Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Анализ масс-спектрометрии для выявления повсеместного ания метеоуожего тега CENP-A (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-A вездесущность является важным требованием для осаждения CENP-A в центрометре, унаследованного через димеризацию между делением клеток, и необходимым для жизнеспособности клеток. Здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного ирования белка CENP-A (EYFP-CENP-A).

Abstract

Изучение структуры и динамики кинетохоров и центромер имеет важное значение для понимания хромосомной нестабильности (CIN) и прогрессирования рака. Как хромосомное расположение и функция центрометра (т.е. центрометрической идентичности) определяются и участвуют в точной хромосомной сегрегации является фундаментальным вопросом. CENP-A предлагается быть индикатором не-ДНК (эпигенетический знак) центрометрической идентичности, и CENP-A вездесущность требуется для осаждения CENP-A на центрроме, унаследованном через димеризацию между делением клеток, и незаменима для жизнеспособности клеток.

Здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного eyFP-CENP-A K124R мутанта, предполагающего, что повсеместное распространение в другом лизине индуцируется из-за пометки EYFP в мутантном белке CENP-A K124R. Была успешно выявлена вездесущность Lysine 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R, что соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A с помощью анализа масс-спектрометрии. Предостережение обсуждается при использовании GFP/EYFP или маркировке белка с высоким молекулярным весом в качестве инструмента для анализа функции белка. Текущий технический предел также обсуждается для обнаружения вездесущих полос, идентификации конкретного места вездесущности (ы), а также визуализации вездесущности в живых клетках или конкретной одной клетке в течение всего клеточного цикла.

Метод анализа масс-спектрометрии, представленный здесь, может быть применен к человеческому белку CENP-A с различными тегами и другими белками центрометрии. Эти комбинированные методы, состоящие из нескольких анализов/анализов, могут быть рекомендованы исследователям, заинтересованным в определении функциональных ролей вездесущности.

Introduction

В большинстве эукариот, спиндельные микротрубочки должны прикрепляться к одной области каждой хромосомы, называется центрометр. Кинетохор представляет собой комплекс белков, которые расположены в центрометре. Изучение времени движения центрального и кинетохорного белка и структуры кинетохоров и центромер имеет важное значение для понимания нестабильности хромосом (CIN) и прогрессирования рака. Ключевыми вопросами являются то, как определяются хромосомное расположение и функция центрометра (т.е. центрометрической идентичности) и как они участвуют в точной хромосомной сегрегации. У большинства видов наличие специального нуклеосомы, содержащего специфический гистоноподобный белок под названием CENP-A, определяет центральномерную идентичность. Поэтому предполагается, что CENP-A является индикатором не ДНК (эпигенетический знак) центрометрической идентичности. Важно выяснить механизм того, как CENP-A определяет центрометрию идентичности у людей.

Холлидей соединения распознавания белка (HJURP) является CENP-A-специфический сопровождатель, который депозиты CENP-A в центрометрических нуклеосом1,2,3. Ранее мы сообщали, что CUL4A-RBX1-COPS8 E3 лигаза необходима для CENP-A вездесущность на лизине 124 (K124) и центрромной локализации4. Кроме того, наши результаты показали, что центрометричный набор вновь синтезированных CENP-A требует уже существующих вездесущих CENP-A5. Таким образом, была представлена модель, предполагающая, что вездесущность CENP-A наследуется путем димеризации между делениями клеток.

В отличие от наших выводов и выводов Yu et al., отрицательные результаты относительно CENP-A и его центрометрической локализации были недавно опубликованы6. В статье утверждалось, что ceNP-A изменения на лизине 124 (K124) являются необязательными для создания, обслуживания и долгосрочной функции человеческих центромерес, на основе их негативных результатов, показывающих, что мутация K124R не влияет на локализацию CENP-A centromere ни жизнеспособность клеток6. Тем не менее, есть достаточно места для обсуждения в их результатах и выводах, и мы уже описали, какая проблема может быть в их предыдущей публикации7. Следует обратить внимание на то, что они сплавили белки с CENP-A, которые имеют гораздо большие молекулярные веса, чем размер эндогенного CENP-A: например, они сплавили 30 кДа повышенного желтого флуоресцентного белка (EYFP) до 16-/F kDa CENP-A и проанализировали EYFP-CENP-A K124R в их протеине слияния Е.1. K124 убиквитин, как ожидается, не связывать непосредственно с HJURP на основе структурных прогнозов4, однако, добавление моно-убиквитин, по прогнозам, будет иметь влияние на протеиновую конформацию CENP-A. Белок конформации CENP-A может быть изменен наличием большого синтезного белка, и это конформационное изменение может замаскировать структурные изменения, вызванные потерей вездесущности. Мы предполагаем, что слияние крупногабаритного белка вызывает повсеместное распространение в лизине, кроме K124 в EYFP-CENP-A K124R мутант и это вездесущность на другом сайте ингибирует / маски оригинального K124R одного мутанта фенотипа. Доказательства того, что вездесущность происходит при различных лизинах в CENP-A K124R мутантный белок с большим протеином тега (EYFP) было сообщено в нашей предыдущей публикации8. Было установлено, что пометка EYFP вызывает повсеместное распространение другого лизинового сайта EYFP-CENP-A K124R и что мутант EYFP-CENP-A K124R связывается с HJURP. В результате, эта вездесущность на другом сайте ингибирует/маски оригинального фенотипа-мутанта K124R, и оба мутанта EYFP-CENP-A WT и K124R показали центрометрию локализации (мы использовали и сравнивали pBabe-EYFP-CENP-A WT и K124R-мутант, вместе с контролем pBabe-EYFP). Результаты показали, что помеченные флагом или немаркированные CENP-A K124R мутанты смертельно опасны, но могут быть спасены моноубиквитином синтезом, что свидетельствует о том, что вездесущение CENP-A является необходимым для жизнеспособности клеток.

В последние годы, многие исследования разработали различные анализы для выявления постпереводных модификаций (PTMs) белка CENP-A и других центрально-кинетохоровых белков как in vivo и in vitro9,10,11. По аналогии с ПТС гистоновых белков, которые являются основным механизмом, регулирующим функцию хроматина, ПТМ центрометрических компонентов хроматина также участвуют в важном механизме регулирования общей структуры и функции центрометров. Большинство сайтов CENP-A PTM специфичны для ceNP-A-содержащих нуклеосом, хотя некоторые из них сохраняются в гистон H3, что свидетельствует о том, что модификация этих остатков способствует функции центрометра. PTMs CENP-A, включая фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, и вездесущность были ранее сообщалось9, предполагая, что CENP-A подвергается различным ПТМ и их комбинаторных массивов на его аминокислотной конечной и C-термин гистон-фолд домена. Важность модификаций CENP-A в различных функциях была выявлена многими группами, включая нашу. Эти функции включают осаждение CENP-A на центромерах, стабильность белка, и набор CCAN (составная центрометрическая связанная сеть)9. Тем не менее, ограниченные исследования и выводы CENP-A PTMs заранее, где сравнения сделаны с одним из канонических гистонов, которые прямо или косвенно регулируют их функцию. Технические доклады, посвященные методологии выявления этих ПТС CENP-A, также ограничены.

Потому что CENP-A вездесущность требуется для осаждения CENP-A в центрометре12, унаследованной через димеризацию между делением клеток5, и необходимым для жизнеспособности клеток8, метод для определения CENP-A вездесущность будет иметь важное значение в будущем для изучения функциональной активности, позиционирования и структуры центрометра. Поэтому здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного ания мутанта EYFP-CENP-A K124R, предполагающего, что пометка EYFP вызывает убиквитирование в другом лизине в мутантном белке CENP-A K124R8. Протоколы других контрольных анализов и анализов (анализ иммунофлуоресценции, анализ нароста, и ин vivo ubiquitylation analysissay) также представлены для обсуждения результатов анализа крупной масс-спектрометрии должным образом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток и ретровирусная трансфекция конструкций pBabe-EYFP-CENP-A

ПРИМЕЧАНИЕ: EYFP-CENP-A выражается от pBabe-EYFP-CENP-A на аналогичном уровне белка до эндогенного CENP-A. Общий клеточный белок CENP-A заменяется этим EYFP-CENP-A после нарушения CENP-A-/F аллеля кре рекомбиназа, как в RPE-1 CENP-A-/- клетки6.

  1. Приготовление супернатанта, содержащего ретровирус с использованием 293T упаковочных клеток.
    1. День 0: Распространение 293T упаковочных клеток на 6-ну культуры пластины (1,0 х 106 клеток / хорошо). Культурные клетки в высокоцинцинцинатурных DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток для использования при посеве.
    2. День 1: Подготовка реакции трансфекционной инфекции около 23 ч после распространения (24 ч точек 0 ч точки трансфекционной). Трансфектная плазмида выражения каждого pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) и pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (см. таблицу 1).
    3. Выберите одну комбинацию помощников / упаковки плазмидов, перечисленных в таблице 2 и добавить их в трубки, содержащие один из плазмидов, перечисленных выше. Есть в основном эти 3 комбинации для помощника / упаковки плазмиды (Таблица 2). Любая комбинация работала в этих экспериментах и показала аналогичную эффективность трансфекации.
    4. Подготовка 50 МЛ уменьшенной среды сыворотки и смешать 2,0 мкг каждого pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316) и pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (см. таблицу 1) добавление одной комбинации плазмидов-помощников/упаковки, перечисленных в таблице 2 (см. ниже). Инкубировать эту смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Эта смесь является раствором А.
    5. Подготовьте еще 50 МЛ уменьшенной среды сыворотки и смешайте 1,5 мл трансфекционных реагентов I и II соответственно (Таблица материалов). Инкубировать эту смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Эта смесь является раствором B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, добавить только 6,0 л трансфекционного реагента III (полиэтиленимин (PEI); 1,0 мг/мл) в растворе B или добавить 6,0 л трансфекционного реагента III в дополнение к трансфекционным реагентам I и II в растворе B(Таблица материалов).
    6. Смешайте решения A и B вместе и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
    7. После мытья культивируемых клеток один раз с PBS, добавить смесь решений A и B (т.е., ДНК-липидный комплекс) непосредственно к каждому колодцу 6-ну культуры пластины, которая имеет 500 мл уменьшенной среды сыворотки. Окончательная концентрация плазмиды составляет 3,3 мкг/мл.
    8. После инкубации клеток при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 4,5 ч, измените средний и высокоцикулярный DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Положите 2 mL/well среды культуры после среднего изменения в плите культуры 6-well.
    9. Культура клеток при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 на 48 ч после трансфекции. Выполните ретровирусную инфекцию на третий день с помощью супернатанта, содержащего ретровирус.
  2. Ретровирусная инфекция КЕНП-А-/F RPE-1 целевых клеток.
    1. День 2: За день до заражения, распространение CENP-A-/F RPE-1 целевых клеток для трансфекта в 6-ну культуры хорошо (2,25 х 105 клеток / хорошо). Клетки культуры в DMEM: F12средний (Таблица материалов) с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение клеток для колонии нарост анализы, иммунофлуоресценция, и западный анализ помарки в качестве контроля. Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток для использования при посеве.
    2. День 3 (день заражения вируса): На 48 ч после трансфекции 293T упаковочных клеток, собирать супернатант, содержащий вирус и фильтр через 0,45 мкм фильтр (не используйте 0,2 мкм фильтр, который будет сдвигать оболочку вируса). Рекомендуется использовать фильтры полиэтерсульфольфона (PES).
    3. Заразить клетки CENP-A-/F RPE-1 вирусом. Для одного колодца 6-хорошо культуры пластины, добавить 1 мл свежих средств массовой информации, 1 мл вируса супернатанта и полибрена к окончательной концентрации 8 мкг / мл. Инкубировать CENP-A-/F RPE-1 клетки при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 4 дней до дня 7 после трансфекты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период для CENP-A-/F RPE-1 рост клеток должен быть определен эмпирически путем проведения анализа для достижения оптимальных результатов.

2. Иммунофлуоресценция клеток, содержащих pBabe-EYFP-CENP-A

  1. День 7: 4 дня после ретровирусной инфекции pBabe-EYFP-CENP-A конструкций, удалить культуры среды по аспирации. Промыть клетки один раз с TBS (25 mM Tris-HCl, рН 7.5; 125 mM NaCl). Примените TBS в сторону культурных скважин, чтобы не нарушать поверхность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная точка времени для фиксации клеток должна быть определена эмпирически. Иммунофлуоресцентные сигналы как EYFP-CENP-A WT, так и K124R обнаруживаются на центрометре по крайней мере через 4 дня после ретровирусной инфекции pBabe-EYFP-CENP-A конструкций даже без инфекции Cre (данные не показаны, Рисунок 1C-E для данных с инфекцией Cre).
  2. Выполните фиксации метанола клеток и иммунофлуоресценции окрашивания, как описано ранее13.
  3. В качестве первичных антител используются анти-GFP антитела (1:1000 разбавления) и анти-CENP-B антитела (коэффициент разбавления 1:200) для маркера центрального местоположения в TBS содержащие 4% козьей сыворотки (см. Таблица Материалов для антител, используемых).
  4. Удалите избыток монтажа среды с бумажным полотенцем и печать края крышки с лаком для ногтей на последнем шаге.
  5. Обратитесь к ранее описанному методу13 для наблюдения изображений иммунофлуоресценции, приобретения, количественной оценки и анализа оставшихся сигналов EYFP-CENP-A в центрометре.
  6. Выполните приобретение изображений, обработку, включая деконволюцию, количественную оценку и анализ с помощью программного обеспечения A или Программного обеспечения B1 и B2 (см. таблицу материалов). Опционально используйте программное обеспечение C1-C3 (см. Таблицу материалов)для конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите 2.6.1 в дополнительных файлах кодирования для всех команд, используемых в программном обеспечении А. Смотрите 2.6.2 в дополнительных файлах кодирования для всех команд, используемых в программах B1 и B2.

3. Колония нарост анализы с использованием pBabe-EYFP-CENP-A после ретро-Cre вирусной инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Причина для выполнения этого анализа заключается в сравнении жизнеспособности клеток между EYFP-CENP-A WT и K124R мутант после нарушения CENP-A-/F аллеля Кре рекомбиназы (после замены общего клеточного белка CENP-A).

  1. Ретровирусная трансфекция конструкций pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Выполните ретровирусную трансфекцию клеток CENP-A-/F RPE-1, как описано в разделе 1. Культурные клетки в DMEM: F12 среды с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин для 72 ч после вирусной инфекции.
    2. Через три дня после ретровирусной инфекции конструкций pBabe-EYFP-CENP-A (на 6-й день) добавляйте бластицидидин S (10 мкг/мл) в скважинах, содержащих трансинфицированные клетки, которые будут использоваться для анализа и контрольных экспериментов колонии. Клетки выращиваются по крайней мере через 14 дней после вирусной инфекции в присутствии бластицида S. Изменение среды, содержащей blasticidin S каждые 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки достигают около 80% слияния до посева для колонии анализа (3.2.7. и 3.2.8), прохождение клеток на 1:2 и 1:5 соотношение trypsinization и покрытие в 6 хорошо культуры пластины.
    3. Соберите клетки для западной помарки на день 7 для того чтобы подтвердить выражение протеина pBabe-EYFP-CENP-A конструкций без инфекции Cre. Выполните западный анализ помарки, как описано в разделе 4. Результаты показаны на рисунке 1B (полосы 1-4).
    4. Для колонии нарост анализ с инфекцией cre вируса, держать клетки растут в течение 14 дней после вирусной инфекции в присутствии blasticidin S (т.е., растут клетки в blasticidin S содержащие среды до дня 17 для результатов, представленных здесь).
  2. Ретро-Cre вирусной инфекции pBabe-пуро-Cre
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 0 в шаге 3.2.1 соответствует 13-му дню раздела 3.1.
    1. День от 0 до дня 3: Выполните ретровирусную трансфекцию клеток CENP-A-/F RPE-1 с использованием pBabe-puro-Cre (B3027) в качестве плазмиды выражения (подробнее см. раздел 1). Убедитесь, что бластицидидин S (10 мкг/мл) добавляется в среде культуры.
    2. День 4: Трипсинизировать клетки, чтобы отделить его от пластины. Плита 500 или 5000 клеток в трипликате в 6-ну культуры пластины. Культурные клетки в DMEM: F12 средний с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
    3. День 5: Добавьте бластицидин S (10 мкг/мл) в среду культуры. Для покрытия 5000 или 500 ячеек выберите клетки с бластицидидином S (10 мкг/мл) 3-24 дня (до 14-го дня в 3.2.7) или 3-28 дней (до 18-го дня в 3.2.8) после вирусной инфекции конструкций (pBabe-EYFP-ANP)..).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой колонии нарастания анализа, трансфекция pBabe-puro-Cre добавляется вместе с трансфекцией pBabe-EYFP-CENP-A. Трансфекция pBabe-EYFP-CENP-A выполняется в 3.1. Трансфекция pBabe-puro-Cre выполняется в 3.2.1.
    4. День 10 (7 дней после инфекции вируса ретро-Cre): Соберите клетки для западного анализа blotting для того чтобы подтвердить истощение протеина endogenous CENP-A после инфекции вируса retro-Cre и/или выражения протеина pBabe-EYFP-CENP-A конструкций на таком же дне 10.
    5. Выполните западные пятна, как описано в разделе 4 в тот же день 10. Результаты показаны на рисунке 1B (полосы 5-7).
    6. Выполните анализ иммунофлуоресценции (раздел 2 выше), чтобы подтвердить, что оба EYFP-CENP-A WT и K124R локализованы в центрроме через 7 дней после инактивации оставшегося эндогенного аллеля CENP-A. Результаты показаны на рисунке 1C-1E.
    7. День 14: Выполните анализ нарастания колонии с пластиной, посеянной с 5000 клеток. Исправить клетки в течение 10 минут в метаноле и пятно в течение 10 минут в кристально фиолетовый раствор (2,3% кристально фиолетовый, 0,1% оксалата аммония, 20% этанола (см. рисунок 2B). Подсчитайте количество колоний с помощью программного обеспечения OpenCFU (см. рисунок 2C).
    8. День 18: Используйте пластину, посеянную 500 клетками. Исправить и пятно клетки, как описано в шаге 3.2.7 (см. рисунок 2B). Подсчитайте количество колоний (см. рисунок 2C).

4. Западный анализ помарки с использованием pBabe-EYFP-CENP-A

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к ранее описанному методу13 для западного анализа помарки с использованием антител, указанных в рисунке 1B и рисунке 2A и таблице материалов для белков EYFP-CENP-A.

  1. Изолировать белки путем лисирования клеток, выращенных с различными вирусной инфекции. Затем используйте 20 мкг белка в одном колодце геля SDS PAGE. Передача белков на мембрану PVDF, как описано ранее13.
  2. Вымойте мембрану 3x после инкубации первичными вторичными антителами. Обнаружение и анализ белковых полос на мембране с помощью инфракрасной системы визуализации и/или изображения хемилюминесценции для обнаружения иммуноблока. Эти результаты показаны на рисунке 1B и рисунке 2A.
    1. Для инфракрасной системы визуализации для обнаружения и анализа белковых полос, см. шаг 4.2.1 в дополнительных файлах кодирования.
    2. Используйте изображение хемилюминесценции для обнаружения и анализа белковых полос, см. шаг 4.2.2 в дополнительных файлах кодирования. Для этой системы используйте сверхчувствительный расширенный хемилюминесцентный (ECL) субстрат(Таблица материалов).
    3. Дополнительно, используйте западный буфер зачистки пятнывания для того чтобы strip out pre-incubated антитела от мембраны PVDF и reblot оно с по-разному антителами для следующего поворота западного анализа. Эмпирически определить оптимизированное время инкубации и температуру для использования.

5. Культура клеток, трансфекция и инво вездесущя анализы с использованием p'CXIP-EYFP-CENP-A

ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень белка EYFP-CENP-A, выраженный из p'CXIP-вектора, в 10 раз выше, чем уровень белка CENP-A. Использование этого вектора облегчает иммунопреципитацию большего количества белков EYFP-CENP-A, наблюдение полосы убиквитизации EYFP-CENP-A и выявление повсеместного eyFP-тегами ceNP-A (EYFP-CENP-A) с помощью анализа масс-спектрометрии.

  1. Трансфекция для анализа ин vivo ubiquitylation с использованием p'CXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Семя 36,2 х 105 CENP-A-/F RPE-1 клетки в 10 см ткани культуры блюдо. Культурные клетки в высокоцинцинцинатурных DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток, которая будет использоваться при посеве. Приготовьте не менее 2 блюд для одного иммунопреципитации (ИП) образца, чтобы получить минимум 1 мг общего белка.
    2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 18 ч.
    3. При 17 ч после посева подготовьте трансфекционные реагенты.
    4. Сделать решение A путем смешивания 6,7 г плазмиды каждого p'CXIP-EYFP (B3252), p'CXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), p'CXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Таблица 1) в 335 мл сыворотки с пониженной, средней, средней, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавьте 6,7 г плазмиды pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) ко всем образцам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все векторы перечислены в таблице 1.
    5. Сделать раствор B путем смешивания 10,1 л трансфекционных реагентов I и II, соответственно, в 335 мл уменьшенной среды сыворотки и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательный шаг заключается в добавлении только 40,2-л трансфекционного реагента III (полиэтиленемиин (PEI); 1,0 мг/мл) в растворЕ B или добавить 40,2 л трансфекционного реагента III в дополнение к трансфектным реагентам I и II в растворе B (Таблица Материалов).
    6. Смешайте решения A и B вместе и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
    7. После мытья культивируемых клеток один раз с PBS, добавить смесь решений А и В (т.е. ДНК-липидный комплекс) непосредственно к каждому из отдельных 10 см ткани культуры блюдо, которое имеет 3,35 мл хл снижение среды сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 1,67 мкг/мл плазмиды.
    8. Инкубировать клетки при инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 на 4,5 ч. После 4,5 ч, изменить средний и высоко глюкозный DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
    9. Культура клеток при 37 кк с 5% CO2 на 48 ч после трансфекции. Собирайте клетки для подготовки лисатов клеток.
  2. Приготовление белка бусы связаны с анти-GFP антитела.
    1. Возьмите 25 мл (50% v/v) белка A шарики для одной реакции иммунопреципитации (IP). Вымойте с буфером A1(Таблица материалов)по крайней мере 3x, чтобы удалить EtOH, и сделать 50% раствор с буфером A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; полный EDTA-бесплатный прот-тит.
    2. Добавьте 2,0 л анти-GFP антитела (Анти-76: Домашнее антитело) к бисеру, подготовленным выше, и добавьте 10-й объем буфера А1 по сравнению с чистым объемом бисера.
    3. Выполните сквозное вращение при 4 градусах по Цельсию за 4-18 ч. Оптимальная продолжительность времени для сквозного вращения должна определяться эмпирически на основе эффективности иммунопресуляции.
    4. Центрифуга бисера на 100 х г в течение 1 мин и удалить несвязанный супернатант. Добавьте буфер A1, чтобы повторно сделать 50% (v/v) решение бисера. Используйте 25 ЗЛ (50% v/v) этого решения для одной реакции IP.
  3. Иммунопреципитация (IP) с использованием белка сефалозные бусы связаны с анти-GFP антитела.
    1. Лизы клетки получены в шаге 5.1.9 в буфере A1 путем звуковой и замораживания-оттепели процесса.
    2. Измерьте концентрацию белка и нормализуйте количество белков среди различных образцов ИС. Удалите 5% образца из каждой трубки, чтобы запустить в виде 5% образца ввода в SDS-PAGE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец ввода 5% может быть заморожен в жидком азоте и снабжен при -80 градусов по Цельсию, если он не загружается в течение дня.
    3. Смешайте остальную часть 95% лизата с 25 л (50% v/v) белка бусы связаны с анти-GFP антитела, который был подготовлен в шаге 5.2. Выполните сквозное вращение при 4 градусах по Цельсию за 4-18 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная продолжительность времени для сквозного вращения должна быть определена эмпирически.
    4. Центрифуговый белок бусы с привязанным к нему белком (т.е. иммунопреципитами) со 100 х г на 1 мин, и удалить супернатант. Вымойте иммунопрецилиты буфером А1, центрифугируя при 100 х г в течение 1 мин. Выполните этот шаг 4x.
    5. Смешайте 5% Вход и остальные 95% иммунопрецититов с 2x и 4x SDS-PAGE погрузочно-загрузочного буфера14, соответственно. Отварить эти два образца в течение 5 минут, а затем загрузить их на 10,0% денатурации SDS-полиакриламид гель для электрофореза в разных полосах. Используйте для электрофореза более крупный гель SDS-PAGE (например, 17 см х 15 см). Если образцы работают в меньшем гель, это может быть невозможно наблюдать четкие / резкие полосы вездесущих.
    6. Выполните западный анализ помарки, как описано в разделе 4 с использованием антител, указанных в предыдущем докладе8. Результат показан на рисунке 2A.
    7. Используйте западный буфер зачистки пятно, чтобы лишить предварительно инкубированных антител из мембраны PVDF и реблот его с различными антителами для следующего раунда западного анализа помарки.

6. Масс-спектрометрия для определения места повсеместного захоронения мутанта EYFP-CENP-A K124R

  1. Трансфекция для анализа масс-спектрометрии с использованием p'CXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Семена CENP-A-/F RPE-1 клетки в 10 см ткани культуры блюдо. Убедитесь, что плотность клеток составляет 36,2 х 105 клеток на блюдо. Культурные клетки в высокоцинцинцинатурных DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Приготовьте не менее 20 блюд для одного образца иммунопреципитации (ИП), чтобы получить не менее 10 мг общего белка (см. 5,3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток для использования при посеве.
    2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 18 ч. Подготовка трансфекционных реагентов 23 ч после распространения (24 ч точка 0 ч трансфекция).
    3. При 17 ч после посева подготовьте трансфекционные реагенты и трансфекционные клетки как (4.1.3). Трансинфицированные клетки имеют pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) и p'CXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 48 ч после трансфекции. Собирайте клетки для лисатов клеток.
    5. Лизы клетки в буфере A1 и выполнять иммунопреципитации как (5,2) и (5,3). Выполнить эти два иммунопреципитации лисатов следующим образом (6.1.6) и (6.1.7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В (6.1.6), запустите образец в стандартных трис-глициновых гелей. В (6.1.7), запустите образец в коммерчески доступных 4%-12% Bis-Tris белковых гелей. Смотрите также Обсуждение.
    6. Держите одну выборку для 10% от общего иммунопреципиатора, чтобы подтвердить вездесущность EYFP-CENP-A и точно определить положение вездесущего EYFP-CENP-A, как описано в разделе 5. Выполнить этот образец в стандартных Tris-глицин гели. SDS-PAGE и западные помарки были выполнены как (5.3).
    7. Держите еще один образец для 90% от общего иммунопреципитанта для анализа масс-спектрометрии. Запустите этот образец в двух скважинах коммерчески доступных 4%-12% белковых гелей Bis-Tris. Выполните Coomassie синее окрашивание с помощью Синюю раствора Coomassie. Акциз и вырезать гель области 50-70 кДа (putative моно-Ub-EYFP-CENP-A K124R области). Используйте эту область геля для анализа масс-спектрометрии.
  2. Анализ массовой спектрометрии с использованием пищеварения в геле.
    1. Нарезать кубиками каждый гелевый ломтик интереса на мелкие кусочки (1 мм2)и поместите его в 0,5 мл белковых низко связывающих труб.
    2. Вымойте с 100 мл 50% (v/v) ацетонитриле в 25 мМ NH4HCO3, вихрь 10-15 мин, спина вниз, отбросить супернатант, повторить 3x.
    3. Сосредоточьте образец с помощью скамейки вакуумный концентратор в течение 30 минут, чтобы высушить геля штук.
    4. Добавьте 10 мл 10 нг/л секвенирования трипсина и дайте гелям регидратировать в течение 5 мин.
    5. Добавьте 25 мМ NH4HCO3 достаточно, чтобы покрыть геля штук, переварить при 37 градусов по Цельсию на ночь.
    6. Перенесите переваренный супернатант в чистую силиконизированную трубку 0,65 мЛ. Добавьте 50% (v/v) ацетонитриле/5% (v/v) формиановой кислоты (30 мл или достаточно для покрытия), вихрь 10 мин, спина и передачи в ту же трубку извлечения. Повторите 3x.
    7. Добавьте 10 ацетонитриля в геля, вихрь 5 мин, и спина вниз. Перенесите супернатант в ту же трубку.
    8. Сосредоточьте образцы с помощью скамейки вакуумный концентратор до 2 мл, добавьте 8 мл 3% (v/v) ацетонитриле /2% (v/v) формиметровой кислоты к образцу, вихря в течение 15 мин, и спина вниз на 16000 х г в течение 30 мин. Образцы готовы для анализа масс-спектрометрии.
    9. Выполните получение данных MS с помощью LC-MS/MS с помощью жидкой хроматографическойсистемы (Таблица материалов)в сочетании с инструментом масс-спектрометрии(Таблица материалов).
    10. Введите 8 МЛ восстановленного образца в столбец жидкой хроматографии обратной фазы (RPLC).
    11. Разделите пептиды с градиентом 2-80% растворителя В за 60 мин. Убедитесь, что градиент состоит из увеличения доли растворителя B от 2% до 22% в 40 мин, от 22% до 35% растворителя B в 12 мин, затем восхождение на 80% растворителя B в 4 мин, и, наконец, проведение на 80% растворителя B за последние 4 мин. Установите скорость потока постоянной на 300 nL/min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Solvent A содержит 0,1% форминовой кислоты и 2% ацетонитриле, растворитель B содержит 0,1% промежную кислоту и 98% ацетонитриле. Все концентрации показаны как объем/объем.
    12. Сбор данных массовой спектрометрии с использованием режима получения данных. Вкратце, соберите спектр MS в 350-1500 м/з для 250 мс. Выберите 50 самых интенсивных прекурсоров с зарядом 2-5 для дальнейшей фрагментации. Соберите MS/MS спектра в 100-2000 м/з на 100 мс, исключите ионы прекурсоров от перевыборов на 15 с.
    13. Для поиска базы данных откройте коммерческое программное обеспечение (см. Таблицу материалов)для анализа данных масс-спектрометрии на рабочем столе.
    14. Чтобы сделать новый поиск, нажмите кнопку«LC»в верхнем меню. Затем нажмите кнопку"Добавить",чтобы загрузить исходные файлы данных MS.
    15. Выберите«Идентификатор человеческого белка»в«Методе Paragon»в качестве метода поиска базы данных. Поиск исходных файлов данных MS необработанной базы данных по базе данных UniProt Homo Sapiens (содержащий 160 566 последовательностей, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Установите параметры поиска следующим образом: выберите трипсин в качестве фермента пищеварения, допускаем до 3 недостающих расщеплений, 4 модификации и 2-5 зарядов на пептид. Установите массовую ошибку до 20 ppm для первого поиска и 0.02 Da для фрагментированных ионов. Укажите пороговые значения ложной скорости обнаружения (ФДР) для белков, пептидов и модификаций менее 1%. Установите все остальные параметры программного обеспечения для значений по умолчанию (см. рисунок 3 для анализа масс-спектрометрии).
    17. Нажмите кнопку"Сохранить как"справа от верхнего меню, выберите папку для хранения результатов поиска, введите имя поиска и нажмите кнопку"Сохранить".
    18. Нажмите кнопку"Процесс"справа от верхнего меню, чтобы начать поиск. После завершения поиска данные с вступившим именем поиска будут автоматически храниться в выбранной папке. Данные могут быть легко открыты с помощью программного обеспечения F.
    19. Чтобы получить СПЕКТР MS/MS какого-либо конкретного пептида, дважды щелкните результаты поиска, чтобы открыть его программным обеспечением F. Сначала щелкните белок в списке белков в верхней части меню, а затем нажмите пептид на середине меню. MS/MS этого пептида показан в нижней части меню.
    20. Чтобы экспортировать и сохранять спектр MS/MS, нажмите на спектр MS/MS в нижней части меню, выберите копию, а затем вставьте в подходящий файл, такой как PPT или doc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мутант EYFP-CENP-A K124 показывает повсеместное распространение, взаимодействие с HJURP, и никаких дефектов в локализации центрометра ни летальности клеток. Здесь система, о которой сообщили Фачинетти и др. (2017)6 была переобочена: в диплоидных клетках человека (RPE-1) с одним нарушенным и одним 'floxed'' CENP-A аллеля(CENP-A-/F),EYFP-CENP-A было выражено из ретровирусного вектора pBabe-EYFP. В этой системе, выражение эндогенных CENP-A от CENP-A-/F аллель может быть нарушена Cre рекомбиназы6. Генные конструкции EYFP- CENP-A WT или K124R мутант(Рисунок 1A), который спасает потерю эндогенных CENP-A, были стабильно выражены при ретровирусной интеграции. Оставшееся выражение эндогенного CENP-A от CENP-A-/F аллеля было затем нарушено рекомбиназа Кре. Выражение эндогенного CENP-A не было обнаружено через 7 дней после индукции рекомбиназы Cre(рисунок 1B,полосы 5-7). Было установлено, что экспрессия белков EYFP-CENP-A WT и K124R находится на том же уровне, что и начальный эндогенный уровень белка CENP-A(рисунок 1B,полосы 3, 4, 6 и 7). Оба EYFP-CENP-A WT и K124R мутанты показали центрометрической локализации на 7 дней после нарушения оставшегося выражения эндогенных CENP-A от CENP-A-/F аллель (Рисунок 1C-1E). Оба EYFP-CENP-A WT и K124R мутант показал повсеместное и взаимодействие с HJURP в отличие от случая флаг-тегами или untagged CENP-A WT и K124R мутант (Рисунок 2A; данные не показаны для флага тегами или untagged CENP-A)8. Жизнеспособность клетки была также рассмотрена путем выполнения анализа нароста колонии через 14 дней после нарушения оставшегося эндогенного аллеля CENP-A (Рисунок 2B). Оба EYFP-CENP-A WT и K124R мутанты показали аналогичное количество колоний 'спасенных' 14 дней после нарушения оставшихся эндогенных CENP-A аллель (Рисунок 2B и 2C). Таким образом, наши результаты соответствуют тем, о чем сообщили Фачинетти идр.

Повсеместное распространение на лизине 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R было выявлено с помощью анализа масс-спектрометрии. Было установлено, что как EYFP-CENP-A WT, так и мутант K124R показывают повсеместное и взаимодействие с HJURP в отличие от случая с флагом или немаркированным CENP-A WT и мутантом K124R(рисунок 2A;данные, не показанные для флаг-меткой или untagged CENP-A)8. Эти результаты показывают, что слияние белка EYFP вызывает повсеместное распространение в лизине, кроме K124 в EYFP-CENP-A K124R мутант, и это повсеместное распространение на другом сайте способствовать взаимодействию EYFP-CENP-A K124R с HJURP. Повсеместное распространение в лизине 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R было выявлено в ячейках CENP-A-/F с помощью анализа IP-масс-спектрометрии(рисунок 3A и рисунок 3B). Лизин 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A. Взятые вместе, наши результаты показывают, что слияние крупногабаритного белка (например, EYFP-тегов) вызывает вездесущность в лизине, кроме K124 в CENP-A, и это вездесущность на другом сайте ингибирует / маски оригинального K124R одного мутанта фенотипа.

Figure 1
Рисунок 1: мутант EYFP-CENP-A K124 локализуется на центромерах. (A) Представления различных конструкций белка CENP-A, отмеченных EYFP (улучшенный желтый флуоресцентный белок) в N terminus. Красные буквы отмечают положение замены аминокислотЫ K124R в указанной конструкции (слева). Результаты анализов, проведенных в этом исследовании, показаны (справа). (B) Западный анализ помарки не показал наличие обнаруживаемых эндогенных CENP-A. Иммуноблот анализ, чтобы проверить наличие выражения указанных спасательных конструкций (около 45 кДа) до и после инфекции Cre. Выражение белка pBabe-EYFP-конструкций было подтверждено до cre инфекции (полосы 1-4), а также после инфекции Cre (полосы 5-6). Отсутствие эндогенного белка CENP-A (около 15 кДа) было подтверждено в линии ceNP-A-/- клеточные линии, собранные через 7 дней после инфекции Cre (полосы 5-6). Белок GAPDH использовался в качестве контроля за погрузкой. (C) EYFP-CENP-A K124 мутант локализует на центрометрах. CENP-A-/F RPE-1 клетки были cotransfected с указанными конструкциями, культивируемые 7 дней после инфекции вируса ретро-Cre, и immunostained. Визуализация DAPI (синий), EYFP (зеленый) и эндогенных CENP-B (красный), который служил в качестве центрометрического контроля местоположения. Масштабная планка, 10 мкм. (D) Модели локализации, показанные в (C) обобщены как гистограммы. За эксперимент было подсчитано более 200 межфазных ячеек с сигналами EYFP-положительных сигналов (n No 3, и показаны средние проценты . 'Другие (Не-центрромер)' изображает в основном поврежденные клетки, мертвые клетки, или клетки с нуклеолярной локализации в межфазы, которые наблюдались из-за трансфекции или других методов лечения. В K124R не наблюдалось существенной (n.s.) разницы по сравнению с WT (тест студента). (E) EYFP полученных сигналов на центрометрии показано в (C) были количественно. Сигналы были нормализованы до сигналов WT, и показаны средние проценты (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: мутант EYFP-CENP-A K124 вездесущ и взаимодействует с HJURP, а на жизнеспособность клеток не повлияла мутация K124R EYFP-CENP-A. (A) Мутант EYFP-CENP-A K124 вездесущен и взаимодействует с HJURP. Ин vivo вездесущя анализ. Клетки CENP-A-/F RPE-1 были трансфицированы указанными конструкциями. Белки в 5% от общего количества лизатов клеток (Вход) и иммунопрецирататов (IP) с использованием анти-GFP кролика поликлональных антител были обнаружены в результате западного анализа пятностей с использованием указанных антител. Указаны можно на что. Эта цифра была изменена с Niikura и др.8. (B) Репрезентативные изображения из колонии анализа нароста, как показано в схеме (вверху) двух различных условий (1 и 2) для указанных трансфекционных EYFP-CENP-A. (C) Гистограммы, суммируя выживание колонии в (B). Средние проценты (ЗМЭ) более чем 3 независимых экспериментов (n No 3) нормализуются с процентом выживших колоний в EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p Зтт; 0,0001 и Зп хт; 0,01 по сравнению с управлением EYFP (тест студента). В K124R не наблюдалось существенной (n.s.) разницы по сравнению с WT (тест студента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Фрагменты вездесущих пептидов EYFP-CENP-A K124R были обнаружены в результате анализа масс-спектрометрии. (A) Доказательства повсеместного ubiquitylation на лизине 306 (K306) EYFP-CENP-A K124R в RPE-1 CENP-A-/F ячейки. Лизин 306 (K306) EYFP-CENP-A K124R соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A. Пептид ЛЁКLRGGSTHLLIR (покрытие 95,9%, уверенность 87,8%) определяется путем анализа диссоциации, вызванного столкновением. Значения m/z (Da) b (зеленые) и y (красные) ионы в спектрах (A), обнаруженных во время фрагментации, выделены зеленым цветом в таблице (B). Повсеместное распространение K306 подтверждается мотивом LRGG (неполное расщепление) иона b-3 (м/з 753.4730) и ионом y-8 (м/з 1350.8328). (B)Таблица подчеркивает значения m/z (Da) b (зеленых) и y (красных) ионов в спектре (A). L'K(Umc)STHLLIR в таблице (B) указывает на пептидL'K LRGGSTHLLIR, показанный в (A). Эти цифры были изменены с Niikura и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Номер B Соответствующие характеристики (ы) Ссылки Источник
B3027 pBabe-пуро-Cre Niikura et al., 2019 Д-р Амрута Аштекар, д-р Лоуренс С. Киршнер
B3182 pBabe-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3161 pBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 Д-р Даниэле Фачинетти, д-р Дон У. Кливленд
B3164 pBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 Д-р Даниэле Фачинетти, д-р Дон У. Кливленд
B3031 psPAX2 Niikura et al., 2019 Д-р Джон Томпсон, д-р Густаво В. Леоне
D3032 pMD2.g Niikura et al., 2019 Д-р Джон Томпсон, д-р Густаво В. Леоне
B3189 Pgp Niikura et al., 2019 Д-р Кэндзи Таго (Jichi Medical Univeristy, Япония)
B3190 pCI-VSVG Niikura et al., 2019 Д-р Кэндзи Таго (Jichi Medical Univeristy, Япония)
B3001 Ppam Niikura et al., 2019 -
B3252 p'CXIP-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3254 ПСХИП-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 -
B3256 p'CXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 -
B2806 pCGN-HA-Ubiquitin Niikura et al., 2019 -

Таблица 1: Плазмидные векторы, используемые в данном исследовании.

Номер B Помощник/упаковывая плазмидные векторы Комбинация 1 Комбинация 2 Комбинация 3
B3031 psPAX2 (lentiviral gag/pol вектор) 2 мкг
D3032 pMD2.g (лентивиральный вектор env) 2 мкг
B3189 pGP (ретровирусный вектор кляп/поль) 2 мкг
B3190 pCI-VSVG (ретровирусный вектор env) 2 мкг
B3001 pPAM (амфотропный вектор помощника, кодирующий ретровирусный кляп-поль-энв) 2 мкг

Таблица 2: Комбинации векторов помощника/упаковки плазмиды, используемых в (1.1.3): ретровирусная трансфекция конструкций pBabe-EYFP-CENP-A.

Дополнительные файлы кодирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описали методы анализа масс-спектрометрии для выявления повсеместного EYFP-CENP-A K124R мутант, предполагая, что EYFP пометки вызывает вездесущность на другой лизин в CENP-A K124R мутант белка8. В наших результатах мы успешно определили повсеместное ubiquitylation на лизине 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R, что соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A через анализ масс-спектрометрии. Анализ массовой спектрометрии описано здесь мимический метод, как мы ранее определить лизин 124 (K124) вездесущий сайт CENP-A WT-Флаг12. Таким образом, этот метод может быть применен к человеку CENP-A белка с различными тегами и другими белками центрометра-кинетохора. Анализ массовой спектрометрии на основе LC-MS/MS широко распространен для выявления потенциальных постпереводных модификаций (ПТМ) широкого спектра белков. Наши комбинаторные методы, состоящие из нескольких анализов/анализов (т.е. в vivo ubiquitylation анализа, колонии анализа рост, и анализ масс-спектрометрии) могут быть рекомендованы для исследователей, которые заинтересованы в определении функциональных ролей вездесущих (ы) их целевого белка (ы).

Однако этот протокол не охватывает обнаружение вездесущих полос и/или идентификацию специфических участков вездесущности (ы) этих белков в живых клетках или конкретной одной клетке в течение всего клеточного цикла. В эти годы оптогенетические подходы разработаны кардинально и оказывают большое влияние на количественные исследования систем сигнализации клеток. Оптогенетика изначально предоставила подходы, которые точно активируют или ингибируют отдельные нейроны с помощью однокомпонентных, микробных систем на основе опсина. В настоящее время белковая активность с беспрецедентной пространственной точностью может контролироваться с помощью природных генетически закодированных фоторецепторов, а различные генетически закодированные инструменты позволяют контролировать свет многих биологических процессов, включая белковую фосфорилирование15. Таким образом, оптогенетика является перспективной системой для исследования spatiotemporal протеин киназы сигнализации на клеточном и весь уровень организма. Количество светоуправляемых белковых киназа быстро растет, хотя нынешнее число по-прежнему ограничено. Однако развитие светоотразационного белка задерживается, а высокомолекулярная маркировка фоторецепторов может нарушить повсеместное распространение как WT, так и мутантных белков и функционально изменить функцию местного белка как вышепригоняя. Таким образом, развитие более низкого молекулярного веса пометки или зондирования техники срочно требуется для визуализации вездесущности и / или для исследования spatiotemporal вездесущность белка сигнализации на уровне живой клеточной и всего организма.

В настоящем исследовании, EYFP векторного контроля имеет важное значение для контроля анализы и анализы (анализ иммунофлуоресценции, анализ нарастания колонии, и в vivo вездесущий анализ) для обсуждения результатов основных анализа масс-спектрометрии правильно. Неспецифическое взаимодействие с EYFP-белком часто наблюдается в эксперименте иммунопреципитации, поэтому векторный контроль EYFP необходим для оценки истинного взаимодействия белка, сплавленного EYFP(ы). Наш анализ масс-спектрометрии с использованием EYFP-CENP-A K124R, выраженный в rpE-1 CENP-A-/F-клетки не показали повсеместного на лизинах в полипептидной последовательности EYFP. Однако, в других неизвестных условиях, можно было ожидать, что лизин сайт в полипептидной последовательности EYFP вездесущ в EYFP- и / или других помеченных синтез белка высокой молекулярной массы.

Для анализа наростков колонии рекомендуется собирать клетки для западного анализа помарки, чтобы подтвердить истощение белка эндогенного CENP-A после ретро-Cre вирусной инфекции и белковое выражение pBabe-EYFP-CENP-A конструкций. Таким образом, мы можем судить, если колония рост фенотипа действительно из-за единственного выражения экзогенных CENP-A WT или мутантов. Для любого западного анализа помарки, если зачистка выполнена для того чтобы reblot мембрана с по-разному антителами для следующего поворота западного анализа помарки, то одно должно использовать такую же количественную систему обнаружения как пятно предыдущего поворота для помарки следующего поворота с потехой по-разному антителами. Следует убедиться, что полосы в помарке предыдущего хода не обнаруживаются в прицельной области мембраны в помарке следующего хода с различными антителами. Или использовать ту же систему количественного обнаружения, как помарка предыдущего поворота и проверить, если инкубация с простым вторичным антителом, используемым в помарке предыдущего хода не приводит к обнаружению белковых полос перед началом помарки следующего поворота с различными антителами. Для анализа инви ubiquitylation важно запустить больший гель SDS-PAGE с помощью аппарата для запуска большего геля SDS-PAGE (Gel electrophoresis аппарата I или II). Эмпирически, больше SDS-PAGE гель будет отделять белковые полосы четко и повысить чувствительность обнаружения слабых полос, которые могли бы быть плохо обнаружены в меньшем гель (т.е., белковые полосы появляются острее в больших гель).

Чрезвычайно важно выбрать правильный гель SDS-PAGE для картирования постпереводных модификаций (ПТМ) конкретного белка, тщательного LC-MS/MS. Наиболее широко используемой гель-системой для SDS-PAGE является система Laemmli, которая использует трис-глициновые гели, включающие компонент укладки геля и растворяющийся гель-компонент. В этой классической системе, рН и ионические силы буферов, используемых в укладке гель (Трис, рН 6.8) и решение гель (Трис, рН 8.8) отличаются от буфера, используемого для запуска геля (Трис, рН 8.3). Искажение полосы, потеря разрешения или полос артефактов могут быть вызваны высокощелочной работой рН системы Laemmli. В предыдущем докладе описаны основные причины плохого разрешения полосы с системой Laemmli16, включая нестабильность и короткий срок действия разрешающего геля из-за гидролиза полиакриламида на высоком рН, химические изменения образцов белков, повторное окисление пониженных дисульфидов остатков цистеина белков, и расщепление связей Asp-Pro белков с нагреванием при 95-100 градусов по Цельсию в буфере образца Laemmli при рН 5.2. Коммерчески доступные 4%-12% протеиновые гели Bis-Tris являются Bis-Tris HCI-буфером (рН 6.4) и работают при рН ca. 7.0 в отличие от традиционных гликиных гелей Tris-glycine16. Многочисленные достоинства, сравнивая с системой Laemmli, генерируются нейтральным операционным рН систем Bis-Tris16,включая высокую стабильность и длительный срок действия разрешающего геля, повышенную стабильность белка образца во время электрофореза при нейтральном рН, что приводит к более четкому разрешению полосы и точным результатам, а также полное сокращение дисульфидов и отсутствие расщепления облигаций Asp-Pro. В этом отчете мы могли бы успешно сопоставить ПТМ белка EYFP-CENP-A K124R(рисунок 3),используя коммерчески доступные 4%-12% белковые гели Bis-Tris. Таким образом, коммерчески доступные 4%-12% Bis-Tris белковые гели настоятельно рекомендуется использовать для этой цели.

Для картирования постпереводных модификаций (PTMs) специфического белка широко используется переваривание в геле целевого белка в сочетании с LC-MS/MS. В этом исследовании мы стремились определить места убиквитинации EYFP-CENP-A K124R с помощью стратегии очистки и массы сродства (AP-MS). Таким образом, первым ключевым шагом является получение большого количества вездесущих EYFP-CENP-A K124R белка с высокой чистотой с использованием иммунопреципитации от EYFP-CENP-A K124R переэкспрессионных клеток, которые могли бы значительно облегчить идентификацию и подтверждение мест убиквитинации EYFP-CENP-A K124R LC-MS/ MS. Чтобы уменьшить интерферент неубиктиинированного белка EYFP-CENP-A K124R, западные пятна анти-GFP, анти-HA (Ub), анти-убикитин (см. раздел No6.1.6) и Coomassie синее окрашивание (см. раздел No 6.1.7) были выполнены, чтобы точно определить положение вездесущего EYFP-CENP-A K124R на SDS-PAGE гель. Наконец, только сведенная к минимуму область гелевой полосы, содержащей вездесущий EYFP-CENP-A K124R был вырезан для в геле пищеварения в сочетании с LC-MS/MS, чтобы получить оптимизированные результаты. Когда высушенные пептиды восстанавливаются перед эксплуатацией LC-MS/MS, 3% (v/v) ацетонитриле /2% (v/v) формиановой кислоты было использовано, чтобы помочь лучше растворить и скорость восстановления пептидов. Иногда поиск базы данных может привести к PTMs, которые действительно не существуют из-за приблизительного алгоритма назначения поисковой системы. Таким образом, еще одним важным шагом является подтверждение EYFP-CENP-A K124R ubiquitination сайтов через ручной обзор MS / MS вездесущих пептидов с помощью программного обеспечения F (Таблица материалов), которые могли бы устранить "нереальные" убивитинации сайтов введены приблизительное назначение по базе данных поиска. Таким образом, эта стратегия AP-MS создала эффективный и надежный трубопровод для идентификации участков убиквитинации EYFP-CENP-A K124R с важнейшим биологическим значением. Что еще более важно, этот трубопровод также может быть широко расширен для исследования ПТМ различных функциональных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Чао-Джун Ли в Центре исследований моделей животных, Нанкинский университет для анализа масс-спектрометрии. Мы благодарим Янмини Далал, Тацуо Фукагава и нынешних исследователей из Центра исследований проблем животных, Нанкинского университета и Детского научно-исследовательского института рака Грейхи за их полезное обсуждение, экспериментальное руководство и реагенты. Мы благодарим Дона У. Кливленда, Даниэле Фачинетти, Янмини Далала, Мина Буя, Густаво В. Леоне, Джона Томпсона, Лоуренса С. Киршнера, Амруту Аштекар, Бена Э. Блэка, Гленниса А. Логсдона, Кэндзи Таго и Дон С. Чендлера за их щедрые подарки реагентов. Y.N. была поддержана Цзянсу провинции "двойной первый класс" Строительный фонд, Цзянсу провинции естественных наук фонда (SBK2019021248), провинция Цзянсу16-й Шесть больших талантов Пики фонда (TD-SWYY-001), провинция Цзянсу "Иностранный эксперт Сто талантов программа" Фонд (SBK2019010048), и Национальный фонд естественных наук в Китае (31970665). Это исследование было частично поддержано грантом NCI R21 CA205659.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

Биология Выпуск 160 центрометр кинетохор митоз CENP-A пост-переводная модификация ПТМ вездесущность анализ масс-спектрометрии
Анализ масс-спектрометрии для выявления повсеместного ания метеоуожего тега CENP-A (EYFP-CENP-A)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter