Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל מערכת אוטונומית טרנסלמינארית לאפנולציה של לחץ תוך עיני ותוך גולגולתי במקטעים האחוריים של התורם האנושי

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61006
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

Summary

אנו מתארים ומפרטים את השימוש במערכת האוטונומית הטרנסלמינרית. מערכת זו משתמשת במגזר האחורי האנושי כדי לווסת באופן עצמאי את הלחץ בתוך המקטע (תוך עיני) וסביב עצב הראייה (תוך גולגולתי) כדי ליצור שיפוע לחץ טרנסלמינארי המחקה תכונות של נוירופתיה אופטית גלאוקומטית.

Abstract

קיים צורך בלתי ממומש עדכני במודל אנושי פרה-אקליני חדש שיכול להתמקד באטיולוגיה של מחלות אקס ויו באמצעות לחץ תוך גולגולתי (ICP) ולחץ תוך עיני (IOP) שיכול לזהות פרדיגמות פתוגניות שונות הקשורות לפתוגנזה הגלאוקומה. מודלים של תרבות איברים של פרגור פלח חיצוני של Ex vivo נוצלו בעבר בהצלחה ויישמו טכנולוגיות יעילות לגילוי פתוגנזה גלאוקומה ובדיקת טיפולים. הקרנת תרופות פרה-קלינית ומחקר המבוצע על מערכות איברים אנושיים ex vivo יכול להיות מתורגם יותר למחקר קליני. מאמר זה מתאר בפירוט את הדור והתפעול של מודל לחץ טרנסלמינארי אנושי חדש שנקרא המערכת האוטונומית הטרנסלמינרית (TAS). מודל TAS יכול לווסת באופן עצמאי ICP ו- IOP באמצעות מקטעים אחוריים של תורמים אנושיים. המודל מאפשר ללמוד פתוגנזה באופן פרה-אקליני. זה יכול להפחית את השימוש בבעלי חיים במחקר עיניים. בניגוד למודלים ניסיוניים במבחנה, ניתן לשמור גם על מבנה הרקמה של ראש עצב הראייה (ONH), המורכבות והשלמות במודל האקס ויוו TAS.

Introduction

הערכות עולמיות בסקרים האחרונים מצביעות על כך ש - 285 מיליון אנשים חיים עם לקות ראייה, כולל 39 מיליון עיוורים1. בשנת 2010, ארגון הבריאות העולמי תיעד כי שלושה מתוך תשעת הגורמים המובילים הרשומים לעיוורון מתרחשים בחלק האחורי של העין1. מחלות עיניים מגזר אחורי כוללות את הרשתית, choroid, עצב הראייה2. הרשתית ועצב הראייה הם הרחבות מערכת העצבים המרכזית (CNS) של המוח. האקסונים של תאי הגנגליון ברשתית (RGC) חשופים לנזק מכיוון שהם יוצאים מהעין דרך ראש עצב הראייה (ONH) כדי ליצור את עצב הראייה3. ONH נשאר הנקודה הפגיעה ביותר עבור אקסונים RGC בגלל רשת 3D של קורות רקמת חיבור בשם lamina cribrosa (LC)4. ONH הוא האתר הראשוני של עלבון אקסונים RGC בגלאוקומה5,6,7, ושינויים ביטוי גנים בתוך ONH נחקרו בדגמי יתר לחץ דם עיניים וגלאוקומה8,9,10. האקסונים של RGC רגישים ב- ONH בשל הפרשי לחץ בין התא התוך עיני, הנקרא לחץ תוך עיני (IOP), ובתוך המרחב התת-עכבישי perioptic החיצוני, הנקרא לחץ תוך גולגולתי (ICP)11. אזור LC מפריד בין שני האזורים, שמירה על הפרשי לחץ נורמליים, עם IOP הנע בין 10-21 מ"מ כ"ג ו- ICP מ 5-15 מ"מHg12. הפרש הלחץ דרך הלמינה בין שני התאים נקרא שיפוע הלחץ הטרנסלמינארי (TLPG)13. גורם סיכון מרכזי לגלאוקומה הוא IOP14 גבוה.

IOP מוגבר מגביר את העומס בתוך ומרחב אזור למינאר6,15,16. תצפיות ניסיוניות במודלים של בני אדם ובעלי חיים מציגות את ה- ONH כאתר הראשוני של נזק אקסוני17,18. הפרדיגמה הביומכנית של מתח ומתח הקשורים ל- IOP הגורמים לנזק גלאוקומה ב- ONH משפיעה גם על הפתופיזיולוגיה של גלאוקומה19,20,21. למרות שבבני אדם שינויים הנגרמים על ידי לחץ פוגעים באופן מכני ב- RGC axons22, מכרסמים חסרי לוחות קולגן בתוך הלמינה יכולים גם לפתח גלאוקומה7,23. בנוסף, IOP גבוה נשאר גורם הסיכון הבולט ביותר בחולי גלאוקומה בזווית פתוחה ראשונית, בעוד חולי גלאוקומה מתח נורמלי לפתח נוירופתיה אופטית גלאוקומה גם ללא IOP גבוה. יתר על כן, ישנם גם תת קבוצה של חולים יתר לחץ דם עינית שאינם מראים נזק עצבי הראייה. כמו כן הוצע כי לחץ נוזל השדרתי (CSFp) עשוי לשחק תפקיד פתוגנזה גלאוקומה. הראיות מצביעות על כך ICP הוא הוריד ~ 5 מ"מ כ"ג בחולי גלאוקומה בהשוואה לאנשים רגילים, ובכך גורם ללחץ טרנסלמינארי מוגבר ולשחק תפקיד מכריע במחלה24,25. בעבר, הוכח במודל כלבים, כי על ידי שליטה בשינויי IOP ו- CSFp, יכולות להיות תזוזות גדולות של הדיסק האופטי26. העלאת CSFp בעיני חזירים הראתה גם זן עיקרי מוגבר בתוך אזור LC ורקמה עצבית רטרולמינארית. עומס מוגבר על RGCs ואזור LC תורם לחסימת תחבורה אקסונית ואובדן RGCs27. ניוון פרוגרסיבי של RGCs קושר לאובדן תמיכה טרופית28,29, גירוי של תהליכים דלקתיים/ויסות חיסוני30,31, ומשפיעים אפופטוטיים29,32,33,34,35. בנוסף, פגיעה אקסונית (איור 3) גורמת להשפעות מזיקות על ה-RGCs וגורמת לכשל רגנרטיבי36,37,38,39. למרות ההשפעות של IOP נחקרו היטב, מחקר מינימלי בוצע על שינויים חריגים בלחץ טרנסלמינארי. רוב הטיפולים לגלאוקומה מתמקדים בייצוב IOP. עם זאת, למרות שהורדת IOP מאטה את התקדמות המחלה, היא אינה הופכת אובדן שדה ראייה ומונעת אובדן מוחלט של RGCs. הבנת שינויים נוירודגנרטיביים הקשורים ללחץ בגלאוקומה תהיה חיונית למניעת מוות של RGC.

הראיות הנוכחיות מצביעות על כך אפנון לחץ translaminar עקב שינויים מכניים, ביולוגיים, או פיזיולוגיים שונים בחולים הסובלים מליקויי ראייה טראומטיים או ניווניות יכול לגרום לאובדן ראייה משמעותי. נכון לעכשיו, לא קיים מודל פלח דם פרה-אקליני אמיתי שיכול לאפשר את המחקר של נזק ביומכני גלאוקומה בתוך ONH האנושי ex vivo. תצפית וטיפול בחלק האחורי של העין הוא אתגר עצום ברפואת עיניים27. ישנם מחסומים פיזיים וביולוגיים כדי למקד את העין האחורית, כולל שיעורי חיסול גבוהים, מחסום רשתית הדם, ותגובות חיסוניות פוטנציאליות40. רוב בדיקות היעילות והבטיחות למטרות סמים חדשניות מושגות תוך שימוש במודלים של תאי במבחנה ובדגמים של בעלי חיים ב-vivo41. האנטומיה העין מורכבת, ובמחקרי במבחנה אינם מחקים במדויק את המחסומים האנטומיים והפיזיולוגיים המוצגים על ידי מערכות מודל רקמות. למרות שמודלים של בעלי חיים הם הכרח למחקרים פרמקוקינטיים, הפיזיולוגיה העיןית של העין האחורית האנושית עשויה להשתנות בין מינים שונים של בעלי חיים, כולל אנטומיה תאית של הרשתית, vasculature, ו ONH41,42.

השימוש בבעלי חיים דורש תקנות אתיות אינטנסיביות ומפורטות, מחויבות פיננסית גבוהה ושחזור יעיל43. לאחרונה, הנחיות רבות אחרות התפתחו לשימוש אתי בבעלי חיים במחקר ניסיוני44,45,46. חלופה לניסויים בבעלי חיים היא שימוש במודלים של עיניים אנושיות ex vivo כדי לחקור פתוגנזה מחלות וניתוח פוטנציאלי של תרופות להגנה על נזק ONH. רקמה אנושית לאחר המוות היא משאב בעל ערך לחקר פרדיגמות מחלות אנושיות, במיוחד במקרה של מחלות ניווניות אנושיות, מכיוון שזיהוי תרופות פוטנציאליות שפותחו במודלים של בעלי חיים דורש את הצורך להיות מתורגם לבני אדם47. רקמת התורם האנושי ex vivo כבר בשימוש נרחב לחקר הפרעות אנושיות47,48,49, ומערכות תרבות איברים מגזרי קדם אנושי סיפקו בעבר מודל ex vivo ייחודי לחקור את הפתופיזיולוגיה של IOP50,51,52.

כדי לחקור לחץ טרנסלמינארי הקשור ל- IOP ו- ICP בעיני האדם, עיצבנו ופיתחנו בהצלחה מערכת אוטונומית טרנסלמינארית דו-תאית (TAS) שיכולה לווסת באופן עצמאי את IOP ו- ICP באמצעות מקטעים אחוריים מעיני תורם אנושי. זהו המודל האנושי ex vivo הראשון לחקור לחץ טרנסלמינאר ולנצל את ההשפעות הביומכניות של TLPG על ONH.

מודל זה של Ex vivo אנושי TAS יכול לשמש כדי לגלות ולסווג שינויים תאיים ותפקודיים המתרחשים עקב העלאה כרונית של IOP או ICP. בדוח זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול שלב אחר שלב של ניתוח, הגדרה וניטור של מודל המקטע האחורי האנושי של TAS. הפרוטוקול יאפשר לחוקרים אחרים לשחזר ביעילות את מודל הקטע האחורי האנושי החדש הזה של ex vivo כדי לחקור פתוגנזה של מחלות ביומכניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

העיניים הושגו על פי הוראות הצהרת הלסינקי למחקר הנוגע לרקמת אדם.

הערה: עיניים מבנקים עיניים מכובדים (למשל, מכון עיניים אריות להשתלה, מחקר, טמפה FL) נקצרו בתוך 6-12 שעות של מוות סרום תורם נבדק עבור הפטיטיס B, הפטיטיס C, ווירוס כשל חיסוני אנושי 1 ו -2. ברגע שהם התקבלו, העיניים נותחו והוקמו במודל TAS בתוך 24 שעות. קריטריוני אי-הכללה כללו כל פתולוגיה עינית. העיניים לא הוחרגו על סמך גיל, גזע או מין. כדי להבטיח את הכדאיות של הרשתית עם קבלתה, explants רשתית נקצרו מתורמי הרקמות ותרברב במשך 7 ו -14 ימים (איור משלים 1). רשתיות אלה היו גם מנותקות וגדלו RGCs בריאים בתרבות במשך 7 ימים עם כתמים חיוביים עבור סמן RGC, חלבון מחייב RNA עם splicing מרובים (RBPMS), כמו גם מכתים שרשרת אור neurofilament חיובי (NEFL) כתמים neurofilaments שלהם (איור 2 משלים). .

1. הכנה ועיקור של ציוד ואספקה

  1. עיין ברשימת החומרים לקבלת רשימה מלאה של החומרים הדרושים וכן למספרי ספקים וקטלוגים.
  2. לפני השימוש, לעקר את כל הציוד והמכשירים על ידי autoclaving או באמצעות אמפולות תחמוצת אתילן.

2. הכנת מדיום זלוף

  1. הוסיפו 1% פניצילין סטרפטומיצין (10,000 פניצילין U/mL, 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-0.85% NaCl) ו-1% L-גלוטמין (200 מ"ר) עד 1,000 מ"ל גלוקוז גבוה של Dulbecco שונה בגודל בינוני (DMEM).
  2. לחטא את מדיום זלוף על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.

3. מערך מערכת אוטונומית טרנסלמינארית (TAS)

  1. הגדר מזרקי זרימה (מאגרי IOP ו- ICP).
    1. הוסף 30 מ"ל של מדיום זלוף (סעיף 2) למזרק 30 מ"ל. צרף עצירה תלת-כיוונית למזרק 30 מ"ל. צרף מסנן הידרופילי 0.22 מיקרומטר לעצירה תלת כיוונית. חבר מתאם ספח 15 G Luer למסנן ההידרופילי 0.22 מיקרומטר.
    2. הסר בועות אוויר מהגדרת המזרק. חברו צינורות למתאם 15 G Luer Stub. סגור את היציאה הצדדית של הסטופקוק עם מכסה מנעול אוניברסלי שלא הומצא. חזור על הפעולה עבור שתי הגדרות בסך הכל.
    3. סמן מזרק אחד כלחץ תוך גולגולתי של ערוץ 1 (CH1 ICP) והמזרק השני כלחץ תוך עיני של ערוץ 2 (CH2 IOP).
  2. הגדר מזרקי זרימה (מאגרי IOP ו- ICP).
    1. צרף עצירה תלת-כיוונית למזרק של 30 מ"ל. חבר מתאם ספח 15 G Luer לתחנה תלת-כיוונית. חברו צינורות למתאם 15 G Luer Stub.
    2. סגור את היציאה הצדדית של הסטופקוק עם מכסה מנעול אוניברסלי שלא הומצא. חזור על הפעולה עבור שתי הגדרות בסך הכל. סמן מזרק אחד כ- CH1 ICP ואת המזרק השני כ- CH2 IOP.

4. הכנת כדור הארץ כולו האנושי

הערה: אם מתקבלות עיניים שלמות, בצע את ההליך שלהלן כדי להפריד את המקטע הקדמי מהקטע האחורי של העין. אם העיניים מתקבלות חוצה, להתחיל בשלב 4.4.

  1. מניחים עין שלמה לתוך פתרון פוידון-יוד במשך 2 דקות.
  2. יש לשטוף את העין בתמיסה סטרילית של פוספט (PBS) כדי לשטוף את הפובידון-יוד. חזור פעמיים.
  3. הסר את adnexa מכל כדור העין באמצעות מלקחיים ומספריים. חתחו את העין בקו המשווה כדי להפריד בין המקטעים הקדמיים והאחוריים של העין.
  4. הסר את נדן עצב הראייה. הסר את ההומור הזגג מהקטע האחורי.
  5. גזור סקלרה נוספת ממקטע אחורי, במידת הצורך, כדי להבטיח התאמה טובה בכיפה העגולה של תא IOP (התחתון). באמצעות מלקחיים, ודא כי הרשתית מפוזרת באופן שווה על החלק האחורי של המקטע.
  6. הגדרת תא IOP (תחתון)
    1. מקם את המקטע האחורי האנושי לתוך תא IOP (התחתון) של TAS מעל הכיפה העגולה עם עצב הראייה מול החלק העליון.
    2. אטמו את המקטע האחורי באמצעות טבעת השרף אפוקסי עם ארבעה ברגים, והבטיחו אטם הדוק.
    3. הכנס את הצינורות ליציאות IN ו- OUT של תא IOP (התחתון). מזרק הזרימה של IOP עם צינורות המכילים מדיום מוכנס ליציאת IN ומזרק היציאה הריק של IOP עם צינורות מוכנס ליציאת OUT.
    4. השתמש בשיטת הדחיפה / משיכה כדי להחדיר לאט את מדיום ההזדוה ליציאת הזרימה כדי למלא את העין האחורית ובו זמנית מושך לאט את המדיום זלוף החוצה דרך המזרק החוצה כדי להסיר את כל בועות האוויר מן הקווים. להפסיק להחדיר מדיום פעם הן IN ו OUT צינורות ריקים של בועות אוויר.
    5. תנעלו את העצירה במצב כבוי. הסר את המזרק 30 מ"ל מהרכבת מסנן היציאה IOP IN ומלא מחדש ב- 30 מ"ל של בינוני. החלף את המזרק של 30 מ"ל בהרכבה של המסנן.
  7. הגדרת תא ICP (למעלה)
    1. הנח את התא /מכסה של ICP (עליון) מעל החלק האחורי של המקטע האחורי. ודא כי עצב הראייה נמצא בתוך התא העליון. לאטום את התא העליון עם ארבעה ברגים.
    2. הכנס את הצינורות ליציאות IN ו- OUT של תא ICP (למעלה). מזרק הזרימה של ICP עם צינורות המכילים מדיום מוכנס ליציאת IN ומזרק היציאה הריק של ICP עם צינורות מוכנס ליציאת OUT.
    3. החדירו בעדינות ובאיטיות את המדיום ליציאת IN כדי למלא את תא ה-ICP ולהסיר בועות אוויר מהקווים בשיטת הדחיפה/משיכה. הפסק להחדיר מדיום פעם תא ICP, כמו גם צינורות IN ו- OUT הם ריקים של בועות אוויר.
    4. תנעלו את העצירה במצב כבוי. הסר את המזרק של 30 מ"ל מה- ICP בהרכבה של מסנן היציאה ומלא מחדש ב- 30 מ"ל של בינוני. החלף את המזרק של 30 מ"ל בהרכבה של המסנן.

5. הגדרת מערכת הקלטת נתונים

הערה: מערכת הקלטת הנתונים מורכבת ממקור כוח בן 8 ערוצים, מגבר גשר רב ערוצי, מתמרים ללחץ הידרוסטטי ומחשב עם תוכנת רכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). להלן תיאורים של אופן ההגדרה וכיול המערכת.

  1. חבר את כבל החשמל לחלק האחורי של מקור החשמל בן 8 הערוצים וחבר להתקן גיבוי סוללה.
  2. חבר את כבל ה- USB ממקור החשמל בן 8 הערוצים לחלק האחורי של המחשב.
  3. חבר את מקור החשמל בן 8 הערוצים למגבר הגשר הרב-ערוצי באמצעות כבל I2C שסופק.
  4. חבר את כבלי כידון ניל-קונסלמן (BNC) לכניסות הערוץ מול מקור הכוח בן 8 הערוצים וסוף הכבלים לערוצים המתאימים בחלק האחורי של המגבר הרב-ערוצי.
  5. חבר את כבלי המתמר לחזית המגבר הרב-ערוצי.
  6. התקן את תוכנת רכישת הנתונים במחשב.
    1. הפעל את מתקין התקנת התוכנה לרכישת נתונים מתקליטור התוכנה שסופק.
    2. בצע את ההוראות המופיעות על מסך המחשב.
    3. לאחר השלמת ההתקנה, בחר סיום.
  7. הפעל את מקור הכוח בן 8 הערוצים.
  8. הפעל את המחשב ופעיל את תוכנת רכישת הנתונים.
    1. בחירת | קבצים חדש.
    2. בחר | התקנה הגדרות ערוץ. בחר שלושה ערוצים (מימין למטה למסך). בעמודה כותרת ערוץ שנה את שם הערוצים באופן הבא: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. בחר 2 mV עבור הטווח בכל הערוצים. בעמודה חישוב בחר ללא חישוב עבור ערוצים 1 ו- 2.
    4. בעמודה חישוב בחר אריתמטי עבור ערוץ 3. במקטע נוסחה : בחר ערוצים/CH2; בחר חשבון "-"; בחר ערוצים/CH1. במקטע פלט בחר mmHg. בחר אישור. בחר שוב אישור .
  9. תקימו וכיילו את מתמרי הלחץ ההידרוסטטיים.
    הערה: יש לכייל מתמרי לחץ הידרוסטטיים לפני ניסויים בשיטה הבאה.
    1. חבר את מתמרי הלחץ ההידרוסטטיים לקווי המתמר המחוברים למגבר הגשר הרב-ערוצי.
    2. חבר מזרק 30 מ"ל מלא באוויר ליציאה הצדדית של מתמר הלחץ CH1 (ICP). חבר את ה- sphygmomanometer לתחתית מתמר הלחץ CH1 (ICP).
    3. בתרשים, הצג את הדף של תוכנת רכישת הנתונים, הגדר את מהירות הדגימה על-ידי לחיצה שמאלית על החץ לצד זמן הדגימה ובחר 100. לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני באזור CH1 (ICP) של הדף.
    4. בחר מגבר גשר. בחר מסנן ראשי. בחר אפס והמתן עד שהמערכת תתאפס, תוך דאגה לא להזיז את מתמר הלחץ.
    5. צבוט את הכרטיסיות הלבנות של מתמר הלחץ ולדחוף אוויר דרך המתמר עד 40 מ"מ כ"ג מתקבל על sphygmomanometer. שחררו את הכרטיסיות הלבנות והסירו את המזרק והפיגמומנומטר.
    6. בדף המרת יחידות , בחר 'מינוס (-)'. הדגש את הרמה הגבוהה ביותר כדי לציין 40 מ"מ כ"ג. לחץ על החץ עבור נקודה 1 והזן 40.
    7. סמן את הרמה הנמוכה ביותר כדי לציין 0 מ"מ כ"ג. לחץ על החץ עבור נקודה 2 והזן 0. בחר mmHg עבור היחידות. בחר אישור.
    8. בחר אישור (עמוד מגבר גשר). חזור על שלבים 9.1-9.7 עבור CH2 (IOP) באמצעות 100 מ"מ כ"ג לרמה הגבוהה ביותר ו- 0 לרמה הנמוכה ביותר.
  10. חבר את יחידת המקטע TAS/אחורי למערכת רכישת הנתונים.
    1. מקם את יחידת המקטע TAS /אחורי לתוך אינקובטור (37 °C (37 °C, 5% CO2). חבר את צינורות ICP מיציאת OUT למתמר הלחץ CH1 (ICP).
    2. חבר את צינורות IOP מיציאת OUT למתמר הלחץ CH2 (IOP).
    3. חבר את הגדרות המזרק (ICP ו- IOP) עם בינוני מיציאות IN למעמד הטבעת.
    4. בדף תצוגת תרשים בחר התחל דגימה. הגדר את מהירות הדגימה על-ידי לחיצה שמאלית על החץ לצד זמן הדגימה ובחר איטי ודקה אחת.
    5. התאם את המזרקים על הטבעת לעמוד למעלה או למטה כדי לווסת את לחצי ICP ו- IOP לדרישות פרוטוקול.
    6. בצע חידוש מערכתי של בינוני במערכת כל 48-72 שעות באמצעות שיטת הדחיפה והמשיכה.

6. אחזור וניתוח נתונים

  1. פתח את קובץ הנתונים בתוכנת רכישת הנתונים.
  2. במקטע לוח נתונים , לחץ על סמל הוספה מרובה למשטח נתונים . יופיע חלון חדש.
    1. במקטע חפש שימוש בחר שעה מהתפריט הנפתח.
    2. במקטע בחר בחר שעה אחת כל שעה מהתפריטים הנפתחים.
    3. במקטע שלב דרכה בחר קובץ שלם ולאחר מכן לחץ על הוסף.
  3. במקטע לוח נתונים לחץ על סמל תצוגת לוח נתונים . סמן את כל הנתונים והעתק/הדבק בגיליון אלקטרוני.
  4. חשב את הממוצע ואת סטיות התקן עבור IOP, ICP ו- TLPG עבור כל 24 שעות. איסוף הנתונים באמצעות אפשרות טבלת הציר בתוכנית גיליון אלקטרוני ובגרף.

7. אימונוהיסטוכימיה והמטוקסילין והכתמת אאוזין של מקטעים אחוריים

  1. הסר את מקטעי העיניים האחוריים בעקבות נקודות זמן שונות מדגם TAS ותקן פורמלין לפני paraffinizing.
  2. תחלק את העיניים כדי לייצר מישורי רקמת קשת.
  3. דפראפין להפוך את פלחי פרפין משובץ עם 100% קסילן, 95% אתנול, 50% תמיסת אתנול.
  4. לשטוף את השקופיות עם PBS במשך 10 דקות ולחסום עם חוצץ חסימה בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
  5. מקטעי תוויות עם נוגדנים עיקריים: סמן אנטי קולגן IV (מטריצה חוץ-תאית (ECM), NB120-6586, 1:100) ואנטי למינין (סמן ECM, NB300-144, 1:100, אנטי RBPMS (סמן RGC), GTX118619, 1:50).
  6. זהה את הנוגדנים העיקריים באמצעות נוגדנים משניים Alexa Fluor (אלכסה פלור 488 אנטי ארנב עז, A11008, 1:500).
  7. תטעה את גרעיני התא באמצעות פתרון נגד עמעום DAPI.
  8. צלם תמונות של המקטעים המוכתמים ותמונות הפאזה עם עדשות אובייקטיביות 4x ו- 10x באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלה של חומרים).
  9. להכתמת המטוקסילין ואוסין (H&E), עבדו את המקטעים במערכת כתמים אוטומטית (ראו טבלת חומרים) לדפראפיזציה באמצעות 100%, קסילן 95% אתנול, 50% תמיסת אתנול וכתם עם H&E.
  10. צלם תמונות באמצעות עדשות המטרה 4x ו- 10x באמצעות מיקרוסקופ עם מקור אור שדה בהיר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תכנון ויצירה של המערכת האוטונומית הטרנסלמינרית
דיפרנציאל לחץ טרנסלמינארי הוא מנגנון מפתח פוטנציאלי בפתוגנזה של מחלות שונות, כולל גלאוקומה. השימושים במודל המתואר כוללים, אך אינם מוגבלים, את המחקר של גלאוקומה (IOP גבוה, אולי ירידה ICP), פגיעה מוחית טראומטית (ICP גבוה), וחשיפה ארוכת טווח לליקוי ראייה הקשור מיקרו-כבידה (ICP גבוה, IOP גבוה). כדי לסייע בגילוי פתוגנזה מולקולרית המתמקדת בלחץ טרנסלמינארי בעין האנושית, עיצבנו, יצרנו ואימתנו את מודל ה- TAS. המודל האנושי החדש שלנו ex vivo נותן מערכת פרה-אקלינית ייחודית ללמוד באופן עצמאי שינויים פתוגניים הקשורים ל- ICP ו- IOP. כדי לטפל ביישומים פרה-אקליניים אנושיים, המודל שלנו מספק פרדיגמה ex vivo של לימוד פתוגנזה עקב שינויים בלחץ טרנסלמינארי. עיצוב הדגם האטום מתואר עם תצוגות קדמיות ושקופות מלאות (איור 1A, 1B) עם תצוגה דיאגרמתית מפורטת של המודל כדי לתאר את כל יציאות הזרימה והזרימה (איור 1C). התצוגה השקופה בצבע עם מקטע אחורי אנושי בדגם מודפס בתלת-ממד מוצגת בפועל (איור 1D, 1E).

מערכת אוטונומית טרנסלמינארית: מודל לחץ טרנסלמינארי חדש של ex vivo
יצרנו את מודל ה- TAS עם שני תאים אוטונומיים (כלומר, תאי IOP ו- ICP). בבסיס התחתון של הדגם, הכוס האחורית האנושית הונחה מעל הכיפה העגולה עם עצב הראייה הפונה למעלה. ברגע שהכוס האחורית הונחה ונאטמה בתא IOP, הנחנו את תא ICP על גבי העצב. שמרנו על עצמאות שני התאים ועל חותם מושלם באמצעות טבעות O שמתאימות לכל תא בדיוק (איור 2A). התא התחתון או תא IOP מילאו ורגולציה הלחץ בכוס, בעוד התא העליון להתאים סביב עצב הראייה מווסת את ICP סביב העצב באמצעות מאגרי לחץ הידרוסטטיים. באמצעות המודל, אנחנו באופן עצמאי מווסת IOP ו- ICP באמצעות לחץ הידרוסטטי. ההבדל בין שני התאים זוהה כשינוי בשיפוע הלחץ הטרנסלמינארי (איור 2B). הדגם המתואר עם כל האבזור הסופי במקום, כולל מזרקי הזרימה וההזרמה המחוברים, מוצג באיור 2C.

תרבות מוצלחת ותחזוקת לחץ במערכת האוטונומית הטרנסלמינרית
כדי להבטיח ששני התאים יתעבדו באופן עצמאי במערכת, ויסינו מספר הפרשי לחץ על ידי שמירה על תא IOP ו- ICP בהפרשי לחץ ממוצעים שונים (TLPG רגיל: IOP: ICP, 15:5 מ"מ כ"ג; TLPG מוגבה >10 מ"מ כ"ג; TLPG מוגבה >20 מ"מ/ג' ). בתחילה בדקנו את התחזוקה של הפרשי לחץ נורמליים ממוצעים בשני התאים (IOP/ICP רגיל) באמצעות פרמטרים שונים ושונים של תנאי IOP ו- ICP: 1) IOP רגיל: ICP ירד (איור 3A); 2) IOP מוגבר: ICP ירד (איור 3B); ו-3) IOP מוגבה: ICP מוגבה (איור 3C). IOP נורמלי הממוצע נע בין 10-21 מ"מ (לחץ ורידים אפיסקלרלי בחשבון) ו- ICP נורמלי מ 5-15 מ"מ כ"ג. במקום המגבלה של חוסר לחץ וסקולרי, עדיין שמרנו על הלחץ לשיעורים אלה, שכן הרעיון היה להפעיל את הלחץ המקסימלי ב- ONH. אנחנו באופן עצמאי מווסת רמות לחץ שונות בשני התאים (ICP, 5-10 מ"מ כ"ג; IOP, 20-40 מ"מ כ"ג). כדי להבטיח תחזוקת לחץ בין שני התאים, שמרנו על IOP בתנאים רגילים (15 מ"מ/ג') וירידה ב-ICP (4 מ"מ/ג') כדי לקיים TLPG (IOP-ICP) בין ה-LC של 11 מ"מ ליש"ט (איור 3A). לאחר מכן הגבינו את ה-IOP (43 מ"מ/ג') והפחתנו את ה-ICP (3 מ"מ/ג') (איור 3B) ולבסוף הגבינו את הלחצים בשניהם (IOP, 64 מ"מ/ג'; ICP, 9 מ"מ/ג'י) כדי ליצור את הרמה הגדולה ביותר של TLPG במהירות של 55 מ"מ ל"ג (איור 3C). כדי להבטיח את הכדאיות של הרקמה (איור 4), המדיום ברקמות הוחלף כל 48 שעות על ידי חיבור מזרק ריק לעצירת היציאה ודחיפה איטית של כ -5 מ"ל של מדיום זלוף דרך יציאת הזרימה באמצעות שיטת הדחיפה / משיכה. עליות לחץ מינימליות התרחשו בזמן חילופים בינוניים (איור 4G) ולא השפיעו על המורפולוגיה של ה-ONH כפי שמוצג בנתוני האימונוהיסטוכימיה של 14 ו-30 יום (איור 4A–F). כדי לאשר שאנחנו יכולים לתרבות מקטעים אחוריים עבור מסגרות זמן מורחבות עם כדאיות יעילה בתוך מודל TAS, ניתחנו חתך רוחב של ONH לאחר תחזוקה של IOP ו- ICP רגילים במשך 14 ו -30 ימים. הצלחנו לתרבות בהצלחה מקטעים אלה במודל במשך 14 יום (איור 4A, 4B) עם תאי ONH בריאים וביטוי מטריצה חוץ-תאי של קולגן IV (COLIV) בראש עצב הראייה (איור 4C). הכדאיות והתחזוקה הדומות של המקטע האחורי נצפו גם במשך 30 יום (איור 4D, 4E) עם ביטוי של COLIV ו- DAPI (איור 4F). הייצוג הגרפי של ערכי TLPG (IOP-ICP) (איור 4G) מתאר תחזוקה מתמדת של ערכי IOP לאורך זמן ב- 15.6 ± 4.6 מ"מ ו- ICP ממוצע ב- 11.0 ± 4.6 מ"מ/שעה למשך 30 יום עם TLPG של 4.6 ± 1.3 מ"מ לגר (טבלה 1).

שינויים מורפולוגיים בשיפוע לחץ טרנסלמינארי מוגבר של ONH
תכונה קלינית נפוצה של גלאוקומה של מחלה נוירודגנרטיבית הקשורה לגיל היא כוסות ONH. כוסות Prelaminar נבדל על ידי אובדן הדרגתי של רקמות עצביות prelaminar, אשר מגביר הן את העומק והן את הרוחב של הכוס ובכך מגדיל את יחס לדיסק. כוסות למינאר מבוססות רקמת חיבור, כאשר ה-LC נע בהדרגה בחפירה. כוסות גלאוקומה הוא שילוב של שני רכיבים אלה, המשקף הן נזק ושיפוץ של רקמות חיבור למינאר. העלאת ה-IOP מובילה לעיבוי LC עקב עלייה במסת פרברי הקולגן53. תוך שימוש במודל TAS, יצרנו TLPG מוגבה על ידי הגדלת IOP או הפחתת ICP על פני נקודות זמן שונות. שמרנו על טווח של TLPG מוגבה במשך 7 ימים עם ערכי IOP ממוצעים לאורך זמן ב 22.8 ± 18.6 מ"מ/ג' ו-ICP ממוצע ב-6.9 ± 7.6 מ"מ/ג' עם TLPG של 15.9 ± 11.8 מ"מ ל"ג (טבלה 2). TLPGs הגבוה ביותר תועדו ב 36 מ"מ כ"ג. לאחר מכן נותחו מקטעים אחוריים אנושיים לצורך עיבוי הדרגתי של קרני למינאר וכיסות ב-ONH באזורים מוכתמים ב-H&E ככל שהזמן התקדם בין שליטה, יום אחד, שלושה ימים ו-7 ימים תחת TLPG מוגבה (איור 5A–D). כוסות ותחבוי נצפו ב-7 ימים של TLPG מוגבה (איור 5D). יתר על כן, ביטוי קוליב לאורך זמן בין שליטה, יום אחד, 3 ימים ו-7 ימים הראה קורות מעובבות וביטוי מוגבר ב-7 ימים (איור 5E–H). תמונות פאזה המשווה רקמת בקרה שאינה בתרבית במודל TAS (איור 5I) ו- 7 ימים (איור 5J) של TLPG מוגבה במודל TAS מציגות RGCs בריאים בתוך ה- GCL (איור 5I) ללא כוסות (איור 5I) עבור הפקד, בעוד שתחת תנאים של TLPG מוגבה התמונות מראות כוסות נרחבות ללא סמן RBPMS-RGC שנותר ב- RNFL (איור 5J) ושיפוץ מוגבר של ECM כפי שמוצג על ידי COLIV מוגבה בתוך ONH (איור 5 ג').

Figure 1
איור 1: מערכת אוטונומית טרנסלמינארית. תיאור מודל. (A) תצוגה קדמית מוצקה. (ב) תצוגה שקופה. (ג) תצוגה דיאגרמתית. (D) תצוגה שקופה בצבע. (ה) דגם מודפס בתלת-ממד בפועל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מכניקה של המערכת האוטונומית הטרנסלמינרית. (A) מודל TAS עם תאי ICP ו- IOP לוויסות הפרשי לחץ טרנסלמינאריים. (ב) תיאור של מודל TAS עם רגולציה אוטונומית של לחץ הידרוסטטי בשני התאים באמצעות הגבהת המאגרים. (ג) תמונה של מודל TAS עם כל האבזור במקום וייצוג של מזרקי מאגר הזרימה והזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תחזוקת לחץ עצמאית בתוך המערכת האוטונומית הטרנסלמינרית. ייצוג גרפי של לחצים מווסתים באופן עצמאי, ולחצים יציבים נשמרים בתאים העליונים (ICP) והתחתון (IOP) עם (A) IOP רגיל /ICP מופחת (B) IOP גבוה / ICP מופחת, ו- (C) IOP גבוה / ICP מוגבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תחזוקה ושמיה של מקטעים אחוריים במערכת האוטונומית הטרנסלמינרית. מקטעים אחוריים אנושיים היו תרבותיים באמצעות מודל TAS במשך 14 ו 30 ימים בתנאים רגילים של IOP ו- ICP. H&E מוכתם חתך רוחב של ONH אנושי ב 14 ימים (A) הגדלה נמוכה (40x) ו (B) הגדלה גבוהה (100x). (C) COLIV החיסוני עם ביטוי DAPI (100x). תיאורים דומים של כתמי H&E ב-30 יום ב-(D) 40x ו-(E) 100x מיקרוגרפים ו-(F) COLIV המחסן בביטוי DAPI (100x). ז) מצגת גרפית של Δ ב mmHg של IOP-ICP (TLPG) עבור מקטעים אחוריים אנושיים מתוחזק במשך 30 ימים בתרבות. קוליב = ירוק; DAPI = כחול; (א, תכשיר ב);" (D, inset E); H&E = המטוקסילין וכתם אאוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ארגון מחדש מורפולוגי של ראש עצב הראייה לאחר שיפוע לחץ טרנסלמינארי גבוה במערכת האוטונומית הטרנסלמינארית. מקטעים אחוריים אנושיים היו תרבותיים באמצעות מודל TAS עבור נקודות זמן שונות בתנאי TLPG גבוהים. חתך רוחב של ONH אנושי המתאר כתמי H&E של (A) שליטה (B) יום אחד ב- TAS (C) 3 ימים ב- TAS, ו- (D) 7 ימים של תרבות. ביטוי של קוליב עם DAPI ב- ONH של (E) שליטה (F) יום אחד ב- TAS (G) 3 ימים ב- TAS, ו- (H) 7 ימים בתרבות. תמונות חתך ONH של (I) שולטות ב- ONH המתארות (I') כתמי רשתית של RBPMS ו- (I'') מכתימים ONH עם COLIV ו- DAPI. ניגודיות שלב של (J) 7 ימים של TLPG מוגבה ב- TAS עם ets המתארים (J') כתמי רשתית של RBPMS ו - (J'') מכתימים ONH עם COLIV ו- DAPI. קוליב, RBPMS = ירוק; DAPI = כחול; (A-D) הגדלה של פי 40; (E-H) הגדלה של פי 100; (אני ו- J) הגדלה 200x; (J') הגדלה של פי 400; (J'') הגדלה של פי 100; (J, inset J 'ו J''); H&E = המטוקסילין וכתם אאוזין; TAS = מערכת אוטונומית טרנסלמינארית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ימים IOP ממוצע של 24 שעות ממוצע ICP של 24 שעות ממוצע TLPG (IOP-ICP)
1 17.7 12.1 5.7
2 20.0 15.0 5.0
3 13.4 9.6 3.7
4 15.1 10.5 4.5
5 11.6 8.3 3.3
6 14.0 9.5 4.5
7 17.2 13.8 3.4
8 19.3 16.1 3.2
9 17.7 15.0 2.8
10 10.9 8.0 2.9
11 16.3 10.2 6.1
12 14.7 11.8 2.9
13 7.5 4.5 3.0
14 5.5 1.4 4.1
15 13.5 8.3 5.2
16 15.4 10.3 5.1
17 11.7 4.5 7.3
18 13.3 9.3 4.0
19 23.5 19.7 3.8
20 20.3 14.5 5.7
21 12.8 5.8 7.0
22 25.8 19.9 5.9
23 19.3 13.5 5.8
24 18.8 15.1 3.7
25 14.4 8.9 5.5
AVG 15.6 11.0 4.6
STD 4.6 4.6 1.3

טבלה 1: תחזוקה של TLPG רגיל מתוחזק במשך 30 ימים. ערכים טבלאיים המתארים ערכי IOP, ICP ו- TLPG כל 24 שעות עם ממוצע וסטיית תקן במהלך קורס הזמן המלא.

ימים IOP ממוצע של 24 שעות ממוצע ICP של 24 שעות ממוצע TLPG של 24 שעות
1 4.1 -1.0 5.1
2 6.3 1.1 5.3
3 13.4 4.0 9.4
4 19.0 1.1 17.9
5 55.6 19.5 36.2
6 39.5 12.8 26.7
7 21.5 10.8 10.6
AVG 22.8 6.9 15.9
STD 18.6 7.6 11.8

טבלה 2: תחזוקה של מגוון של TLPG מוגבה מתוחזק במשך 7 ימים. ערכים טבלאיים המתארים ערכי IOP, ICP ו- TLPG כל 24 שעות עם ממוצע וסטיית תקן במהלך קורס הזמן המלא.

איור משלים 1: תרבות האקס ויוו אנושית. ניגודיות פאזה, תמונות מוכתמות חיוביות של RGC (RBPMS-green) ותמונות תאיות (DAPI-blue) של explants ברשתית בתרבות למשך (A-C) למשך 7 ימים ו-(D-F) 14 ימים (הגדלה של פי 200). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 2: תרבויות RGC למבוגרים אנושיים. סמן RGC (RBPMS-ירוק) ו- DAPI (כחול) מוכתמים RGCs 7 ימים בתרבות (A) 200x (B) 400x הגדלה. (C) RGCs מוכתמים עבור NEFL (ירוק) ו- DAPI (כחול) בהגדלה של פי 400. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רקמות אנושיות לאחר המוות הן משאב בעל ערך מיוחד לחקר מחלות ניווניות אנושיות מכיוון שזיהוי תרופות פוטנציאליות שפותחו במודלים של בעלי חיים צריך להיות מתורגם לבני אדם47. ההשפעות של העלאת IOP אנושית מבוססות היטב, אבל מחקר מינימלי בוצע על שינויים חריגים בלחץ TRANSLAMINAR ONH. למרות שקיימים מספר מודלים של בעלי חיים ומודלים סופיים של ONH אנושי, אין מודל אנושי ex vivo לחקר שינויים בלחץ טרנסלמינארי41,54,55,56,57. קיים צורך בלתי ממומש עדכני למודל אנושי פרה-אקליני חדש שיכול להתמקד באטיולוגיה של מחלות אקס ויו באמצעות IOP ו- ICP ויכול לזהות פרדיגמות פתוגניות שונות הקשורות לפתוגנזה גלאוקומה. הבנת שינויים פתולוגיים הקשורים ללחץ ב- ONH תהיה חיונית למניעת מוות של RGC. השימוש המשולב ב- IOP, ICP ו- TLPG במודל TAS הוא גישה ייחודית לחקר ניוון תלוי לחץ באופן פרה-אקליני המשתמש ברקמת מקטע אחורי אנושי. במודל TAS, אנו יכולים לתרבות מקטעים אחוריים של כוסות עיניים אנושיות כדי לחקור שינויים של לחץ טרנסלמינארי באמצעות רגולציה אוטונומית של תאי IOP ו- ICP. הוא מספק בסיס לפיתוח מגוון חדש של טיפוליות המתמקדות בלחץ טרנסלמינארי כמנגנון של ניוון.

הגדרת מודל TAS דורשת תשומת לב לפרטים בהיבטים רבים: הניתוח הנכון של המקטעים האחוריים האנושיים, המבטיח שהרשתית נמצאת בשלמותה ומתפרסת על הכוס האחורית, מיקום נכון של המקטע מעל כיפת תא IOP, מיקום מדויק של תא ICP מעל ON, איטום יעיל של שני התאים, ותחזוקת לחצים הידרוסטטיים באופן עצמאי על ידי ויסות הגובה של מאגרי IOP ו- ICP. ניתוח צריך להתבצע בעיניים כי הם לא יותר מ 24-36 שעות לאחר המוות, כי הרשתית מתדרדרת בהדרגה אם מדיום תרבות יעיל אינו מתחדש. חידוש מערכתי של מדיום בוצע במערכת שלנו כל 48-72 שעות. היבט מכריע נוסף של המערכת הוא אורך ה- ON. זה קריטי כדי להבטיח כי לפחות 0.5-1 ס"מ של ON נשאר על העין cadaveric. אין להשתמש בעיני התורם אם יש להן או-תאי זמן קצרים, ה- ON פגום, הגלובוס נפגע ומנוטרל, או נדן ON מנותק. יתר על כן, בעת הצבת המקטע האחורי מעל הכיפה, O-טבעת חייבת להיות בכושר הדוק במקום ואת תא ICP העליון אטום כראוי עם ברגים. אביזרי ההצמדה שבהם הצינורות מתחברים בכל צד של הבסיס העליון והתחתון של הדגם צריכים גם הם להיבדק כדי להבטיח שהצינורות מתאימים וננעלים במקום. אם הצינורות אינם במקומם כראוי, בועות אוויר נצפו בתוך הצינורות ויפגעו במדידות הלחץ בתוך כל תא.

תחזוקה ושמיה של המקטעים האחוריים לאחר המוות במודל TAS שלנו היה דאגה קריטית לפרוטוקול זה. רקמת האדם לאחר המוות נחקרה בעבר בהרחבה48,49, עם מחקר RNA שנערך לאחרונה של 1,068 רקמות תורם לאחר המוות המאשר כי רקמת המוח האנושית שלאחר המוות שנאספה במשך עשרות שנים יכולה לשמש כחומר באיכות גבוהה לחקר הפרעות אנושיות47. בנוסף, בעבר בהצלחה ביטוי פרופיל של רקמות העין תורם אנושי העין לאחר המוות בוצע58. ביטוי גנים ערכי PLIER עבור גנים אפופטוזיס היו מינימליים או לא קיים בערכת נתונים זו עבור רקמת רשתית 6 h לאחר המוות58. יתר על כן, הוכח כי אחסון היפותרמי של רקמת העין יכול להתבצע ביעילות59. הוכח כי פעילות תא גנגליון נשמרת במשך 50 שעות כאשר עיניים מיניפיג מאוחסנות בתנאים איסכמיים והיפותרמיים41,60. לכן, השתמשנו בנקודת הזמן של 6 שעות כקריטריוני ההכללה שלנו לאיסוף עיניים תורם. מהירות ההידרדרות לאחר המוות של מקטעים אחוריים וניתוק רשתית חסרה בספרות, אך ההשתתפות שלנו בתוך 6 שעות, מסירה מעל קרח, ומערך תרבות של מקסימום 36 שעות הוא גם בטווח של כדאיות רקמות כפי שמתואר איור משלים 1 ו איור משלים 2. באמצעות מודל TAS, השגנו בהצלחה תחזוקה בריאה של רקמות במשך 30 יום.

מגבלה נוספת של מודל TAS היא חוסר היכולת הנוכחית שלנו לדגמן את המקצבים הביולוגיים המחזוריים של ICP ו- IOP שנצפים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. זה יכול להיות מטופל בעתיד באמצעות משאבה שיכולה לווסת IOP קצבי עירוי ICP. יתר על כן, אזהרה נוספת למודל היא חוסר זרימת הדם בתוך העין הקדווית. לכן, ההשפעות של לחץ דם לא ניתן ללמוד, אבל זה גם מאפשר לנו במיוחד להתוות את ההשפעות הפתוגניות של שינויים TLPG בלבד, כולל IOP ו- ICP.

היקף עתידי של המודל ישלב אוטומציה של מערכות המאגר לשינויים הידרוסטטיים ושיפוע של בינוני באמצעות משאבת עירוי עם מזרק ריק יציאה על המתמר במקום סבבים מרובים של שינוי בינוני שיושמו בפרוטוקול זה. ניתן גם לאסוף ולנתח את הנוזל ממאגר IOP ו- ICP. ניתן לאסוף מדיום עבור ביטוי סמן ביולוגי כדי להתמקד בטאיפים עתידיים. אנו יכולים גם לזהות מסלולים או מולקולות שניתן לטפל בהם בתרופות או בטיפול גנטי ולבדוק טיפולים אלה במודלים שונים של בעלי חיים של ICP לפני התרגום לניסויים קליניים בבני אדם.

לסיכום, המודל שלנו לא רק מספק בסיס אנושי של בדיקות, אבל זה יכול גם להיות מנוצל כדי לאמת את הניתוחים שיכולים למקד שינויי לחץ translaminar בעין. היא פותחת שדרה לביצוע רפואה מדויקת באמצעות השתלת תאי גזע של מטופלים על משקפי עיניים של תורמים אנושיים ולחיצתם במודל ה- TAS. זה מאפשר לנו לבדוק את המטפלים ex vivo עם היכולת להיות מתורגם למרפאה וניתן להתייחס לאנשים חיים. עם המודל שלנו אנו יכולים כעת להעריך את השינויים המתרחשים בלחץ טרנסלמינארי וכיצד הוא ממלא תפקיד מכריע בפתוגנזה הקשורים למחלות טראומטיות ונוירודגנרטיביות שונות. זה יוביל להבנה טובה יותר של מנגנונים מולקולריים פתוגניים ב- ONH הקשורים ל- IOP ו- ICP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברי כתב היד אין ניגוד אינטרסים פוטנציאלי לחשוף.

Acknowledgments

המימון לפרויקט זה היה באמצעות כספים לפי שיקול דעתה של ד"ר קולין מ. מקדואל. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, Inc. למחלקת UW מדיסון לרפואת עיניים ומדעי הראייה. אנו מודים לד"ר אבוט פ. קלארק ווימינג מאו על הסיוע הטכני שלהם במודל תרבות האיברים. אנו מודים למכון העיניים של האריות להשתלה ומחקר (טמפה, FL) על מתן עיני התורם האנושי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		 Amazon B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) Amazon B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle Vitality Medical 302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap QOSINA 2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver Brikksen Stainless Steel Fastners PPMSSSCH4C.5  
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE Fisher Scientific NC9085343  
Betadine Purdue PUR1815001EACH  
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167-100EA  
Corning L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS Med Plus Medical Supply COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) Katena K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps F.S.T. 11254-20
Eye Scissors Standard Curved Katena K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes Capitol Scientific 351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers Fisher Scientific 16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium Fisher Scientific SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution Fisher Scientific SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear Qosina 28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate AD instruments DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box Jenson Global JG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscope Keyence B2-X710
LabChart 8 AD instruments LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer Leica ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White QOSINA 65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228) AD instruments FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508) AD instruments PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male McMAster-Carr 7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe McMAster-Carr 51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. Fisher Scientific 14-171-268
Superblock T20 Fisher Scientific PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T. 14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved Katena K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS) University of North Texas Health Science Center N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		 Marco Rubber & Plastics B1000-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 158 לחץ תוך עיני לחץ תוך גולגולתי שיפוע לחץ טרנסלמינארי תאי גנגליון רשתית ראש עצב הראייה תרבות איברי זלוף
מודל מערכת אוטונומית טרנסלמינארית לאפנולציה של לחץ תוך עיני ותוך גולגולתי במקטעים האחוריים של התורם האנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, T. P., Curry, S. M.,… More

Sharma, T. P., Curry, S. M., Lohawala, H., McDowell, C. Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments. J. Vis. Exp. (158), e61006, doi:10.3791/61006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter