Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

Abstract

Kinetokoreve sentromerlerin yapısı ve dinamiklerinin incelenmesi kromozomal instabilite (CIN) ve kanser ilerlemesini n anlaşılmasında önemlidir. Bir sentromerin kromozom yerinin ve işlevinin (yani centromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldığı temel bir sorudur. CENP-A sentromer kimliğinin DNA olmayan indikatörü (epigenetik işareti) olarak önerilmektedir ve cenp-A ubiquitition centromere de CENP-A birikimi için gereklidir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez.

Burada, EYFP-CENP-A K124R mutantının ubiquitylation'ını tanımlamak için kütle spektrometresi analizini açıklıyoruz ve cenp-A K124R mutant proteinindeki EYFP etiketlemesi nedeniyle farklı bir lizinde ubiquitylation indüklenmiş olduğunu öne sürüyoruz. EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) ubiquitylation başarıyla tanımlanmış, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lizin 56 (K56) ile karşılık gelmektedir. Bir uyarı GFP / EYFP kullanımı veya bir proteinin işlevini analiz etmek için bir araç olarak yüksek molekül ağırlıklı protein etiketleme tartışılır. Mevcut teknik sınır da her yerde bantların tespiti, siteye özgü ubiquitylation(lar) belirlenmesi ve canlı hücrelerde veya belirli bir hücrede tüm hücre döngüsü boyunca ubikitlasyon görselleştirme için tartışılmıştır.

Burada sunulan kütle spektrometresi analizi yöntemi farklı etiketleri ve diğer sentromer-kinetokore proteinleri ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Çeşitli tahliller/analizlerden oluşan bu kombinatory yöntemler, her yerde bulunan işlevsel rollerini belirlemek isteyen araştırmacılar için önerilebilir.

Introduction

Ökaryotların çoğunda, iğ mikrotübülleri sentromer olarak adlandırılan her kromozomun tek bir bölgesine bağlanmalıdır. Kinetochore sentromere bulunan proteinlerin bir komplekstir. Sentromer ve kinetokore proteininin hareketlerinin zamanlaması ile kinetokore ve sentromerlerin yapısının incelenmesi kromozom instabilitesi (CIN) ve kanser ilerlemesini anlamak için önemlidir. Önemli sorular, bir sentromerin kromozom konumunun ve işlevinin (yani sentromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldıklarıdır. Çoğu türde, CENP-A adı verilen özel histon benzeri protein içeren özel bir nükleozomun varlığı sentromer kimliğini tanımlar. Bu nedenle CENP-A'nın sentromer kimliğin DNA olmayan göstergesi (epigenetik işareti) olduğu öne sürüldü. CENP-A'nın insanlardaki centromer kimliğini nasıl tanımladığımekanizmasını açıklamak önemlidir.

Holliday kavşak tanıma proteini (HJURP) CENP-A-spesifik şaperon hangi mevduat CENP-A centromeric nükleozomlar1,2,3. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase lisenin üzerinde CENP-A ubiquitylation için gerekli olduğunu bildirdik 124 (K124) ve centromere lokalizasyon4. Ayrıca, sonuçlarımız yeni sentezlenen CENP-A centromere işe önceden varolan her yerde CENP-A5gerektirdiğini gösterdi. Böylece, CENP-A ubiquitylation hücre bölünmeleri arasında dimerization yoluyla kalıtsal olduğunu düşündüren bir model sağlanmıştır.

Bulgularımız ve Yu ve ark.'nın bulgularının aksine, CENP-A ve merkezsel lokalizasyonu ile ilgili olumsuz sonuçlar son zamanlarda6yayınlanmıştır. Makalede, Lizin 124 (K124) üzerinde CENP-A modifikasyonları kurulması için vazgeçilebilir olduğunu iddia etti, bakım, ve insan centromeres uzun vadeli fonksiyonu, K124R mutasyonu CENP-A centromere lokalizasyonu etkilemediğini gösteren olumsuz sonuçlara dayanarak ne hücre canlılığı6. Ancak, onların sonuçları ve sonuçları tartışma için yeterli oda var, ve biz zaten ne sorun var onların önceki yayın7olabilir açıklanmıştır . Endojen CENP-A boyutundan çok daha büyük molekül ağırlıklarına sahip olan CENP-A ile proteinleri eritmiş olmaları dikkat edilmelidir: örneğin, ~30 kDa geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile ~16 kDa CENP-A'ya eritmiş ve RPE-1CENP-A-Fout sisteminde EYFP-CENP-A K124R füzyon proteinini analiz ettiler. K124 ubiquitin yapısaltahminleredayalı hjurp doğrudan bağlamak için beklenmez 4 , Ancak, mono-ubikitin eklenmesi CENP-A protein konformasyonu üzerinde bir etkisi olduğu tahmin edilmektedir. CENP-A konformasyonunun proteini büyük bir füzyon proteininin varlığı ile değiştirilebilir ve bu konformasyonel değişim ubikilasyon kaybının neden olduğu yapısal değişiklikleri maskeleyebilir. Büyük boyutlu proteinfüzyonunun EYFP-CENP-A K124R mutantında K124 dışındaki bir lizinde ubiquitylation'ı indüklemesini ve başka bir sitedeki bu ubiquitylation'ın orijinal K124R tek mutant fenotipini inhibe ettiğini/maskelediğini öneriyoruz. Cenp-A K124R mutant proteininde büyük etiketli protein (EYFP) ile farklı lizinde ubiquitylation'ın meydana geldiğine dair kanıtlar 8. EYFP etiketlemenin EYFP-CENP-A K124R'ın başka bir lizin bölgesinin her yerde bulunmasına neden olduğu ve EYFP-CENP-A K124R mutantının HJURP'ye bağladığı saptandı. Sonuç olarak, başka bir sitede bu ubiquitylation inhibe / maskeler orijinal K124R tek mutant fenotip, ve hem EYFP-CENP-A WT ve K124R mutantlar centromere lokalizasyon gösterdi (biz kullanılan ve pBabe-EYFP-CENP-A WT ve K124R mutant karşılaştırıldı, birlikte pBabe-EY controlFP.). Sonuçlar, Bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A K124R mutantlarının ölümcül olduğunu ancak monoubiquitin füzyonu ile kurtarılabilen leri gösterdi, bu da CENP-A ubiquitylation'ın hücre canlılığı için vazgeçilmez olduğunu düşündürüyor.

Son yıllarda, birçok çalışma da in vivo ve in vitro9,,10,,11HEM CENP-A protein ve diğer centromere-kinetochore proteinlerin posttranslational değişiklikler (PTMs) tanımlamak için farklı tahliller geliştirdik. Kromatin fonksiyonlarını düzenleyen önemli bir mekanizma olan histon proteinlerinin PTM'lerine benzer olarak, sentromerik kromatin bileşenlerinin PTM'leri de sentromerlerin genel yapısını ve işlevini düzenleyen önemli bir mekanizmada yer almaktadır. CENP-A PTM bölgelerinin çoğu CENP-A içeren nükleozomlara özgüdür, ancak bunlardan birkaçı histon H3'te korunmuştur, bu kalıntıların modifikasyonunun sentromere özgü fonksiyona katkıda bulunduğu ileri sürülmektedir. Fosforilasyon, asetilasyon, metilasyon ve ubikitlasyon da dahil olmak üzere CENP-A PTMs daha önce bildirilmiştir9, CENP-A ptms çeşitli tabi olduğunu düşündüren ve amino terminus ve C-terminus histon-fold etki alanında onların kombinatoryal dizileri. Birden fazla fonksiyonda CENP-A modifikasyonlarının önemi bizimki de dahil olmak üzere birçok grup tarafından ortaya kondu. Bu fonksiyonlar centromerlerde CENP-A birikimini, protein stabilitesini ve CCAN'ın (kurucu sentromer ilişkili ağ) işe alınmasını içerir9. Ancak, cenp-A PtM'lerin sınırlı çalışmaları ve bulguları, işlevlerini doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyen kanonik histones biri ile karşılaştırmalar yapıldığı nda önceden oluşturulmuştur. Bu CENP-A PTM'lerini tanımlamak için metodolojiye odaklanan teknik raporlar da sınırlıdır.

CENP-A ubiquitylation centromere12de CENP-A birikimi için gerekli olduğundan , hücre bölünmesi arasında dimerization yoluyla kalıtsal5, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez8, CENP-A ubikirlasyon belirlemek için yöntem fonksiyonel aktivite, konumlandırma ve centromere yapısını incelemek için gelecekte gerekli olacaktır. Bu nedenle, burada EYFP-CENP-A K124R mutant ubiquitylation tanımlamak için kütle spektrometresi analizi açıklar EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Diğer kontrol tahlil ve analizlerinin protokolleri (immünofloresan analizi, koloni büyüme dışı tahlil ve in vivo ubiquitition tahlil) ayrıca büyük kütle spektrometresi analizinin sonuçlarını doğru bir şekilde tartışmak için sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre kültürü ve pBabe-EYFP-CENP-A yapılarının retrovirüs transfeksiyonu

NOT: EYFP-CENP-A, pBabe-EYFP-CENP-A'dan benzer protein düzeyinde endojen CENP-A'ya kadar ifade edilir. Toplam hücresel CENP-A proteini, CENP-A-/F alelinin CRE rekombinaz ile bozulmasından sonra bu EYFP-CENP-A iledeğiştirilir.

  1. 293T ambalaj hücreleri kullanılarak retrovirüs içeren supernatant hazırlanması.
    1. 0. Gün: 6 kuyulu kültür plakası (1.0 x 106 hücre/kuyu) üzerine 293T ambalaj hücreleri yayın. %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM'deki kültür hücreleri. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, tohumlamada kullanılacak hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin.
    2. 1. Gün: Yayıldıktan sonra 23 saat civarında transfeksiyon reaksiyonu hazırlayın (24 saat noktası transfeksiyonun 0 saat noktasıdır). Her pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) ve pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) transfect ekspresyon plazmid (Tablo 1bakınız).
    3. Tablo 2'de listelenen yardımcı/ambalaj plazmidlerinin bir kombinasyonunu seçin ve bunları yukarıda listelenen plazmidlerden birini içeren tüplere ekleyin. Çoğunlukla yardımcı / ambalaj plazmidler için bu 3 kombinasyonları vardır(Tablo 2). Herhangi bir kombinasyon bu deneylerde çalıştı ve benzer transfection verimliliği gösterdi.
    4. 50 μL azaltılmış serum ortamı hazırlayın ve her pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) ve pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (Tablo 1'ebakınız) tablo 2'de listelenen yardımcı/ambalaj plazmidlerinin bir kombinasyonunu ekleyerek karıştırın (aşağıya bakın). Bu karışımı oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya yatırın. Bu karışım Çözelti A.
    5. 50 μL azaltılmış serum ortamı nı daha hazırlayın ve sırasıyla 1,5 μL transfeksiyon reaktifi I ve II'yi karıştırın (Malzeme Tablosu). Bu karışımı oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya yatırın. Bu karışım B çözeltisi.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, b çözeltisine sadece 6.0 μL transfeksiyon reaktifi III (polietilen [PEI]; 1.0 mg/mL) ekleyin veya çözelti B'de I ve II çözeltisine transfeksiyon reaktifleri I ve II'ye ek olarak 6.0 μL transfeksiyon reaktifi III ekleyin.
    6. A ve B çözeltilerini karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Kültürlü hücreleri PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, 500 μL azaltılmış serum ortamına sahip 6 kuyulu kültür plakasının her kuyunun her kuyusu için A ve B çözeltilerinin (yani DNA-lipid kompleksi) karışımını doğrudan ekleyin. Plazmidin son konsantrasyonu 3.3 g/mL'dir.
    8. Hücreleri %5 CO2 atmosferinde %5,5'lik bir atmosferde 37 °C'de kuluçkaya yattıktan sonra, orta yı %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM olarak değiştirin. 6 kuyulu kültür plakasında ki orta değişiklikten sonra 2 mL/kuyu kültür ortamı koyun.
    9. Transfeksiyon sonrası 48 saat için %5 CO2 atmosferinde hücreleri 37 °C'de kültürlendirin. Retrovirüs içeren supernatant kullanarak Gün 3 retrovirüs enfeksiyonu gerçekleştirin.
  2. CENP-A-/F RPE-1 hedef hücrelerinin retrovirüs enfeksiyonu.
    1. 2. Gün: Enfeksiyondan bir gün önce, CENP-A-/F RPE-1 hedef hücrelerini 6-well kültüründe (2,25 x 105 hücre/kuyu) transfect olarak yayın. DMEM kültür hücreleri: F12 orta(Tablo Malzemeler) ile 10% FBS ve 1% penisilin-streptomisin.
      NOT: Koloni büyüme tahlilleri, immünoresans ve batı leke analizi için hücreleri kontrol olarak yayın. En iyi sonuçlar için, ampirik tohumlama kullanmak için hücre yoğunluğunu belirleyin.
    2. 3. Gün (virüsün enfeksiyon günü): 293T ambalaj hücrelerinin transfeksiyonundan sonra 48 saat, virüs içeren süpernatantı toplayın ve 0,45 μm filtreden geçirin (virüs zarfını yakayan 0,2 μm'lik filtre kullanmayın). Polyethersulfone (PES) filtreleri kullanılması tavsiye edilir.
    3. CENP-A-/F RPE-1 hücrelerini virüsle enfekte edin. 6-iyi kültür plakabir kuyu için, 8 μg /mL son konsantrasyona 1 mL taze medya, 1 mL virüs supernatant ve polibren ekleyin. 37 °C'de CENP-A-/F RPE-1 hücrelerini transfeksiyondan sonra 4 gün boyunca %5 CO2 atmosferinde kuluçkaya yatırın.
      NOT: CENP-A-/F RPE-1 hücre büyümesi için kuluçka dönemi, optimal sonuçlar için yapılan analizler takip edilerek ampirik olarak belirlenmelidir.

2. PBabe-EYFP-CENP-A içeren hücrelerin immünofloresan analizi

  1. 7. Gün: pBabe-EYFP-CENP-A retrovirüs enfeksiyonundan 4 gün sonra, aspirasyon la kültür ortamını ortadan kaldırır. Hücreleri tbs (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl) ile bir kez durula. Hücrelerin yüzeyini rahatsız etmemek için kültür kuyularının yan tarafına TBS uygulayın.
    NOT: Hücre fiksasyonu için en uygun zaman noktası ampirik olarak belirlenmelidir. Hem EYFP-CENP-A WT hem de K124R immünofloresan sinyalleri, pBabe-EYFP-CENP-A'nın retrovirüs enfeksiyonundan en az 4 gün sonra centromerde tespit edilebilir (veriler gösterilmez, Cre enfeksiyonu olan veriler için Şekil 1C-E).
  2. Daha önce açıklandığı gibi metanol hücre fiksasyonu ve immünofloresan boyama gerçekleştirin13.
  3. Primer antikorlar % 4 keçi serumu içeren TBS'de sentromer konum belirteci için anti-GFP antikor (1:1.000 seyreltme) ve anti-CENP-B antikor (1:200 seyreltme oranı) kullandığından (bkz.
  4. Bir kağıt havlu ile aşırı montaj ortamı çıkarın ve son adımda oje ile coverslip kenarları mühür.
  5. Centromerde EYFP-CENP-A'nın kalan sinyallerinin immünororeskence görüntü gözlemi, edinimi, sayısallaştırılması ve analizi için daha önce açıklanan13 yöntemine bakın.
  6. A veya B1 ve B2 Yazılımlarını kullanarak görüntü edinimi, dekonvolution, niceleme ve analiz dahil olmak üzere işleme gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). İsteğe bağlı olarak, konfokal lazer tarama mikroskobu için C1-C3 yazılımlarını (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
    NOT: Yazılım A'da kullanılan tüm komutlar için Ek kodlama dosyalarında 2.6.1'e bakın. B1 ve B2 yazılımlarında kullanılan tüm komutlar için Ek kodlama dosyalarında 2.6.2'ye bakın.

3. Retro-Cre virüs enfeksiyonu sonrası pBabe-EYFP-CENP-A kullanılarak koloni outgrowth tahlilleri

NOT: Bu titrenin nedeni, CENP-A-/F alelinin Cre rekombinaz ile bozulmasından sonra (toplam hücresel CENP-A proteininin değiştirilmesinden sonra) EYFP-CENP-A WT ve K124R mutantı arasındaki hücre canlılığını karşılaştırmaktır.

  1. PBabe-EYFP-CENP-A retrovirüs transfeksiyonu yapır.
    1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi CENP-A-/F RPE-1 hücrelerinin retrovirüs transfeksiyonu gerçekleştirin. DMEM kültür hücreleri: F12 orta ile 10% FBS ve 1% penisilin-streptomisin için 72 h virüs enfeksiyonu sonra.
    2. PBabe-EYFP-CENP-A yapılarının retrovirüs enfeksiyonundan üç gün sonra (6. günde), koloni büyüme testi ve kontrol deneyleri için kullanılacak transfected hücreleri içeren kuyularda blasticidin S (10 μg/mL) ekleyin. Virüsler virüs enfeksiyonundan en az 14 gün sonra blasticidin S. Blasticidin S içeren ortamı 5 günde bir değiştirin.
      NOT: Eğer hücreler koloni tayini için tohumlamadan önce yaklaşık %80 biraraya ulaşırsa (3.2.7. ve 3.2.8), 6 kuyulu kültür plakasında tripsinizasyon ve kaplama ile hücreleri 1:2 ve 1:5 oranında iletin.
    3. PBabe-EYFP-CENP-A protein ekspresyonunu doğrulamak için 7. Bölüm 4'te açıklandığı gibi batı leke analizini gerçekleştirin. Sonuçlar Şekil 1B'de (şerit 1-4) gösterilmiştir.
    4. Cre virüs enfeksiyonu ile koloni outgrowth tahdit için, blasticidin S varlığında virüs enfeksiyonu sonra 14 gün boyunca büyüyen hücreleri tutmak (yani, blasticidin S orta içeren hücreleri büyümek 17 Gün burada sunulan).
  2. PBabe-puro-Cre retro-Cre virüs enfeksiyonu
    NOT: 3.2.1 adımdaki 0.
    1. Gün 0-Gün 3: Ifade plazmid olarak pBabe-puro-Cre (B3027) kullanarak CENP-A-/F RPE-1 hücrelerinin retrovirüs transfeksiyon gerçekleştirin (ayrıntılar için bölüm 1 bakınız). Blasticidin S'nin (10 μg/mL) kültür ortamına eklenmesini sağlayın.
    2. 4. Gün: Hücreleri plakadan ayırmak için deneyin. Plaka 500 veya 5.000 hücreleri 6-iyi kültür plaka triplicate. DMEM kültür hücreleri: F12 orta% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin.
    3. 5. Gün: Kültür ortamına blasticidin S (10 μg/mL) ekleyin. 5.000 veya 500 hücre kaplaması için, blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 gün (14.gün [3.2.7]'ye kadar) veya 3-28 gün (18.güne kadar [3.2.8]) olan hücreleri, yapı ların virüs enfeksiyonundan sonra seçin (pBabe-EYFP-CENP-A yapıları).
      NOT: Bu koloni büyüme sadranında pBabe-puro-Cre transfeksiyonu pBabe-EYFP-CENP-A transfeksiyonu ile birlikte eklenir. pBabe-EYFP-CENP-A transfeksiyonu 3.1'de yapılır. pBabe-puro-Cre transfeksiyonu 3.2.1'de yapılır.
    4. Gün 10 (retro-Cre virüs enfeksiyonu sonra 7 gün): Aynı Gün 10 oluşturur retro-Cre virüs enfeksiyonu ve / veya protein ekspresyonu sonra endojen CENP-A protein tükenmesini onaylamak için batı leke analizi için hücreleri toplamak.
    5. Aynı Gün 10 bölüm 4 açıklandığı gibi batı lekeleme gerçekleştirin. Sonuçlar Şekil 1B'de gösterilmiştir (şerit 5-7).
    6. Eyfp-CENP-A WT ve K124R'ın geri kalan endojen CENP-A alelinin aktivasyonundan 7 gün sonra sentromere lokalize olduğunu doğrulamak için immünororesans analizi (yukarıdaki bölüm 2) yapın. Sonuçlar Şekil 1C-1E'degösterilmiştir. Figure 1
    7. 14. Gün: 5.000 hücre ile tohumlu plaka ile koloni outgrowth tsay gerçekleştirin. Hücreleri 10 dakika metanolve leke için 10 dakika boyunca kristal menekşe çözeltisi (2,3% kristal menekşe, %0,1 amonyum oksalat, %20 etanol (Bkz. Şekil 2B). OpenCFU yazılımını kullanarak koloni sayısını say (Bkz. Şekil 2C).
    8. 18. Gün: 500 hücreli tabak kullanın. 3.2.7'de açıklandığı gibi hücreleri düzeltme ve boyama (Bkz. Şekil 2B). Koloni sayısını say (Bkz. Şekil 2C).

4. PBabe-EYFP-CENP-A kullanarak Batı leke analizi

NOT: Şekil 1B ve Şekil 2A'da belirtilen antikorlar kullanılarak Batı leke analizi için daha önce açıklanan13 yöntemine ve EYFP-CENP-A proteinleri için Malzeme Tablosuna bakınız.

  1. Farklı virüs enfeksiyonu ile yetiştirilen hücreleri lysing proteinleri izole. Daha sonra, SDS PAGE jel bir kuyuda protein 20 μg kullanın. Proteinleri daha önce açıklandığı gibi BIR PVDFmembranınaaktarın 13 .
  2. Kuluçkadan sonra membranı primer-sekonder antikorlarla 3kat yıkayın. İmmünoblot tespiti için kızılötesi görüntüleme sistemi ve/veya kemilüminesans görüntüleyicisi ile membrandaki protein bantlarını tespit edin ve analiz edin. Bu sonuçlar Şekil 1B ve Şekil 2A'dagösterilmiştir.
    1. Kızılötesi görüntüleme sisteminin protein bantlarını algılaması ve analiz etmesi için, Tamamlayıcı kodlama dosyalarındakiadım 4.2.1'e bakın.
    2. Protein bantlarını tespit etmek ve analiz etmek için chemiluminescence imager'ı kullanın, ek kodlama dosyalarındaadım 4.2.2'ye bakın. Bu sistem için, ultra hassas gelişmiş kemilüminesans (ECL) substrat(Tablo Malzemeler)kullanın.
    3. İsteğe bağlı olarak, PVDF membrandan önceden kuluçkaya yatan antikorları soymak ve batı analizinin bir sonraki dönüşü için farklı antikorlarla yeniden lekelemek için batı leke sıyırma tamponu kullanın. Ampirik olarak kullanılacak en iyi kuluçka süresini ve sıcaklığını belirleyin.

5. Hücre Kültürü, transfeksiyon ve in vivo ubiquitylation tahlilleri pQCXIP-EYFP-CENP-A kullanarak

NOT: PQCXIP-vektöründen ifade edilen EYFP-CENP-A protein düzeyi endojen CENP-A protein seviyesinden ~ 10kat daha yüksektir. Bu vektörün kullanımı, EYFP-CENP-A proteinlerinin daha yüksek miktarda immünopredimesini, EYFP-CENP-A'nın her yerde bulunan bantlarının gözlemlemesini ve KÜTLE Spektrometresi analizi ile EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation'unun belirlenmesini kolaylaştırır.

  1. PQCXIP-EYFP-CENP-A kullanarak in vivo ubiquitylation tahlilleri için transfeksiyon.
    1. Tohum 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 hücreleri 10 cm doku kültürü çanak. %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM'deki kültür hücreleri.
      NOT: Optimal sonuçlar için, tohumlamada kullanılacak hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin. En az 1 mg toplam protein elde etmek için bir immünopremitasyon (IP) numunesi için en az 2 tabak hazırlayın.
    2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Tohumlamadan sonra saat 17'de transfeksiyon reaktiflerini hazırlayın.
    4. Çözelti a' yı her pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(Tablo 1) azaltılmış orta 335 μL'lik karışık olarak karıştırarak A çözeltisi yapın, ve 5 dk. Tüm numunelere 6.7 g pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) plazmidi ekleyin.
      NOT: Tüm vektörler Tablo 1'delistelenmiştir.
    5. 10.1 μL transfeksiyon reaktifleri I ve II'yi sırasıyla 335 μL azaltılmış serum ortamına karıştırarak B çözeltisini yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: İsteğe bağlı bir adım sadece eklemek tir 40.2 μL transfeksiyon reaktifiii (polietilen [PEI]; 1.0 mg/mL) b çözeltisine veya 40.2 μL transfeksiyon reaktifi III eklemek transfeksiyon reaktifleri I ve II çözeltib (Malzeme Tablosu).
    6. A ve B çözeltilerini karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Kültürlü hücreleri PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, 3,35 mL μL azaltılmış serum ortamına sahip 10 cm'lik doku kültürü çanaklarının her birine doğrudan A ve B çözeltilerinin (yani DNA-lipid kompleksi) karışımını ekleyin.
      NOT: Son konsantrasyon 1.67 μg/mL plazmiddir.
    8. Hücreleri 37 °C inkübatörde %5 CO2 ile 4,5 saat kuluçkaya yatırın. 4,5 saat sonra orta yı %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM olarak değiştirin.
    9. Transfeksiyon sonrası hücreleri %5 CO2 ile %48 h ile 37 °C'de kültürlendirin. Hücre lysates hazırlık için hücreleri toplamak.
  2. Proteinin hazırlanması Anti-GFP antikorile bağlı bir boncuk.
    1. İmmünenyağış (IP) bir reaksiyon için protein A boncuk25 μL (%50 v/v) alın. EtOH'u çıkarmak için tampon A1(Malzeme Tablosu)ile en az 3x yıkayın ve tampon A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; %0.5 Nonidet P-40; %0.5 deoksikorat; %0.5 SDS; 1 mM EDTA; komple EDTA içermeyen protease inhibitör lüzumlu reaktive edici) ile %50 çözüm yapın.
    2. Yukarıda hazırlanan boncuklara 2,0 μL anti-GFP antikor (Anti-76: Ev yapımı antikor) ekleyin ve net boncuk hacmiile karşılaştırarak 10x hacimli tampon A1 ekleyin.
    3. 4 °C'de 4-18 saat uç-uç döndürme gerçekleştirin. Uçtan uca dönüş için en uygun zaman uzunluğu immünopresipitasyonun etkinliğine göre ampirik olarak belirlenmelidir.
    4. Boncukları 1 dk için 100 x g'da santrifüj edin ve bağlanmamış süpernatantı çıkarın. Boncukların %50 (v/v) çözümünü yeniden yapmak için arabellek A1 ekleyin. IP'nin bir reaksiyonu için bu çözeltinin 25 μL'sini (%50 v/v) kullanın.
  3. İmmünopreplit (IP) protein kullanarak Anti-GFP antikor ile bağlı bir sepharose boncuk.
    1. Sonication ve freeze-çözülme işlemi ile tampon A1 adım 5.1.9 elde lyse hücreleri.
    2. Farklı IP örnekleri arasında protein konsantrasyonlarını ölçün ve protein miktarlarını normalleştirin. SDS-PAGE'de %5 Giriş örneği olarak çalıştırmak için her tüpten numunenin %5'ini çıkarın.
      NOT: %5'lik Giriş numunesi bir gün içinde yüklenmezse sıvı nitrojen içinde dondurulabilir ve -80 °C'de stoklanabilir.
    3. %95'lik kısmı 25 μL (%50 v/v) proteinle karıştırın 5.2 adımda hazırlanan anti-GFP antikora bağlı boncuklar. 4 °C'de 4-18 saat uç-uç döndürme gerçekleştirin.
      NOT: Uç-uç dönüş için en uygun zaman uzunluğu ampirik olarak belirlenmelidir.
    4. Santrifüj protein 1 dk için 100 x g ile ona bağlı protein ile boncuklar (yani, immünopeksiitates), ve supernatant kaldırın. 1 dk. 100 x g'de santrifüj ederek immünopeksipititatları tampon A1 ile yıkayın.
    5. Sırasıyla %5 Giriş ve %95 immünopeksipititatları 2x ve 4x SDS-PAGE yüklemetamponu 14ile karıştırın. 5 dakika için bu iki örnek kaynatın ve daha sonra farklı şeritlerde elektroforez için% 10.0 denaturing SDS-poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Elektroforez için daha büyük SDS-PAGE jeli (örn. 17 cm x 15 cm) kullanın. Numuneler daha küçük jelde çalıştırılırsa, net/keskin herikide varolma bantlarını gözlemlemek mümkün olmayabilir.
    6. Bir öncekiraporda8'de belirtilen antikorları kullanarak bölüm 4'te açıklandığı şekilde batı leke analizi yapın. Sonuç Şekil 2A'dagösterilmiştir.
    7. PVDF membrandan önceden kuluçkaya yatan antikorları soymak ve batı leke analizinin bir sonraki turu için farklı antikorlarla yeniden lekelemek için batı leke sıyırma tamponunu kullanın.

6. EYFP-CENP-A K124R mutantının ubiquitylation bölgesini belirlemek için kütle spektrometresi

  1. PQCXIP-EYFP-CENP-A kullanılarak kütle spektrometresi analizi için transfeksiyon.
    1. 10 cm doku kültürü çanak tohum CENP-A-/F RPE-1 hücreleri. Hücre yoğunluğunun çanak başına 36,2 x 105 hücre olduğundan kontrol edin. %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM'deki kültür hücreleri. En az 10 mg toplam protein elde etmek için bir immünopremitasyon (IP) numunesi için en az 20 tabak hazırlayın (bkz. 5.3).
      NOT: En iyi sonuçlar için, tohumlamada kullanılacak hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin.
    2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Tohumlamadan sonra saat 17'de transfeksiyon reaktiflerini ve transfect hücreleri (4.1.3) olarak hazırlayın. Transfected hücrelerpCGN-HA-Ubiquitin (B2806) ve pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) vardır.
    4. Hücreleri transfeksiyondan sonra 48 saat boyunca %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücre lysates için hücreleri toplamak.
    5. Arabellek A1'deki lyse hücreleri immünopresidasyon (5.2) ve (5.3) olarak gerçekleştirirler. İmmünyağış lysatlarının bu ikisini aşağıdaki (6.1.6) ve (6.1.7) çalıştırın.
      NOT: (6.1.6) olarak, numuneyi standart Tris-glisin jellerinde çalıştırın. (6.1.7), ticari olarak mevcut 4%-12% Bis-Tris protein jelleri örnek çalıştırın. Ayrıca bkz.
    6. EYFP-CENP-A ubikilasyonunu doğrulamak ve bölüm 5'te açıklandığı gibi ubiquitinated EYFP-CENP-A'nın konumunu tam olarak belirlemek için toplam immünopsipitanların %10'u için bir örnek tutun. Bu örneği standart Tris-glisin jellerinde çalıştırın. SDS-PAGE ve western blot (5.3) olarak gerçekleştirildi.
    7. Kütle spektrometresi analizi için toplam immünopprepititantların %90'ı için başka bir örnek daha tutun. Bu örneği ticari olarak mevcut olan %4-12 Bis-Tris protein jellerinin iki kuyusunda çalıştırın. Coomassie mavi solüsyonu kullanarak Coomassie mavi boyama gerçekleştirin. Tüketim ve 50-70 kDa jel bölge kesip (putatif mono-UB-EYFP-CENP-A K124R bölge). Kütle spektrometresi analizi için bu jel bölgesini kullanın.
  2. Jel içi sindirim kullanılarak kütle spektrometresi analizi.
    1. İlginin her bir jel dilimini küçük parçalara (1 mm2)ayırın ve 0,5 mL protein düşük bağlayıcı tüplere yerleştirin.
    2. 25 mM NH4HCO3'te100 μL %50 (v/v) asetonitril ile yıkayın, girdap 10-15 dk, aşağı doğru dön, süpernatant'ı atın, 3x'i tekrarlayın.
    3. Jel parçaları kurutmak için 30 dakika tezgah üstü vakum konsantratörü kullanarak örnek konsantre.
    4. 10 ng/μL sıralama sınıfı tripsin 10 μL ekleyin ve jel parçalarının 5 dakika boyunca susuz kalmasını sağlar.
    5. Jel parçalarını kaplayacak kadar 25 mM NH4HCO3 ekleyin, bir gecede 37 °C'de sindirin.
    6. Sindirilmiş süpernatantı temiz bir 0,65 mL silikonlu tüpe aktarın. %50 (v/v) asetonitril/%5 (v/v) formik asit (30 μL veya yeterli, girdap 10 dakika, spin ve transfer aynı ekstraksiyon tüpüne ekleyin. 3x'i tekrarlayın.
    7. Jel parçaları, girdap 5 dakika için 10 μL asetonitril ekleyin ve aşağı spin. Supernatant'ı aynı tüpe aktarın.
    8. Tezgah üstü vakum konsantratörü kullanarak numuneleri 2 μL'ye yoğunlaştırın, numuneye %8 l 3 (v/v) asetonitril (%2) formik asit, 15 dakika girdap ve 30 dk için 16.000 x g'de aşağı doğru dönme numuneleri kütle spektrometresi analizi için hazırdır.
    9. Ms veri alımını lc-MS/MS ile bir kütle spektrometresi cihazı(Malzeme Tablosu)ile birleşen sıvı kromatografi sistemi(Malzeme Tablosu)kullanarak gerçekleştirin.
    10. Ters faz sıvı kromatografisi (RPLC) sütununa 8 μL yeniden oluşturulmuş numune enjekte edin.
    11. Peptitleri 60 dakika içinde %2-80 degradeli B çözücü ile ayırın. Degradenin 40 dakika içinde %2'den %22'ye, 12 dakika içinde %22 ila %35 çözücü B'ye, sonra 4 dk'da %80 çözücü B'ye tırmandığından ve son olarak son 4 dakika boyunca %80 çözücü B'de tutarak akış hızını 300 mL/nL'de ayarladığından emin olun.
      NOT: Çözücü A %0.1 formik asit ve %2 asetonitril, %0.1 formik asit ve %98 asetonitril içerir. Tüm konsantrasyonlar hacim/hacim olarak gösterilir.
    12. Veriye bağımlı edinme modunu kullanarak kütle spektrometresi verilerini toplayın. Kısaca, 250 ms için 350-1500 m/z MS spektrumları toplamak daha fazla parçalanma için şarj 2-5 ile Top 50 yoğun öncüleri seçin. 100 ms için 100-2000 m/z'de MS/MS spektrumlarını toplayın, öncül iyonları 15 s'lik yeniden seçimden hariç takın.
    13. Veritabanı araması için, masaüstündeki kütle spektrometresi verilerini analiz etmek için ticari yazılımı açın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    14. Yeni bir arama yapmak için üst menüdeki "LC" düğmesini tıklayın. Ardından orijinal MS ham veri dosyalarını yüklemek için "Ekle" düğmesini tıklatın.
    15. Veritabanı arama yöntemi olarak "Paragon Metodu" nda "İnsan Protein Kimliği" seçeneğini belirleyin. Orijinal MS ham veri dosyalarını UniProt Homo Sapiens veritabanına karşı arayın (160.566 dizi, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640 içeren).
    16. Arama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: sindirim enzimi olarak tripsin'i seçin, peptid başına en fazla 3 eksik dekolte, 4 modifikasyon ve 2-5 şarj bekleyin. İlk arama için dakikada 20 sayfaya, parçalanmış iyonlar için 0,02 Da'ya kadar kütle hatası ayarlayın. Protein, peptit ve modifikasyon bölgeleri için yanlış bulma oranı (FDR) eşikleri %1'den az belirtin. Yazılımdaki diğer tüm parametreleri varsayılan değerlere ayarlayın (kütle spektrometresi analizi için Şekil 3'e bakın).
    17. Üst menünün sağındaki "Olarak Kaydet" düğmesine tıklayın, arama sonuçlarını depolamak için bir klasör seçin, arama adını girin ve "Kaydet" düğmesine tıklayın.
    18. Aramayı başlatmak için üst menünün sağındaki "İşlem" butonuna tıklayın. Arama sona erdikten sonra, girilen arama adı içeren veriler otomatik olarak seçilen klasörde depolanır. Veriler Yazılım F tarafından kolayca açılabilir.
    19. Herhangi bir peptidin MS/MS spektrumlarını elde etmek için, Yazılım F ile açmak için arama sonuçlarını çift tıklatın. İlk olarak, menünün üst kısmındaki protein listesindeki proteine tıklayın, ardından menünün ortasındaki peptid'e tıklayın. Bu peptidin MS/MS'si menünün alt kısmında gösterilir.
    20. MS/MS spektrumunu dışa aktarmak ve kaydetmek için, menünün altındaki MS/MS spektrumlarına sağ tıklayın, kopyala'yı seçin ve ardından PPT veya doc. biçimi gibi uygun bir dosyaya yapıştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EYFP-CENP-A K124 mutant her yerde gösterir, HJURP ile etkileşim, ve centromere lokalizasyonunda hiçbir kusur ne hücre öldürücü. Burada Fachinetti et al. (2017)6 tarafından bildirilen sistem yeniden oluşturuldu: diploid insan (RPE-1) hücrelerinde bir bozulmuş ve bir ''floxed'' CENP-A alel(CENP-A-/F),EYFP-CENP-A pBabe-EYFP retrovirus vektörü ifade edildi. Bu sistemde, CENP-A-/F alel endojen CENP-A ifadesi Cre rekombinaz6tarafından bozulabilir. Endojen CENP-A kaybını kurtaran EYFP- CENP-A WT veya K124R mutant(Şekil 1A)gen yapıları retroviral entegrasyon yapıldığında sted olarak ifade edilmiştir. CENP-A-/F alelesinden endojen CENP-A'nın kalan ifadesi cre rekombinaz tarafından bozuldu. Endojen CENP-A ekspresyonu Cre rekombinazin indüksiyonundan 7 gün sonra saptanmadı (Şekil 1B, şeritler 5-7). Hem EYFP-CENP-A WT hem de K124R protein ekspresyonu ilk endojen CENP-A protein düzeyine benzer düzeyde bulunmuştur(Şekil 1B, şerit 3, 4, 6, ve 7). Hem EYFP-CENP-A WT hem de K124R mutantları CENP-A -/F-/F alelinden kalan cenp-A ifadesinin bozulmasından 7 gün sonra sentromer lokalizasyonunu gösterdiler (Şekil 1C-1E). Hem EYFP-CENP-A WT hem de K124R mutant, Bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A WT ve K124R mutant(Şekil 2A; bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A için gösterilmez veriler)8durumundan farklı olarak HJURP ile her yerde ve etkileşim gösterdi. Hücre canlılığı da kalan endojen CENP-A alel bozulmasından 14 gün sonra koloni outgrowth doğrama gerçekleştirerek ele alınmıştır(Şekil 2B). Hem EYFP-CENP-A WT hem de K124R mutantları, kalan endojen CENP-A alelinin bozulmasından 14 gün sonra benzer sayıda ''kurtarılmış'' koloni ler gösterdiler (Şekil 2B ve 2C). Böylece, sonuçlarımız Fachinetti ve ark.6tarafından bildirilenlerle uyumlu.

EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 'da (K306) ubikitiletion kütle spektrometresi analizi ile ortaya çıktı. Bu hem EYFP-CENP-A WT ve K124R mutant bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A WT ve K124R mutant durumunda aksine HJURP ile her yerde ve etkileşim gösterir bulundu (Şekil 2A; veri Bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A için gösterilmez)8. Bu sonuçlar, EYFP proteinfüzyonu EYFP-CENP-A K124R mutant K124 dışında bir lizin de ubiquitylation indükler öneririz, ve başka bir sitede bu ubiquitylation HJURP ile EYFP-CENP-A K124R etkileşimini teşvik. EYFP-CENP-A K124R'daki lizin 306 'da (K306) ubikitlasyon, IP kütle spektrometresi analizi ile CENP-A-/F hücrelerinde ortaya çıktı (Şekil 3A ve Şekil 3B). EYFP-CENP-A K124R'daki lizin 306 (K306) CENP-A'da lizin 56 (K56) ile karşılık gelmektedir. Birlikte ele alındığında, bizim sonuçlar büyük boyutlu protein füzyon (örneğin, EYFP-etiketleme) CENP-A K124 dışında bir lizin de her yerde indükler, ve başka bir sitede bu ubiquitylation inhibe / maskeler orijinal K124R tek mutant fenotip.

Figure 1
Şekil 1: EYFP-CENP-A K124 mutant centromers lokalize. (A) Farklı CENP-A proteininin temsilleri N terminusundaki EYFP (geliştirilmiş sarı floresan protein) ile etiketlenir. Kırmızı harfler belirtilen yapı (solda) K124R amino asit ikamesi konumunu işaretleyin. Bu çalışmada yapılan tahlillerin sonuçları gösterilmiştir (sağda). (B) Batı leke analizi saptanabilir endojen CENP-A varlığını göstermedi. Cre enfeksiyonu öncesi ve sonrası belirtilen kurtarma yapılarının (yaklaşık 45 kDa) ekspresyonunun varlığını kontrol etmek için immünoblot analizi. pBabe-EYFP-yapılarının protein ekspresyonu Cre enfeksiyonu (şerit 1-4) ve Cre enfeksiyonu (şerit 5-6) sonrası doğrulandı. Endojen CENP-A proteininin yokluğu (yaklaşık 15 kDa) Cre enfeksiyonundan 7 gün sonra toplanan CENP-A-/- hücre hatlarında doğrulandı (şek 5-6 şeritli). GAPDH proteini yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. (C) EYFP-CENP-A K124 mutant centromers lokalize. CENP-A-/F RPE-1 hücreleri belirtilen yapılarla cotransfeced edildi, retro-Cre virüs enfeksiyonu 7 gün sonra kültürlü, ve immünostained. Centromer konum kontrolü olarak görev yapan DAPI (mavi), EYFP (yeşil) ve endojen CENP-B (kırmızı) görselleştirme. Ölçek çubuğu, 10 μm. (D) (C)'de gösterilen lokalizasyon desenleri histogram olarak özetlenmiştir. Deney başına EYFP pozitif sinyallere sahip 200'den fazla interfaz hücresi sayıldı (n ≥ 3 deney) ve ortalama yüzdeler (±SD) gösterilmiştir. ''Diğerleri (Non-centromere)'' transfeksiyon veya diğer tedaviler nedeniyle gözlenen interfazda nükleoler lokalizasyonu olan çoğunlukla hasarlı hücreleri, ölü hücreleri veya hücreleri betimler. K124R'da WT (Öğrencinin t-testi) ile karşılaştırıldığında anlamlı (n.s.) fark gözlenmedi. (E) (C)'de gösterilen sentromerlerde EYFP kaynaklı sinyaller ölçüldü. Sinyaller WT'ye göre normalleştirildi ve ortalama yüzdeler (±SEM) gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: EYFP-CENP-A K124 mutantı her yerde bulunur ve HJURP ile etkileşime girilir ve hücre canlılığı EYFP-CENP-A'nın K124R mutasyonundan etkilenmez. (A) EYFP-CENP-A K124 mutant ı her yerde bulunan ve HJURP ile etkileşime girilir. In vivo ubiquitylation tsay. CENP-A-/F RPE-1 hücreleri belirtilen yapılarla transfekslendi. Anti-GFP tavşan poliklonal antikor kullanılarak total hücre lisatlarının (Giriş) ve immünopsipitatların (IP) %5'inde bulunan proteinler, belirtilen antikorlar kullanılarak batı leke analizi ile saptandı. Putatif di-Ub-EYFP-CENP-A (**) ve putatif mono-Ub-EYFP-CENP-A (*) belirtilmiştir. Bu rakam Niikura ve ark.8'dendeğiştirilmiştir. (B) EYFP-CENP-A'nın belirtilen transfectantantları için iki farklı koşulun (üstte) (üstte) gösterildiği gibi koloni outgrowth'dan temsili görüntüler. (C) Histogramlar (B) deneylerinin koloni hayatta kalmasını özetler. 3'ten fazla bağımsız deneyin (n ≥ 3) ortalama yüzdeleri (±SEM) EYFP-CENP-A WT'de (EYFP-WT) hayatta kalan kolonilerin yüzdesi ile normale döndürülür. p < 0.0001 ve **p < 0.01 EYFP kontrolü (Öğrencinin t-testi) ile karşılaştırıldığında. K124R'da WT (Öğrencinin t-testi) ile karşılaştırıldığında anlamlı (n.s.) fark gözlenmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kütle spektrometresi analizi ile ubiquitylated EYFP-CENP-A K124R peptidlerinin parçaları saptandı. (A) RPE-1 CENP-A-/F hücrelerinde EYFP-CENP-A K124R'ın lizin 306 (K306) de ubikitlasyon kanıtı. EYFP-CENP-A K124R'ın lisin 306 (K306) cenp-A'daki lizin 56 (K56) ile karşılık gelmektedir. LQKLRGGSTHLLIR peptid (kapsama alanı %95.9, güven %87.8) çarpışmaya bağlı dissosiyatasyon analizi ile tanımlanır. Parçalanma sırasında tespit edilen (A) spektrumundaki b (yeşil) ve y (kırmızı) iyonlarının m/z (Da) değerleri (B) tablosunda yeşil ile vurgulanır. K306'nın ubiquitylation b-3 iyon LRGG motifi (eksik dekolte) ve y-8 iyon (m/z 1350.8328) tarafından doğrulanır. (B) Tablo, (A) spektrumundaki b (yeşil) ve y (kırmızı) iyonlarının m/z (Da) değerlerini vurgular. LQK[Umc]STHLLIR tablosunda (B) gösterilen LQKLRGGSTHLLIR peptid gösterir (A). Bu rakamlar Niikura ve ark.8'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

B numarası İlgili karakteristik(ler) Başvuru Kaynak
B3027 pBabe-puro-Cre Niikura ve ark., 2019 Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner
B3182 pBabe-EYFP Niikura ve ark., 2019 -
B3161 pBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura ve ark., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3164 pBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura ve ark., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3031 psPAX2 Niikura ve ark., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
D3032 pMD2.g Niikura ve ark., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
B3189 Pgp Niikura ve ark., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japonya)
B3190 pCI-VSVG Niikura ve ark., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japonya)
B3001 pPAM Niikura ve ark., 2019 -
B3252 pQCXIP-EYFP Niikura ve ark., 2019 -
B3254 pQCXIP-EYFP-CENP-A WT Niikura ve ark., 2019 -
B3256 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura ve ark., 2019 -
B2806 pCGN-HA-Ubiquitin Niikura ve ark., 2019 -

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan plazmid vektörleri.

B numarası Yardımcı/ambalaj plazmid vektörleri Kombinasyon 1 Kombinasyon 2 Kombinasyon 3
B3031 psPAX2 (lentiviral gag/pol vektör) 2μg
D3032 pMD2.g (lentiviral env vektör) 2μg
B3189 pGP (retroviral gag/pol vektörü) 2μg
B3190 pCI-VSVG (retroviral env vektör) 2μg
B3001 pPAM (amphotropic yardımcı vektör kodlama retroviral gag-pol-env) 2μg

Tablo 2: (1.1.3): PBabe-EYFP-CENP-A yapılarının retrovirüs transfeksiyonunda kullanılan yardımcı/ambalaj plazmid vektörlerinin kombinasyonları.

Ek Kodlama Dosyaları. Bu dosyaları indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada EYFP-CENP-A K124R mutant ın ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi yöntemleri açıklanan EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Sonuçlarımızda, EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) üzerinde, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lisin 56 (K56) ile karşılık gelen her yerde başarılı bir şekilde saptandı. Burada açıklanan kütle spektrometresi analizi, daha önce CENP-A WT-Flag12'ninlizin 124 (K124) ubiquitylation bölgesini tanımladığımız için bir mimik yöntemidir. Bu nedenle bu yöntem farklı etiketleri ve diğer centromere-kinetochore proteinleri ile insan CENP-A proteinuygulanabilir. LC-MS/MS'ye dayalı kütle spektrometresi analizi, geniş bir protein spektrumunun potansiyel çeviri sonrası modifikasyonlarını (PtM'ler) belirlemek için yaygın olarak kabul edilir. Çeşitli tahlil/analizlerden (yani in vivo ubiquitylation tahlil, koloni büyüme dışı tahlil ve kütle spektrometresi analizi) oluşan kombinatory yöntemlerimiz, hedef protein(ler)in in ubiquitylation(lar) fonksiyonel rollerini belirlemek isteyen araştırmacılar için önerilebilir.

Ancak, bu protokol, tüm hücre döngüsü boyunca canlı hücrelerde veya belirli bir hücrede bu proteinlerin her yerde bulunan bantların saptanması ve/veya bölgeye özgü ubiquitylation(lar) belirlenmesini kapsamaz. Bu yıllarda optogenetik yaklaşımlar önemli ölçüde geliştirilmekte ve hücre sinyalizasyon sistemlerinin kantitatif çalışmaları üzerinde yüksek bir etki yaratmaktadır. Optogenetik başlangıçta tam olarak tek bileşenli, mikrobiyal opsin tabanlı sistemleri kullanarak bireysel nöronları aktive veya inhibe yaklaşımlar sağlamıştır. Şu anda, benzeri görülmemiş spatiotemporal hassasiyet ile protein aktivitesi doğal genetik olarak kodlanmış fotoreseptörler istismar tarafından kontrol edilebilir, ve çeşitli genetik kodlanmış araçlar protein fosforilasyon dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin ışık kontrolü sağlar15. Bu nedenle, optogenetik hücresel ve tüm organizma düzeylerinde spatiotemporal protein kiazan sinyalizasyon araştırmak için umut verici bir sistemdir. Işık kontrollü protein kinazlarının sayısı hızla artmakla birlikte, mevcut sayı hala sınırlıdır. Ancak, ışık kontrollü protein ubiquitylation gelişimi geciktirilir, ve fotoreseptörlerin yüksek moleküler ağırlık etiketleme wt ve mutant proteinlerin her yerde bozabilir ve fonksiyonel olarak belirtildiği gibi yerli protein fonksiyonunu değiştirebilir. Bu nedenle, daha düşük molekül ağırlığı etiketleme veya probing tekniğinin geliştirilmesi acilen ubiquitylation görselleştirmek ve / veya canlı hücresel ve tüm organizma düzeylerinde spatiotemporal protein ubiquitylation sinyal araştırmak için gereklidir.

Bu çalışmada, EYFP vektör kontrolü, büyük kütle spektrometresi analizinin sonucunu doğru tartışmak için kontrol tahlil leri ve analizleri (immünofloresan analizi, koloni büyüme dışı tahlil ve in vivo ubikitiletion tahlilleri) için gereklidir. İmmünenyağış deneyinde EYFP-proteinile non-spesifik etkileşim sıklıkla gözlenir, bu nedenle EYFP-erimiş proteinin gerçek etkileşimini değerlendirmek için EYFP vektör kontrolü vazgeçilmezdir. RPE-1 CENP-A-/F hücrelerinde ifade edilen EYFP-CENP-A K124R kullanarak yapılan kütle spektrometresi analizlerimizDE EYFP polipeptid dizisinde lisin sitelerinde her yerde rastlanma gösterilemedi. Ancak, diğer bilinmeyen koşullarda, EYFP polipeptid dizisinde lizin sitenin YÜKSEK molekül ağırlığı na göre eyfp ve/veya diğer etiketli füzyon proteininde her yerde olması beklenebilir.

Koloni büyüme tahlilleri için, retro-Cre virüs enfeksiyonu ve pBabe-EYFP-CENP-A oluşturur protein ekspresyonu sonra endojen CENP-A protein tükenmesini onaylamak için batı leke analizi için hücrelerin toplanması tavsiye edilir. Bu şekilde, koloni büyüme fenotip gerçekten eksojen CENP-A WT veya mutantların tek ifade nedeniyle olup olmadığını yargılayabilirsiniz. Herhangi bir batı leke analizi için, eğer sıyırma batı leke analizinin bir sonraki dönüşü için farklı antikorlar ile membran reblot yapılırsa, bir sonraki dönüş leke için bir önceki dönüş leke farklı antikorlar ile aynı kantitatif algılama sistemi kullanmalıdır. Bir önceki dönüş leke bantları farklı antikorlar ile bir sonraki dönüş leke membran hedeflenen bölgede tespit edilemez olduğundan emin olmalısınız. Ya da önceki dönüşün lekesiyle aynı kantitatif algılama sistemini kullanın ve önceki dönüşün lekesinde kullanılan ikincil antikorla inkübasyonun bir sonraki dönüşün farklı antikorlarla bir sonraki dönüş lekesine başlamadan önce protein bantlarının tespitine yol açıp açmadığını kontrol edin. In vivo ubiquitylation tsay için, daha büyük SDS-PAGE jel çalıştırmak için aparat kullanarak daha büyük SDS-PAGE jel çalıştırmak için önemlidir (Jel elektroforez cihazı I veya II). Ampirik olarak, daha büyük SDS-PAGE jel açıkça protein bantları ayırmak ve kötü küçük jel tespit edilmiş olabilir soluk bantların tespiti duyarlılığını artırmak (yani, protein bantları büyük jel daha keskin görünür).

Belirli bir protein kapsamlı LC-MS/MS'in çeviri sonrası modifikasyonlarını (PTM'leri) haritalamak için uygun SDS-PAGE jelini seçmek son derece önemlidir. SDS-PAGE için en yaygın olarak kullanılan jel sistemi, bir istifleme jel bileşeni ve çözücü jel bileşeni oluşan Tris-glisin jelleri kullanan Laemmli sistemidir. Bu klasik sistemde, istifleme jelinde (Tris, pH 6.8) ve çözücü jelde (Tris, pH 8.8) kullanılan tamponların pH ve iyonik mukavemeti jelin çalıştırılmada kullanılan tampondan farklıdır (Tris, pH 8.3). Bant bozulması, çözünürlük kaybı veya artifakı bantları Laemmli sisteminin yüksek alkali çalışma pH'ından kaynaklanabilir. Önceki raporda, yüksek pH'da poliakrilamidin hidrolizi nedeniyle çözünürlüğün dengesizliği ve kısa süredmesi de dahil olmak üzere, Laemmli sistemi16ile zayıf bant çözünürlüğünün başlıca nedenleri açıklanmıştır. örnek proteinlerin kimyasal değişimleri, proteinlerin sistein kalıntılarının azaltılmış disülfürlerin reoksidasyonu ve pH 5.2'de Laemmli numune tamponunda 95-100 °C'de ısıtılarak Asp-Pro proteinlerinin bölünmesi. Ticari olarak mevcut 4%-12% Bis-Tris protein jelleri Bis-Tris HCI-tamponlu (pH 6.4) ve pH ca. 7.0 geleneksel Tris-glisin jelleri aksine çalıştırılır16. Laemmli sistemi ile karşılaştıran sayısız yararları Bis-Tris sistemlerinin nötr çalışma pH tarafından oluşturulur16, yüksek stabilite ve çözme jel uzun son kullanma süresi de dahil olmak üzere, nötr pH elektroforez sırasında gelişmiş örnek protein stabilitesi keskin bant çözünürlüğü ve doğru sonuçlar, ve disülfürlerin tam azaltılması ve Asp-Pro bağlarının bölünme yokluğu. Bu raporda, ticari olarak mevcut olan %4-12 Bis-Tris protein jellerini kullanarak EYFP-CENP-A K124R proteininin(Şekil 3)PTM'lerini başarıyla haritalayabiliriz. Bu nedenle, ticari olarak mevcut 4%-12% Bis-Tris protein jelleri son derece bu amaç için kullanılması tavsiye edilir.

Belirli bir proteinin çeviri sonrası modifikasyonlarının (PTM'ler) haritalamasında, LC-MS/MS ile birleşen hedef proteinin in-gel sindirimi yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, yakınlık saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS) stratejisi ni kullanarak her yerde bulunan bölgeleri EYFP-CENP-A K124R olarak belirlemeye çalıştık. Bu nedenle, ilk önemli adım büyük miktarda ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R protein ivedi likte yüksek saflıkta EYFP-CENP-A K124R aşırı ifade hücreleri, büyük ölçüde tanımlama ve LC-MS / MS tarafından EYFP-CENP-A K124R her yerde sitelerinin teyidi kolaylaştırabilir immünoprediyokal kullanarak elde etmektir. Ubikitinated olmayan EYFP-CENP-A K124R proteininin girişimlerini azaltmak için, Batıda anti-GFP, anti-HA (Ub), anti-Ubiquitin (bkz. bölüm [6.1.6]) ve Coomassie mavi boyama (bkz. bölüm [6.1.7]) SDS-PAGE jelüzerinde her yerde bulunan EYFP-CENP-A K124R'nin konumunu tam olarak belirlemek için yapılmıştır. Son olarak, her yerde bulunan EYFP-CENP-A K124R içeren jel bandının en aza indirgenmiş bir alanı, optimize edilmiş sonuçlar elde etmek için LC-MS/MS ile birleştiğinde jel içi sindirim için çıkarıldı. Kurutulmuş peptidler LC-MS/MS çalışmadan önce yeniden oluşturulduğunda, peptidlerin daha iyi çözünürlük ve iyileşme hızına yardımcı olmak için %3 (v/v) asetonitril /2 %(v/v) formik asit kullanılmıştır. Bazen veritabanı arama gerçekten arama motorunun yaklaşık atama algoritması nedeniyle var olmayan PTM'ler neden olabilir. Böylece, başka bir kritik adım yazılım F yardımı ile her yerde peptidlerin MS / MS manuel olarak gözden geçirerek EYFP-CENP-A K124R ubiquitination siteleri onaylamak için(Malzeme Tablosu),hangi ortadan kaldırabilir "gerçek dışı" heryerde siteleri veritabanı arama tarafından yaklaşık atama tarafından tanıtıldı. Özetle, bu AP-MS stratejisi, önemli biyolojik öneme sahip EYFP-CENP-A K124R ubiquitination sitelerinin belirlenmesi için etkin ve sağlam bir boru hattı oluşturmuştur. Daha da önemlisi, bu boru hattı da yaygın olarak çeşitli fonksiyonel proteinlerin PTMs araştırmak için uzatılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Acknowledgments

Biz Model Hayvan Araştırma Merkezi' nde Chao-Jun Li teşekkür, Nanjing Üniversitesi kütle spektrometresi analizi için. Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa ve Model Hayvan Araştırma Merkezi, Nanjing Üniversitesi ve Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü'ndeki mevcut araştırmacılara yararlı tartışmaları, deneysel rehberlikleri ve reaktifleri için teşekkür ederiz. Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago ve Dawn S. Chandler'a cömert reaktif hediyeleri için teşekkür ederiz. Y.N., Jiangsu Eyaleti ''Double- First-Class'' İnşaat Fonu tarafından desteklendi. Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Fonu (SBK2019021248), Jiangsu Eyaleti 16Altı Büyük Yetenek Peaks Fonu (TD-SWYY-001), Jiangsu Eyaleti "Yabancı Uzman Yüz Yetenekler Programı" Fonu (SBK2019010048) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31970665). Bu çalışma kısmen NCI hibe R21 CA205659 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

Biyoloji Sayı 160 centromere kinetokore mitoz CENP-A post-translation PTM ubiquitylation kütle spektrometresi analizi
EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter