Summary
We beschrijven en detailleren het gebruik van het translaminaire autonome systeem. Dit systeem maakt gebruik van het menselijke posterieure segment om onafhankelijk de druk in het segment (intraoculair) en rond de oogzenuw (intracranieel) te reguleren om een translaminaire drukgradiënt te genereren die kenmerken van glaucomateuze optische neuropathie nabootst.
Abstract
Er is een huidige onvervulde behoefte aan een nieuw preklinisch menselijk model dat zich ex vivo op ziekte-etiologie kan richten met behulp van intracraniale druk (ICP) en intraoculaire druk (IOP) die verschillende pathogene paradigma's met betrekking tot de pathogenese van glaucoom kan identificeren. Ex vivo humane anterieure segment perfusie orgaankweekmodellen zijn eerder met succes gebruikt en toegepast als effectieve technologieën voor de ontdekking van glaucoompathogenese en het testen van therapeutica. Preklinische screening van geneesmiddelen en onderzoek uitgevoerd op ex vivo menselijke orgaansystemen kunnen beter vertaalbaar zijn naar klinisch onderzoek. Dit artikel beschrijft in detail de generatie en werking van een nieuw ex vivo menselijk translaminair drukmodel genaamd het translaminaire autonome systeem (TAS). Het TAS-model kan ICP en IOP onafhankelijk reguleren met behulp van menselijke donorposterieure segmenten. Het model maakt het mogelijk om pathogenese op een preklinische manier te bestuderen. Het kan het gebruik van levende dieren in oogheelkundig onderzoek verminderen. In tegenstelling tot in vitro experimentele modellen kunnen de weefselstructuur, complexiteit en integriteit van de oogzenuwkop (ONH) ook binnen het ex vivo TAS-model worden gehandhaafd.
Introduction
Wereldwijde schattingen in recente enquêtes suggereren dat 285 miljoen mensen met een visuele beperking leven, waaronder 39 miljoen blind1. In 2010 documenteerde de Wereldgezondheidsorganisatie dat drie van de negen genoemde belangrijkste oorzaken van blindheid voorkomen in het achterste segment van het oog1. Oogziekten in het achterste segment omvatten het netvlies, vaatvlies en oogzenuw2. Het netvlies en de oogzenuw zijn uitbreidingen van het centrale zenuwstelsel (CZS) van de hersenen. De retinale ganglioncel (RGC) axonen zijn kwetsbaar voor schade omdat ze het oog verlaten via de oogzenuwkop (ONH) om de oogzenuw te vormen3. De ONH blijft het meest kwetsbare punt voor de RGC-axonen vanwege het 3D-netwerk van bindweefselbundels die de lamina cribrosa (LC) worden genoemd4. De ONH is de eerste plaats van belediging van RGC-axonen bij glaucoom5,6,7, en genexpressieveranderingen binnen de ONH zijn bestudeerd in oculaire hypertensie- en glaucoommodellen8,9,10. De RGC-axonen zijn gevoelig bij de ONH als gevolg van drukverschillen tussen het intraoculaire compartiment, de intraoculaire druk (IOP) genoemd, en binnen de externe perioptische subarachnoïdale ruimte, de intracraniale druk (ICP) genoemd11. Het LC-gebied scheidt beide gebieden, met behoud van normale drukverschillen, met IOP variërend van 10-21 mmHg en ICP van 5-15 mmHg12. Het drukverschil door de lamina tussen de twee kamers wordt de translaminaire drukgradiënt (TLPG)13 genoemd. Een belangrijke risicofactor voor glaucoom is verhoogde IOP14.
Verhoogde IOP verhoogt de spanning binnen en over het laminaire gebied6,15,16. Experimentele waarnemingen in mens- en diermodellen presenteren de ONH als de eerste plaats van axonale schade17,18. Het biomechanische paradigma van IOP-gerelateerde stress en spanning die glaucomateuze schade veroorzaken bij de ONH beïnvloedt ook de pathofysiologie van glaucoom19,20,21. Hoewel bij mensen drukgeïnduceerde veranderingen RGC-axonen mechanisch beschadigen22, kunnen knaagdieren zonder collageenachtige platen in de lamina ook glaucoom ontwikkelen7,23. Bovendien blijft verhoogde IOP de meest prominente risicofactor bij patiënten met primair open hoekglaucoom, terwijl patiënten met een normale spanning glaucoom glaucomateuze optische neuropathie ontwikkelen, zelfs zonder verhoogde IOP. Bovendien zijn er ook een subgroep van oculaire hypertensieve patiënten die geen schade aan de oogzenuw vertonen. Er is ook gesuggereerd dat cerebrospinale vloeistofdruk (CSFp) een rol kan spelen bij de pathogenese van glaucoom. Er zijn aanwijzingen dat de ICP is verlaagd tot ~5 mmHg bij glaucoompatiënten in vergelijking met normale personen, waardoor een verhoogde translaminaire druk wordt veroorzaakt en een cruciale rol wordt gespeeld bij ziekte24,25. Eerder werd in een hondenmodel aangetoond dat door het regelen van IOP- en CSFp-veranderingen, er grote verplaatsingen van de optische schijf26 kunnen zijn. Het verhogen van CSFp in varkensogen heeft ook een verhoogde hoofdbelasting aangetoond in het LC-gebied en retrolaminair neuraal weefsel. Verhoogde druk op de RGC's en het LC-gebied draagt bij aan axonale transportblokkade en verlies van RGC's27. Progressieve degeneratie van RGC's is in verband gebracht met verlies van trofische ondersteuning28,29, stimulatie van ontstekingsprocessen/immuunregulatie30,31 en apoptotische effectoren29,32,33,34,35. Bovendien veroorzaakt axonaal letsel (figuur 3) schadelijke effecten op de RGC's, waardoor regeneratief falen wordt veroorzaakt36,37,38,39. Hoewel de effecten van IOP goed zijn bestudeerd, is er minimaal onderzoek gedaan naar abnormale translaminaire drukveranderingen. De meeste behandelingen voor glaucoom richten zich op het stabiliseren van IOP. Hoewel verlaging van de IOP de progressie van de ziekte vertraagt, keert het gezichtsveldverlies niet om en voorkomt het volledig verlies van RGC's. Inzicht in drukgerelateerde neurodegeneratieve veranderingen in glaucoom zal cruciaal zijn om RGC-dood te voorkomen.
Het huidige bewijs geeft aan dat translaminaire drukmodulaties als gevolg van verschillende mechanische, biologische of fysiologische veranderingen bij patiënten die lijden aan traumatische of neurodegeneratieve visuele beperkingen aanzienlijk verlies van het gezichtsvermogen kunnen veroorzaken. Momenteel bestaat er geen echt preklinisch menselijk posterieur segmentmodel dat de studie van glaucomateuze biomechanische schade binnen de ex vivo menselijke ONH mogelijk maakt. Observatie en behandeling van het achterste segment van het oog is een enorme uitdaging in de oogheelkunde27. Er zijn fysieke en biologische barrières om het achterste oog te richten, waaronder hoge eliminatiesnelheden, bloed-retinale barrière en potentiële immunologische reacties40. De meeste werkzaamheids- en veiligheidstests voor nieuwe geneesmiddeldoelen worden uitgevoerd met behulp van in vitro cellulaire en in vivo diermodellen41. Oculaire anatomie is complex en in vitro studies bootsen niet nauwkeurig de anatomische en fysiologische barrières na die worden gepresenteerd door weefselmodelsystemen. Hoewel diermodellen een noodzaak zijn voor farmacokinetische studies, kan de oculaire fysiologie van het menselijk achterste oog variëren tussen verschillende diersoorten, waaronder cellulaire anatomie van het netvlies, vasculatuur en ONH41,42.
Het gebruik van levende dieren vereist intensieve en gedetailleerde ethische voorschriften, een hoge financiële inzet en effectieve reproduceerbaarheid43. Onlangs zijn er meerdere andere richtlijnen gevolgd voor het ethisch gebruik van dieren in experimenteel onderzoek44,45,46. Een alternatief voor dierproeven is het gebruik van ex vivo human eye-modellen om de pathogenese van ziekten te onderzoeken en mogelijke analyse van geneesmiddelen voor het beschermen van ONH-schade. Menselijk postmortaal weefsel is een waardevolle hulpbron voor het bestuderen van menselijke ziekteparadigma's, vooral in het geval van menselijke neurodegeneratieve ziekten, omdat identificatie van potentiële geneesmiddelen die in diermodellen zijn ontwikkeld, de noodzaak vereist om naar mensen te vertalen47. Het ex vivo menselijke donorweefsel is uitgebreid gebruikt voor de studie van menselijke aandoeningen47,48,49, en menselijke anterieure segment perfusie orgaankweeksystemen hebben eerder een uniek ex vivo model geleverd om de pathofysiologie van verhoogde IOP50,51,52 te bestuderen.
Om translaminaire druk gerelateerd aan IOP en ICP in menselijke ogen te bestuderen, hebben we met succes een tweekamer translaminair autonoom systeem (TAS) ontworpen en ontwikkeld dat IOP en ICP onafhankelijk kan reguleren met behulp van posterieure segmenten van menselijke donorogen. Het is het eerste ex vivo menselijke model dat translaminaire druk bestudeert en de biomechanische effecten van TLPG op de ONH benut.
Dit ex vivo menselijke TAS-model kan worden gebruikt om cellulaire en functionele modificaties te ontdekken en te classificeren die optreden als gevolg van chronische verhoging van IOP of ICP. In dit rapport beschrijven we het stapsgewijze protocol voor het ontleden, instellen en bewaken van het TAS-model voor menselijke posterieure segmenten. Het protocol zal andere onderzoekers in staat stellen om dit nieuwe ex vivo onder druk staande menselijke posterieure segmentmodel effectief te reproduceren om de pathogenese van biomechanische ziekten te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ogen werden verkregen volgens de bepalingen van de Verklaring van Helsinki voor onderzoek met menselijk weefsel.
OPMERKING: Ogen van gerenommeerde oogbanken (bijv. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) werden binnen 6-12 uur na overlijden geoogst en donorserum werd getest op hepatitis B, hepatitis C en humaan immunodeficiëntievirus 1 en 2. Nadat ze waren ontvangen, werden de ogen binnen 24 uur ontleed en in het TAS-model geplaatst. Exclusiecriteria omvatten elke oculaire pathologie. Ogen werden niet uitgesloten op basis van leeftijd, ras of geslacht. Om de levensvatbaarheid van het netvlies bij ontvangst te garanderen, werden retinale explantaten geoogst van de weefseldonoren en gedurende 7 en 14 dagen gekweekt (aanvullende figuur 1). Deze netvliezen werden ook gedissocieerd en groeiden gezonde RGC's in cultuur gedurende 7 dagen met positieve kleuring voor RGC-marker, RNA-bindend eiwit met multiple splicing (RBPMS), evenals positieve neurofilament light chain (NEFL) kleuring in hun neurofilamenten (aanvullende figuur 2). .
1. Voorbereiding en sterilisatie van apparatuur en benodigdheden
- Raadpleeg de tabel met materialen voor een volledige lijst van benodigde benodigdheden en leveranciers- en catalogusnummers.
- Steriliseer voor gebruik alle apparatuur en instrumenten door ethyleenoxideampullen te autoclaveren of te gebruiken.
2. Bereiding van het perfusiemedium
- Voeg 1% penicilline streptomycine (10.000 E / ml penicilline, 10.000 μg / ml streptomycine in 0,85% NaCl) en 1% L-glutamine (200 mM) toe aan 1.000 ml hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM).
- Steriliseer het perfusiemedium door een filter van 0,22 μm te laten gaan.
3. Translaminair autonoom systeem (TAS) setup
- Stel instroomspuiten in (IOP- en ICP-reservoirs).
- Voeg 30 ml van het perfusiemedium (sectie 2) toe aan een spuit van 30 ml. Bevestig een 3-weg stopkraan aan de spuit van 30 ml. Bevestig een hydrofiel filter van 0,22 μm aan de 3-weg stopkraan. Bevestig een 15 G Luer stub adapter aan het 0,22 μm hydrofiele filter.
- Verwijder luchtbellen uit de opstelling van de spuit. Bevestig de slang aan de 15 G Luer stub adapter. Sluit de zijpoort van de stopkraan met een ongeventileerde universele slotdop. Herhaal dit voor in totaal twee opstellingen.
- Label de ene spuit als kanaal 1 intracraniale druk (CH1 ICP) en de andere spuit als kanaal 2 intraoculaire druk (CH2 IOP).
- Stel uitstroomspuiten (IOP- en ICP-reservoirs) in.
- Bevestig een 3-weg stopkraan aan een spuit van 30 ml. Bevestig een 15 G Luer stub adapter aan de 3-weg stopkraan. Bevestig de slang aan de 15 G Luer stub adapter.
- Sluit de zijpoort van de stopkraan met een ongeventileerde universele slotdop. Herhaal dit voor in totaal twee opstellingen. Label de ene spuit als CH1 ICP en de andere spuit als CH2 IOP.
4. Voorbereiding van de hele menselijke oogbol
OPMERKING: Als hele ogen worden ontvangen, volgt u de onderstaande procedure om het voorste segment te scheiden van het achterste segment van het oog. Als de ogen doorsneden zijn, begin dan bij stap 4.4.
- Plaats een heel oog in povidon-jodiumoplossing gedurende 2 minuten.
- Spoel het oog in steriele fosfaat gebufferde oplossing (PBS) om het povidon-jodium af te spoelen. Herhaal dit 2 keer.
- Verwijder de adnexa van de hele oogbol met een tang en schaar. Bisect het oog op de evenaar om de voorste en achterste segmenten van het oog te scheiden.
- Verwijder de oogzenuwschede. Verwijder de glasvochthumor uit het achterste segment.
- Trim indien nodig extra sclera uit het achterste segment om een goede pasvorm op de ronde koepel van de IOP (onderste) kamer te garanderen. Zorg er met een tang voor dat het netvlies gelijkmatig over de achterkant van het segment wordt verdeeld.
- IOP (onderste) kameropstelling
- Plaats het menselijke achterste segment in de IOP (onderste) kamer van de TAS over de ronde koepel met de oogzenuw naar boven gericht.
- Sluit het achterste segment af met de epoxyhars O-ring met vier schroeven, wat zorgt voor een strakke afdichting.
- Steek de slang in de IN- en UIT-poorten van de IOP(onderste) kamer. De IOP-instroomspuit met slanghoudend medium wordt in de IN-poort gestoken en de lege IOP-uitstroomspuit met slang wordt in de OUT-poort geplaatst.
- Gebruik de push/pull-methode om het perfusiemedium langzaam in de instroompoort te injecteren om de achterste oogschelp te vullen en tegelijkertijd het perfusiemedium langzaam door de uitstroomspuit naar buiten te trekken om eventuele luchtbellen uit de leidingen te verwijderen. Stop met het infunderen van medium zodra zowel de IN- als de OUT-buizen geen luchtbellen hebben.
- Vergrendel de stopkranen in de uit-stand. Verwijder de spuit van 30 ml uit de IOP IN-poortfilterassemblage en vul deze bij met in totaal 30 ml medium. Plaats de spuit van 30 ml terug op de filterassemblage.
-
ICP (bovenste) kameropstelling
- Plaats de ICP (bovenste) kamer/deksel over de achterkant van het achterste segment. Zorg ervoor dat de oogzenuw zich in de bovenste kamer bevindt. Sluit de bovenste kamer af met vier schroeven.
- Steek de slang in de IN- en UIT-poorten van de ICP(bovenste) kamer. De ICP-instroomspuit met slanghoudend medium wordt in de IN-poort ingebracht en de lege ICP-uitstroomspuit met slang wordt in de OUT-poort geplaatst.
- Breng het medium voorzichtig en langzaam in de IN-poort om de ICP-kamer te vullen en luchtbellen van de lijnen te verwijderen met behulp van de push/pull-methode. Stop met het infunderen van medium zodra de ICP-kamer en zowel de IN- als de OUT-slang geen luchtbellen hebben.
- Vergrendel de stopkranen in de uit-stand. Verwijder de spuit van 30 ml uit de ICP in poortfilterassemblage en vul deze bij met in totaal 30 ml medium. Plaats de spuit van 30 ml terug op de filterassemblage.
5. Gegevensregistratiesysteem instellen
OPMERKING: Het gegevensregistratiesysteem bestaat uit een 8-kanaals stroombron, meerkanaals brugversterker, hydrostatische drukomvormers en een computer met software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel). Hieronder wordt beschreven hoe u het systeem instelt en kalibreert.
- Sluit het netsnoer aan op de achterkant van de 8-kanaals voedingsbron en sluit het aan op een back-upapparaat voor de batterij.
- Sluit de USB-kabel van de 8-kanaals voedingsbron aan op de achterkant van de computer.
- Sluit de 8-kanaals voedingsbron aan op de meerkanaals brugversterker met behulp van het meegeleverde I2C-snoer.
- Sluit de Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabels aan op de kanaalingangen voor de 8-kanaals stroombron en het uiteinde van de kabels op de overeenkomstige kanalen aan de achterkant van de meerkanaalsversterker.
- Sluit de transducerkabels aan op de voorkant van de meerkanaalsversterker.
- Installeer de software voor gegevensverzameling op de computer.
- Voer het installatieprogramma voor gegevensverzamelingssoftware uit vanaf de meegeleverde software-cd.
- Volg de instructies op het computerscherm.
- Wanneer de installatie is voltooid, selecteert u Voltooien.
- Schakel de 8-kanaals voedingsbron in.
- Schakel de computer in en start de software voor gegevensverzameling.
- Selecteer Bestand | Nieuw.
- Selecteer Setup | Kanaalinstellingen. Selecteer drie kanalen (linksonder in het scherm). Wijzig in de kolom Kanaaltitel de naam van de kanalen als volgt: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Selecteer 2 mV voor het bereik op alle kanalen. Selecteer in de kolom Berekening de optie Geen berekening voor kanalen 1 en 2.
- Selecteer in de kolom Berekening de optie Rekenen voor kanaal 3. In het gedeelte Formule : Selecteer kanalen/CH2; Selecteer rekenkundige "-"; Selecteer kanalen/CH1. Selecteer in het gedeelte Uitvoer mmHg. Selecteer OK. Selecteer nogmaals OK .
- Stel de hydrostatische drukomvormers in en kalibreer ze.
OPMERKING: Hydrostatische drukomvormers moeten voorafgaand aan experimenten worden gekalibreerd met behulp van de volgende methode.- Sluit de hydrostatische drukomvormers aan op de transducerleidingen die aan de meerkanaals brugversterker zijn bevestigd.
- Bevestig een spuit gevuld met lucht van 30 ml aan de zijpoort van de CH1 (ICP) drukomvormer. Bevestig de bloeddrukmeter aan de onderkant van de CH1 (ICP) drukomvormer.
- Bekijk in de grafiek de pagina van de software voor gegevensverzameling, stel de bemonsteringssnelheid in door met de linkermuisknop op de pijl naast de bemonsteringstijd te klikken en 100 te selecteren. Klik vervolgens met de rechtermuisknop in het CH1 (ICP) gebied van de pagina.
- Selecteer Bridge Amp. Selecteer Netfilter. Selecteer Nul en wacht tot het systeem nul uitvalt, waarbij u ervoor zorgt dat u de drukomvormer niet verplaatst.
- Knijp in de witte lipjes van de drukomvormer en duw lucht door de transducer totdat 40 mmHg op de bloeddrukmeter is verkregen. Laat de witte lipjes los en verwijder de spuit en bloeddrukmeter.
- Selecteer op de pagina Eenhedenconversie het teken 'min (-)'. Markeer het hoogste plateau om 40 mmHg aan te geven. Klik op de pijl voor punt 1 en voer 40 in.
- Markeer het laagste plateau om 0 mmHg aan te geven. Klik op de pijl voor punt 2 en voer 0 in. Selecteer mmHg voor de units. Selecteer OK.
- Selecteer OK (Bridge Amp-pagina). Herhaal stap 9.1-9.7 voor CH2 (IOP) met 100 mmHg voor het hoogste plateau en 0 voor het laagste plateau.
- Sluit de TAS/posterieure segmenteenheid aan op het data-acquisitiesysteem.
- Plaats de TAS/posterieure segmenteenheid in een incubator (37 °C, 5% CO2). Bevestig de ICP-slang van de OUT-poort aan de CH1 (ICP) drukomvormer.
- Bevestig de IOP-buis van de OUT-poort aan de CH2 (IOP) drukomvormer.
- Bevestig de spuitopstellingen (ICP en IOP) met medium van de IN-poorten aan de ringstandaard.
- Selecteer op de pagina Grafiekweergave de optie Bemonstering starten. Stel de bemonsteringssnelheid in door met de linkermuisknop op de pijl naast de bemonsteringstijd te klikken en selecteer Langzaam en 1 min.
- Stel de spuiten op de ringstand omhoog of omlaag om de ICP- en IOP-drukken te regelen volgens de protocolvereisten.
- Voer systemische aanvulling van het medium in het systeem uit om de 48-72 uur via de duw- en trekmethode.
6. Ophalen en analyseren van gegevens
- Open het gegevensbestand in de software voor gegevensverzameling.
- Klik in het gedeelte Data Pad op het pictogram Meerdere toevoegen aan Data Pad . Er verschijnt een nieuw venster.
- Selecteer in het gedeelte Zoeken met de optie Tijd in het vervolgkeuzemenu.
- Selecteer in het gedeelte Selecteren 1 uur per 1 uur in de vervolgkeuzemenu's.
- Selecteer in het gedeelte Doorstap de optie Heel bestand en klik vervolgens op Toevoegen.
- Klik in het gedeelte Data Pad op het pictogram Data Pad View . Markeer alle gegevens en kopieer/plak in een spreadsheet.
- Bereken de gemiddelde en standaarddeviaties voor IOP, ICP en TLPG voor elke 24 uur. Verzamel de gegevens met de draaitabeloptie in een spreadsheetprogramma en grafiek.
7. Immunohistochemie en hematoxyline- en eosinekleuring van achterste segmenten
- Verwijder de achterste oogsegmenten volgens verschillende tijdspunten uit het TAS-model en fixeer in formaline voordat u paraffineert.
- Snijd de ogen om sagittale weefselvlakken te produceren.
- Deparaffiniseer de paraffine-ingebedde segmenten met een 100% xyleen, 95% ethanol, 50% ethanol oplossing.
- Was de glaasjes met PBS gedurende 10 minuten en blokkeer met een blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Labelsecties met primaire antilichamen: anti-collageen IV (extracellulaire matrix (ECM) marker, NB120-6586, 1:100) en anti-laminine (ECM marker, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC marker), GTX118619, 1:50).
- Detecteer de primaire antilichamen met behulp van Alexa Fluor secundaire antilichamen (Alexa Fluor 488 geiten anti-konijn, A11008, 1:500).
- Counterstain de celkernen met behulp van DAPI anti-fade oplossing.
- Leg beelden vast van de gekleurde secties en fasebeelden met 4x en 10x objectieve lenzen met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie Materialentabel).
- Voor de hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring verwerkt u de secties in een geautomatiseerd kleuringssysteem (zie Tabel met materialen) voor deparaffinisatie met behulp van een 100%, xyleen 95% ethanol, 50% ethanoloplossing en kleuring met H&E.
- Leg foto's vast met de 4x en 10x objectieflenzen met behulp van een microscoop met een heldere veldlichtbron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ontwerp en creatie van het translaminaire autonome systeem
Translaminair drukverschil is een potentieel sleutelmechanisme in de pathogenese van verschillende ziekten, waaronder glaucoom. Toepassingen voor het beschreven model omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de studie van glaucoom (verhoogde IOP, misschien verminderde ICP), traumatisch hersenletsel (verhoogde ICP) en langdurige blootstelling aan microzwaartekracht-geassocieerde visuele beperking (verhoogde ICP, verhoogde IOP). Om moleculaire pathogenese gericht op translaminaire druk in het menselijk oog te helpen ontdekken, hebben we het TAS-model ontworpen, gemaakt en gevalideerd. Ons nieuwe ex vivo menselijke model geeft een uniek preklinisch systeem om ICP en IOP-geassocieerde pathogene veranderingen onafhankelijk te bestuderen. Om menselijke preklinische toepassingen aan te pakken, biedt ons model een ex vivo paradigma voor het bestuderen van pathogenese als gevolg van translaminaire drukveranderingen. Het verzegelde modelontwerp is afgebeeld met solide front- en transparante weergaven (figuur 1A, 1B) met een gedetailleerde schematische weergave van het model om alle in- en uitstroompoorten weer te geven (figuur 1C). De kleurentransparante weergave met een menselijk achterste segment in een echt 3D-geprint model wordt weergegeven (Figuur 1D, 1E).
Translaminair autonoom systeem: een nieuw ex vivo menselijk translaminair drukmodel
We hebben het TAS-model gegenereerd met twee autonome kamers (d.w.z. IOP- en ICP-kamers). In de onderste basis van het model werd de menselijke achterste beker over de bovenkant van de ronde koepel geplaatst met de oogzenuw naar boven gericht. Nadat de achterste beker in de IOP-kamer was geplaatst en verzegeld, plaatsten we de ICP-kamer bovenop de zenuw. We behielden de onafhankelijkheid van beide kamers en een perfecte afdichting met behulp van O-ringen die precies in elke kamer passen (figuur 2A). De onderste kamer of de IOP-kamer vulde en regelde de druk in de beker, terwijl de bovenste kamer rond de oogzenuw paste en de ICP rond de zenuw regelde via hydrostatische drukreservoirs. Met behulp van het model hebben we IOP en ICP onafhankelijk gereguleerd met behulp van hydrostatische druk. Het verschil tussen beide kamers werd geïdentificeerd als een verandering in translaminaire drukgradiënt (figuur 2B). Het afgebeelde model met alle eindfittingen op hun plaats, inclusief de aangesloten in- en uitstroomreservoirspuiten, is weergegeven in figuur 2C.
Succesvol cultuur- en drukonderhoud in het translaminaire autonome systeem
Om ervoor te zorgen dat beide kamers onafhankelijk van elkaar in het systeem werkten, regelden we verschillende drukverschillen door de IOP-kamer en ICP op verschillende gemiddelde drukverschillen te houden (normale TLPG: IOP: ICP, 15:5 mmHg; verhoogde TLPG >10 mmHg; verhoogde TLPG >20 mmHg). We hebben in eerste instantie het behoud van gemiddelde normale drukverschillen in beide kamers (normale IOP/ICP) getest door middel van verschillende parameters van IOP- en ICP-omstandigheden: 1) normale IOP: verlaagde ICP (figuur 3A); 2) verhoogde IOP: verlaagde ICP (figuur 3B); en 3) verhoogde IOP: verhoogde ICP (figuur 3C). De gemiddelde normale IOP varieert van 10-21 mmHg (episclerale veneuze druk meegerekend) en normale ICP van 5-15 mmHg. In plaats van de beperking van het niet hebben van vasculaire druk, handhaafden we nog steeds de druk op deze snelheden, omdat het idee was om de maximale druk op de ONH uit te oefenen. We regelden onafhankelijk verschillende drukniveaus in beide kamers (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20-40 mmHg). Om drukbehoud tussen beide kamers te garanderen, hielden we IOP onder normale omstandigheden (15 mmHg) en verlaagden we ICP (4 mmHg) om een TLPG (IOP-ICP) tussen de LC van 11 mmHg te houden (figuur 3A). Vervolgens verhoogden we de IOP (43 mmHg) en verlaagden we de ICP (3 mmHg) (figuur 3B) en ten slotte verhoogde drukken in beide (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) om het grootste niveau van TLPG te genereren bij 55 mmHg (figuur 3C). Om de levensvatbaarheid van het weefsel te garanderen (figuur 4), werd het medium in de weefsels om de 48 uur verwisseld door een lege spuit aan de uitstroomstopkraan te bevestigen en langzaam ongeveer 5 ml perfusiemedium door de instroompoort te duwen met behulp van de push/pull-methode. Minimale drukverhogingen traden op op het moment van mediumuitwisseling (figuur 4G) en hadden geen invloed op de morfologie van de ONH zoals weergegeven in de 14- en 30-daagse immunohistochemische gegevens (figuur 4A-F). Om te bevestigen dat we posterieure segmenten konden kweken voor langere tijdframes met effectieve levensvatbaarheid binnen het TAS-model, analyseerden we doorsneden van de ONH na onderhoud van normale IOP en ICP gedurende 14 en 30 dagen. We waren in staat om deze segmenten gedurende 14 dagen succesvol te kweken in het model (figuur 4A, 4B) met gezonde ONH-cellen en extracellulaire matrixexpressie van collageen IV (COLIV) aan de oogzenuwkop (figuur 4C). Vergelijkbare levensvatbaarheid en onderhoud van het achterste segment werd ook waargenomen gedurende 30 dagen (figuur 4D, 4E) met expressie van COLIV en DAPI (figuur 4F). De grafische weergave van TLPG-waarden (IOP-ICP) (figuur 4G) toont een constante handhaving van IOP-waarden in de loop van de tijd bij 15,6 ± 4,6 mmHg en ICP-gemiddelde bij 11,0 ± 4,6 mmHg gedurende 30 dagen met een TLPG van 4,6 ± 1,3 mmHg (tabel 1).
Morfologische veranderingen in de ONH post verhoogde translaminaire drukgradiënt
Een gemeenschappelijk klinisch kenmerk van de leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekte glaucoom is ONH cupping. Prelaminaire cupping onderscheidt zich door progressief verlies van prelaminaire neurale weefsels, waardoor zowel de diepte als de breedte van de cup toeneemt en zo de cup-to-disk ratio toeneemt. Laminaire cupping is gebaseerd op bindweefsel, waarbij de LC progressief naar achteren beweegt en graaft. Glaucomatous cupping is een combinatie van deze twee componenten, die zowel schade als remodellering van laminair bindweefsel weerspiegelen. Verhoging van de IOP leidt tot LC-verdikking als gevolg van een toename van collageenfibrilmassa53. Met behulp van het TAS-model creëerden we een verhoogde TLPG door de IOP te verhogen of de ICP over verschillende tijdspunten te verlagen. We handhaafden een bereik van verhoogde TLPG gedurende 7 dagen met gemiddelde IOP-waarden in de loop van de tijd op 22,8 ± 18,6 mmHg en ICP-gemiddelde op 6,9 ± 7,6 mmHg met een TLPG van 15,9 ± 11,8 mmHg (tabel 2). De hoogste TLPGs werden gedocumenteerd bij 36 mmHg. Menselijke posterieure segmenten werden vervolgens morfologisch geanalyseerd voor progressieve verdikking van laminaire balken en cupping bij de ONH in H & E-gekleurde secties naarmate de tijd vorderde tussen controle, 1 dag, 3 dagen en 7 dagen onder verhoogde TLPG (figuur 5A-D). Cupping en verdikking werden waargenomen na 7 dagen verhoogde TLPG (figuur 5D). Verder vertoonde COLIV-expressie in de tijd tussen controle, 1 dag, 3 dagen en 7 dagen verdikte balken en verhoogde expressie met 7 dagen (figuur 5E-H). Fasebeelden waarin controleweefsel wordt vergeleken dat niet is gekweekt in het TAS-model (figuur 5I) en 7 dagen (figuur 5J) van verhoogde TLPG binnen het TAS-model tonen gezonde RGC's binnen de GCL (figuur 5I) zonder cupping (figuur 5I) voor de controle, terwijl onder omstandigheden van verhoogde TLPG de beelden uitgebreide cupping tonen zonder resterende RGC's (RBPMS-RGC-marker) in de RNFL (figuur 5J) en verhoogde remodellering van ECM zoals aangetoond door verhoogde COLIV in de ONH (figuur 5J).
Figuur 1: Translaminair autonoom systeem. Modelafbeelding. (A) Solide vooraanzicht. (B) Transparante weergave. (C) Schematische weergave. (D) Transparante weergave in kleur. (E) Actueel 3D-geprint model. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mechanica van het translaminaire autonome systeem. (A) Het TAS-model met ICP- en IOP-kamers voor het reguleren van translaminaire drukverschillen. (B) Weergave van het TAS-model met autonome regeling van de hydrostatische druk in beide kamers door verhoging van reservoirs. (C) Afbeelding van het TAS-model met alle fittingen op hun plaats en weergave van de in- en uitstroomreservoirspuiten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Onafhankelijk drukonderhoud binnen het translaminaire autonome systeem. Grafische weergave van drukken die onafhankelijk worden gemoduleerd en stabiele drukken die worden gehandhaafd in de bovenste (ICP) en onderste (IOP) kamers met (A) normale IOP / verlaagde ICP (B) verhoogde IOP / verlaagde ICP en (C) verhoogde IOP / verhoogde ICP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Onderhoud en levensvatbaarheid van posterieure segmenten binnen het translaminaire autonome systeem. Menselijke posterieure segmenten werden gekweekt met behulp van het TAS-model gedurende 14 en 30 dagen onder normale omstandigheden van IOP en ICP. H & E gekleurd doorsneden van menselijke ONH na 14 dagen in (A) lage vergroting (40x) en (B) hoge vergroting (100x). (C) COLIV immunostaining met DAPI-expressie (100x). Vergelijkbare afbeeldingen van H&E-kleuring na 30 dagen in (D) 40x en (E) 100x microfoto's en (F) COLIV immunostaining met DAPI-expressie (100x). G) Grafische weergave van Δ in mmHg van IOP-ICP (TLPG) voor menselijke posterieure segmenten gedurende 30 dagen in cultuur. COLIV = groen; DAPI = blauw; (A, inzet B); (D, inzet E); H&E = hematoxyline en eosine vlek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Morfologische herstructurering van de oogzenuwkop na verhoogde translaminaire drukgradiënt in het Translaminair Autonoom Systeem. Menselijke posterieure segmenten werden gekweekt met behulp van het TAS-model voor verschillende tijdstippen onder verhoogde TLPG-omstandigheden. Dwarsdoorsneden van menselijke ONH met H&E-kleuring van (A) controle (B) 1 dag in TAS (C) 3 dagen in TAS en (D) 7 dagen cultuur. Expressie van COLIV met DAPI in de ONH van (E) controle (F) 1 dag in TAS (G) 3 dagen in TAS, en (H) 7 dagen in cultuur. Fasecontrast ONH dwarsdoorsnede beelden van (I) controle ONH met (I') retina kleuring van RBPMS en (I'') ONH kleuring met COLIV en DAPI. Fasecontrast van (J) 7 dagen verhoogde TLPG in TAS met inzetstukken die (J') netvlieskleuring van RBPMS en (J'') ONH-kleuring met COLIV en DAPI weergeven. COLIV, RBPMS = groen; DAPI = blauw; (A–D) 40x vergroting; (E–H) 100x vergroting; (I en J) 200x vergroting; (J') 400x vergroting; (J'') 100x vergroting; (J, inzet J' en J''); H & E = hematoxyline en eosine vlek; TAS = Translaminair Autonoom Systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dagen | Gemiddelde IOP van 24 uur | Gemiddelde ICP van 24 uur | Gemiddelde TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| GESLACHTSZIEKTE | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabel 1: Onderhoud van normale TLPG gedurende 30 dagen. Tabelwaarden met IOP-, ICP- en TLPG-waarden om de 24 uur met gemiddelde en standaarddeviatie over het volledige tijdsverloop.
| Dagen | Gemiddelde IOP van 24 uur | Gemiddelde ICP van 24 uur | Gemiddelde TLPG van 24 uur |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| GESLACHTSZIEKTE | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabel 2: Onderhoud van een bereik van verhoogde TLPG gehandhaafd gedurende 7 dagen. Tabelwaarden met IOP-, ICP- en TLPG-waarden om de 24 uur met gemiddelde en standaarddeviatie over het volledige tijdsverloop.
Aanvullende figuur 1: Ex vivo menselijke retinale explantcultuur. Fasecontrast, RGC-positief gekleurd (RBPMS-groen) en cellulaire (DAPI-blauw) gekleurde beelden van retinale explantaten in cultuur gedurende (A-C) 7 dagen en (D-F) 14 dagen (200x vergroting). Klik hier om deze figuur te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Menselijke volwassen RGC-culturen. RGC marker (RBPMS-groen) en DAPI (blauw) gekleurd RGC's 7 dagen in cultuur (A) 200x (B) 400x vergroting. (C) RGC's gekleurd voor NEFL (groen) en DAPI (blauw) bij 400x vergroting. Klik hier om deze figuur te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menselijke postmortale weefsels zijn een bijzonder waardevolle bron voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten, omdat identificatie van potentiële geneesmiddelen die in diermodellen zijn ontwikkeld, vertaalbaar moet zijn naar mensen47. De effecten van menselijke IOP-verhoging zijn goed ingeburgerd, maar er is minimaal onderzoek gedaan naar abnormale ONH translaminaire drukveranderingen. Hoewel er meerdere diermodellen en eindige modellering van menselijke ONH bestaan, is er geen ex vivo menselijk model om translaminaire drukveranderingen te bestuderen41,54,55,56,57. Er bestaat momenteel een onvervulde behoefte aan een nieuw preklinisch menselijk model dat zich ex vivo op ziekte-etiologie kan richten met behulp van IOP en ICP en verschillende pathogene paradigma's kan identificeren die verband houden met glaucoompathogenese. Het begrijpen van drukgerelateerde pathologische veranderingen bij de ONH zal cruciaal zijn om RGC-dood te voorkomen. Het gecombineerde gebruik van IOP, ICP en TLPG binnen het TAS-model is een unieke benadering om drukafhankelijke degeneratie op een preklinische manier te bestuderen met behulp van menselijk posterieur segmentweefsel. In het TAS-model kunnen we achterste segmenten van menselijke oogbekers kweken om veranderingen van translaminaire druk te bestuderen door autonome regulatie van de IOP- en ICP-kamers. Het biedt een basis voor het ontwikkelen van een nieuwe reeks therapieën die zich richten op translaminaire druk als een mechanisme van degeneratie.
Het opzetten van het TAS-model vereist aandacht voor detail in veel aspecten: de juiste dissectie van de menselijke achterste segmenten, ervoor zorgen dat het netvlies intact is en verspreid over de achterste beker, de juiste plaatsing van het segment over de koepel van de IOP-kamer, het nauwkeurig situeren van de ICP-kamer over de ON, effectieve afdichting van beide kamers, en onderhoud van hydrostatische drukken onafhankelijk door de hoogte van IOP- en ICP-reservoirs te regelen. Dissectie moet worden uitgevoerd in ogen die niet meer dan 24-36 h postmortaal zijn, omdat het netvlies geleidelijk verslechtert als het effectieve kweekmedium niet wordt aangevuld. Systemische aanvulling van medium werd uitgevoerd in ons systeem elke 48-72 uur. Een ander cruciaal aspect van het systeem is de lengte van de ON. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er ten minste 0,5-1 cm AAN op het kadasteroog achterblijft. Donorogen mogen niet worden gebruikt als ze korte ON's hebben, de ON is beschadigd, de wereldbol is aangetast en leeggelopen, of de ON-mantel is losgemaakt. Verder moet bij het plaatsen van het achterste segment over de koepel de O-ring stevig op zijn plaats worden geplaatst en moet de bovenste ICP-kamer correct worden afgedicht met schroeven. De punaisefittingen waar de slang aan elke kant van de boven- en ondervoet van het model wordt bevestigd, moeten ook worden getest om ervoor te zorgen dat de slang op zijn plaats past en vergrendelt. Als de slang niet goed op zijn plaats zit, worden luchtbellen in de buis waargenomen en worden de drukmetingen in elke kamer in gevaar gebracht.
Onderhoud en levensvatbaarheid van de postmortale posterieure segmenten in ons TAS-model was een kritieke zorg voor dit protocol. Menselijk postmortaal weefsel is eerder uitgebreid bestudeerd48,49, met een recente RNA-analysestudie van 1.068 postmortale donorweefsels die bevestigen dat postmortaal menselijk hersenweefsel dat gedurende tientallen jaren is verzameld, kan dienen als hoogwaardig materiaal voor onderzoek naar menselijke aandoeningen47. Daarnaast is eerder succesvolle expressieprofilering van oculaire menselijke donoroogweefsels postmortaal uitgevoerd58. Genexpressie PLIER-waarden voor apoptosegenen waren minimaal of niet-bestaand in deze dataset voor retinaal weefsel 6 h postmortem58. Bovendien is aangetoond dat hypotherme opslag van oogweefsel effectief kan worden uitgevoerd59. Het is aangetoond dat de ganglioncelactiviteit gedurende 50 uur wordt gehandhaafd wanneer minipig-ogen worden opgeslagen bij ischemische en onderkoelde omstandigheden41,60. Daarom hebben we het 6-uurstijdpunt gebruikt als onze inclusiecriteria voor het verzamelen van donoroogcups. De snelheid van postmortale verslechtering van posterieure segmenten en netvliesloslating ontbreekt in de literatuur, maar onze enucleatie binnen 6 uur, levering over ijs en kweekopstelling van maximale 36 uur ligt ruim binnen het bereik van weefsel levensvatbaarheid zoals weergegeven in aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2. Met behulp van het TAS-model hebben we met succes een gezond onderhoud van weefsel gedurende 30 dagen bereikt.
Een andere beperking van het TAS-model is ons huidige onvermogen om de cyclische circadiane ritmes van ICP en IOP te modelleren die worden waargenomen onder normale fysiologische omstandigheden. Dit kan in de toekomst worden aangepakt door een pomp te gebruiken die ritmische IOP en ICP-infusie kan regelen. Verder is een ander voorbehoud bij het model het gebrek aan bloedcirculatie in het kadaster oog. De effecten van bloeddruk kunnen dus niet worden bestudeerd, maar dit stelt ons ook in staat om specifiek de pathogene effecten van alleen TLPG-veranderingen af te bakenen, waaronder IOP en ICP.
Een toekomstige reikwijdte van het model zou automatisering van de reservoirsystemen voor hydrostatische veranderingen en perfusie van medium door een infusiepomp met een lege uitgangsspuit op de transducer omvatten in plaats van de meerdere rondes van mediumverandering die in dit protocol werden geïmplementeerd. De vloeistof uit het IOP- en ICP-reservoir kon ook worden verzameld en geanalyseerd. Medium kan worden verzameld voor biomarkerexpressie om toekomstige therapieën te richten. We kunnen ook routes of moleculen identificeren die kunnen worden behandeld met medicijnen of gentherapie en deze therapieën testen in verschillende diermodellen van ICP voordat ze worden vertaald naar klinische proeven bij mensen.
Kortom, ons model biedt niet alleen een menselijke basis voor testen, maar het kan ook worden gebruikt om therapieën te valideren die translaminaire drukveranderingen in het oog kunnen aanpakken. Het opent een weg om precisiegeneeskunde uit te voeren door transplantatie van stamcellen van patiënten op menselijke donoroogcups en deze onder druk te zetten in het TAS-model. Dit stelt ons in staat om therapieën ex vivo te testen met het vermogen om vertaalbaar te zijn naar de kliniek en herkenbaar voor levende individuen. Met ons model kunnen we nu de veranderingen in translaminaire druk beoordelen en hoe deze een cruciale rol speelt in de pathogenese geassocieerd met verschillende traumatische en neurodegeneratieve ziekten. Dit zal leiden tot een beter begrip van pathogene moleculaire mechanismen in de ONH die geassocieerd zijn met IOP en ICP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van het manuscript hebben geen potentiële belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Financiering voor dit project was via discretionaire fondsen van Dr. Colleen M. McDowell. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, Inc. aan het UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Wij danken Drs. Abbot F. Clark en Weiming Mao voor hun technische hulp bij het perfusie orgaankweekmodel. We bedanken het Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) voor het leveren van de menselijke donorogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R.
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R.
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
