Summary
Descriviamo e dettagliamo l'uso del sistema autonomo translaminare. Questo sistema utilizza il segmento posteriore umano per regolare in modo indipendente la pressione all'interno del segmento (intraoculare) e che circonda il nervo ottico (intracranico) per generare un gradiente di pressione translaminare che imita le caratteristiche della neuropatia ottica glaucomatosa.
Abstract
C'è un bisogno attualmente insoddisfatto di un nuovo modello umano preclinico in grado di indirizzare l'eziologia della malattia ex vivo utilizzando la pressione intracranica (ICP) e la pressione intraoculare (IOP) in grado di identificare vari paradigmi patogenetici correlati alla patogenesi del glaucoma. I modelli di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore anteriore umano ex vivo sono stati precedentemente utilizzati e applicati con successo come tecnologie efficaci per la scoperta della patogenesi del glaucoma e la sperimentazione di terapie. Lo screening preclinico dei farmaci e la ricerca condotta su sistemi di organi umani ex vivo possono essere più traducibili nella ricerca clinica. Questo articolo descrive in dettaglio la generazione e il funzionamento di un nuovo modello di pressione translaminare umana ex vivo chiamato sistema autonomo translaminare (TAS). Il modello TAS può regolare in modo indipendente ICP e IOP utilizzando segmenti posteriori di donatori umani. Il modello consente di studiare la patogenesi in modo preclinico. Può ridurre l'uso di animali vivi nella ricerca oftalmica. A differenza dei modelli sperimentali in vitro, la struttura, la complessità e l'integrità del tessuto della testa del nervo ottico (ONH) possono anche essere mantenute all'interno del modello TAS ex vivo.
Introduction
Stime globali in recenti sondaggi suggeriscono che 285 milioni di persone vivono con disabilità visive, tra cui 39 milioni che sono ciechi1. Nel 2010, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha documentato che tre delle nove principali cause di cecità elencate si verificano nel segmento posteriore dell'occhio1. Le malattie oculari del segmento posteriore coinvolgono la retina, la coroide e il nervo ottico2. La retina e il nervo ottico sono estensioni del sistema nervoso centrale (SNC) del cervello. Gli assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono vulnerabili ai danni perché escono dall'occhio attraverso la testa del nervo ottico (ONH) per formare il nervo ottico3. L'ONH rimane il punto più vulnerabile per gli assoni RGC a causa della rete 3D dei fasci di tessuto connettivo chiamata lamina cribrosa (LC)4. L'ONH è il sito iniziale di insulto agli assoni RGC nel glaucoma5,6,7, e i cambiamenti di espressione genica all'interno dell'ONH sono stati studiati nei modelli di ipertensione oculare e glaucoma8,9,10. Gli assoni RGC sono sensibili all'ONH a causa dei differenziali di pressione tra il compartimento intraoculare, chiamato pressione intraoculare (IOP), e all'interno dello spazio subaracnoideo perioptico esterno, chiamato pressione intracranica (ICP)11. La regione LC separa entrambe le aree, mantenendo normali differenziali di pressione, con IOP che vanno da 10-21 mmHg e ICP da 5-15 mmHg12. La differenza di pressione attraverso la lamina tra le due camere è chiamata gradiente di pressione translaminare (TLPG)13. Un importante fattore di rischio del glaucoma è l'elevata IOP14.
L'aumento della IOP aumenta la deformazione all'interno e attraverso la regione laminare6,15,16. Osservazioni sperimentali nell'uomo e modelli animali presentano l'ONH come il sito iniziale del danno assonale17,18. Il paradigma biomeccanico dello stress correlato alla IOP e del ceppo che causa danni glaucomatosi all'ONH influenza anche la fisiopatologia del glaucoma19,20,21. Anche se nell'uomo i cambiamenti indotti dalla pressione danneggiano meccanicamente gli assoni RGC22, i roditori privi di placche collagenose all'interno della lamina possono anche sviluppare il glaucoma7,23. Inoltre, la IOP elevata rimane il fattore di rischio più importante nei pazienti con glaucoma primario ad angolo aperto, mentre i pazienti con glaucoma a tensione normale sviluppano neuropatia ottica glaucomatosa anche senza IOP elevata. Inoltre, ci sono anche un sottogruppo di pazienti ipertesi oculari che non mostrano danni al nervo ottico. È stato anche suggerito che la pressione del liquido cerebrospinale (CSFp) possa svolgere un ruolo nella patogenesi del glaucoma. L'evidenza indica che l'ICP è abbassato a ~ 5 mmHg nei pazienti con glaucoma rispetto agli individui normali, causando così un aumento della pressione translaminare e svolgendo un ruolo cruciale nella malattia24,25. In precedenza, è stato dimostrato in un modello canino, che controllando i cambiamenti IOP e CSFp, ci possono essere grandi spostamenti del disco ottico26. L'innalzamento della CSFp negli occhi suini ha anche mostrato un aumento dello sforzo principale all'interno della regione LC e del tessuto neurale retrolaminare. L'aumento della tensione sugli RGC e sulla regione LC contribuisce al blocco del trasporto assonale e alla perdita di RGC27. La progressiva degenerazione degli RGC è stata associata alla perdita del supporto trofico28,29, alla stimolazione dei processi infiammatori/regolazione immunitaria30,31 e agli effettori apoptotici29,32,33,34,35. Inoltre, la lesione assonale (Figura 3) provoca effetti dannosi sugli RGC, innescando il fallimento rigenerativo36,37,38,39. Anche se gli effetti della IOP sono stati ben studiati, sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare. La maggior parte dei trattamenti per il glaucoma si concentra sulla stabilizzazione della IOP. Tuttavia, anche se l'abbassamento della IOP rallenta la progressione della malattia, non inverte la perdita del campo visivo e previene la perdita completa di RGC. Comprendere i cambiamenti neurodegenerativi legati alla pressione nel glaucoma sarà fondamentale per prevenire la morte di RGC.
Le prove attuali indicano che le modulazioni della pressione translaminare dovute a vari cambiamenti meccanici, biologici o fisiologici in pazienti affetti da disabilità visive traumatiche o neurodegenerative possono causare una significativa perdita della vista. Attualmente, non esiste un vero modello preclinico del segmento posteriore umano che possa consentire lo studio del danno biomeccanico glaucomatoso all'interno dell'ONH umano ex vivo. L'osservazione e il trattamento del segmento posteriore dell'occhio è una sfida enorme in oftalmologia27. Esistono barriere fisiche e biologiche per colpire l'occhio posteriore, tra cui alti tassi di eliminazione, barriera emato-retinica e potenziali risposte immunologiche40. La maggior parte dei test di efficacia e sicurezza per nuovi bersagli farmacologici sono realizzati utilizzando modelli cellulari e animali in vivo in vitro41. L'anatomia oculare è complessa e gli studi in vitro non imitano accuratamente le barriere anatomiche e fisiologiche presentate dai sistemi di modelli tissutali. Anche se i modelli animali sono una necessità per gli studi di farmacocinetica, la fisiologia oculare dell'occhio posteriore umano può variare tra le varie specie animali, tra cui l'anatomia cellulare della retina, la vascolarizzazione e l'ONH41,42.
L'uso di animali vivi richiede norme etiche intensive e dettagliate, un elevato impegno finanziario e un'efficace riproducibilità43. Recentemente, sono seguite molte altre linee guida per l'uso etico degli animali nella ricerca sperimentale44,45,46. Un'alternativa alla sperimentazione animale è l'uso di modelli di occhio umano ex vivo per studiare la patogenesi della malattia e la potenziale analisi dei farmaci per proteggere i danni da ONH. Il tessuto umano post mortem è una risorsa preziosa per lo studio dei paradigmi delle malattie umane, soprattutto nel caso delle malattie neurodegenerative umane, perché l'identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali richiede la necessità di essere traducibili all'uomo47. Il tessuto del donatore umano ex vivo è stato ampiamente utilizzato per lo studio dei disturbi umani47,48,49 e i sistemi di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore umano hanno precedentemente fornito un modello ex vivo unico per studiare la fisiopatologia di IOP50,51,52 elevati.
Per studiare la pressione translaminare correlata a IOP e ICP negli occhi umani, abbiamo progettato e sviluppato con successo un sistema autonomo translaminare a due camere (TAS) in grado di regolare in modo indipendente IOP e ICP utilizzando segmenti posteriori dagli occhi dei donatori umani. È il primo modello umano ex vivo a studiare la pressione translaminare e sfruttare gli effetti biomeccanici del TLPG sull'ONH.
Questo modello TAS umano ex vivo può essere utilizzato per scoprire e classificare le modificazioni cellulari e funzionali che si verificano a causa dell'elevazione cronica della IOP o dell'ICP. In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo passo-passo di dissezione, impostazione e monitoraggio del modello del segmento posteriore umano TAS. Il protocollo consentirà ad altri ricercatori di riprodurre efficacemente questo nuovo modello di segmento posteriore umano pressurizzato ex vivo per studiare la patogenesi delle malattie biomeccaniche.
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Protocol
Gli occhi sono stati ottenuti secondo le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki per la ricerca che coinvolge tessuti umani.
NOTA: gli occhi di banche oculari affidabili (ad esempio, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) sono stati raccolti entro 6-12 ore dalla morte e il siero del donatore è stato testato per l'epatite B, l'epatite C e il virus dell'immunodeficienza umana 1 e 2. Una volta ricevuti, gli occhi sono stati sezionati e impostati nel modello TAS entro 24 ore. I criteri di esclusione includevano qualsiasi patologia oculare. Gli occhi non sono stati esclusi in base all'età, alla razza o al sesso. Per garantire la vitalità della retina al ricevimento, gli espianti retinici sono stati prelevati dai donatori di tessuto e coltivati per 7 e 14 giorni (Figura supplementare 1). Queste retine sono state anche dissociate e sono cresciute RGC sane in coltura per 7 giorni con colorazione positiva per il marcatore RGC, proteina legante l'RNA con splicing multiplo (RBPMS), nonché colorazione positiva della catena leggera del neurofilamento (NEFL) nei loro neurofilamenti (Figura supplementare 2). .
1. Preparazione e sterilizzazione di attrezzature e forniture
- Fare riferimento alla Tabella dei materiali per un elenco completo delle forniture richieste, nonché i numeri di fornitore e di catalogo.
- Prima dell'uso, sterilizzare tutte le apparecchiature e gli strumenti in autoclave o utilizzando fiale di ossido di etilene.
2. Preparazione del mezzo di perfusione
- Aggiungere l'1% di penicillina streptomicina (10.000 U / mL di penicillina, 10.000 μg / mL di streptomicina in 0,85% NaCl) e l'1% di L-glutammina (200 mM) a 1.000 ml di glucosio alto Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
- Sterilizzare il mezzo di perfusione passando attraverso un filtro da 0,22 μm.
3. Configurazione del sistema autonomo translaminare (TAS)
- Impostare le siringhe di afflusso (serbatoi IOP e ICP).
- Aggiungere 30 mL del mezzo di perfusione (paragrafo 2) a una siringa da 30 mL. Attaccare un rubinetto a 3 vie alla siringa da 30 ml. Collegare un filtro idrofilo da 0,22 μm al rubinetto a 3 vie. Collegare un adattatore per stub Luer da 15 G al filtro idrofilo da 0,22 μm.
- Rimuovere le bolle d'aria dalla configurazione della siringa. Collegare il tubo all'adattatore per stub Luer da 15 G. Chiudere la porta laterale del rubinetto con un tappo di blocco universale non ventilato. Ripetere l'operazione per un totale di due configurazioni.
- Etichettare una siringa come pressione intracranica del canale 1 (CH1 ICP) e l'altra siringa come pressione intraoculare del canale 2 (CH2 IOP).
- Impostare siringhe di deflusso (serbatoi IOP e ICP).
- Attaccare un rubinetto a 3 vie a una siringa da 30 ml. Collegare un adattatore per stub Luer da 15 G al rubinetto a 3 vie. Collegare il tubo all'adattatore per stub Luer da 15 G.
- Chiudere la porta laterale del rubinetto con un tappo di blocco universale non ventilato. Ripetere l'operazione per un totale di due configurazioni. Etichettare una siringa come CH1 ICP e l'altra siringa come CH2 IOP.
4. Preparazione del globo oculare umano intero
NOTA: se vengono ricevuti occhi interi, seguire la procedura riportata di seguito per separare il segmento anteriore dal segmento posteriore dell'occhio. Se gli occhi vengono ricevuti in due, iniziare dal passaggio 4.4.
- Mettere un occhio intero nella soluzione di povidone-iodio per 2 minuti.
- Risciacquare l'occhio in soluzione tampone fosfato sterile (PBS) per risciacquare il povidone-iodio. Ripeti 2 volte.
- Rimuovere gli annessi da tutto il globo oculare usando pinze e forbici. Taglia in due l'occhio all'equatore per separare i segmenti anteriore e posteriore dell'occhio.
- Rimuovere la guaina del nervo ottico. Rimuovere l'umore vitreo dal segmento posteriore.
- Tagliare la sclera aggiuntiva dal segmento posteriore, se necessario, per garantire una buona aderenza alla cupola rotonda della camera IOP (inferiore). Usando la pinza, assicurarsi che la retina sia distribuita uniformemente sulla parte posteriore del segmento.
- Configurazione della camera IOP (inferiore)
- Posizionare il segmento posteriore umano nella camera IOP (inferiore) del TAS sopra la cupola rotonda con il nervo ottico rivolto verso l'alto.
- Sigillare il segmento posteriore utilizzando l'O-ring in resina epossidica con quattro viti, garantendo una tenuta ermetica.
- Inserire il tubo nelle porte IN e OUT della camera IOP (inferiore). La siringa di afflusso IOP con il mezzo contenente tubi viene inserita nella porta IN e la siringa di deflusso IOP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
- Utilizzare il metodo push/pull per infondere lentamente il mezzo di perfusione nella porta di afflusso per riempire la oculare posteriore e contemporaneamente estrarre lentamente il mezzo di perfusione attraverso la siringa di deflusso per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle linee. Interrompere l'infusione del mezzo una volta che entrambi i tubi IN e OUT sono privi di bolle d'aria.
- Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 mL dal gruppo filtro della porta IOP IN e ricaricarla con un totale di 30 mL di mezzo. Sostituire la siringa da 30 mL sul gruppo filtro.
-
Configurazione della camera ICP (superiore)
- Posizionare la camera/coperchio ICP (superiore) sul retro del segmento posteriore. Assicurarsi che il nervo ottico si trovi all'interno della camera superiore. Sigillare la camera superiore con quattro viti.
- Inserire il tubo nelle porte IN e OUT della camera ICP (superiore). La siringa di afflusso ICP con supporto contenente tubi viene inserita nella porta IN e la siringa di deflusso ICP vuota con tubo viene inserita nella porta OUT.
- Infondere delicatamente e lentamente il mezzo nella porta IN per riempire la camera ICP e rimuovere le bolle d'aria dalle linee utilizzando il metodo push/pull. Interrompere l'infusione del mezzo una volta che la camera ICP e sia il tubo IN che OUT sono privi di bolle d'aria.
- Blocca i rubinetti in posizione off. Rimuovere la siringa da 30 mL dall'ICP nel gruppo filtro porta e ricaricarla con un totale di 30 mL di mezzo. Sostituire la siringa da 30 mL sul gruppo filtro.
5. Configurazione del sistema di registrazione dei dati
NOTA: il sistema di registrazione dei dati è composto da una fonte di alimentazione a 8 canali, un amplificatore a ponte multicanale, trasduttori di pressione idrostatici e un computer con software di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali). Di seguito viene descritto come impostare e calibrare il sistema.
- Collegare il cavo di alimentazione alla parte posteriore della fonte di alimentazione a 8 canali e collegarlo a un dispositivo di backup della batteria.
- Collegare il cavo USB dalla fonte di alimentazione a 8 canali sul retro del computer.
- Collegare la fonte di alimentazione a 8 canali all'amplificatore a ponte multicanale utilizzando il cavo I2C in dotazione.
- Collegare i cavi Bayonet Neill-Concelman (BNC) agli ingressi del canale di fronte alla fonte di alimentazione a 8 canali e l'estremità dei cavi ai canali corrispondenti nella parte posteriore dell'amplificatore multicanale.
- Collegare i cavi del trasduttore alla parte anteriore dell'amplificatore multicanale.
- Installare il software di acquisizione dati sul computer.
- Eseguire il programma di installazione del software di acquisizione dati dal CD del software in dotazione.
- Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo del computer.
- Al termine dell'installazione, selezionare Fine.
- Accendere la fonte di alimentazione a 8 canali.
- Accendere il computer e avviare il software di acquisizione dati.
- Seleziona file | Nuovo.
- Seleziona | di installazione Impostazioni canale. Seleziona tre canali (in basso a sinistra dello schermo). Nella colonna Titolo canale rinominare i canali come segue: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Selezionare 2 mV per l'intervallo su tutti i canali. Nella colonna Calcolo selezionare Nessun calcolo per i canali 1 e 2.
- Nella colonna Calcolo selezionare Aritmetica per il canale 3. Nella sezione Formula : Selezionare canali/CH2; Selezionare l'aritmetica "-"; Selezionare canali/CH1. Nella sezione Output selezionare mmHg. Selezionare OK. Selezionare di nuovo OK .
- Impostare e calibrare i trasduttori di pressione idrostatici.
NOTA: i trasduttori di pressione idrostatici devono essere calibrati prima degli esperimenti utilizzando il seguente metodo.- Collegare i trasduttori di pressione idrostatici alle linee dei trasduttori collegati all'amplificatore a ponte multicanale.
- Collegare una siringa da 30 mL riempita d'aria alla porta laterale del trasduttore di pressione CH1 (ICP). Collegare lo sfigmomanometro alla parte inferiore del trasduttore di pressione CH1 (ICP).
- Nel grafico, visualizzare la pagina del software di acquisizione dati, impostare la velocità di campionamento facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla freccia accanto al tempo di campionamento e selezionare 100. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse nell'area CH1 (ICP) della pagina.
- Selezionare Bridge Amp. Selezionare Filtro di rete. Selezionare Zero e attendere che il sistema si azzeri, facendo attenzione a non muovere il trasduttore di pressione.
- Pizzicare le linguette bianche del trasduttore di pressione e spingere l'aria attraverso il trasduttore fino a ottenere 40 mmHg sullo sfigmomanometro. Rilasciare le linguette bianche e rimuovere la siringa e lo sfigmomanometro.
- Nella pagina Conversione unità , seleziona il segno "meno (-)". Evidenziare il plateau più alto per indicare 40 mmHg. Fate clic sulla freccia per il punto 1 e immettete 40.
- Evidenziare il plateau più basso per indicare 0 mmHg. Fate clic sulla freccia per il punto 2 e immettete 0. Selezionare mmHg per le unità. Selezionare OK.
- Selezionare OK (pagina Bridge Amp). Ripetere i passaggi 9,1-9,7 per CH2 (IOP) utilizzando 100 mmHg per il plateau più alto e 0 per il plateau più basso.
- Collegare l'unità TAS/segmento posteriore al sistema di acquisizione dati.
- Posizionare l'unità TAS/segmento posteriore in un incubatore (37 °C, 5% CO2). Collegare il tubo ICP dalla porta OUT al trasduttore di pressione CH1 (ICP).
- Collegare il tubo IOP dalla porta OUT al trasduttore di pressione CH2 (IOP).
- Collegare le configurazioni della siringa (ICP e IOP) con il supporto dalle porte IN al supporto dell'anello.
- Nella pagina Visualizzazione grafico selezionare Avvia campionamento. Imposta la velocità di campionamento facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla freccia accanto al tempo di campionamento e seleziona Lento e 1 minuto.
- Regolare le siringhe sull'anello in piedi verso l'alto o verso il basso per regolare le pressioni ICP e IOP in base ai requisiti del protocollo.
- Eseguire il rifornimento sistemico del mezzo nel sistema ogni 48-72 ore attraverso il metodo push and pull.
6. Recupero e analisi dei dati
- Aprire il file di dati nel software di acquisizione dati.
- Nella sezione Data Pad , fare clic sull'icona Aggiungi più a Data Pad . Apparirà una nuova finestra.
- Nella sezione Trova utilizzando selezionare Ora dal menu a discesa.
- Nella sezione Seleziona selezionare 1 ora ogni 1 ora dai menu a discesa.
- Nella sezione Passaggio selezionare Intero file, quindi fare clic su Aggiungi.
- Nella sezione Data Pad fare clic sull'icona Data Pad View . Evidenzia tutti i dati e copia/incolla in un foglio di calcolo.
- Calcola le deviazioni medie e standard per IOP, ICP e TLPG per ogni 24 ore. Raccogli i dati utilizzando l'opzione tabella pivot in un programma e grafico per fogli di calcolo.
7. Immunoistochimica e colorazione di ematossilina ed eosina dei segmenti posteriori
- Rimuovere i segmenti oculari posteriori seguendo vari punti temporali dal modello TAS e fissarli in formalina prima della paraffinazione.
- Sezionare gli occhi per produrre piani di tessuto sagittale.
- Deparaffinizzare i segmenti incorporati in paraffina con una soluzione di etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 50%.
- Lavare le diapositive con PBS per 10 minuti e bloccare con un tampone di blocco a temperatura ambiente per 1 ora.
- Etichette di sezioni con anticorpi primari: anti-collagene IV (marcatore Extracellular Matrix (ECM), NB120-6586, 1:100) e anti-laminina (marcatore ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcatore RGC), GTX118619, 1:50).
- Rileva gli anticorpi primari utilizzando gli anticorpi secondari Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit, A11008, 1:500).
- Controbattere i nuclei cellulari usando la soluzione anti-dissolvenza DAPI.
- Cattura le immagini delle sezioni colorate e delle immagini di fase con lenti obiettivo 4x e 10x usando un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
- Per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E), elaborare le sezioni in un sistema di colorazione automatizzato (vedere Tabella dei materiali) per la deparaffinazione utilizzando una soluzione di etanolo al 100%, xilene 95%, etanolo al 50% e colorazione con H & E.
- Cattura immagini con le lenti obiettivo 4x e 10x utilizzando un microscopio con una sorgente luminosa a campo luminoso.
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Representative Results
Progettazione e realizzazione del sistema autonomo translaminare
Il differenziale di pressione translaminare è un potenziale meccanismo chiave nella patogenesi di varie malattie, incluso il glaucoma. Gli usi per il modello descritto includono, ma non sono limitati a, lo studio del glaucoma (IOP elevata, forse ICP diminuita), lesioni cerebrali traumatiche (ICP elevato) ed esposizione a lungo termine alla compromissione visiva associata alla microgravità (ICP elevato, IOP elevato). Per aiutare a scoprire la patogenesi molecolare mirata alla pressione translaminare nell'occhio umano, abbiamo progettato, creato e convalidato il modello TAS. Il nostro nuovo modello umano ex vivo fornisce un sistema preclinico unico per studiare in modo indipendente i cambiamenti patogeni associati a ICP e IOP. Per affrontare le applicazioni precliniche umane, il nostro modello fornisce un paradigma ex vivo di studio della patogenesi dovuta alle variazioni di pressione translaminari. Il design del modello sigillato è rappresentato con viste frontali solide e trasparenti (Figura 1A, 1B) con una vista diagrammatica dettagliata del modello per rappresentare tutte le porte di afflusso e deflusso (Figura 1C). Viene mostrata la vista trasparente a colori con un segmento posteriore umano in un modello stampato in 3D reale (Figura 1D, 1E).
Sistema autonomo translaminare: un nuovo modello di pressione translaminare umana ex vivo
Abbiamo generato il modello TAS con due camere autonome (cioè camere IOP e ICP). Nella base inferiore del modello, la coppa posteriore umana è stata posizionata sopra la parte superiore della cupola rotonda con il nervo ottico rivolto verso l'alto. Una volta che la coppa posteriore è stata posizionata e sigillata nella camera IOP, abbiamo posizionato la camera ICP sopra il nervo. Abbiamo mantenuto l'indipendenza di entrambe le camere e una tenuta perfetta utilizzando O-ring che si adattano con precisione a ciascuna camera (Figura 2A). La camera inferiore o la camera IOP riempivano e regolavano la pressione nella tazza, mentre la camera superiore si adattava al nervo ottico e regolava l'ICP attorno al nervo attraverso serbatoi di pressione idrostatica. Utilizzando il modello, abbiamo regolato in modo indipendente IOP e ICP utilizzando la pressione idrostatica. La differenza tra le due camere è stata identificata come un cambiamento nel gradiente di pressione translaminare (Figura 2B). Il modello raffigurato con tutti i raccordi finali in posizione, comprese le siringhe del serbatoio di afflusso e deflusso collegate, è mostrato nella Figura 2C.
Mantenimento efficace della coltura e della pressione nel sistema autonomo translaminare
Per garantire che entrambe le camere funzionassero in modo indipendente nel sistema, abbiamo regolato diversi differenziali di pressione mantenendo la camera IOP e l'ICP a diversi differenziali di pressione medi (TLPG normale: IOP: ICP, 15:5 mmHg; TLPG elevato >10 mmHg; TLPG elevato >20 mmHg). Inizialmente abbiamo testato il mantenimento dei differenziali di pressione normali medi in entrambe le camere (IOP / ICP normale) attraverso vari parametri diversi di condizioni IOP e ICP: 1) IOP normale: diminuzione ICP (Figura 3A); 2) IOP elevata: diminuzione dell'ICP (Figura 3B); e 3) IOP elevata: ICP elevato (Figura 3C). La IOP normale media varia da 10-21 mmHg (pressione venosa episclerale fattorizzata) e ICP normale da 5-15 mmHg. Invece della limitazione di non avere pressione vascolare, abbiamo comunque mantenuto la pressione a questi tassi, poiché l'idea era di esercitare la pressione massima all'ONH. Abbiamo regolato in modo indipendente vari livelli di pressione in entrambe le camere (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20-40 mmHg). Per garantire il mantenimento della pressione tra le due camere, abbiamo mantenuto la IOP in condizioni normali (15 mmHg) e diminuito l'ICP (4 mmHg) per sostenere un TLPG (IOP-ICP) tra l'LC di 11 mmHg (Figura 3A). Abbiamo quindi elevato IOP (43 mmHg) e diminuito ICP (3 mmHg) (Figura 3B) e infine aumentato le pressioni in entrambi (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) per generare il più grande livello di TLPG a 55 mmHg (Figura 3C). Per garantire la vitalità del tessuto (Figura 4), il mezzo nei tessuti è stato scambiato ogni 48 ore attaccando una siringa vuota al rubinetto di deflusso e spingendo lentamente circa 5 ml di mezzo di perfusione attraverso la porta di afflusso utilizzando il metodo push/pull. Aumenti minimi di pressione si sono verificati al momento dello scambio del mezzo (Figura 4G) e non hanno influenzato la morfologia dell'ONH come mostrato nei dati di immunoistochimica a 14 e 30 giorni (Figura 4A-F). Per confermare che potremmo coltivare segmenti posteriori per intervalli di tempo estesi con un'effettiva vitalità all'interno del modello TAS, abbiamo analizzato le sezioni trasversali dell'ONH dopo il mantenimento della normale IOP e ICP per 14 e 30 giorni. Siamo stati in grado di coltivare con successo questi segmenti nel modello per 14 giorni (Figura 4A, 4B) con cellule ONH sane ed espressione della matrice extracellulare di collagene IV (COLIV) alla testa del nervo ottico (Figura 4C). Una simile vitalità e mantenimento del segmento posteriore è stata osservata anche per 30 giorni (Figura 4D, 4E) con espressione di COLIV e DAPI (Figura 4F). La rappresentazione grafica dei valori TLPG (IOP-ICP) (Figura 4G) mostra un mantenimento costante dei valori IOP nel tempo a 15,6 ± 4,6 mmHg e ICP medio a 11,0 ± 4,6 mmHg per 30 giorni con un TLPG di 4,6 ± 1,3 mmHg (Tabella 1).
Cambiamenti morfologici al gradiente di pressione translaminare elevato post ONH
Una caratteristica clinica comune del glaucoma della malattia neurodegenerativa legata all'età è la coppettazione ONH. La coppettazione prelaminare si distingue per la progressiva perdita di tessuti neurali prelaminari, che aumenta sia la profondità che la larghezza della tazza e quindi aumenta il rapporto tazza-disco. La coppettazione laminare è basata sul tessuto connettivo, con la LC che si muove posteriormente progressivamente e scava. La coppettazione glaucomatosa è una combinazione di questi due componenti, che riflette sia il danno che il rimodellamento dei tessuti connettivi laminari. L'aumento della IOP porta all'ispessimento della LC a causa di un aumento della massa delle fibrille di collagene53. Utilizzando il modello TAS, abbiamo creato un TLPG elevato aumentando la IOP o diminuendo l'ICP su vari punti temporali. Abbiamo mantenuto un intervallo di TLPG elevato per 7 giorni con valori IOP medi nel tempo a 22,8 ± 18,6 mmHg e media ICP a 6,9 ± 7,6 mmHg con un TLPG di 15,9 ± 11,8 mmHg (Tabella 2). I TLPG più alti sono stati documentati a 36 mmHg. I segmenti posteriori umani sono stati quindi analizzati morfologicamente per l'ispessimento progressivo dei fasci laminari e la coppettazione all'ONH in sezioni colorate H & E man mano che il tempo progrediva tra il controllo, 1 giorno, 3 giorni e 7 giorni sotto TLPG elevato (Figura 5A-D). La coppettazione e l'ispessimento sono stati osservati a 7 giorni di TLPG elevato (Figura 5D). Inoltre, l'espressione di COLIV nel tempo tra il controllo, 1 giorno, 3 giorni e 7 giorni ha mostrato fasci ispessiti e un aumento dell'espressione di 7 giorni (Figura 5E-H). Le immagini di fase che confrontano il tessuto di controllo non coltivato nel modello TAS (Figura 5I) e 7 giorni (Figura 5J) di TLPG elevato all'interno del modello TAS mostrano RGC sani all'interno del GCL (Figura 5I) senza coppettazione (Figura 5I) per il controllo, mentre in condizioni di TLPG elevato le immagini mostrano un'ampia coppettazione senza RGC rimanenti (marcatore RBPMS-RGC) nell'RNFL (Figura 5J) e un maggiore rimodellamento dell'ECM come mostrato da COLIV elevato all'interno del ONH (Figura 5J).
Figura 1: Sistema autonomo translaminare. Rappresentazione del modello. (A) Solida vista frontale. (B) Vista trasparente. (C) Vista diagrammatica. (D) Vista trasparente a colori. (E) Modello stampato in 3D effettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Meccanica del sistema autonomo translaminare. (A) Il modello TAS con camere ICP e IOP per la regolazione dei differenziali di pressione translaminare. (B) Rappresentazione del modello TAS con regolazione autonoma della pressione idrostatica in entrambe le camere attraverso l'elevazione dei serbatoi. (C) Immagine del modello TAS con tutti i raccordi in posizione e rappresentazione delle siringhe del serbatoio di afflusso e deflusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Mantenimento indipendente della pressione all'interno del sistema autonomo translaminare. Rappresentazione grafica delle pressioni modulate in modo indipendente e pressioni stabili mantenute nelle camere superiore (ICP) e inferiore (IOP) con (A) IOP normale / ICP diminuito (B) IOP elevato / ICP diminuito e (C) IOP elevato / ICP elevato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Manutenzione e vitalità dei segmenti posteriori all'interno del sistema autonomo translaminare. I segmenti posteriori umani sono stati coltivati utilizzando il modello TAS per 14 e 30 giorni in condizioni normali di IOP e ICP. Sezioni trasversali colorate H&E di ONH umano a 14 giorni in (A) basso ingrandimento (40x) e (B) alto ingrandimento (100x). (C) Coliv immunocolorante con espressione DAPI (100x). Rappresentazioni simili di colorazione H&E a 30 giorni in micrografie (D) 40x e (E) 100x e (F) immunocolorazione COLIV con espressione DAPI (100x). G) Presentazione grafica di Δ in mmHg di IOP-ICP (TLPG) per segmenti posteriori umani mantenuti per 30 giorni in coltura. COLIV = verde; DAPI = blu; (A, inserto B); (D, inserto E); H&E = colorazione di ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Ristrutturazione morfologica della testa del nervo ottico dopo elevato gradiente di pressione translaminare nel Sistema Autonomo Translaminare. I segmenti posteriori umani sono stati coltivati utilizzando il modello TAS per vari punti temporali in condizioni TLPG elevate. Sezioni trasversali di ONH umano raffiguranti colorazione H&E di (A) controllo (B) 1 giorno in TAS (C) 3 giorni in TAS e (D) 7 giorni di cultura. Espressione di COLIV con DAPI nell'ONH di (E) controllo (F) 1 giorno in TAS (G) 3 giorni in TAS e (H) 7 giorni in coltura. Immagini della sezione trasversale ONH a contrasto di fase di (I) controllo ONH raffigurante (I') colorazione della retina di RBPMS e (I'') colorazione ONH con COLIV e DAPI. Contrasto di fase di (J) 7 giorni di TLPG elevato in TAS con inserti raffiguranti (J') colorazione della retina di RBPMS e (J'') colorazione ONH con COLIV e DAPI. COLIV, RBPMS = verde; DAPI = blu; (A–D) ingrandimento 40x; (E–H) Ingrandimento 100x; (I e J) ingrandimento 200x; (J') ingrandimento 400x; (J'') ingrandimento 100x; (J, inserto J' e J''); H&E = colorazione di ematossilina ed eosina; TAS = Sistema autonomo translaminare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Giorni | IOP medio di 24 h | ICP medio di 24 h | TLPG medio (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| MEDIO | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| STD | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabella 1: Mantenimento del normale TLPG mantenuto per 30 giorni. Valori tabulari che rappresentano i valori IOP, ICP e TLPG ogni 24 ore con deviazione media e standard nel corso dell'intero percorso.
| Giorni | IOP medio di 24 h | ICP medio di 24 h | TLPG medio di 24 h |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| MEDIO | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| STD | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabella 2: Mantenimento di un intervallo di TLPG elevato mantenuto per 7 giorni. Valori tabulari che rappresentano i valori IOP, ICP e TLPG ogni 24 ore con deviazione media e standard nel corso dell'intero percorso.
Figura supplementare 1: Coltura di espianto retinico umano ex vivo. Contrasto di fase, immagini colorate RGC positive (RBPMS-verde) e cellulari (DAPI-blu) di espianti retinici in coltura per (A-C) 7 giorni e (D-F) 14 giorni (ingrandimento 200x). Fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: Colture RGC adulte umane. Marcatore RGC (RBPMS-verde) e DAPI (blu) RGC colorati 7 giorni in coltura (A) ingrandimento 200x (B) 400x. (C) RGC colorati per NEFL (verde) e DAPI (blu) con ingrandimento 400x. Fare clic qui per scaricare questa figura.
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Discussion
I tessuti umani post mortem sono una risorsa particolarmente preziosa per lo studio delle malattie neurodegenerative umane, poiché l'identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali deve essere traducibile per l'uomo47. Gli effetti dell'elevazione della IOP umana sono ben consolidati, ma sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare dell'ONH. Anche se esistono più modelli animali e modelli finiti di ONH umano, non esiste un modello umano ex vivo per studiare le variazioni di pressione translaminare41,54,55,56,57. Esiste un bisogno attualmente insoddisfatto di un nuovo modello umano preclinico in grado di indirizzare l'eziologia della malattia ex vivo utilizzando IOP e ICP e in grado di identificare vari paradigmi patogenetici correlati alla patogenesi del glaucoma. Comprendere i cambiamenti patologici legati alla pressione presso l'ONH sarà fondamentale per prevenire la morte di RGC. L'uso combinato di IOP, ICP e TLPG all'interno del modello TAS è un approccio unico per studiare la degenerazione dipendente dalla pressione in modo preclinico utilizzando il tessuto del segmento posteriore umano. Nel modello TAS, possiamo coltivare segmenti posteriori di oculari umani per studiare i cambiamenti della pressione translaminare attraverso la regolazione autonoma delle camere IOP e ICP. Fornisce una base per lo sviluppo di una nuova gamma di terapie che si concentrano sulla pressione translaminare come meccanismo di degenerazione.
L'impostazione del modello TAS richiede attenzione ai dettagli in molti aspetti: la corretta dissezione dei segmenti posteriori umani, assicurando che la retina sia intatta e diffusa sulla coppa posteriore, il corretto posizionamento del segmento sopra la cupola della camera IOP, la posizione accurata della camera ICP sopra l'ON, la sigillatura efficace di entrambe le camere, e mantenimento delle pressioni idrostatiche in modo indipendente regolando l'altezza dei serbatoi IOP e ICP. La dissezione deve essere eseguita in occhi che non superano le 24-36 ore post mortem, perché la retina si deteriora progressivamente se il terreno di coltura efficace non viene reintegrato. Il rifornimento sistemico del mezzo è stato eseguito nel nostro sistema ogni 48-72 ore. Un altro aspetto cruciale del sistema è la lunghezza dell'ON. È fondamentale assicurarsi che almeno 0,5-1 cm di ON siano lasciati sull'occhio cadaverico. Gli occhi dei donatori non devono essere usati se hanno OB corti, l'ON è danneggiato, il globo è compromesso e sgonfio o la guaina ON è staccata. Inoltre, quando si posiziona il segmento posteriore sopra la cupola, l'O-ring deve essere saldamente inserito in posizione e la camera ICP superiore correttamente sigillata con viti. Anche i raccordi a spinta in cui il tubo si attacca su ciascun lato della base superiore e inferiore del modello devono essere testati per garantire che il tubo si adatti e si blocchi in posizione. Se il tubo non è correttamente posizionato, si osserveranno bolle d'aria all'interno del tubo e comprometteranno le misurazioni della pressione all'interno di ciascuna camera.
La manutenzione e la vitalità dei segmenti posteriori post-mortem nel nostro modello TAS era una preoccupazione critica per questo protocollo. Il tessuto umano post-mortem è stato precedentemente ampiamente studiato48,49, con un recente studio di analisi dell'RNA di 1.068 tessuti donatori post-mortem che confermano che il tessuto cerebrale umano post-mortem raccolto nel corso di decenni può servire come materiale di alta qualità per lo studio dei disturbi umani47. Inoltre, è stato eseguito un profilo di espressione precedentemente riuscito di tessuti oculari oculari di donatori umani post mortem58. I valori PLIER di espressione genica per i geni dell'apoptosi erano minimi o inesistenti in questo set di dati per il tessuto retinico 6 h postmortem58. Inoltre, è stato dimostrato che la conservazione ipotermica del tessuto oculare può essere eseguita in modo efficace59. È stato dimostrato che l'attività delle cellule gangliari viene mantenuta per 50 ore quando gli occhi minipig sono immagazzinati in condizioni ischemiche e ipotermiche41,60. Pertanto, abbiamo utilizzato il punto temporale di 6 ore come criterio di inclusione per la raccolta della oculare del donatore. La velocità del deterioramento post-mortem dei segmenti posteriori e del distacco della retina è carente in letteratura, ma la nostra enucleazione entro 6 ore, la consegna su ghiaccio e la configurazione della coltura di massimo 36 ore è ben all'interno dell'intervallo di vitalità tissutale come illustrato nella Figura supplementare 1 e nella Figura supplementare 2. Utilizzando il modello TAS, siamo riusciti a mantenere con successo il tessuto per 30 giorni.
Un'altra limitazione del modello TAS è la nostra attuale incapacità di modellare i ritmi circadiani ciclici di ICP e IOP che si osservano in condizioni fisiologiche normali. Questo può essere affrontato in futuro utilizzando una pompa in grado di regolare l'infusione ritmica di IOP e ICP. Inoltre, un altro avvertimento al modello è la mancanza di circolazione sanguigna all'interno dell'occhio cadaverico. Pertanto, gli effetti della pressione sanguigna non possono essere studiati, ma questo ci consente anche di delineare specificamente gli effetti patogeni dei soli cambiamenti TLPG, tra cui IOP e ICP.
Un ambito futuro del modello includerebbe l'automazione dei sistemi di serbatoio per i cambiamenti idrostatici e la perfusione del mezzo attraverso una pompa per infusione con una siringa vuota di uscita sul trasduttore invece dei molteplici cicli di cambio del mezzo che sono stati implementati in questo protocollo. Il fluido dal serbatoio IOP e ICP potrebbe anche essere raccolto e analizzato. Il mezzo può essere raccolto per l'espressione di biomarcatori per indirizzare le terapie future. Possiamo anche identificare percorsi o molecole che possono essere trattati con farmaci o terapia genica e testare queste terapie in vari modelli animali di ICP prima della traduzione in studi clinici sull'uomo.
In conclusione, il nostro modello non solo fornisce una base umana di test, ma può anche essere utilizzato per convalidare terapie che possono indirizzare i cambiamenti di pressione translaminare nell'occhio. Apre una strada per eseguire la medicina di precisione attraverso il trapianto di cellule staminali del paziente su oculari di donatori umani e pressurizzarli nel modello TAS. Questo ci permette di testare terapie ex vivo con la capacità di essere traducibili in clinica e riconducibili a individui viventi. Con il nostro modello possiamo ora valutare i cambiamenti che si verificano nella pressione translaminare e come svolge un ruolo cruciale nella patogenesi associata a varie malattie traumatiche e neurodegenerative. Ciò porterà a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari patogenetici nell'ONH associati a IOP e ICP.
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Disclosures
Gli autori del manoscritto non hanno potenziali conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo progetto è stato attraverso fondi discrezionali della dott.ssa Colleen M. McDowell. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, Inc. al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive di UW Madison. Ringraziamo i dottori Abbot F. Clark e Weiming Mao per la loro assistenza tecnica con il modello di coltura degli organi a perfusione. Ringraziamo il Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) per aver fornito gli occhi dei donatori umani.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R.
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R.
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
