Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)
Summary
A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.
Abstract
Estudar a estrutura e a dinâmica das cinetochores e centrosmers é importante na compreensão da instabilidade cromossômica (CIN) e da progressão do câncer. Como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e participar da segregação precisa do cromossomo é uma questão fundamental. O CENP-A é proposto para ser o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade do centromere, e a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular.
Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a ubiquização em uma lise diferente é induzida por causa da marcação do EYFP na proteína mutante CENP-A K124R. A ubiquização de Lysine 306 (K306) no EYFP-CENP-A K124R foi identificada com sucesso, o que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. Uma ressalva é discutida no uso de GFP/EYFP ou na marcação de proteína de alto peso molecular como ferramenta para analisar a função de uma proteína. Também é discutido o limite técnico atual para a detecção de bandas ubiquadas, identificação de ubiquização específica do local e visualização de ubiquização em células vivas ou uma única célula específica durante todo o ciclo celular.
O método de análise de espectrometria de massa aqui apresentado pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes tags e outras proteínas centromere-kinetochore. Esses métodos combinatórios que consistem em vários ensaios/análises poderiam ser recomendados para pesquisadores interessados em identificar funções funcionais de ubiquização.
Introduction
Na maioria dos eucariotes, os microtúbulos de fuso devem ser anexados a uma única região de cada cromossomo, denominado centômero. O kinetochore é um complexo de proteínas que estão localizadas no centromere. Estudar o tempo dos movimentos da proteína centrómera e da kinetochore e a estrutura de cinetochores e centromers é importante para a compreensão da instabilidade cromossomo (CIN) e da progressão do câncer. As principais questões são como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e como participam da segregação precisa do cromossomo. Na maioria das espécies, a presença de um nucleossomo especial contendo uma proteína específica semelhante a histona chamada CENP-A define a identidade do centromere. Portanto, propõe-se que o CENP-A seja o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade centromere. É importante elucidar o mecanismo de como o CENP-A define a identidade centrômera em humanos.
A proteína de reconhecimento de junção Holliday (HJURP) é o acompanhante específico do CENP-A que deposita CENP-A em nucleosósmos centréricos1,,2,,3. Já noticiamos anteriormente que o CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase é necessário para ubiquização CENP-A na lysina 124 (K124) e na localização do centromere4. Além disso, nossos resultados mostraram que o recrutamento centralizado do CENP-A recém-sintetizado requer ubiquização pré-existente CENP-A5. Assim, foi fornecido um modelo sugerindo que a ubiquização CENP-A é herdada por meio da dimerização entre as divisões celulares.
Em contraste com nossos achados e os de Yu et al., os resultados negativos relativos ao CENP-A e sua localização centromérica foram publicados recentemente6. O artigo alegou que as modificações do CENP-A na lysina 124 (K124) são dispensáveis para o estabelecimento, manutenção e função de longo prazo dos centrosmers humanos, com base em seus resultados negativos mostrando que a mutação do K124R não afetou a localização do centromere CENP-A nem a viabilidadecelular 6. No entanto, há espaço suficiente para debate em seus resultados e conclusões, e já descrevemos que problema poderia haver em sua publicação anterior7. Atenção deve ser dada que eles fundiram proteínas com CENP-A, que têm pesos moleculares muito maiores do que o tamanho do CENP-A endógeno: por exemplo, fundiram ~30 kDa proteína fluorescente amarela aumentada (EYFP) para ~16 kDa CENP-A e analisaram a proteína de fusão EYFP-CENP-A K124R em seu sistema de eliminação RPE-1 CENP-A-/F. A ubiquitina K124 não deverá se ligar diretamente ao HJURP com base nas previsões estruturais4, no entanto, prevê-se que a adição de mono-ubiquitina tenha um impacto na conformação proteica do CENP-A. A proteína da conformação CENP-A pode ser alterada pela presença de uma grande proteína de fusão, e essa mudança conformacional pode mascarar as alterações estruturais causadas pela perda da ubiquidade. Sugerimos que a fusão de proteínas de grande porte induz a ubiquização em uma lise diferente do K124 no mutante EYFP-CENP-A K124R e esta ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R. Evidências de que a ubiquização ocorre em diferentes lisesinas na proteína mutante CENP-A K124R com uma grande proteína de etiqueta (EYFP) foi relatada em nossa publicação anterior8. Verificou-se que a marcação EYFP induz a ubiquização de outro local de lise de EYFP-CENP-A K124R e que o mutante EYFP-CENP-A K124R se liga ao HJURP. Como resultado, essa ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R, e tanto os mutantes EYFP-CENP-A WT e K124R mostraram localização de centromere (usamos e comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutantes, juntamente com pBabe-EFPYFP control.). Os resultados demonstraram que os mutantes CENP-A K124R marcados por bandeiras são letais, mas podem ser resgatados por uma fusão de monoubiquidade, sugerindo que a ubiquização CENP-A é indispensável à viabilidade celular.
Nos últimos anos, muitos estudos desenvolveram diferentes ensaios para identificar modificações pós-transacionais (PTMs) da proteína CENP-A e outras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo quanto in vitro9,,10,,11. Análogos aos PTMs de proteínas histonas que são um dos principais mecanismos que regulam a função da cromatina, PTMs de componentes centromericos de cromatina também estão envolvidos em um mecanismo essencial para regular a estrutura geral e a função dos centromers. A maioria dos sítios CENP-A PTM são específicos para nucleosómos contendo CENP-A, embora alguns deles sejam conservados em histona H3, sugerindo que a modificação desses resíduos contribuem para a função específica do centromere. Os PTMs de CENP-A, incluindo fosforilação, acetilação, metilação e ubiquização foram relatados anteriormente9, sugerindo que o CENP-A é submetido a uma variedade de PTMs e suas matrizes combinatórias em seu domínio amino terminus e C-terminus histone-fold. A importância das modificações do CENP-A em múltiplas funções foi revelada por muitos grupos, incluindo o nosso. Essas funções envolvem deposição do CENP-A em centrosmers, estabilidade proteica e recrutamento da CCAN (rede constitutiva associada ao centromere)9. No entanto, estudos limitados e achados de PTMs CENP-A são pré-formados onde comparações são feitas com uma das histonas canônicas que regulam direta ou indiretamente sua função. Relatórios técnicos com foco na metodologia de identificação desses PTMs CENP-A também são limitados.
Como a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere12, herdada por dimerização entre a divisãocelular 5, e indispensável à viabilidade celular8,o método para identificar a ubiquização CENP-A seria essencial no futuro para estudar a atividade funcional, o posicionamento e a estrutura do centromere. Portanto, aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Protocolos de outros ensaios e análises de controle (análise de imunofluorescência, ensaio de crescimento de colônias e ensaio de onipresençação in vivo) também são apresentados para discutir o resultado da análise de espectrometria de massa corretamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos métodos de análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Em nossos resultados, identificamos com sucesso a ubiquização na lysina 306 (K306) em EYFP-CENP-A K124R, que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. A análise de espectrometria de massa descrita aqui é …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Chao-Jun Li no Centro de Pesquisa Animal Modelo, Universidade de Nanjing pela análise de espectrometria em massa. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e pesquisadores atuais do Centro de Pesquisa Animal Modelo, Nanjing University e Greehey Children’s Cancer Research Institute por sua discussão útil, orientação experimental e reagentes. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler por seus generosos presentes de reagentes. Y.N. foi apoiado pelo Fundo de Construção da Província de Jiangsu ”Double-First-Class”, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Província de Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province “Foreign Expert Hundred Talents Program” Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudo foi parcialmente apoiado pela subvenção nci R21 CA205659.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
