le CH2 (IOP) en utilisant 100 mmHg pour le plateau le plus élevé et 0 pour le plateau le plus bas.
- Connectez l’unité TAS/segment postérieur au système d’acquisition de données.
- Placer l’unité TAS/segment postérieur dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2). Fixez le tube ICP de l’orifice OUT au transducteur de pression CH1 (ICP).
- Fixez le tube IOP de l’orifice OUT au transducteur de pression CH2 (IOP).
- Fixez les configurations de seringue (ICP et IOP) avec un support entre les ports IN et le support annulaire.
- Dans la page Vue graphique, sélectionnez Démarrer l’échantillonnage. Réglez la vitesse d’échantillonnage en cliquant avec le bouton gauche de la flèche à côté du temps d’échantillonnage et sélectionnez Lent et 1 min.
- Ajustez les seringues sur l’anneau vers le haut ou vers le bas pour réguler les pressions ICP et IOP aux exigences du protocole.
- Effectuez un réapprovisionnement systémique du milieu dans le système toutes les 48 à 72 heures grâce à la méthode push and pull.
6. Récupération et analyse des données
- Ouvrez le fichier de données dans le logiciel d’acquisition de données.
- Dans la section Data Pad , cliquez sur l’icône Multiple Add to Data Pad . Une nouvelle fenêtre apparaîtra.
- Dans la section Rechercher à l’aide , sélectionnez Heure dans le menu déroulant.
- Dans la section Sélectionner , sélectionnez 1 heure toutes les 1 heure dans les menus déroulants.
- Dans la section Étape par étape, sélectionnez Fichier entier , puis cliquez sur Ajouter.
- Dans la section Data Pad , cliquez sur l’icône Data Pad View . Mettez en surbrillance toutes les données et copiez/collez-les dans une feuille de calcul.
- Calculez les écarts-types et moyens pour IOP, ICP et TLPG toutes les 24 heures. Rassemblez les données à l’aide de l’option de tableau croisé dynamique dans un tableur et un graphique.
7. Immunohistochimie et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des segments postérieurs
- Retirez les segments postérieurs de l’œil suivant divers points temporels du modèle TAS et fixez-les dans le formol avant la paraffinisation.
- Sectionner les yeux pour produire des plans de tissu sagittal.
- Déparaffinez les segments incorporés à la paraffine avec une solution 100% xylène, 95% éthanol, 50% éthanol.
- Lavez les lames avec PBS pendant 10 min et bloquez avec un tampon de blocage à température ambiante pendant 1 h.
- Sections d’étiquetage avec anticorps primaires : anti-collagène IV (marqueur de matrice extracellulaire (ECM), NB120-6586, 1:100) et anti-laminine (marqueur ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marqueur RGC), GTX118619, 1:50).
- Détecter les anticorps primaires à l’aide des anticorps secondaires Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin, A11008, 1:500).
- Contre-tache les noyaux cellulaires à l’aide d’une solution anti-décoloration DAPI.
- Capturez des images des sections colorées et des images de phase avec des lentilles d’objectif 4x et 10x à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir Tableau des matériaux).
- Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), traiter les sections dans un système de coloration automatisé (voir tableau des matériaux) pour la déparaffinisation à l’aide d’une solution d’éthanol à 100%, de xylène à 95%, d’éthanol à 50% et de coloration avec H & E.
- Capturez des images avec les objectifs 4x et 10x à l’aide d’un microscope avec une source de lumière à champ lumineux.
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Representative Results
Conception et création du système autonome translaminaire
La différence de pression translaminaire est un mécanisme clé potentiel dans la pathogenèse de diverses maladies, y compris le glaucome. Les utilisations du modèle décrit comprennent, sans toutefois s’y limiter, l’étude du glaucome (PIO élevée, peut-être diminution de la PCI), des lésions cérébrales traumatiques (PCI élevée) et de l’exposition à long terme à une déficience visuelle associée à la microgravité (PCI élevée, PIO élevée). Pour aider à découvrir la pathogenèse moléculaire ciblant la pression translaminaire dans l’œil humain, nous avons conçu, créé et validé le modèle TAS. Notre nouveau modèle humain ex vivo donne un système préclinique unique pour étudier indépendamment les changements pathogènes associés à la PCI et à la PIO. Pour répondre aux applications précliniques humaines, notre modèle fournit un paradigme ex vivo d’étude de la pathogenèse due aux changements de pression translaminaire. La conception du modèle scellé est représentée avec des vues avant et transparentes (Figure 1A, 1B) avec une vue schématique détaillée du modèle pour représenter tous les ports d’entrée et de sortie (Figure 1C). La vue transparente en couleur avec un segment postérieur humain dans un modèle imprimé en 3D réel est illustrée (Figure 1D, 1E).
Système autonome translaminaire : un nouveau modèle de pression translaminaire humaine ex vivo
Nous avons généré le modèle TAS avec deux chambres autonomes (c’est-à-dire les chambres IOP et ICP). Dans la base inférieure du modèle, la coupe postérieure humaine a été placée sur le dessus du dôme rond avec le nerf optique tourné vers le haut. Une fois que la coupe postérieure a été placée et scellée dans la chambre IOP, nous avons placé la chambre ICP sur le nerf. Nous avons maintenu l’indépendance des deux chambres et une étanchéité parfaite à l’aide de joints toriques qui s’adaptent précisément à chaque chambre (Figure 2A). La chambre inférieure ou la chambre IOP remplissait et régulait la pression dans la tasse, tandis que la chambre supérieure s’adaptait autour du nerf optique et régulait l’ICP autour du nerf à travers des réservoirs de pression hydrostatiques. À l’aide du modèle, nous avons régulé indépendamment la PIO et l’ICP en utilisant la pression hydrostatique. La différence entre les deux chambres a été identifiée comme un changement du gradient de pression translaminaire (figure 2B). Le modèle représenté avec tous les raccords finaux en place, y compris les seringues de réservoir d’entrée et de sortie connectées, est illustré à la figure 2C.
Culture réussie et maintien de la pression dans le système autonome translaminaire
Pour nous assurer que les deux chambres fonctionnaient indépendamment dans le système, nous avons régulé plusieurs différentiels de pression en maintenant la chambre IOP et l’ICP à différents différentiels de pression moyenne (TLPG normal: IOP: ICP, 15:5 mmHg; TLPG élevé >10 mmHg; TLPG élevé >20 mmHg). Nous avons d’abord testé le maintien de différentiels de pression normaux moyens dans les deux chambres (IOP / ICP normale) à travers divers paramètres de conditions IOP et ICP: 1) IOP normale: diminution de la PCI (Figure 3A); 2) PIO élevée : diminution de la PCI (figure 3B); et 3) PIO élevée : PCI élevée (Figure 3C). La PIO normale moyenne varie de 10 à 21 mmHg (pression veineuse épisclérale prise en compte) et la PCI normale de 5 à 15 mmHg. Au lieu de la limitation de ne pas avoir de pression vasculaire, nous avons quand même maintenu la pression à ces taux, car l’idée était d’exercer la pression maximale à l’ONH. Nous avons régulé indépendamment différents niveaux de pression dans les deux chambres (ICP, 5–10 mmHg; PIO, 20–40 mmHg). Pour assurer le maintien de la pression entre les deux chambres, nous avons maintenu la PIO dans des conditions normales (15 mmHg) et diminué la PCI (4 mmHg) pour maintenir un TLPG (IOP-ICP) entre la CL de 11 mmHg (Figure 3A). Nous avons ensuite augmenté la PIO (43 mmHg) et diminué la PCI (3 mmHg) (Figure 3B) et enfin les pressions élevées dans les deux (PIO, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) pour générer le plus grand niveau de TLPG à 55 mmHg (Figure 3C). Pour assurer la viabilité du tissu (figure 4), le milieu dans les tissus a été échangé toutes les 48 heures en attachant une seringue vide au robinet d’arrêt de sortie et en poussant lentement environ 5 mL de milieu de perfusion à travers l’orifice d’entrée à l’aide de la méthode push/pull. Des augmentations de pression minimes se sont produites au moment de l’échange moyen (figure 4G) et n’ont pas affecté la morphologie de l’ONH comme le montrent les données d’immunohistochimie à 14 et 30 jours (figure 4A-F). Pour confirmer que nous pouvions cultiver des segments postérieurs pendant des périodes prolongées avec une viabilité effective dans le modèle TAS, nous avons analysé des sections transversales de l’ONH après le maintien de la PIO et de la PCI normales pendant 14 et 30 jours. Nous avons pu cultiver avec succès ces segments dans le modèle pendant 14 jours (Figure 4A, 4B) avec des cellules ONH saines et l’expression de la matrice extracellulaire du collagène IV (COLIV) à la tête du nerf optique (Figure 4C). Une viabilité et un maintien similaires du segment postérieur ont également été observés pendant 30 jours (figure 4D, 4E) avec expression de COLIV et de DAPI (figure 4F). La représentation graphique des valeurs TLPG (IOP-ICP) (Figure 4G) illustre un maintien constant des valeurs IOP au fil du temps à 15,6 ± 4,6 mmHg et ICP à 11,0 ± 4,6 mmHg pendant 30 jours avec un TLPG de 4,6 ± 1,3 mmHg (tableau 1).
Modifications morphologiques du gradient de pression translaminaire post-élevé de l’ONH
Une caractéristique clinique commune de la maladie neurodégénérative liée à l’âge glaucome est la ventouse ONH. Les ventouses prélaminaires se distinguent par une perte progressive des tissus neurals prélaminaires, ce qui augmente à la fois la profondeur et la largeur de la coupe et augmente ainsi le rapport coupe-disque. Les ventouses laminaires sont basées sur le tissu conjonctif, le LC se déplaçant vers l’arrière progressivement et excavant. Les ventouses glaucomateuses sont une combinaison de ces deux composants, reflétant à la fois les dommages et le remodelage des tissus conjonctifs laminaires. L’élévation de la PIO entraîne un épaississement de la CL en raison d’une augmentation de la masse de fibrilles de collagène53. En utilisant le modèle TAS, nous avons créé un TLPG élevé en augmentant la PIO ou en diminuant l’ICP sur différents points temporels. Nous avons maintenu une plage de TLPG élevé pendant 7 jours avec des valeurs moyennes de PIO au fil du temps à 22,8 ± 18,6 mmHg et une moyenne ICP à 6,9 ± 7,6 mmHg avec une TLPG de 15,9 ± 11,8 mmHg (tableau 2). Les TLPG les plus élevés ont été documentés à 36 mmHg. Les segments postérieurs humains ont ensuite été analysés morphologiquement pour l’épaississement progressif des faisceaux laminaires et des ventouses à l’ONH dans les sections colorées H & E au fur et à mesure que le temps progressait entre le contrôle, 1 jour, 3 jours et 7 jours sous TLPG élevé (Figure 5A-D). Des ventouses et un épaississement ont été observés à 7 jours de TLPG élevé (figure 5D). De plus, l’expression de COLIV au fil du temps entre le contrôle, 1 jour, 3 jours et 7 jours a montré des faisceaux épaissis et une expression accrue de 7 jours (Figure 5E–H). Les images de phase comparant le tissu témoin non cultivé dans le modèle TAS (Figure 5I) et 7 jours (Figure 5J) de TLPG élevé dans le modèle TAS montrent des CGR sains dans le GCL (Figure 5I) sans ventouses (Figure 5I) pour le contrôle, tandis que dans des conditions de TLPG élevé, les images montrent des ventouses étendues sans RGC restants (marqueur RBPMS-RGC) dans le RNFL (Figure 5J) et un remodelage accru de l’ECM comme le montre un COLIV élevé dans le ONH (Figure 5J).
Figure 1 : Système autonome translaminaire. Représentation du modèle. (A) Vue de face solide. B) Vue transparente. (C) Vue schématique. (D) Vue transparente couleur. (E) Modèle réel imprimé en 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mécanique du système autonome translaminaire. (A) Le modèle TAS avec chambres ICP et IOP pour la régulation des différentiels de pression translaminaire. (B) Représentation du modèle TAS avec régulation autonome de la pression hydrostatique dans les deux chambres par élévation des réservoirs. (C) Image du modèle TAS avec tous les raccords en place et représentation des seringues du réservoir d’entrée et de sortie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Maintien indépendant de la pression au sein du système autonome translaminaire. Représentation graphique des pressions modulées indépendamment et des pressions stables maintenues dans les chambres supérieure (ICP) et inférieure (IOP) avec (A) IOP normale / ICP diminuée (B) IOP élevée / ICP diminuée, et (C) IOP élevée / ICP élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Entretien et viabilité des segments postérieurs au sein du système autonome translaminaire. Les segments postérieurs humains ont été cultivés à l’aide du modèle TAS pendant 14 et 30 jours dans des conditions normales de PIO et de PCI. H & E a coloré des sections transversales d’ONH humain à 14 jours en (A) faible grossissement (40x) et (B) grossissement élevé (100x). (C) Immunocoloration coliv avec expression DAPI (100x). Représentations similaires de la coloration H & E à 30 jours dans les micrographies (D) 40x et (E) 100x et (F) colIV immunocolorant avec expression DAPI (100x). G) Présentation graphique de Δ en mmHg de l’IOP-ICP (TLPG) pour les segments postérieurs humains maintenus pendant 30 jours en culture. COLIV = vert; DAPI = bleu; (A, encadré B); (D, encadré E); H&E = coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Restructuration morphologique de la tête du nerf optique après gradient de pression translaminaire élevé dans le système autonome translaminaire. Les segments postérieurs humains ont été cultivés à l’aide du modèle TAS pour divers points temporels dans des conditions TLPG élevées. Coupes transversales d’ONH humain représentant la coloration H & E du contrôle (A) (B) 1 jour en TAS (C) 3 jours en TAS et (D) 7 jours de culture. Expression de COLIV avec DAPI dans l’ONH de (E) contrôle (F) 1 jour en TAS (G) 3 jours en TAS, et (H) 7 jours en culture. Images de coupe transversale ONH à contraste de phase de (I) contrôle ONH représentant (I') coloration de la rétine de RBPMS et (I'') coloration ONH avec COLIV et DAPI. Contraste de phase de (J) 7 jours de TLPG élevé dans TAS avec des encarts représentant (J') coloration de la rétine de RBPMS et (J'') coloration ONH avec COLIV et DAPI. COLIV, RBPMS = vert; DAPI = bleu; (A–D) grossissement de 40x; (E–H) Grossissement de 100x; (I et J) grossissement de 200x; (J') grossissement de 400x; (J'') grossissement de 100x; (J, encadré J’et J''); H&E = coloration à l’hématoxyline et à l’éosine; TAS = Système autonome translaminaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Jours | PIO moyenne de 24 h | ICP moyen de 24 h | TLPG moyen (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| MST | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tableau 1 : Maintien du TLPG normal pendant 30 jours. Valeurs tabulaires représentant les valeurs IOP, ICP et TLPG toutes les 24 heures avec une moyenne et un écart-type sur l’ensemble du parcours temporel.
| Jours | PIO moyenne de 24 h | ICP moyen de 24 h | TLPG moyen de 24 h |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| MST | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tableau 2 : Maintien d’une gamme de TLPG élevé maintenue pendant 7 jours. Valeurs tabulaires représentant les valeurs IOP, ICP et TLPG toutes les 24 heures avec une moyenne et un écart-type sur l’ensemble du parcours temporel.
Figure supplémentaire 1 : Culture ex vivo d’explants rétiniens humains. Contraste de phase, images colorées RGC positives (RBPMS-vert) et cellulaires (bleu DAPI) d’explants rétiniens en culture pendant (A-C) 7 jours et (D-F) 14 jours (grossissement 200x). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure supplémentaire 2 : Cultures humaines adultes de RGC. Marqueur RGC (RBPMS-vert) et DAPI (bleu) colorés 7 jours en culture (A) grossissement 200x (B) 400x. (C) RGC colorés pour NEFL (vert) et DAPI (bleu) à un grossissement de 400x. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
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Discussion
Les tissus post-mortem humains sont une ressource particulièrement précieuse pour l’étude des maladies neurodégénératives humaines, car l’identification des médicaments potentiels développés dans des modèles animaux doit pouvoir être transposable aux humains47. Les effets de l’élévation de la PIO chez l’homme sont bien établis, mais peu de recherches ont été effectuées sur les changements anormaux de pression translaminaire de l’ONH. Même s’il existe plusieurs modèles animaux et une modélisation finie de l’ONH humain, il n’existe pas de modèle humain ex vivo pour étudier les changements de pression translaminaire41,54,55,56,57. Il existe actuellement un besoin non satisfait d’un nouveau modèle humain préclinique capable de cibler l’étiologie de la maladie ex vivo à l’aide de la PIO et de la PCI et d’identifier divers paradigmes pathogènes liés à la pathogenèse du glaucome. Comprendre les changements pathologiques liés à la pression à l’ONH sera crucial pour prévenir la mort du RGC. L’utilisation combinée de la PIO, de l’ICP et du TLPG dans le modèle TAS est une approche unique pour étudier la dégénérescence dépendante de la pression de manière préclinique en utilisant du tissu du segment postérieur humain. Dans le modèle TAS, nous pouvons cultiver des segments postérieurs de coupes oculaires humaines pour étudier les changements de pression translaminaire grâce à une régulation autonome des chambres IOP et ICP. Il fournit une base pour le développement d’une nouvelle gamme de thérapies qui se concentrent sur la pression translaminaire en tant que mécanisme de dégénérescence.
La mise en place du modèle TAS nécessite une attention aux détails à de nombreux égards: la dissection correcte des segments postérieurs humains, la garantie que la rétine est intacte et étalée sur la coupe postérieure, le placement correct du segment sur le dôme de la chambre IOP, la localisation précise de la chambre ICP sur l’ON, l’étanchéité efficace des deux chambres, et le maintien des pressions hydrostatiques indépendamment en régulant la hauteur des réservoirs IOP et ICP. La dissection doit être effectuée dans les yeux qui ne sont pas plus de 24 à 36 heures après l’autopsie, car la rétine se détériore progressivement si le milieu de culture efficace n’est pas reconstitué. Le réapprovisionnement systémique du milieu a été effectué dans notre système toutes les 48 à 72 heures. Un autre aspect crucial du système est la longueur de l’ON. Il est essentiel de s’assurer qu’il reste au moins 0,5 à 1 cm d’ON sur l’œil cadavérique. Les yeux de donneurs ne doivent pas être utilisés s’ils ont des ON courts, si l’ON est endommagé, si le globe est compromis et dégonflé ou si la gaine ON est détachée. De plus, lors du placement du segment postérieur au-dessus du dôme, le joint torique doit être bien ajusté en place et la chambre ICP supérieure correctement scellée avec des vis. Les raccords à poussoir où le tube se fixe de chaque côté de la base supérieure et inférieure du modèle doivent également être testés pour s’assurer que le tube s’adapte et se verrouille en place. Si le tube n’est pas correctement en place, des bulles d’air seront observées à l’intérieur du tube et compromettront les mesures de pression dans chaque chambre.
Le maintien et la viabilité des segments postérieurs post-mortem dans notre modèle TAS étaient une préoccupation critique pour ce protocole. Le tissu post-mortem humain a déjà fait l’objet d’études approfondies48,49, avec une étude récente d’analyse de l’ARN de 1 068 tissus de donneurs post-mortem confirmant que le tissu cérébral humain post-mortem prélevé au fil des décennies peut servir de matériel de haute qualité pour l’étude des troubles humains47. En outre, un profilage d’expression précédemment réussi des tissus oculaires des tissus oculaires de donneurs humains post-mortem a été effectué58. Expression génique Les valeurs PLIER pour les gènes d’apoptose étaient minimes ou inexistantes dans cet ensemble de données pour le tissu rétinien 6 h post-mortem58. En outre, il a été démontré que le stockage hypothermique du tissu oculaire peut être effectué efficacement59. Il a été démontré que l’activité des cellules ganglionnaires est maintenue pendant 50 h lorsque les yeux de minipig sont stockés dans des conditions ischémiques et hypothermiques41,60. Par conséquent, nous avons utilisé le point de temps de 6 h comme critère d’inclusion pour la collecte d’oculaires de donneurs. La vitesse de détérioration post-mortem des segments postérieurs et de décollement de la rétine fait défaut dans la littérature, mais notre énucléation dans les 6 heures, l’administration sur la glace et la configuration de la culture de 36 h maximum se situent bien dans la plage de viabilité tissulaire décrite dans la figure supplémentaire 1 et la figure supplémentaire 2. En utilisant le modèle TAS, nous avons réussi à maintenir des tissus sains pendant 30 jours.
Une autre limite du modèle TAS est notre incapacité actuelle à modéliser les rythmes circadiens cycliques de l’ICP et de l’IOP qui sont observés dans des conditions physiologiques normales. Cela peut être résolu à l’avenir en utilisant une pompe capable de réguler la PIO rythmique et la perfusion ICP. En outre, une autre mise en garde au modèle est le manque de circulation sanguine dans l’œil cadavérique. Ainsi, les effets de la pression artérielle ne peuvent pas être étudiés, mais cela nous permet également de délimiter spécifiquement les effets pathogènes des seuls changements TLPG, y compris la PIO et la PCI.
Une portée future du modèle incorporerait l’automatisation des systèmes de réservoir pour les changements hydrostatiques et la perfusion du milieu à travers une pompe à perfusion avec une seringue vide de sortie sur le transducteur au lieu des multiples cycles de changement de milieu qui ont été mis en œuvre dans ce protocole. Le fluide du réservoir IOP et ICP a également pu être collecté et analysé. Le milieu peut être recueilli pour l’expression de biomarqueurs afin de cibler les thérapies futures. Nous pouvons également identifier des voies ou des molécules qui peuvent être traitées avec des médicaments ou une thérapie génique et tester ces thérapies dans divers modèles animaux de PCI avant leur traduction en essais cliniques humains.
En conclusion, notre modèle fournit non seulement une base humaine de tests, mais il peut également être utilisé pour valider des thérapies qui peuvent cibler les changements de pression translaminaire dans l’œil. Il ouvre la voie à la médecine de précision par la transplantation de cellules souches de patients sur des œillets de donneurs humains et à leur mise sous pression dans le modèle TAS. Cela nous permet de tester des thérapies ex vivo avec la capacité d’être traduisibles à la clinique et reliées à des individus vivants. Avec notre modèle, nous pouvons maintenant évaluer les changements qui se produisent dans la pression translaminaire et comment elle joue un rôle crucial dans la pathogenèse associée à diverses maladies traumatiques et neurodégénératives. Cela conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires pathogènes dans l’ONH qui sont associés à la PIO et à l’ICP.
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Disclosures
Les auteurs du manuscrit n’ont aucun conflit d’intérêts potentiel à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par des fonds discrétionnaires de la Dre Colleen M. McDowell. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, Inc. au département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de l’UW Madison. Nous remercions les Drs Abbot F. Clark et Weiming Mao pour leur assistance technique avec le modèle de culture d’organes de perfusion. Nous remercions le Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) d’avoir fourni les yeux de donneurs humains.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R.
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R.
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
