Summary
CENP-A泛化是CENP-A在中心区沉积的重要要求，通过细胞分裂之间的二化遗传，对细胞的生存能力不可或缺。在这里，我们描述质谱分析，以确定EYFP标记CENP-A（EYFP-CENP-A）蛋白的泛化。
Abstract
研究基诺胆和中中心体的结构与动力学对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展非常重要。染色体的位置和功能如何确定中心（即中心体特性）并参与准确的染色体分离是一个根本问题。CENP-A被建议为中心鉴定的非DNA指标（表观遗传标记），CENP-A泛化是中心体沉积所需的，通过细胞分裂之间的二化遗传，对细胞的生存能力不可或缺。
在这里，我们描述质谱分析，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，这表明，由于CENP-A K124R突变蛋白中的EYFP标记，在不同的LyFP标记诱导了不同莱氨酸的泛基化。通过质谱分析，成功识别了EYFP-CENP-A K124R中的莱辛306（K306）泛化，与CENP-A中的莱氨酸56（K56）相对应。使用GFP/EYFP或标记高分子量蛋白质作为分析蛋白质功能的工具时讨论了一个警告。目前还讨论了对泛基带的检测、对位点特异性泛基化的识别以及活细胞或整个细胞周期中特定单细胞泛化的可视化的技术限制。
本文介绍的质谱分析方法可应用于具有不同标签的人类CENP-A蛋白和其他中分蛋白。这些组合方法由几种分析/分析组成，可以推荐给有兴趣识别泛基化功能作用的研究人员。
Introduction
在大多数真核生物中，主轴微管必须附着在每条染色体的单个区域上，称为中心。基内托多尔是位于百分中心附近的蛋白质复合体。研究中胸和基内托多尔蛋白运动的时间以及基内托丘尔和中心体的结构对于了解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展非常重要。关键问题是如何确定中心仪的染色体位置和功能（即中心身份），以及它们如何参与准确的染色体分离。在大多数物种中，含有一种称为CENP-A的特定组蛋白的特殊核细胞的存在定义了中位认同。因此，建议CENP-A是中心标识的非DNA指标（表观遗传标记）。阐明CENP-A如何定义人类中中心身份的机制非常重要。
Holliday结识别蛋白（HJURP）是CENP-A特异性伴郎，它沉积在中中心核,体,1、2、3中。3我们之前曾报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连结对于Lysine124（K124）和中圆素定位4的CENP-A泛基酶是必需的。此外，我们的结果表明，新合成的CENP-A的中程招募需要预先存在的泛基化CENP-A5。因此，提供了一个模型，表明CENP-A泛基化是通过细胞分裂之间的二化遗传的。
与我们的发现和余等人的调查结果相反，最近发表了关于CENP-A及其中心定位的负面结果。文章称，CENP-A对莱辛124（K124）的修改对于人类中心体的建立、维持和长期功能是可有的，基于其负面结果表明，K124R的突变不影响CENP-A中心体定位，两者细胞的生存能力6。然而，在他们的结果和结论中有足够的空间进行辩论，我们已经在他们以前的出版物7中描述了什么问题。需要注意的是，它们将蛋白质与CENP-A融合在一起，其分子量比内源CENP-A大得多：例如，它们将+30 kDa增强性黄色荧光蛋白（EYFP）融合到+16kDa CENP-A，并分析了RPE-1 CENP-A K124R融合蛋白中的RPE-1CENP-A-F-F淘汰系统。根据结构预测4，K124泛素预计不会直接与HJURP结合，但是，单泛素的添加预计将对CENP-A的蛋白质构象产生影响。CENP-A构象的蛋白质可以通过大型融合蛋白的存在来改变，这种构象变化可能掩盖由泛基化损失引起的结构变化。我们建议，大尺寸蛋白质的融合在EYFP-CENP-A K124R突变体中诱导K124以外的Lysine泛基化，而另一个站点的这种泛基化抑制/掩盖原始的K124R单突变表型。CENP-A K124R突变蛋白中具有大标签蛋白（EYFP）的不同莱辛发生泛基化的证据，在我们的上一份出版物8中报道。研究发现，EYFP标记诱导EYFP-CENP-A K124R的另一个莱辛站点的泛化，EYFP-CENP-A K124R突变体与HJURP结合。因此，在另一个站点的这种泛化抑制/掩盖了原始的K124R单突变体，EYFP-CENP-A WT和K124R突变体都显示出百分位定位（我们使用并比较了pBabe-EYFP-CENP-A WT和K124R突变体，以及pBabe-FPEY控制）。结果表明，标记或未标记的CENP-A K124R突变体是致命的，但可以通过单比素融合来拯救，这表明CENP-A泛化对于细胞的生存能力是必不可少的。
近年来，许多研究已经开发出不同的分析方法，以识别CENP-A蛋白和其他中端细胞-基内托托蛋白的翻译后修饰（PTMs），包括体内和体外,9、10、11。,1011与组蛋白的PTM类似，作为调节染色质功能的主要机制，中分色染色质成分的PTM也参与调节中分素整体结构和功能的基本机制。大多数CENP-A PTM位点特定于CENP-A含核糖体，尽管其中一些在组蛋白H3中保存，这表明这些残留物的修饰有助于中分中心特异性功能。CENP-A的PTM包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛化，9日曾报道过，这表明CENP-A在其氨基元和C-术语组蛋白折叠域上受到各种PTM及其组合阵列的影响。CENP-A 在多个函数中修改的重要性被包括我们在内的许多团体所揭示。这些功能涉及CENP-A在中心沉积，蛋白质稳定性，和CCAN（构成中心相关网络）的招募9。然而，CENP-A PPTM 的有限研究和发现是预先形成，其中比较与直接或间接调节其功能的规范组体之一进行比较。侧重于确定这些 CENP-A PPTM 方法的技术报告也有限。
由于CENP-A泛化是CENP-A在中心12的沉积所需要，通过细胞分裂5之间的二化遗传，对细胞活力8不可或缺，因此，识别CENP-A泛化的方法在未来对于研究中心的功能活性、定位和结构至关重要。因此，在这里我们描述质谱分析，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，表明EYFP标记在CENP-A K124R突变蛋白8中诱导不同莱辛的泛基化。提出了其他控制测定和分析（免疫荧光分析、菌落生长测定和体内泛化分析）的规程，以恰当地讨论主要质谱分析的结果。
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Protocol
1. pBabe-EYFP-CENP-A构造的细胞培养和逆转录病毒转染
注：EYFP-CENP-A 以与内源 CENP-A 相似的蛋白质水平从 pBabe-EYFP-CENP-A 表示。总细胞CENP-A蛋白被这种EYFP-CENP-A所取代，在CENP-A-/F等位-/F基因被Cre重组酶破坏后，如RPE-1 CENP-A-/--细胞6。
- 使用293T包装细胞制备含有逆转录病毒的上一症。
- 第 0 天：将 293T 包装细胞铺在 6 井培养板（1.0 x 106细胞/井）上。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。在 37 °C 的大气中孵育细胞，在 5% CO2 的大气中孵育 24 小时。
注：为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。 - 第1天：在扩散后23小时左右准备转染反应（24小时点是转染的0小时点）。每个 pBabe-EYFP （B3182）、pBabe-EYFP-CENP-A WT （B3161） 和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R （B3164） 的异质表达质粒（参见表 1）。
- 选择表2中列出的帮助器/包装质粒组合，并将其添加到包含上面列出的质粒之一的管中。帮助者/包装质粒的这3种组合大多有这3种组合（表2）。任何组合在这些实验中都有效，并显示出类似的转染效率。
- 制备 50 μL 的减少血清介质，并混合每个 pBabe-EYFP （B3182）， pBabe-EYFP-CENP-A WT （B316） 的 2.0 μg 1）和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R （B3164） （见表1） 添加表 2 中列出的帮助器/包装质粒的一种组合（见下文）。在室温下孵育这种混合物5分钟。这种混合物是溶液 A。
- 再制备 50 μL 的减少血清介质，并分别混合 1.5 μL 的转染试剂 I 和 II（材料表）。在室温下孵育这种混合物5分钟。这种混合物是溶液B。
注：可选地，在溶液B中只添加6.0μL的转染试剂III（聚乙烯胺[PEI];1.0mg/mL），或在溶液B（材料表）中添加6.0μL的转染试剂III和II。 - 将溶液 A 和 B 混合在一起，在室温下孵育 15 分钟。
- 使用 PBS 洗涤培养细胞一次后，将溶液 A 和 B（即 DNA 脂复合物）的混合物直接添加到具有 500 μL 减少血清介质的 6 井培养板的每个井中。质粒的最终浓度为3.3μg/mL。
- 在 37 °C 下在 5% CO2的大气中孵育细胞 4.5 小时后，使用 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素将中高葡萄糖 DMEM 更改为高葡萄糖 DMEM。在6井培养板中介质变化后，将培养介质的2mL/井。
- 转染后48小时，在37°C的大气中培养细胞，2在5%CO2的大气中。使用含有逆转录病毒的上一名上一名，于第3天进行逆转录病毒感染。
- 第 0 天：将 293T 包装细胞铺在 6 井培养板（1.0 x 106细胞/井）上。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。在 37 °C 的大气中孵育细胞，在 5% CO2 的大气中孵育 24 小时。
- CENP-A-/F-/F RPE-1靶细胞的逆转录病毒感染。
- 第2天：感染前一天，传播CENP-A-/F RPE-1靶细胞，在6井培养井（2.25 x 105细胞/井）中转染。DMEM中的培养细胞：F12培养基（材料表），具有10%FBS和1%青霉素链霉素。
注：传播细胞的菌落生长分析，免疫荧光，和西部印迹分析作为控制。为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。 - 第3天（病毒感染日）：在293T包装细胞转染后48小时，收集含有病毒的上清液，并通过0.45μm过滤器过滤（不要使用0.2μm过滤器，将剪切病毒包络）。建议使用聚氨酯 （PES） 过滤器。
- 感染CENP-A-/F RPE-1细胞与病毒。对于 6 井培养板的一个井，在 8 μg/mL 的最终浓度中加入 1 mL 新鲜介质、1 mL 病毒上细剂和多纤维素。在37°C的大气中孵育CENP-A-/FRPE-1细胞，在5%CO2的大气中孵育4天，直到转染后的第7天。-/F
注：CENP-A-/F RPE-1细胞生长的潜伏期必须通过以下分析确定，以获得最佳结果。
- 第2天：感染前一天，传播CENP-A-/F RPE-1靶细胞，在6井培养井（2.25 x 105细胞/井）中转染。DMEM中的培养细胞：F12培养基（材料表），具有10%FBS和1%青霉素链霉素。
2. 含有pBabe-EYFP-CENP-A的细胞的免疫荧光分析
- 第 7 天： 在 pBabe - Eyfp - cenp - A 构造的逆转录病毒感染后 4 天， 通过渴望去除培养基。用 TBS 冲洗细胞一次（25 mM Tris-HCl，pH 7.5;125 mM NaCl）。将 TBS 涂抹在培养井的一侧，以避免干扰细胞表面。
注：必须根据经验确定细胞固定的最佳时间点。EYFP-CENP-A WT 和 K124R 的免疫荧光信号在 pBabe-EYFP-CENP-A 构造的逆转录病毒感染后至少 4 天在中心可检测到，即使没有 Cre 感染（数据未显示，图 1C-E用于 Cre 感染数据）。 - 执行甲醇细胞固定和免疫荧光染色，如前面所述13。
- 由于原抗体使用抗GNP抗体（1：1，000稀释）和抗CENP-B抗体（稀释比1：200）在含有4%山羊血清的TBS中用于百分之一色位置标记（参见使用抗体的材料表）。
- 用纸巾去除多余的安装介质，并在最后一步用指甲油密封盖玻片的边缘。
- 请参阅前面描述的方法13，用于免疫荧光图像观察、采集、定量和分析 EYFP-CENP-A 在百分中心的剩余信号。
- 使用软件 A 或软件 B1 和 B2 执行图像采集、处理，包括去卷积、量化和分析（参见材料表）。可选地使用软件C1-C3（见材料表）作为共和激光扫描显微镜。
注：有关软件 A 中使用的所有命令，请参阅补充编码文件中的 2.6.1。有关软件 B1 和 B2 中使用的所有命令，请参阅补充编码文件中的 2.6.2。
3. 在复古克里病毒感染后使用 pBabe - Eyfp - cenp - a 进行殖民地生长分析
注：进行此检测的原因是比较 EYFP-CENP-A WT 和 K124R 突变体之间的细胞生存能力，在 Cre 重组酶中断后（在完全细胞 CENP-A 蛋白替换后）。
- pBabe-EYFP-CENP-A 构造的逆转录病毒转染。
- 执行CENP-A-/F RPE-1细胞的逆转录病毒转染，如第1节所述。-/FDMEM 中的培养细胞：F12 培养基，病毒感染后 72 小时，具有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素。
- pBabe-EYFP-CENP-A构造的逆转录病毒感染三天后（第6天），在含有转染细胞的井中加入沙基丁S（10μg/mL），用于菌落生长测定和控制实验。细胞在病毒感染后至少14天生长，在爆炸性S.每5天改变一次含有爆炸基丁S的介质。
注：如果细胞在种子化菌（3.2.7.和3.2.8）播种前达到约80%的汇合，则通过6井培养板的三聚和电镀以1：2和1：5的比例通过细胞。 - 收集细胞的西部印迹第7天，以确认pBabe-EYFP-CENP-A构造的蛋白质表达没有Cre感染。执行西部印迹分析，如第 4 节所述。结果如图1B（通道1-4）所示。
- 对于与Cre病毒感染的菌落生长检测，保持细胞生长14天后，病毒感染存在爆炸性S（即，生长细胞在爆炸基丁S含有介质，直到第17天这里显示的结果）。
- pBabe- puro - cre 的复古克雷病毒感染
注：步骤 3.2.1 中的第 0 天对应于第 3.1 节的第 13 天。- 第 0 天至第 3 天：使用 pBabe-puro-Cre （B3027） 作为表达质粒，执行CENP-A-//F RPE-1 细胞的逆转录病毒转染（详情见第 1 节）。确保在培养基中添加气砂基丁 S （10 μg/mL）。
- 第4天：对细胞进行尝试，将其从盘子中分离出来。在6井培养板中，板500或5000个细胞三分之一。DMEM 中的培养细胞：F12 培养基，具有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素。
- 第5天：向培养基中加入气砂基丁S（10μg/mL）。对于 5，000 或 500 个细胞的电镀，选择具有气化 S （10 μg/ml） 的细胞 3-24 天（直到第 14 天在 [3.2.7]） 或 3-28 天（直到第 18 天在 [3.2.8]） 病毒感染的构造 （pBabe-EYFP-CENP-A 构造）。
注：在这个殖民地的外延检测中，pBabe-puro-Cre的转染与pBabe-EYFP-CENP-A的转染一起添加。pBabe-EYFP-CENP-A 的转染在 3.1 中执行。pBabe-puro-Cre 的转染在 3.2.1 中执行。 - 第10天（逆转录病毒感染后7天）：收集细胞进行西部印迹分析，以确认逆基病毒感染后内源性CENP-A的蛋白质耗竭和/或pBabe-EYFP-CENP-A构造在同一天的第10天。
- 执行西部印迹，如第 10 天第 4 节所述。结果如图1B 所示（通道 5-7）。
- 执行免疫荧光分析（上文第 2 节），确认 EYFP-CENP-A WT 和 K124R 在剩余内源 CENP-A 等位基因灭活 7 天后局部化到中心。结果如图1 C-1E所示。
- 第14天：用5000个细胞种子的盘子进行菌落生长测定。在水晶紫罗兰溶液中修复10分钟的甲醇和染色10分钟（2.3%水晶紫罗兰，0.1%的氧化铵，20%乙醇（见图2B）。计算使用 OpenCFU 软件的殖民地数量（参见图 2C）。
- 第18天：使用用500个细胞播种的盘子。修复和染色细胞，如步骤3.2.7所述（参见图2B）。计算菌落的数量（参见图2C）。
4. 使用 pBabe-EYFP-CENP-A 进行西方印迹分析
注：请参阅前面描述的方法13，使用图1B和图2A所示的抗体进行西式印迹分析，以及EYFP-CENP-A蛋白材料表。 Table of Materials
- 通过分离不同病毒感染的细胞来分离蛋白质。然后，在SDS PAGE凝胶的一个井中使用20μg的蛋白质。如前13所述，将蛋白质转移到PVDF膜上。
- 用初级二级抗体孵育后洗膜3倍。使用红外成像系统和/或化学发光成像仪检测和分析膜上的蛋白质带，用于免疫光。这些结果如图1B和图2A所示。
- 有关红外成像系统检测和分析蛋白质波段，请参阅补充编码文件中的步骤4.2.1。 Supplemental coding files
- 使用化学发光成像器检测和分析蛋白质波段，参见补充编码文件中的步骤4.2.2。 Supplemental coding files对于该系统，请使用超灵敏增强型化学发光（ECL）基板（材料表）。
- 可选地，使用西印脱液缓冲液从PVDF膜中剥离预孵化的抗体，并结合不同的抗体进行再剥离，用于下一轮西方分析。通过经验确定优化的孵育时间和使用温度。
5. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行细胞培养、转染和体内泛化测定
注：从pQCXIP载体表达的EYFP-CENP-A蛋白水平比内源性CENP-A蛋白水平高10倍。这种载体的使用有助于免疫沉淀更高数量的EYFP-CENP-A蛋白，观察EYFP-CENP-A的泛基化带，并通过质谱分析鉴定EYFP标记CENP-A（EYFP-CENP-A）蛋白的泛基化。
- 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行体内泛化测定的转染。
- 种子 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 细胞在10厘米组织培养皿中。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。
注：为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。为一个免疫沉淀（IP）样品准备至少2个菜，以获得至少1毫克的总蛋白质。 - 在37°C的大气中孵育细胞，在5%CO2的大气中孵育18小时。
- 播种后17小时，准备转染试剂。
- 通过混合每个 pQCXIP-EYFP （B3252）， pQCXIP-EYFP-CENP-A WT （B3254）， pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R （B3256） （表1） 在 335 μL 的减性血清介质中， 并在室温下孵育5分钟，在所有样品中加入6.7μg的pCGN-HA-泛素（B2806）。
注：所有向量都列在表1 中。 - 将10.1μL的转染试剂II和II混合，分别混合在335μL的血清介质中，并在室温下孵育5分钟，使溶液B化。
注：可选步骤是仅在溶液B中添加40.2μL转染试剂III（聚乙烯胺[PEI];1.0mg/mL），或在溶液B（材料表）中添加40.2μL转染试剂III和II）。 - 将溶液 A 和 B 混合在一起，在室温下孵育 15 分钟。
- 使用 PBS 清洗培养细胞一次后，将溶液 A 和 B（即 DNA 脂复合物）的混合物直接添加到每个具有 3.35 mL μL 减少血清介质的单个 10 厘米组织培养盘中。
注：质粒的最终浓度为1.67μg/mL。 - 用5%CO 2孵育细胞，4.5小时2。4.5小时后，用10%FBS和1%青霉素链霉素将中高血糖DMEM改变。
- 转染后48小时，在37°C下用5%CO2培养细胞。收集细胞，用于细胞酸盐制备。
- 种子 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 细胞在10厘米组织培养皿中。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。
- 制备蛋白质 A 珠与抗 GFP 抗体结合。
- 服用25μL（50%v/v）蛋白质A珠，用于免疫沉淀（IP）的一次反应。用缓冲器 A1 （材料表） 清洗至少 3 倍以去除 EtOH， 使用缓冲液 A1 （20 mM Tris-HCl， pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% 非化物 P-40; 0.5% 脱氧二酯; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; 完整的无 EDTA 蛋白酶抑制剂试剂）
- 将2.0μL的抗GP抗体（抗#76：自制抗体）添加到上面制备的珠子中，并加入10倍的缓冲量 A1 与净珠体积进行比较。
- 在 4 °C 下进行端到端旋转 4-18 小时。端到端旋转的最佳时间长度必须根据免疫沉淀的效率从经验上确定。
- 将珠子以 100 x g离心 1 分钟，然后取出未绑定的上一代。添加缓冲区 A1 以重新制作珠子的 50% （v/v） 溶液。使用此溶液的 25 μL （50% v/v） 进行 IP 的一次反应。
- 使用蛋白质 A sepharose 珠与抗 GFP 抗体结合的免疫沉淀 （IP）。
- 在缓冲器 A1 中通过声波和冷冻解冻过程获得步骤 5.1.9 中的 Lyse 细胞。
- 测量不同IP样品的蛋白质浓度并使其蛋白质含量正常化。从每个管中取出 5% 的样品，以 SDS-PAGE 中的 5% 输入样品运行。
注：如果一天内未加载，5% 输入样品可冷冻在液氮中，并储存在-80°C。 - 将其余95%的解酶与25μL（50%v/v）的蛋白质 A 珠混合，该珠子结合在步骤5.2中制备的抗GFL抗体。在 4 °C 下进行端到端旋转 4-18 小时。
注：端到端旋转的最佳时间长度必须以经验方式确定。 - 离心蛋白与蛋白质结合的珠子（即免疫沉淀物）与100 x g1分钟，并去除上清液。用缓冲液 A1 用缓冲液洗涤免疫沉淀物，在 100 x g下离心 1 分钟。执行此步骤 4x。
- 将 5% 输入和其余 95% 免疫沉淀物分别与 2x 和 4x SDS-PAGE 加载缓冲液14混合。将这两个样品煮5分钟，然后将它们装在10.0%的变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，用于不同通道中的电泳。使用更大的 SDS-PAGE 凝胶（例如，17 厘米 x 15 厘米）进行电泳。如果样品在较小的凝胶中运行，则可能无法观察到透明/锐利的泛化带。
- 使用上一份报告8中所示的抗体进行西方印迹分析，如第4节所述。结果如图2A所示。
- 使用西印迹剥离缓冲液从PVDF膜中剥离预孵化的抗体，并结合不同的抗体进行下一轮西部印迹分析。
6. 质谱法，用于识别EYFP-CENP-A K124R突变体泛基化位
- 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行质谱分析的转染。
- 种子CENP-A-/F RPE-1细胞在10厘米组织培养皿。检查细胞密度是36.2 x 105细胞每个菜。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。为一个免疫沉淀（IP）样品准备至少20个菜，以获得至少10毫克总蛋白（见5.3）。
注：为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。 - 在 37 °C 的大气中孵育细胞 5% CO2 18 小时。在扩散后准备转染试剂 = 23 小时（24 h 点是转染的 0 h 点）。
- 播种后17小时，将转染试剂和转染细胞准备为（4.1.3）。转染细胞有pCGN-HA-泛素（B2806）和pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R（B3256）。
- 转染后，在5%CO2的大气中孵育细胞，48小时2。收集细胞的细胞。
- 缓冲液A1中的酶细胞，执行免疫沉淀（5.2）和（5.3）。运行这两个免疫沉淀物如下 （6.1.6） 和 （6.1.7）。
注：在 （6.1.6） 中，在标准三叶甘油凝胶中运行样品。在 （6.1.7） 中，在市售的 4%-12% 的 Bis-Tris 蛋白凝胶中运行样品。另请参阅讨论。 - 保留一个样本，用于总免疫沉淀物的 10%，以确认 EYFP-CENP-A 泛化，并精确确定泛化 EYFP-CENP-A 的位置，如第 5 节所述。在标准的三叶甘油凝胶中运行此示例。SDS-PAGE 和西部印迹执行为 （5.3）。
- 为 90% 的总免疫沉淀物保留另一个样本，用于质谱分析。在市售的 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶的两口井内运行此样品。使用库马西蓝色溶液执行库马西蓝色染色。切入并切出50-70 kDa的凝胶区域（单-Ub-EYFP-CENP-A K124R区域）。使用此凝胶区域进行质谱分析。
- 种子CENP-A-/F RPE-1细胞在10厘米组织培养皿。检查细胞密度是36.2 x 105细胞每个菜。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。为一个免疫沉淀（IP）样品准备至少20个菜，以获得至少10毫克总蛋白（见5.3）。
- 使用凝胶内消化进行质谱分析。
- 将每个凝胶片切成小块（1 mm2），放入0.5 mL的蛋白质低结合管中。
- 用 100 μL 50% （v/v） 乙酰二角液在 25 mM NH4HCO3中洗涤，涡流 10-15 分钟，向下旋转，丢弃上流水线，重复 3 倍。
- 使用台式真空浓缩器将样品浓缩 30 分钟，以干燥凝胶片。
- 加入10μL的10纳克/μL测序等级的三辛，让凝胶片补充水分5分钟。
- 加入 25 mM NH4HCO3足以覆盖凝胶片，在 37 °C 下消化过夜。
- 将消化的上清液转移到干净的0.65 mL硅化管中。加入50%（v/v）乙酰酸/5%（v/v）甲酸（30μL或足以覆盖），涡流10分钟，旋转并转移到同一个萃取管中。重复 3x 。
- 将 10 μL 乙酰酸盐加入凝胶片中，涡流 5 分钟，然后向下旋转。将上一液转移到同一管。
- 使用台式真空浓缩器将样品浓缩至 2 μL，将 8 μL 3%（v/v） 乙酰酸 /2% （v/v） 甲酸添加到样品中，涡流 15 分钟，以 16，000 x g 旋转30 分钟。样品可进行质谱分析。
- 使用液相色谱系统（材料表）和质谱仪（材料表）使用LC-MS/MS执行MS数据采集。
- 将8μL的重组样品注入反相液相色谱（RPLC）柱上。
- 在60分钟内用2-80%的溶剂B梯度分离肽。 确保梯度由溶剂 B 在 40 分钟内从 2% 到 22% 增加百分比组成，在 12 分钟内从 2% 到 35% 溶剂 B 增加百分比，然后在 4 分钟内爬升至 80% 溶剂 B，最后保持 80% 溶剂 B 的最后 4 分钟。将流速常数设置为 300 nL/min。
注：溶剂甲含有0.1%的甲酸和2%的乙酰三叶酸，甲酸溶剂B含有0.1%的甲酸和98%的乙酰三叶酸。所有浓度都显示为体积/体积。 - 使用依赖于数据的采集模式收集质谱数据。简言之，在 250 ms/z 中收集 MS 光谱 250 ms. 选择充电为 2~5 的 50 个强烈前体，以进一步分段。收集MS/MS光谱在100~2000米/z100 ms，排除前体离子从15 s的重选。
- 对于数据库搜索，请打开商业软件（参见材料表），分析桌面上的质谱数据。
- 要进行新的搜索，请单击顶部菜单上的"LC"按钮。然后单击"添加"按钮上传原始 MS 原始数据文件。
- 选择"人蛋白ID"中的"Paragon方法"作为数据库搜索方法。根据 UniProt Homo Sapiens 数据库（包含 160，566 个序列（包含 160，566 个序列）搜索原始 MS 原始数据http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640）。
- 将搜索参数设置为以下内容：选择trypsin作为消化酶，允许多达 3 个缺失的裂解，4 个修饰和每个肽 2-5 个电荷。为第一次搜索设置高达 20 ppm 的质量误差，为碎片离子设置 0.02 Da。为小于1% 的蛋白质、肽和修饰位点指定错误发现率 （FDR） 阈值。将软件中的所有其他参数设置为默认值（有关质谱分析，请参阅图3）。
- 单击顶部菜单右侧的"另存为"按钮，选择用于存储搜索结果的文件夹，输入搜索名称，然后单击"保存"按钮。
- 单击顶部菜单右侧的"进程"按钮开始搜索。搜索结束后，输入的搜索名称的数据将自动存储在所选文件夹中。软件 F 可以轻松打开数据。
- 要获取任何特定肽的 MS/MS 光谱，请双击搜索结果以通过软件 F 打开它。首先，单击菜单顶部蛋白质列表中的蛋白质，然后单击菜单中间的肽。此肽的 MS/MS 显示在菜单底部。
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Representative Results
EYFP-CENP-A K124突变体显示泛基化，与HJURP相互作用，且百分位定位无缺陷，两者无细胞杀伤性。在这里，Fachinetti等人（2017年）报告的系统被重新构成：在二倍体人类（RPE-1）细胞携带一个中断和一个'漂浮'CENP-A等位基因（CENP-A-/F），EYFP-CENP-A从pBabe-EYFP逆转录病毒载体表达。CENP-A-/F在这个系统中，CENP-A-/F等位基因的内生CENP-A的表达可能被Cre重组酶6破坏。-/FEYFP-CENP-A WT或K124R突变体（图1A）的基因构造在进行逆转性整合时稳定地表达，它拯救内源性CENP-A的损失。CENP-A-/F等位基因的内生CENP-A-/F的剩余表达随后被Cre重组酶中断。内源性CENP-A的表达在Cre重组酶的诱导7天后未检测到（图1B，车道5-7）。EYFP-CENP-A WT 和 K124R 蛋白表达均与初始内源 CENP-A 蛋白水平相似（图 1B，车道 3、4、6 和 7）。EYFP-CENP-A WT 和 K124R 突变体在CENP-A-/F-/F等位基因内源性 CENP-A 的剩余表达中断后 7 天内显示中端定位（图 1C-1E）。EYFP-CENP-A WT 和 K124R 突变体都显示泛化和与 HJURP 的相互作用，与标记标记或未标记的 CENP-A WT 和 K124R 突变体（图 2A;未显示标记或未标记的 CENP-A 的数据）8 的情况不同。细胞的生存能力也通过执行菌落生长测定14天后，其余的内源CENP-A等位基因中断（图2B）得到解决。EYFP-CENP-A WT 和 K124R 突变体在其余内源CENP-A等位基因中断 14 天后显示类似数量的"获救"菌落（图 2B 和 2C）。因此，我们的结果与法奇内蒂等人报告的结果一样。
EYFP-CENP-A K124R 中Lysine 306 （K306） 的泛化通过质谱分析揭示了。研究发现，EYFP-CENP-A WT和K124R突变体都显示泛化和与HJURP的相互作用，与标记标记或未标记的CENP-A WT和K124R突变体（图2A;未显示标记或未标记CENP-A的数据）8。这些结果表明，EYFP蛋白的融合在EYFP-CENP-A K124R突变体中诱导K124以外的Lysine的泛基化，而另一个站点的这种泛基化促进EYFP-CENP-A K124R与HJURP的相互作用。EYFP-CENP-A K124R 中 Lysine 306 （K306） 的泛甲基化在CENP-A-/F 细胞中通过 IP 质谱分析（图 3A 和图3B） 显示。EYFP-CENP-A K124R 中的莱辛 306 （K306） 对应于 CENP-A 中的莱辛 56 （K56）。综合起来，我们的结果表明，大尺寸蛋白质（例如EYFP标记）的融合在CENP-A中，在K124以外的lysine上诱导泛基化，而另一个站点的这种泛基化抑制/掩盖了原始的K124R单突变表型。
图1：EYFP-CENP-A K124突变体在中心中心进行突变。（A） 在N术语中标有EYFP（增强黄色荧光蛋白）的不同CENP-A蛋白结构的表示。红色字母标记在指示结构中 K124R 氨基酸替代的位置（左图）。本研究中进行的测定结果显示（右）。（B） 西方印迹分析未显示存在可检测的内生CENP-A.免疫吹风分析，以检查在Cre感染之前和之后是否存在指示的救援构造（约45 kDa）。在Cre感染之前（通道1-4）和Cre感染（车道5-6）之前，pBabe-EYFP构造的蛋白质表达得到确认。在Cre感染后7天收集的CENP-A-/-----细胞系中确认了内源性CENP-A蛋白（约15kDa）的缺失。GAPDH蛋白被用作载荷控制。（C） EYFP-CENP-A K124突变体在中心中心进行突变。CENP-A-/F RPE-1细胞与指示构造共同感染，在逆转录病毒感染后7天培养，并进行免疫污染。DAPI（蓝色）、EYFP（绿色）和内生 CENP-B（红色）的可视化，用作中心位置控制。比例杆，10 μm。（D） （C） 中所示的定位模式汇总为直方图。每个实验（n = 3个实验）计算了200多个具有EYFP阳性信号的相间细胞，并显示了平均百分比（+SD）。"'其他（非中心）"描绘了大部分受损的细胞，死细胞，或细胞核定位的相间，这是由于转染或其他治疗观察到的。与 WT（学生 t-测试）相比，K124R 中未观察到显著 （n.s.） 差异。（E） （C） 所示的中点器的 EYFP 派生信号被量化。信号与 WT 信号规范化，显示平均百分比 （+SEM）。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：EYFP-CENP-A K124突变体泛化并与HJURP相互作用，细胞生存能力不受EYFP-CENP-A K124R突变的影响。（A） EYFP-CENP-A K124突变体泛化并与HJURP相互作用。体内泛化测定。CENP-A-/F RPE-1细胞与指示的构造进行转染。使用抗GFP兔多克隆抗体的5%细胞解酶（输入）和免疫沉淀物（IP）中的蛋白质，由西方印迹分析使用所指示的抗体检测。指示使用二元 EYFP-CENP-A （**） 和单核 1-EYFP-CENP-A （*） 。这个数字已经修改了从Niikura等人8。（B） 来自殖民地的代表图像，如在 EYFP-CENP-A 指示的转染剂的两种不同条件（{1} 和 {2}）方案（顶部）中所示。（C） （B） 中实验的殖民地生存的直方图。超过 3 个独立实验 （n = 3） 的均百分比 （+SEM） 与 EYFP-CENP-A WT （EYFP-WT） 中存活菌落的百分比进行规范化。与安永FP控制（学生 t 测试）相比，p < 0.0001 和 **p < 0.01。与 WT（学生 t-测试）相比，K124R 中未观察到显著 （n.s.） 差异。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：质谱分析检测出泛基化EYFP-CENP-A K124R肽片段。（A） EYFP-CENP-A K124R在RPE-1 CENP-A-/F细胞中，在EYFP-CENP-A-/F细胞的莱辛306（K306）中泛碱化的证据。EYFP-CENP-A K124R 的莱辛 306 （K306） 对应于 CENP-A 中的莱氨酸 56 （K56）。LQKLRGGSTHLLIR 肽（覆盖率 95.9%，置信度 87.8%）通过碰撞引起的分离分析进行标识。在碎片过程中检测到的（A）光谱中b（绿色）和y（红色）离子的m/z（Da）值在（B）表中以绿色突出显示。K306 的泛化由 b-3 离子 （m/z 753.4730） 和 y-8 离子 （m/z 1350.8328） 的 LRGG 图案（不完全裂解）得到确认。（B） 该表突出显示（A）光谱中 b（绿色）和 y（红色）离子的 m/z （Da） 值。表（B）中的LQK [Umc] STHLLIR 表示 （A） 中显示的 LQKLRGGSTHLLIR 肽。这些数字已经修改了从Niikura等人8。请单击此处查看此图的较大版本。
| B 编号 | 相关特征 | 参考 | 源 |
| B3027 | 帕贝 - 普洛 - 克雷 | Niikura等人，2019年 | 阿姆鲁塔·阿什特卡尔博士，劳伦斯·基尔希内尔博士 |
| B3182 | 帕贝 - 埃夫普 | Niikura等人，2019年 | - |
| B3161 | 宝贝 - Eyfp - cenp - a Wt | Niikura等人，2019年 | 丹尼尔·法奇内蒂博士，唐·克利夫兰博士 |
| B3164 | pbabe - Eyfp - cenp - A K124r | Niikura等人，2019年 | 丹尼尔·法奇内蒂博士，唐·克利夫兰博士 |
| B3031 | pspax2 | Niikura等人，2019年 | 约翰·汤普森博士，古斯塔沃·里昂博士 |
| D3032 | pmd2. g | Niikura等人，2019年 | 约翰·汤普森博士，古斯塔沃·里昂博士 |
| B3189 | Pgp | Niikura等人，2019年 | 田健治博士（日本济池医学大学） |
| B3190 | pci - vsvg | Niikura等人，2019年 | 田健治博士（日本济池医学大学） |
| B3001 | 帕姆 | Niikura等人，2019年 | - |
| B3252 | pqcxip - Eyfp | Niikura等人，2019年 | - |
| B3254 | pqcxip - Eyfp - cenp - A Wt | Niikura等人，2019年 | - |
| B3256 | pqcxip - Eyfp - cenp - A K124r | Niikura等人，2019年 | - |
| B2806 | pcgn - HA - Ubiquitin | Niikura等人，2019年 | - |
表1：本研究中使用的质粒向量。
| B 编号 | 帮助器/包装质粒载体 | 组合 1 | 组合 2 | 组合 3 |
| B3031 | psPAX2 （扁病毒性咽喉/波尔向量） | 2μg | ||
| D3032 | pMD2.g （伦特处女环境向量） | 2μg | ||
| B3189 | pGP（逆转录病毒性咽喉/波尔向量） | 2μg | ||
| B3190 | pCI-VSVG（逆转录病毒向量） | 2μg | ||
| B3001 | ppam （安福热带帮助器载体编码逆转录病毒 gag - pol - env） | 2μg |
表2：使用（1.1.3）的帮剂/包装质粒载体的组合：pBabe-EYFP-CENP-A构造的逆转录病毒转染。
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Discussion
在这里，我们描述了质谱分析的方法，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，这表明EYFP标记在CENP-A K124R突变蛋白8中诱导不同莱辛的泛基化。在我们的结果中，我们通过质谱分析成功地确定了EYFP-CENP-A K124R中莱辛306（K306）的泛化，与CENP-A中的Lysine 56（K56）相对应。此处描述的质谱分析是一种模拟方法，因为我们之前识别的是 CENP-A WT-Flag12的 Lysine 124 （K124） 泛化位点。因此，该方法可应用于具有不同标签的人类CENP-A蛋白和其他中分中心蛋白。基于LC-MS/MS的质谱分析被普遍接受，用于识别各种蛋白质的潜在翻译后修饰（PTMs）。对于有兴趣确定目标蛋白泛基化功能作用的研究人员，可以推荐我们的组合方法，包括几种测定/分析（即体内泛化测定、菌落生长测定和质谱分析）。
然而，该协议不包括检测泛基带和/或识别活细胞或整个细胞周期中特定单细胞中这些蛋白质的位点特异性泛基化。这些年光遗传学方法发展迅速，对细胞信号系统的定量研究产生了很大的影响。光遗传学最初提供了使用单组分、微生物蛋白酶系统精确激活或抑制单个神经元的方法。目前，蛋白质活性具有前所未有的时空精度，可以通过利用天然基因编码的光感受器来控制，各种基因编码工具允许光控制许多生物过程，包括蛋白质磷酸化15。因此，光遗传学是一个有希望的系统，研究时空蛋白激酶信号在细胞和整个生物体的水平。光控制蛋白激酶的数量正在迅速扩大，尽管目前的数量仍然有限。然而，光控制蛋白泛基化的发展被推迟，光受体的高分子量标记可能会破坏WT和突变蛋白的泛基化，并在功能上改变原生蛋白质的功能。因此，迫切需要发展低分子量标记或探测技术，以可视化泛化和/或研究在活细胞和整个生物体水平上的时态蛋白泛化信号。
本研究认为，EYFP病媒控制对于控制测定和分析（免疫荧光分析、菌落生长测定和体内泛基化分析）至关重要，以正确讨论主要质谱分析的结果。在免疫沉淀实验中经常观察到与EYFP蛋白的非特异性相互作用，因此EYFP病媒控制对于评估EYFP-融合蛋白的真正相互作用是必不可少的。我们使用 EYFP-CENP-A K124R 在 RPE-1CENP-A-/F细胞中表达的质谱分析未在 EYFP 多肽序列中的裂氨酸位点显示泛化。然而，在其他未知条件下，EYFP多肽序列中的裂氨酸位点在EYFP-和/或其他高分子量标记融合蛋白中泛碱化。
对于菌落生长分析，建议收集细胞进行西部印迹分析，以确认逆转录克病毒感染后内源性CENP-A的蛋白质耗竭和pBabe-EYFP-CENP-A构造的蛋白质表达。这样，我们可以判断殖民地的表型是否真的由于外源CENP-A WT或突变体的唯一表达。对于任何西方印迹分析，如果执行剥离以重新剥离具有不同抗体的膜，用于下一轮西部印迹分析，则应使用相同的定量检测系统，作为下一个回合的印迹，使用不同的抗体。应确保前一回合的印迹中的带子在下一回合具有不同抗体的印迹的膜目标区域检测不到。或者使用与前一回合的印迹相同的定量检测系统，并检查使用前一回合的印迹中使用的仅二级抗体的孵育是否未导致蛋白质带检测，然后再使用不同的抗体开始下一个回合的印迹。对于体内泛基化测定，重要的是运行更大的SDS-PAGE凝胶使用仪器运行更大的SDS-PAGE凝胶（凝胶电泳装置一或II）。从经验上看，更大的SDS-PAGE凝胶将清楚地分离蛋白质波段，并增强在较小凝胶中可能检测的微弱带（即蛋白质带在较大的凝胶中显得更锐利）的灵敏度。
选择适当的 SDS-PAGE 凝胶来绘制特定蛋白质彻底 LC-MS/MS 的翻译后修饰 （PTMs） 图，这一点非常重要。SDS-PAGE 最广泛使用的凝胶系统是 Laemmli 系统，它使用由堆叠凝胶组件和分解凝胶组件组成的 Tris-甘氨酸凝胶。在此经典系统中，堆叠凝胶（Tris、pH 6.8）和分色凝胶（Tris、pH 8.8）中使用的缓冲液的 pH 和离子强度不同于用于运行凝胶的缓冲液（Tris，pH 8.3）。带失真、分辨率损失或伪影带可能是由 Laemmli 系统的高碱性工作 pH 值引起的。上一份报告描述了Laemmli系统16的带分辨率差的主要原因，包括由于高pH的聚丙烯酰胺水解而导致的解凝胶的不稳定和短的过期时间， 样品蛋白的化学改动，蛋白质半胱氨酸残留物还原氧化，以及在pH 5.2的Laemmli样品缓冲液中加热95-100°C的蛋白质的 Asp-Pro 键的裂解。市售的4%-12%的Bis-Tris蛋白凝胶是Bis-Tris HCI缓冲（pH 6.4），与传统的Tris-甘氨酸凝胶16不同，其运行水平为pHca.7.0。与莱姆利系统相比，许多优点是由Bis-Tris系统16的中性操作pH值产生的，包括解析凝胶的高稳定性和长过期期，在中性pH值电泳期间增强样品蛋白稳定性，从而产生更清晰的带分辨率和准确的结果，以及完全减少脱硫和没有分离的Apro键。在这份报告中，我们可以使用市售的4%-12%的Bis-Tris蛋白凝胶成功绘制EYFP-CENP-A K124R蛋白（图3）的PTM。因此，强烈建议用于市售的 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶。
为了绘制特定蛋白质的转化后修饰（PTMs），广泛使用目标蛋白的凝胶内消化与LC-MS/MS。在这项研究中，我们寻求使用亲和力纯化-质谱（AP-MS）策略确定EYFP-CENP-A K124R的泛化位点。因此，第一个关键步骤是利用EYFP-CENP-A K124R超表达细胞的免疫沉淀，获得大量泛素的EYFP-CENP-A K124R高纯度蛋白，这大大方便了LC-MS/MS对EYFP-CENP-A K124R的泛素位点的识别和确认。为了减少非泛素 EYFP-CENP-A K124R 蛋白的干扰， 执行了反GFP、抗HA（Ub）、反泛素（见第3.1.6节）和库马西蓝色染色（见第3.1.7节）的西部印迹，以精确确定在SDS-PAGE凝胶上泛泛的EYFP-CENP-A K124R的位置。最后，只有含有泛素EYFP-CENP-A K124R的凝胶带的最小化面积被切除，用于凝胶内消化与LC-MS/MS相结合，以获得优化的结果。当在操作LC-MS/MS之前重组干肽时，使用3%（v/v）乙酰酸/2%（v/v）甲酸来帮助提高肽的溶解度和回收率。有时，由于搜索引擎的近似赋值算法，数据库搜索可能会导致PTM并不存在。因此，另一个关键步骤是确认EYFP-CENP-A K124R泛化站点，通过手动via审查MS/MS的泛泛肽的帮助下，软件F（材料表），这可以消除"不真实"的泛化站点引入近似分配通过数据库搜索。总之，这一AP-MS战略为识别具有关键生物学意义的EYFP-CENP-A K124R泛化场址建立了高效而有力的管道。更重要的是，该管道也可以广泛扩展，以研究各种功能蛋白的PTM。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢南京大学动物模型研究中心的李超军进行质谱分析。我们感谢延米尼·达拉尔、福田康夫和南京大学动物模型研究中心和格力儿童癌症研究所的现任研究人员，感谢他们的有益讨论、实验指导和试剂。我们感谢唐·克利夫兰、丹尼尔·法奇内蒂、扬米尼·达拉尔、明·布伊、古斯塔沃·莱昂、约翰·汤普森、劳伦斯·基尔希纳、阿姆鲁塔·阿什特卡尔、本·布莱克、格伦尼斯·洛格斯顿、肯吉·塔戈和黎明·钱德勒的慷慨捐赠。Y.N.由江苏省"双一级"建设基金、江苏省自然科学基金（SBK201021248）、江苏省第十六届六大人才高峰基金（TD-SWYY-001）、江苏省"外国专家百人计划"基金（SBK201010048）和中国国家自然科学基金（31970665）资助。这项研究得到了NCI赠款R21 CA205659的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | - | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | - | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | - | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | - | - | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | - | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | - | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | - | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | - | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | - | - | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | - | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | - | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | - | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | - | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | - | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | - | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
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