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Biology

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Abstract

Die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Kinetochoren und Zentromern ist wichtig für das Verständnis der chromosomalen Instabilität (CIN) und der Krebsprogression. Wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimeros (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt werden und an einer genauen Chromosomensegregation beteiligt sind, ist eine grundlegende Frage. CENP-A wird als Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Simerung) der Zentromeridentität vorgeschlagen, und CENP-A-Ubiquitylierung ist für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer erforderlich, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist.

Hier beschreiben wir die Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass die Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin aufgrund der EYFP-Tagging im CENP-A K124R mutierten Protein induziert wird. Lysin 306 (K306) Ubiquitylierung in EYFP-CENP-A K124R wurde erfolgreich identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Ein Vorbehalt wird bei der Verwendung von GFP/EYFP oder der Kennzeichnung von hochmolekularem Protein als Werkzeug zur Analyse der Funktion eines Proteins diskutiert. Aktuelle technische Grenzwerte werden auch für den Nachweis von ubiquitylierten Bändern, die Identifizierung von standortspezifischer Ubiquitylierung(n) und die Visualisierung der Ubiquitylierung in lebenden Zellen oder einer bestimmten Einzelzelle während des gesamten Zellzyklus diskutiert.

Die hier vorgestellte Methode der Massenspektrometrieanalyse kann auf humanes CENP-A-Protein mit verschiedenen Tags und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen angewendet werden. Diese kombinatorischen Methoden, die aus mehreren Assays/Analysen bestehen, könnten Forschern empfohlen werden, die daran interessiert sind, funktionelle Rollen der Ubiquitylierung zu identifizieren.

Introduction

In den meisten Eukaryoten müssen Spindelmikrotubuli an einer einzigen Region jedes Chromosoms, die als Zentromer bezeichnet wird, befestigt werden. Der Kinetochor ist ein Komplex von Proteinen, die sich am Zentromer befinden. Die Untersuchung des Timings der Bewegungen von Zentromer und Kinetochorei und der Struktur von Kinetochoren und Zentromeren ist wichtig für das Verständnis der Chromosomeninstabilität (CIN) und der Krebsprogression. Die wichtigsten Fragen sind, wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimers (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt wird und wie sie an der genauen Chromosomensegregation beteiligt sind. Bei den meisten Arten definiert das Vorhandensein eines speziellen Nukleosoms, das ein spezifisches Histon-ähnliches Protein namens CENP-A enthält, die Zentromeridentität. Daher wird vorgeschlagen, dass CENP-A der Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Markierung) der Zentrimeridentität ist. Es ist wichtig, den Mechanismus zu klären, wie CENP-A die Zentromeridentität beim Menschen definiert.

Das Holliday Junction Recognition Protein (HJURP) ist der CENP-A-spezifische Chaperon, der CENP-A in zentromere Nukleosomen1,2,3ablagert. Wir haben bereits berichtet, dass die CUL4A-RBX1-COPS8 E3 Ligase für die CENP-A-Ubiquitylierung auf Lysin 124 (K124) und Zentromerlokalisierung4erforderlich ist. Außerdem zeigten unsere Ergebnisse, dass die Zentromerrekrutierung von neu synthetisiertem CENP-A bereits bestehende, ubiquitylierte CENP-A5erfordert. So wurde ein Modell zur Verfügung gestellt, das darauf hindeutet, dass die CENP-A-Ubiquitylierung durch Dimerisierung zwischen Zellteilungen vererbt wird.

Im Gegensatz zu unseren Erkenntnissen und denen von Yu et al. wurden kürzlich negative Ergebnisse in Bezug auf das CENP-A und seine zentromere Lokalisierung veröffentlicht6. Der Artikel behauptete, dass CENP-A-Modifikationen an Lysin 124 (K124) für die Etablierung, Wartung und Langzeitfunktion menschlicher Zentromere entbehrlich sind, basierend auf ihren negativen Ergebnissen, die zeigen, dass die Mutation von K124R weder die CENP-A-Zentromer-Lokalisierungnoch dieZelllebensfähigkeit beeinflusst eklaten. In ihren Ergebnissen und Schlussfolgerungen gibt es jedoch genügend Raum für Debatten, und wir haben bereits in ihrer vorherigen Veröffentlichung7beschrieben, welches Problem es geben könnte. Es sollte darauf geachtet werden, dass sie Proteine mit CENP-A verschmolzen, die viel größere Molekulargewichte haben als die Größe des endogenen CENP-A: Z.B. verschmolzen sie 30 kDa verbessertes gelbes Fluoreszenzprotein (EYFP) zu 16 kDa CENP-A und analysierte EYFP-CENP-A K124R-Fusionsprotein in ihrem RPE-1 CENP-A-/F-Knockout-System.-/F Es wird nicht erwartet, dass K124-Ubiquitin direkt an HJURP auf der Grundlage struktureller Vorhersagen4bindet, jedoch wird die Zugabe von Mono-Ubiquitin einen Einfluss auf die Proteinkonformation von CENP-A haben. Das Protein der CENP-A-Konformation kann durch das Vorhandensein eines großen Fusionsproteins verändert werden, und diese Konformationsänderung kann die strukturellen Veränderungen verschleiern, die durch den Verlust der Ubiquitylierung verursacht werden. Wir schlagen vor, dass die Fusion von großformatigem Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124 in EYFP-CENP-A K124R Mutant induziert und diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp hemmt/maskiert. Beweise dafür, dass Ubiquitylierung bei unterschiedlichem Lysin im CENP-A K124R-Mutantenprotein mit einem großen Tag-Protein (EYFP) auftritt, wurde in unserer vorherigen Publikation8berichtet. Es wurde festgestellt, dass EYFP-Tagging eine Ubiquitination einer anderen Lysin-Site von EYFP-CENP-A K124R induziert und dass EYFP-CENP-A K124R Mutant an HJURP bindet. Infolgedessen hemmt/maskiert diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp, und sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R-Mutationzeigten zeigten zentrominische Lokalisation (wir verwendeten und verglichen pBabe-EYFP-CENP-A WT und K124R Mutant, zusammen mit pBabe-EYFP-Steuerung). Die Ergebnisse zeigten, dass mit Flaggen markierte oder nicht markierte CENP-A K124R-Mutationen tödlich sind, aber durch eine Monoubiquitin-Fusion gerettet werden können, was darauf hindeutet, dass Die CENP-A-Ubiquitylierung für die Zelllebensfähigkeit unerlässlich ist.

In den letzten Jahren haben viele Studien verschiedene Assays entwickelt, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) von CENP-A-Proteinen und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen sowohl in vivo als auch in vitro9,10,11zu identifizieren. Analog zu den PTMs von Histonproteinen, die ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung der Funktion von Chromatin sind, sind PTMs von zentromerem Chromatin-Komponenten auch an einem wesentlichen Mechanismus zur Regulierung der Gesamtstruktur und Funktion von Zentromeren beteiligt. Die meisten CENP-A PTM-Standorte sind spezifisch für CENP-A-haltige Nukleosomen, obwohl einige von ihnen in Histon H3 konserviert werden, was darauf hindeutet, dass eine Modifikation dieser Rückstände zur zentrominspezifischen Funktion beiträgt. PTMs von CENP-A einschließlich Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Ubiquitylierung wurden zuvor9berichtet, was darauf hindeutet, dass CENP-A einer Vielzahl von PTMs und ihren kombinatorischen Arrays auf seiner Amino-Terminus- und C-Terminus-Histon-Domäne unterworfen ist. Die Bedeutung von CENP-A Modifikationen in mehreren Funktionen wurde von vielen Gruppen, einschließlich unserer, deutlich. Diese Funktionen umfassen CENP-A-Ablagerungen an Zentromeren, Proteinstabilität und Rekrutierung des CCAN (konstitutives Zentromer-assoziiertes Netzwerk)9. Allerdings werden begrenzte Studien und Ergebnisse von CENP-A PTMs vorgeformt, wenn Vergleiche mit einem kanonischen Histon enden, die ihre Funktion direkt oder indirekt regulieren. Technische Berichte, die sich auf die Methodik zur Identifizierung dieser CENP-A-PTMs konzentrieren, sind ebenfalls begrenzt.

Da CENP-A-Ubiquitylierung für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer12erforderlich ist, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung5vererbt wird und für die Zelllebensfähigkeit8unverzichtbar ist, wäre die Methode zur Identifizierung der CENP-A-Ubiquitylierung in Zukunft unerlässlich, um die funktionelle Aktivität, Positionierung und Struktur des Zentromers zu untersuchen. Daher beschreiben wir hier die Massenspektrometrieanalyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. Protokolle anderer Kontrolltests und -analysen (Immunfluoreszenzanalyse, Kolonie-Auswuchs-Assay und In-vivo-Ubiquitylierungstest) werden ebenfalls vorgestellt, um die Ergebnisse der großen Massenspektrometrie-Analyse richtig zu diskutieren.

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Protocol

1. Zellkultur und Retrovirus-Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten

HINWEIS: EYFP-CENP-A wird aus pBabe-EYFP-CENP-A in einem ähnlichen Proteingehalt wie endogene CENP-A ausgedrückt. Das gesamte zelluläre CENP-A-Protein wird nach der Störung des CENP-A-/F-Allels durch Cre-Rekombiinase wie in den RPE-1 CENP-A-/- Zellen6durch dieses EYFP-CENP-A ersetzt.-/F

  1. Herstellung des überdeuchenen Überstandes mit Retrovirus mit 293T Verpackungszellen.
    1. Tag 0: 293T Verpackungszellen auf der 6-Well-Kulturplatte (1,0 x 106 Zellen/Brunnen) verteilen. Kulturzellen in glukosereichem DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 24 h.
      ANMERKUNG: Für optimale Ergebnisse bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll.
    2. Tag 1: Vorbereiten der Transfektionsreaktion um 23 h nach dem Ausbreiten (24 h Punkt ist 0 h Punkt der Transfektion). Transfektionsexpression Plasmid jedes pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) und pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (siehe Tabelle 1).
    3. Wählen Sie eine Kombination von Hilfs-/Verpackungsplasmiden aus, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, und fügen Sie sie den Röhrchen hinzu, die eines der oben aufgeführten Plasmide enthalten. Es gibt meistens diese 3 Kombinationen für Helfer/Verpackungsplasmide (Tabelle 2). Jede Kombination funktionierte in diesen Experimenten und zeigte eine ähnliche Transfektionseffizienz.
    4. Bereiten Sie 50 l reduziertes Serummedium vor und mischen Sie jeweils 2,0 g pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) und pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (siehe Tabelle 1) und fügen eine Kombination von Hilfs-/Verpackungsplasmiden hinzu, die in Tabelle 2 aufgeführt sind (siehe unten). Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. Diese Mischung ist Lösung A.
    5. Bereiten Sie weitere 50 l reduziertes Serummedium vor und mischen Sie 1,5 l Transfektionsreagenzien I bzw. II(Materialtabelle). Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. Diese Mischung ist Lösung B.
      HINWEIS: Optional nur 6,0 l Transfektionsreagenz III (Polyethylenimin [PEI]; 1,0 mg/ml) in Lösung B hinzufügen oder zusätzlich zu den Transfektionsreagenzien I und II in Lösung B(Materialtabelle)6,0 l Transfektionsreagenz III hinzufügen.
    6. Mischen Sie die Lösungen A und B zusammen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min.
    7. Nachdem Sie die kultivierten Zellen einmal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie die Mischung der Lösungen A und B (d.h. DNA-Lipid-Komplex) direkt zu jedem Brunnen der 6-Well-Kulturplatte hinzu, die 500 l reduziertes Serummedium hat. Die Endkonzentration des Plasmids beträgt 3,3 g/ml.
    8. Nach der Inkubation der Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 4,5 h, ändern Sie das mittlere zu hochglukose DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. 2 ml/Gut kulturmittel nach dem mittleren Wechsel in die 6-Well-Kulturplatte geben.
    9. Kultur die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 48 h nach der Transfektion. Führen Sie eine Retrovirus-Infektion am 3. Tag mit dem Überstand durch, der Retrovirus enthält.
  2. Retrovirus-Infektion von CENP-A-/F RPE-1-Zielzellen.
    1. Tag 2: Einen Tag vor der Infektion, verbreiten CENP-A-/F RPE-1 Zielzellen in der 6-Well-Kultur gut transfekt (2,25 x 105 Zellen/gut). Kulturzellen in DMEM: F12 mittel (Materialtabelle) mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
      HINWEIS: Verbreitung von Zellen für Kolonie-Outgrowth-Assays, Immunfluoreszenz und Western-Blot-Analyse als Kontrolle. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll.
    2. Tag 3 (Infektionstag des Virus): Bei 48 h nach Transfektion von 293T Verpackungszellen, sammeln Sie den Überstand enthaltenden Virus und filtern Sie durch 0,45 m Filter (verwenden Sie keinen 0,2 m Filter, der Virushülle schert). Es wird empfohlen, Polyethersulfonfilter (PES) zu verwenden.
    3. Infizieren Sie CENP-A-/F RPE-1-Zellen mit dem Virus. Für einen Brunnen der 6-Well-Kulturplatte 1 ml Frischmedien, 1 ml Virenüberstand und Polybren zu einer Endkonzentration von 8 g/ml hinzufügen. CENP-A-/F RPE-1-Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 4 Tage bis Tag 7 nach der Transfektion inkubieren.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für das Zellwachstum von CENP-A-/F RPE-1 muss empirisch durch folgende Analysen für optimale Ergebnisse bestimmt werden.

2. Immunfluoreszenzanalyse von Zellen, die pBabe-EYFP-CENP-A enthalten

  1. Tag 7: 4 Tage nach der Retrovirus-Infektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten, entfernen Sie das Kulturmedium durch Aspiration. Einmal mit TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl) spülen. Tragen Sie TBS auf die Seite der Kulturbrunnen auf, um eine Störung der Zelloberfläche zu vermeiden.
    HINWEIS: Der optimale Zeitpunkt für die Zellfixierung muss empirisch bestimmt werden. Immunfluoreszenzsignale sowohl von EYFP-CENP-A WT als auch K124R sind am Zentromer mindestens 4 Tage nach einer Retrovirus-Infektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten auch ohne Cre-Infektion nachweisbar (Daten nicht dargestellt, Abbildung 1C-E für die Daten mit Cre-Infektion).
  2. Führen Sie Methanolzellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung wie zuvor beschrieben13durch.
  3. Als primäre Antikörper verwenden Sie einen Anti-GFP-Antikörper (1:1.000 Verdünnung) und einen Anti-CENP-B-Antikörper (Verdünnungsverhältnis von 1:200) für einen Zentromer-Positionsmarker in TBS, der 4% Ziegenserum enthält (siehe Tabelle der verwendeten Antikörper).
  4. Überschüssiges Montagemedium mit einem Papiertuch entfernen und die Ränder des Deckels im letzten Schritt mit Nagellack versiegeln.
  5. Siehe die zuvor beschriebene Methode13 zur Immunfluoreszenzbildbeobachtung, Erfassung, Quantifizierung und Analyse der verbleibenden Signale von EYFP-CENP-A am Zentromer.
  6. Bildaufnahme, Verarbeitung einschließlich Dekonvolution, Quantifizierung und Analyse mit den Softwares A oder Software B1 und B2 (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie optional Softwares C1-C3 (siehe Materialtabelle) für ein konfokales Laserscanmikroskop.
    HINWEIS: Siehe 2.6.1 in Ergänzenden Codierungsdateien für alle Befehle, die in Software A verwendet werden. Siehe 2.6.2 in Ergänzende Codierungsdateien für alle Befehle, die in den Softwares B1 und B2 verwendet werden.

3. Kolonie-Auswuchs-Assays mit pBabe-EYFP-CENP-A nach Retro-Cre-Virus-Infektion

HINWEIS: Der Grund für die Durchführung dieses Assays ist, die Zelllebensfähigkeit zwischen EYFP-CENP-A WT und K124R mutiert nach der Störung des CENP-A-/F-Alleels durch Cre Recombinase (nach dem Ersatz des gesamten zellulären CENP-A-Proteins) zu vergleichen.-/F

  1. Retrovirus-Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten.
    1. Durchführung der Retrovirus-Transfektion-/F von CENP-A-/F RPE-1-Zellen, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Kulturzellen in DMEM: F12 medium mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin für 72 h nach der Virusinfektion.
    2. Drei Tage nach der Retrovirus-Infektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten (an Tag 6) fügen Sie Blasticidin S (10 g/ml) in Brunnen hinzu, die transfizierte Zellen enthalten, um sie für Kolonie-Auswuchs-Assay- und Kontrollexperimente zu verwenden. Zellen werden mindestens 14 Tage nach einer Virusinfektion in Gegenwart von Blasticidin S. das Medium mit Blasticidin S alle 5 Tage ändern.
      ANMERKUNG: Wenn Zellen etwa 80% Zusammenfluss erreichen, bevor sie für den Kolonietest (3.2.7. und 3.2.8) aussät werden, durchgehen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 und 1:5 durch Trypsinisierung und Beschichtung in einer 6-Well-Kulturplatte.
    3. Sammeln Sie Zellen für Western Blot an Tag 7, um die Proteinexpression von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten ohne Cre-Infektion zu bestätigen. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1B (Bahnen 1-4) dargestellt.
    4. Für Kolonie-Auswuchs-Assay mit Cre-Virus-Infektion, halten Sie die Zellen wachsen für 14 Tage nach der Virusinfektion in Gegenwart von Blasticidin S (d. h., wachsen Zellen in Blasticidin S mit Medium bis Tag 17 für die Ergebnisse hier vorgestellt).
  2. Retro-Cre-Virus-Infektion von pBabe-puro-Cre
    HINWEIS: Tag 0 in Schritt 3.2.1 entspricht Tag 13 von Abschnitt 3.1.
    1. Tag 0 bis Tag 3: Durchführung der Retrovirus-Transfektion vonCENP-A-/F RPE-1-Zellen unter Verwendung von pBabe-puro-Cre (B3027) als Expressionsplasmid (Details siehe Abschnitt 1). Stellen Sie sicher, dass Blasticidin S (10 g/ml) im Kulturmedium hinzugefügt wird.
    2. Tag 4: Trypsinize Zellen, um es von der Platte zu lösen. Platte 500 oder 5.000 Zellen in Dreifacharbeit in der 6-Well-Kulturplatte. Kulturzellen in DMEM: F12 mittel mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
    3. Tag 5: Blasticidin S (10 g/ml) zum Kulturmedium hinzufügen. Für 5.000 oder 500 Zellen-Beschichtung wählen Sie Zellen mit Blasticidin S (10 g/ml) 3-24 Tage (bis Tag 14 in [3.2.7]) oder 3-28 Tage (bis Tag 18 in [3.2.8]) nach Virusinfektion von Konstrukten (pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukte).
      HINWEIS: In diesem Kolonie-Auswuchs-Assay wird die Transfektion von pBabe-puro-Cre zusammen mit der Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A hinzugefügt. Die Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A erfolgt in 3.1. Die Transfektion von pBabe-puro-Cre erfolgt in 3.2.1.
    4. Tag 10 (7 Tage nach retro-Cre-Virusinfektion): Sammeln Sie Zellen für die Western-Blotting-Analyse, um die Proteinerschöpfung des endogenen CENP-A nach retro-Cre-Virusinfektion und/oder Proteinexpression von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten am selben Tag 10 zu bestätigen.
    5. Führen Sie western Blotting durch, wie in Abschnitt 4 am selben Tag 10 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1B (Bahnen 5-7) dargestellt.
    6. Führen Sie eine Immunfluoreszenzanalyse (Abschnitt 2 oben) durch, um zu bestätigen, dass sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R 7 Tage nach Inaktivierung des verbleibenden endogenen CENP-A-Alleels auf das Zentromer lokalisiert sind. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1C-1Edargestellt.
    7. Tag 14: Führen Sie den Kolonie-Auswuchs-Assay mit der Platte durch, die mit 5.000 Zellen gesät ist. Fixzellen für 10 min in Methanol und Fleck für 10 min in einer kristallvioletten Lösung (2,3% kristallviolett, 0,1% Ammoniumoxalat, 20% Ethanol (siehe Abbildung 2B). Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die die OpenCFU-Software verwenden (siehe Abbildung 2C).
    8. Tag 18: Verwenden Sie die platte mit 500 Zellen gesät. Fix- und Fleckenzellen, wie in Schritt 3.2.7 beschrieben (siehe Abbildung 2B). Zählen Sie die Anzahl der Kolonien (siehe Abbildung 2C).

4. Western Blot-Analyse mit pBabe-EYFP-CENP-A

HINWEIS: Siehe die zuvor beschriebene Methode13 für die Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die in Abbildung 1B und Abbildung 2A und Materialtabelle für EYFP-CENP-A-Proteine angegeben sind.

  1. Isolieren Sie Proteine, indem Sie die Zellen lysieren, die mit einer unterschiedlichen Virusinfektion gewachsen sind. Verwenden Sie dann 20 g Protein in einem Brunnen des SDS PAGE Gels. Übertragen Sie die Proteine auf eine PVDF-Membran, wie zuvor beschrieben13.
  2. Waschen Sie die Membran 3x nach Inkubationen mit primär-sekundären Antikörpern. Erkennen und analysieren Sie die Proteinbänder auf der Membran mit dem Infrarot-Bildgebungssystem und/oder dem Chemilumineszenz-Imager zur Immunoblot-Erkennung. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 1B und Abbildung 2Adargestellt.
    1. Informationen zum Erkennen und Analysieren der Proteinbänder finden Sie unter Schritt 4.2.1 in Ergänzenden Codierungsdateien.
    2. Verwenden Sie den Chemilumineszenz-Imager, um die Proteinbänder zu erkennen und zu analysieren, siehe Schritt 4.2.2 in Ergänzenden Codierungsdateien. Verwenden Sie für dieses System ein ultraempfindliches, verbessertes chemilumineszierendes Substrat (ECL) (Tabelle der Materialien).
    3. Optional verwenden Sie den westlichen Blot-Abisolierpuffer, um vorbebrütete Antikörper aus der PVDF-Membran zu entfernen und sie mit verschiedenen Antikörpern für die nächste Drehung der westlichen Analyse zu reblegen. Empirisch bestimmen Sie die optimierte Inkubationszeit und Temperatur.

5. Zellkultur,Transfektion und In-vivo-Ubiquitylierungs-Assays mit pQCXIP-EYFP-CENP-A

HINWEIS: Der Proteingehalt von EYFP-CENP-A, ausgedrückt aus dem pQCXIP-Vektor, ist um das 10-fache höher als der endogene CENP-A-Proteinspiegel. Die Verwendung dieses Vektors erleichtert die Immunpräzipitation einer höheren Menge der EYFP-CENP-A-Proteine, die Beobachtung der Ubiquitylierungsbänder von EYFP-CENP-A und die Identifizierung der Ubiquitylierung des EYFP-markierten CENP-A -Proteins (EYFP-CENP-A) durch Massenspektrometrieanalyse.

  1. Transfektion für In-vivo-Ubiquitylierungstests mit pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Samen 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale. Kulturzellen in glukosereichem DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
      ANMERKUNG: Für optimale Ergebnisse bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll. Bereiten Sie mindestens 2 Gerichte für eine Immunpräzipitation (IP) Probe, um ein Minimum von 1 mg Gesamtprotein zu erhalten.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 18 h.
    3. Bei 17 h nach der Aussaat die Transfektionsreagenzien vorbereiten.
    4. Herstellung von Lösung A durch Mischen von 6,7 g Plasmid jedes pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabelle 1) in 335 l reduziertem Serummedium, und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Geben Sie allen Proben 6,7 g Plasmid von pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) hinzu.
      HINWEIS: Alle Vektoren sind in Tabelle 1aufgeführt.
    5. Lösung B durch Mischen von Transfektionsreagenzien I bzw. II in 335 l reduziertem Serummedium und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
      ANMERKUNG: Ein optionaler Schritt besteht darin, in Lösung B nur 40,2 l Transfektionsreagenz III (Polyethylenimin [PEI]; 1,0 mg/ml) hinzuzufügen oder zusätzlich zu den Transfektionsreagenzien I und II in Lösung B(Materialtabelle)40,2 l Transfektionsreagenz III hinzuzufügen.
    6. Mischen Sie die Lösungen A und B zusammen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min.
    7. Nachdem Sie die kultivierten Zellen einmal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie die Mischung der Lösungen A und B (d.h. DNA-Lipid-Komplex) direkt zu jeder einzelnen 10 cm Gewebekulturschale hinzu, die 3,35 ml l reduziertes Serummedium hat.
      HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1,67 g/ml Plasmid.
    8. Inkubieren Sie die Zellen im 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für 4,5 h. Nach 4,5 h das mittlere zu hochglukose DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin ändern.
    9. Kultur die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h nach der Transfektion. Sammeln Sie Zellen für die Zelllysatpräparation.
  2. Herstellung von Protein A Perlen gebunden mit Anti-GFP-Antikörper.
    1. Nehmen Sie 25 l (50% v/v) Protein A Perlen für eine Reaktion der Immunpräzipitation (IP). Mit Puffer A1 (Materialtabelle) mindestens 3x waschen, um EtOH zu entfernen, und 50% Lösung mit Puffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% Desoxycholat; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; komplettes EDTA-freies Protease-Inhibitor-Reagenz) herstellen.
    2. Fügen Sie den oben hergestellten Perlen 2,0 l Anti-GFP-Antikörper (Anti-76: Hausgemachteantikörper) hinzu und fügen Sie 10x Puffervolumen A1 hinzu, das mit dem Volumen der Netzperlen verglichen wird.
    3. End-to-End-Drehung bei 4 °C für 4-18 h durchführen. Die optimale Zeitlänge für die End-to-End-Rotation muss empirisch anhand der Effizienz der Immunpräzipitation bestimmt werden.
    4. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 100 x g für 1 min und entfernen Sie den ungebundenen Überstand. Fügen Sie Puffer A1 hinzu, um eine 50%-Lösung (v/v) der Perlen neu zu erstellen. Verwenden Sie 25 l (50 % v/v) dieser Lösung für eine Reaktion von IP.
  3. Immunpräzipitation (IP) mit Protein A Sepharose Perlen gebunden mit Anti-GFP-Antikörper.
    1. Lyse-Zellen, die in Schritt 5.1.9 in Puffer A1 durch Beschallung und Gefriertauprozess erhalten werden.
    2. Messen Sie die Proteinkonzentrationen und normalisieren Sie die Proteinmengen zwischen verschiedenen IP-Proben. Entfernen Sie 5 % der Probe aus jedem Rohr, das als 5% Eingangsprobe in SDS-PAGE ausgeführt wird.
      HINWEIS: Die 5%-Eingangsprobe kann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht innerhalb eines Tages geladen wird.
    3. Mischen Sie den Rest von 95% Lysat mit 25 l (50% v/v) Protein A Perlen gebunden an Anti-GFP-Antikörper, die in Schritt 5.2 hergestellt wurde. End-to-End-Drehung bei 4 °C für 4-18 h durchführen.
      HINWEIS: Die optimale Zeitlänge für die End-to-End-Rotation muss empirisch bestimmt werden.
    4. Zentrifugenprotein A Perlen mit dem protein gebunden (d.h. Immunpräcipitates) mit 100 x g für 1 min, und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Immunpräcipitate mit Puffer A1 durch Zentrifugieren bei 100 x g für 1 min. Führen Sie diesen Schritt 4x aus.
    5. Mischen Sie den 5% Input und den Rest von 95% Immunpräcipitates mit 2x und 4x SDS-PAGE Ladepuffer14, bzw. mischen. Kochen Sie diese beiden Proben für 5 min und laden Sie sie dann auf ein 10,0% denaturierendes SDS-Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese in verschiedenen Bahnen. Verwenden Sie größeres SDS-PAGE Gel (z.B. 17 cm x 15 cm) für die Elektrophorese. Wenn Proben in kleinerem Gel ausgeführt werden, ist es möglicherweise nicht möglich, klare/scharfe Ubiquitylierungsbänder zu beobachten.
    6. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse wie in Abschnitt 4 beschrieben unter Verwendung der im vorherigen Bericht8angegebenen Antikörper durch. Das Ergebnis ist in Abbildung 2Adargestellt.
    7. Verwenden Sie den westlichen Blot-Abisolierpuffer, um die vorbebrühten Antikörper aus der PVDF-Membran zu entfernen und sie mit verschiedenen Antikörpern für die nächste Runde der Western Blot-Analyse zu reblegen.

6. Massenspektrometrie zur Identifizierung der Ubiquitylierungsstelle des EYFP-CENP-A K124R-Mutanten

  1. Transfektion zur Massenspektrometrieanalyse mit pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Samen CENP-A-/F RPE-1 Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale. Überprüfen Sie, ob die Zelldichte 36,2 x 105 Zellen pro Schale beträgt. Kulturzellen in glukosereichem DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Bereiten Sie mindestens 20 Gerichte für eine Immunpräzipitationsprobe (IP) vor, um mindestens 10 mg Gesamtprotein zu erhalten (siehe 5.3).
      ANMERKUNG: Für optimale Ergebnisse bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 18 h. Bereiten Sie die Transfektionsreagenzien 23 h nach dem Ausbreiten vor (24 h Punkt ist 0 h Punkt der Transfektion).
    3. Bei 17 h nach der Aussaat die Transfektionsreagenzien und transfekten Zellen als (4.1.3) vorbereiten. Transfizierte Zellen haben pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) und pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 48 h nach der Transfektion. Sammeln Sie Zellen für Zelllysate.
    5. Lysezellen im Puffer A1 und führen Immunpräzipitation als (5.2) und (5.3) durch. Führen Sie diese beiden Immunpräzipitationslysate wie folgt (6.1.6) und (6.1.7) aus.
      HINWEIS: Führen Sie die Probe in Standard-Tris-Glycin-Gelen aus (6.1.6). In (6.1.7) führen Sie die Probe in den handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris-Proteingelen aus. Siehe auch Diskussion.
    6. Bewahren Sie eine Probe für 10 % der gesamten Immunpräcipitantien auf, um die EYFP-CENP-A-Ubiquitylierung zu bestätigen und die Position des ubiquitinierten EYFP-CENP-A, wie in Abschnitt 5 beschrieben, genau zu bestimmen. Führen Sie diese Probe in Standard-Tris-Glycin-Gelen aus. SDS-PAGE und Western Blot wurden als (5.3) aufgeführt.
    7. Bewahren Sie eine weitere Probe für 90 % der gesamten Immunpräzipitantien für die Massenspektrometrieanalyse auf. Führen Sie diese Probe in zwei Brunnen der handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris Proteingele. Führen Sie Coomassie blaue Färbung mit Coomassie blau Lösung. Verbrauchen und schneiden Sie die Gelregion von 50-70 kDa (vermeintliche mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R Region). Verwenden Sie diesen Gelbereich für die Analyse der Massenspektrometrie.
  2. Massenspektrometrieanalyse mit In-Gel-Verdauung.
    1. Jede Gelscheibe von Interesse in kleine Stücke (1 mm2) würfeln und in 0,5 ml proteinarme Röhrchen geben.
    2. Waschen Sie mit 100 l 50% (v/v) Acetonitril in 25 mM NH4HCO3, Wirbel 10-15 min, spin down, entsorgen Sie den Überstand, wiederholen 3x.
    3. Konzentrieren Sie die Probe mit einem Tischvakuumkonzentrator für 30 min, um die Gelstücke zu trocknen.
    4. Fügen Sie 10 l von 10 ng / L Sequenzierung Sequencing Grade Trypsin und lassen Sie die Gel-Stücke für 5 min rehydrieren.
    5. Fügen Sie 25 mM NH4HCO3 gerade genug, um die Gelstücke zu decken, verdauen bei 37 °C über Nacht.
    6. Übertragen Sie den verdauten Überstand in ein sauberes 0,65 ml silikonisiertes Rohr. 50% (v/v) Acetonitril/5% (v/v) Ameisensäure (30 l oder genug zur Abdeckung), Wirbel 10 min hinzufügen, drehen und in das gleiche Extraktionsrohr übertragen. Wiederholen Sie 3x.
    7. Den Gelstücken 10 l Acetonitril hinzufügen, 5 min wirbeln und nach unten drehen. Übertragen Sie den Überstand in dieselbe Röhre.
    8. Konzentrieren Sie die Proben mit dem Benchtop-Vakuumkonzentrator auf 2 l, fügen Sie der Probe 8 l 3% (v/v) Acetonitril /2% (v/v) Ameisensäure, Wirbel für 15 min und Spin down bei 16.000 x g für 30 min. Proben sind bereit für die Massenspektrometrieanalyse.
    9. Durchführen der MS-Datenerfassung mit LC-MS/MS mit einem flüssigen Chromatographiesystem (Materialtabelle) gekoppelt mit einem Massenspektrometrieinstrument (Materialtabelle).
    10. Injizieren Sie 8 l rekonstituierte Probe in eine Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie (RPLC)-Säule.
    11. Trennen Sie die Peptide mit einem 2-80% Gradienten des Lösungsmittels B in 60 min. Stellen Sie sicher, dass der Gradient aus einem steigenden Prozentsatz des Lösungsmittels B von 2% auf 22% in 40 min, 22% bis 35% Lösungsmittel B in 12 min besteht, dann auf 80% Lösungsmittel B in 4 min klettert und schließlich in den letzten 4 min bei 80% Lösemittel B hält. Stellen Sie die Durchflussrate konstant auf 300 nL/min.
      HINWEIS: Lösungsmittel A enthält 0,1% Ameisensäure und 2% Acetonitril, Lösungsmittel B 0,1% Ameisensäure und 98% Acetonitril. Alle Konzentrationen werden als Volumen/Volumen angezeigt.
    12. Sammeln Sie Massenspektrometriedaten mithilfe des datenabhängigen Erfassungsmodus. Sammeln Sie kurz MS-Spektren in 350–1500 m/z für 250 ms. Wählen Sie die Top 50 intensiven Vorläufer mit Ladung 2–5 für weitere Fragmentierung. Sammeln Sie MS/MS-Spektren in 100–2000 m/z für 100 ms, ausschließen Vorläuferionen von der Wiederwahl für 15 s.
    13. Öffnen Sie für die Datenbanksuche die kommerzielle Software (siehe Tabelle der Materialien), um Massenspektrometriedaten auf dem Desktop zu analysieren.
    14. Um eine neue Suche zu machen, klicken Sie im oberen Menü auf die Schaltfläche "LC". Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen", um die ursprünglichen MS-Rohdatendateien hochzuladen.
    15. Wählen Sie "Human Protein ID" in der "Paragon-Methode" als Datenbanksuchmethode aus. Durchsuchen Sie die ursprünglichen MS-Rohdatendateien mit der UniProt Homo Sapiens-Datenbank (mit 160.566 Sequenzen, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Legen Sie Suchparameter wie folgt fest: Trypsin als Verdauungsenzym auswählen, bis zu 3 fehlende Spalten, 4 Modifikationen und 2-5 Ladungen pro Peptid zulassen. Stellen Sie einen Massenfehler von bis zu 20 ppm für die erste Suche und 0,02 Da für fragmentierte Ionen ein. Geben Sie FDR-Schwellenwerte (False Discovery Rate) für Protein-, Peptid- und Modifikationsstellen von weniger als 1 % an. Legen Sie alle anderen Parameter in der Software auf Standardwerte fest (siehe Abbildung 3 für Massenspektrometrieanalyse).
    17. Klicken Sie auf die Schaltfläche"Speichern unter" rechts im oberen Menü, wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Suchergebnisse aus, geben Sie den Suchnamen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern".
    18. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Prozess" auf der rechten Seite des oberen Menüs, um die Suche zu starten. Nach Dem Ende der Suche werden Daten mit dem eingegebenen Suchnamen automatisch in dem ausgewählten Ordner gespeichert. Die Daten können einfach durch Software F geöffnet werden.
    19. Um MS/MS-Spektren eines bestimmten Peptids zu erhalten, doppelklicken Sie auf die Suchergebnisse, um es von Software F zu öffnen. Klicken Sie zuerst auf das Protein in der Proteinliste oben im Menü, dann auf das Peptid in der Mitte des Menüs. Die MS/MS dieses Peptids wird unten im Menü angezeigt.
    20. Um MS/MS-Spektren zu exportieren und zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die MS/MS-Spektren am unteren Rand des Menüs, wählen Sie Kopieren aus und fügen Sie sie dann in eine geeignete Datei wie PPT oder doc. format ein.

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Representative Results

EYFP-CENP-A K124 Mutant zeigt Ubiquitylierung, Wechselwirkung mit HJURP, und keine Defekte in der Zentromerlokalisierung weder Zelltod. Hier wurde das von Fachinetti et al. (2017)6 gemeldete System neu konstituiert: In diploiden menschlichen (RPE-1) Zellen, die ein gestörtes und ein ''floxed'' CENP-A Allel (CENP-A-/F) tragen, wurde EYFP-CENP-A aus dem pBabe-EYFP Retrovirusvektor exprimiert. In diesem System könnte die Expression des endogenen CENP-A aus dem CENP-A-/F-Allel-/F durch Cre Recombinase6gestört werden. Genkonstrukte von EYFP- CENP-A WT oder K124R Mutant (Abbildung 1A), die den Verlust der endogenen CENP-A rettet, wurden stabil ausgedrückt, wenn retrovirale Integration durchgeführt wurde. Der verbleibende Ausdruck des endogenen CENP-A aus dem CENP-A-/F-Allel wurde dann durch Cre Recombinase gestört. Die Expression von endogenem CENP-A wurde 7 Tage nach der Induktion der Cre-Rekombiinase nicht nachgewiesen(Abbildung 1B, Bahnen 5-7). Sowohl die Proteinexpression EYFP-CENP-A WT als auch die K124R-Proteine zeigten einen ähnlichen Wert wie der ursprüngliche endogene CENP-A-Proteinspiegel(Abbildung 1B, Bahnen 3, 4, 6 und 7). Sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R Mutanten zeigten 7 Tage nach der Störung der verbleibenden Expression des endogenen CENP-A aus dem CENP-A-/F-Allel (Abbildung 1C-1E). Sowohl EYFP-CENP-A WT als auch der K124R Mutant zeigten Ubiquitylierung und Interaktion mit HJURP im Gegensatz zum Fall von CENP-A WT mit Flag-Tags oder nicht markiertem Kennnamen und dem K124R-Mutanten (Abbildung 2A; Daten, die nicht für Flag-markierte oder nicht markierte CENP-A)8angezeigt wurden. Die Zelllebensfähigkeit wurde auch durch die Durchführung der Kolonie Auswuchs Assay 14 Tage nach der Störung der verbleibenden endogenen CENP-A Allel (Abbildung 2B). Sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R Mutanten zeigten 14 Tage nach der Störung des verbleibenden endogenen CENP-A-Alleels eine ähnliche Anzahl von "geretteten" Kolonien (Abbildung 2B und 2C). Somit entsprechen unsere Ergebnisse denen von Fachinetti et al.6.

Die Ubiquitylierung bei Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R wurde durch Massenspektrometrieanalyse aufgedeckt. Es wurde festgestellt, dass sowohl EYFP-CENP-A WT als auch die K124R Mutante im Gegensatz zu CENP-A WT und dem K124R Mutant(Abbildung 2A; Daten nicht für Flag-markierte oder nicht markierte CENP-A)8angezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Fusion von EYFP-Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124 in EYFP-CENP-A K124R Mutant induziert, und diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort fördert die Interaktion von EYFP-CENP-A K124R mit HJURP. Die Ubiquitylierung bei Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R wurde in CENP-A-/F-Zellen durch IP-Massenspektrometrieanalyse aufgedeckt (Abbildung 3A und Abbildung 3B).-/F Das Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R entspricht Lysin 56 (K56) in CENP-A. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Fusion von großformatigem Protein (z. B. EYFP-Tagging) eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124 in CENP-A induziert, und diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort hemmt/maskiert den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp.

Figure 1
Abbildung 1: EYFP-CENP-A K124 mutiert lokalisiert an Zentromern. (A) Darstellungen der verschiedenen CENP-A-Proteinkonstrukte, die mit EYFP (verbessertes gelbes fluoreszierendes Protein) am Endpunkt N markiert sind. Rote Buchstaben markieren die Position der K124R-Aminosäuresubstitution im angegebenen Konstrukt (links). Die Ergebnisse der in dieser Studie durchgeführten Assays werden gezeigt (rechts). (B) Die Western Blot-Analyse zeigte nicht das Vorhandensein nachweisbarer endogener CENP-A. Immunoblots Analyse auf das Vorhandensein der Expression der angegebenen Rettungskonstrukte (ca. 45 kDa) vor und nach Cre Infektion zu überprüfen. Die Proteinexpression von pBabe-EYFP-Konstrukten wurde vor der Cre-Infektion (Bahnen 1-4) sowie nach der Cre-Infektion (Bahnen 5-6) bestätigt. Das Fehlen des endogenen CENP-A-Proteins (ca. 15 kDa) wurde-/- in den CENP-A-Zellenlinien bestätigt, die 7 Tage nach der Cre-Infektion gesammelt wurden (Bahnen 5-6). GAPDH-Protein wurde als Ladekontrolle verwendet. (C) EYFP-CENP-A K124 mutant lokalisiert bei Zentromern. CENP-A-/F RPE-1-Zellen wurden mit indizierten Konstrukten kotransfiziert, 7 Tage nach einer Retro-Cre-Virusinfektion kultiviert und immungefärbt. Visualisierung von DAPI (blau), EYFP (grün) und endogenem CENP-B (rot), die als Zentromer-Standortkontrolle diente. Schuppenstange, 10 m. (D) Die in (C) dargestellten Lokalisierungsmuster werden als Histogramme zusammengefasst. Pro Experiment wurden mehr als 200 Interphasenzellen mit EYFP-positiven Signalen gezählt (n bis 3 Experimente), und die mittleren Prozentsätze (-SD) werden angezeigt. ''Andere (Non-Centromere)'' zeigt meist beschädigte Zellen, abgestorbene Zellen oder Zellen mit Nukleolar-Lokalisation in der Interphase, die aufgrund von Transfektion oder anderen Behandlungen beobachtet wurden. Bei K124R wurde kein signifikanter (n.s.) Unterschied im Vergleich zu WT (Student es t-test) beobachtet. (E) EYFP-abgeleitete Signale an Centromern, die in (C) gezeigt wurden, wurden quantifiziert. Die Signale wurden auf die von WT normalisiert, und die mittleren Prozentsätze (SEM) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: EYFP-CENP-A K124 Mutant ist allgegenwärtig und interagiert mit HJURP, und die Zelllebensfähigkeit wurde durch die K124R-Mutation von EYFP-CENP-A nicht beeinflusst. (A) Die EYFP-CENP-A K124 Mutante ist allgegenwärtig und interagiert mit HJURP. In vivo Ubiquitylation Assay. CENP-A-/F RPE-1-Zellen wurden mit den angegebenen Konstrukten transfiziert. Proteine in 5% der gesamten Zelllysate (Input) und Immunpräcipitate (IP) mit Anti-GFP Kaninchen polyklonalen Antikörper wurden durch Western Blot Analyse mit den angegebenen Antikörpern nachgewiesen. Putative di-Ub-EYFP-CENP-A (**) und vermeintliche Mono-Ub-EYFP-CENP-A (*) sind angegeben. Diese Zahl wurde von Niikura et al.8geändert. (B) Repräsentative Bilder aus dem Kolonie-Auswuchs-Assay, wie im Schema (oben) von zwei verschiedenen Bedingungen ([1] und [2]) für die angegebenen Transfektanten von EYFP-CENP-A gezeigt. (C) Histogramme, die das Überleben der Kolonien der Experimente in (B) zusammenfassen. Die durchschnittlichen Prozentsätze von mehr als 3 unabhängigen Experimenten (n 3) werden mit dem Prozentsatz der überlebenden Kolonien in EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT) normalisiert. p < 0.0001 und **p < 0.01 im Vergleich zu EYFP-Steuerung (Student es t-test). Bei K124R wurde kein signifikanter (n.s.) Unterschied im Vergleich zu WT (Student es t-test) beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Fragmente von ubiquitylierten EYFP-CENP-A K124R Peptiden wurden in der Massenspektrometrie-Analyse nachgewiesen. (A) Nachweis der Ubiquitylierung bei Lysin 306 (K306) von EYFP-CENP-A K124R in RPE-1 CENP-A-/F-Zellen. Das Lysin 306 (K306) von EYFP-CENP-A K124R entspricht Lysin 56 (K56) in CENP-A. Das LQKLRGGSTHLLIR Peptid (Abdeckung 95,9%, Vertrauen 87,8%) durch kollisionsinduzierte Dissoziationsanalyse identifiziert. Die m/z (Da)-Werte der b (grünen) und y (roten) Ionen in den Spektren von (A), die während der Fragmentierung erkannt wurden, werden in der Tabelle von (B) grün hervorgehoben. Die Ubiquitylierung von K306 wird durch das LRGG-Motiv (unvollständige Spaltung) des B-3-Ionen (m/z 753.4730) und y-8-Ionen (m/z 1350.8328) bestätigt. (B) Die Tabelle hebt die m/z (Da)-Werte der b (grünen) und y (roten) Ionen in den Spektren von (A) hervor. LQK[Umc]STHLLIR in der Tabelle von (B) zeigt das LQKLRGGSTHLLIR Peptid in (A) an. Diese Zahlen wurden von Niikura et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

B-Nummer Relevante Merkmale(n) Verweis Quelle
B3027 pBabe-puro-Cre Niikura et al., 2019 Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner
B3182 pBabe-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3161 pBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3164 pBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3031 psPAX2 Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
D3032 pMD2.g Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
B3189 Pgp Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan)
B3190 pCI-VSVG Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan)
B3001 pPAM Niikura et al., 2019 -
B3252 pQCXIP-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3254 pQCXIP-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 -
B3256 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 -
B2806 pCGN-HA-Ubiquitin Niikura et al., 2019 -

Tabelle 1: Plasmidvektoren, die in dieser Studie verwendet werden.

B-Nummer Helfer/Verpackung von Plasmidvektoren Kombination 1 Kombination 2 Kombination 3
B3031 psPAX2 (lentiviraler Gag/Polvektor) 2 g
D3032 pMD2.g (lentiviraler Env-Vektor) 2 g
B3189 pGP (retroviraler Gag/Polvektor) 2 g
B3190 pCI-VSVG (retroviraler Env-Vektor) 2 g
B3001 pPAM (amphotrope Helfer vektorcodierung retrovirale gag-pol-env) 2 g

Tabelle 2: Kombinationen von Hilfs-/Verpackungsplasmidvektoren, die in (1.1.3) verwendet werden: Retrovirus-Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten.

Ergänzende Codierungsdateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.

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Discussion

Hier beschrieben wir Methoden der Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. In unseren Ergebnissen haben wir erfolgreich die Ubiquitylierung auf Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Die hier beschriebene Massenspektrometrieanalyse ist eine Mimikmethode, da wir zuvor die Lysin 124 (K124) Ubiquitylierungsstelle von CENP-A WT-Flag12identifizieren. Daher kann diese Methode auf humanes CENP-A-Protein mit verschiedenen Tags und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen angewendet werden. Die auf LC-MS/MS basierende Massenspektrometrieanalyse ist allgemein anerkannt, um potenzielle posttranslationale Modifikationen (PTMs) eines breiten Spektrums von Proteinen zu identifizieren. Unsere kombinatorischen Methoden, die aus mehreren Assays/Analysen bestehen (d. h. in vivo Ubiquitylation Assay, Kolonie-Auswuchs-Assay und Massenspektrometrie-Analyse), könnten Forschern empfohlen werden, die daran interessiert sind, funktionelle Rollen der Ubiquitylierung(en) ihrer Zielproteine zu identifizieren.

Dieses Protokoll deckt jedoch nicht den Nachweis von ubiquitylierten Bändern und/oder die Identifizierung der standortspezifischen Ubiquitylierung(en) dieser Proteine in lebenden Zellen oder einer bestimmten Einzelzelle während des gesamten Zellzyklus ab. In diesen Jahren werden optogenetische Ansätze dramatisch entwickelt und haben einen hohen Einfluss auf quantitative Studien von Zellsignalsystemen. Die Optogenetik hat ursprünglich Ansätze geliefert, die einzelne Neuronen mithilfe von einkomponentierten, mikrobiellen Opsin-basierten Systemen präzise aktivieren oder hemmen. Derzeit kann die Proteinaktivität mit beispielloser raumzeitlicher Präzision durch die Nutzung natürlicher genetisch kodierter Photorezeptoren gesteuert werden, und verschiedene genetisch kodierte Werkzeuge ermöglichen die Lichtkontrolle vieler biologischer Prozesse, einschließlich der Proteinphosphorylierung15. Daher ist die Optogenetik ein vielversprechendes System zur Untersuchung der raumzeitlichen Proteinkinase-Signalisierung auf zellulärer und der gesamten Organismusebene. Die Zahl der lichtgesteuerten Proteinkiaas nimmt rapide zu, obwohl die aktuelle Zahl noch begrenzt ist. Die Entwicklung der lichtgesteuerten Protein-Ubiquitylierung verzögert sich jedoch, und die hochmolekulare Kennzeichnung von Photorezeptoren kann die Ubiquitylierung von WT- und mutierten Proteinen stören und die native Proteinfunktion funktionell verändern. Daher ist die Entwicklung von niedermolekularer Tagging- oder Sondierungstechnik dringend erforderlich, um die Ubiquitylierung zu visualisieren und/oder die raumzeitliche Protein-Ubiquitylierungssignalisierung auf der lebenden Zellebene und dem gesamten Organismus zu untersuchen.

In der vorliegenden Studie ist die EYFP-Vektorkontrolle für Kontrolltests und -analysen (Immunfluoreszenzanalyse, Kolonie-Auswuchs-Assay und In-vivo-Ubiquitylierungstest) unerlässlich, um die Ergebnisse einer großen Massenspektrometrieanalyse richtig zu diskutieren. Im Immunpräzipationsexperiment wird häufig eine unspezifische Wechselwirkung mit EYFP-Protein beobachtet, daher ist die EYFP-Vektorkontrolle unerlässlich, um die tatsächliche Wechselwirkung von EYFP-gebundenen Proteinen zu bewerten. Unsere Massenspektrometrieanalyse mit EYFP-CENP-A K124R, ausgedrückt in den-/F RPE-1 CENP-A-/F-Zellen, zeigte keine Ubiquitylierung an Lysin-Standorten in der EYFP-Polypeptidsequenz. Unter anderen unbekannten Bedingungen ist jedoch zu erwarten, dass die Lysin-Site in der EYFP-Polypeptidsequenz in EYFP- und/oder anderem getaggten Fusionsprotein mit hohem Molekulargewicht allgegenwärtig ist.

Für Kolonie-Auswuchs-Assays wird empfohlen, Zellen für die Western-Blot-Analyse zu sammeln, um den Proteinabbau von endogenem CENP-A nach Retro-Cre-Virusinfektion und Proteinexpression von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten zu bestätigen. Auf diese Weise können wir beurteilen, ob der Phänotyp des Kolonieauswachsens wirklich auf den alleinigen Ausdruck von exogenem CENP-A WT oder Mutanten zurückzuführen ist. Wenn für jede Western-Blot-Analyse das Abisolieren durchgeführt wird, um die Membran mit verschiedenen Antikörpern für die nächste Drehung der Western Blot-Analyse zu rebloten, sollte man das gleiche quantitative Detektionssystem wie der Blot eines vorherigen Zugs für den Blot der nächsten Runde mit verschiedenen Antikörpern verwenden. Man sollte sicherstellen, dass die Bänder im Blot des vorherigen Zuges im nächsten Zug mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar sind. Oder verwenden Sie das gleiche quantitative Detektionssystem wie der Blot des vorherigen Zugs und prüfen Sie, ob die Inkubation mit dem bloßen Sekundärantikörper, der im Blot des vorherigen Zugs verwendet wird, nicht zum Nachweis von Proteinbändern führt, bevor der Blot des nächsten Zuges mit verschiedenen Antikörpern beginnt. Für in vivo Ubiquitylierung assay ist es wichtig, größere SDS-PAGE Gel mit dem Gerät laufen, um größere SDS-PAGE Gel laufen (Gel Elektrophorese Apparat I oder II). Empirisch würde ein größeres SDS-PAGE-Gel Proteinbänder deutlich trennen und die Empfindlichkeit des Nachweises der schwachen Bänder erhöhen, die im kleineren Gel schlecht hätten nachgewiesen werden können (d.h. Proteinbänder erscheinen in größerem Gel schärfer).

Es ist äußerst wichtig, das richtige SDS-PAGE-Gel zu wählen, um post-translationale Modifikationen (PTMs) eines bestimmten proteingründlichen LC-MS/MS abzubilden. Das am weitesten verbreitete Gelsystem für SDS-PAGE ist das Laemmli-System, das Tris-Glycin-Gele verwendet, die eine Stapelgelkomponente und die auflösende Gelkomponente umfassen. In diesem klassischen System unterscheiden sich der pH- und Ionengehalt der im Stapelgel (Tris, pH 6.8) und im Auflösungsgel (Tris, pH 8,8) verwendeten Puffer von dem Puffer, der für den Betrieb des Gels verwendet wird (Tris, pH 8.3). Bandverzerrungen, Auflösungsverluste oder Artefaktbänder können durch den hochalkalischen pH-Wert des Laemmli-Systems verursacht werden. Der vorherige Bericht beschrieb die Hauptursachen für eine schlechte Bandauflösung mit dem Laemmli-System16, einschließlich Instabilität und kurzer Ablaufdauer des Auflösenden Gels aufgrund der Hydrolyse von Polyacrylamid bei hohem pH-Wert, chemische Veränderungen von Probenproteinen, Reoxidation reduzierter Disulfide von Cysteinrückständen von Proteinen und Spaltung von Asp-Pro-Bindungen von Proteinen mit Erhitzung bei 95-100 °C im Laemmli-Probenpuffer bei pH 5,2. Die handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris Proteingele sind Bis-Tris HCI-gepuffert (pH 6.4) und werden im Gegensatz zu herkömmlichen Tris-Glycin-Gelen16mit pH ca. 7,0 betrieben. Die zahlreichen Vorteile im Vergleich mit dem Laemmli-System ergeben sich aus dem neutralen Betriebs-pH-Wert der Bis-Tris-Systeme16, einschließlich hoher Stabilität und langer Ablaufdauer des Auflösungsgels, verbesserter Probenproteinstabilität bei Derophorese bei neutralem pH-Wert, was zu einer schärferen Bandauflösung und genauen Ergebnissen führt, sowie eine vollständige Reduzierung der Disulfide und das Fehlen von Spaltungen von Asp-Pro-Bindungen. In diesem Bericht konnten wir erfolgreich PTMs von EYFP-CENP-A K124R Protein (Abbildung 3) mit den handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris Proteingelen kartieren. Daher werden die handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris Proteingele dringend empfohlen, um für diesen Zweck zu verwenden.

Für die Kartierung nach-translationaler Modifikationen (PTMs) eines bestimmten Proteins wird die In-Gel-Verdauung von Zielproteinen in Verbindung mit LC-MS/MS häufig verwendet. In dieser Studie haben wir versucht, Ubiquitinationsstandorte EYFP-CENP-A K124R mit Deraffinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS)-Strategie zu identifizieren. Daher besteht der erste wichtige Schritt darin, eine große Menge an ubiquitiniertem EYFP-CENP-A K124R-Protein mit hoher Reinheit unter Verwendung von Immunpräzipitation aus EYFP-CENP-A K124R-Überexpressionzellen zu erhalten, was die Identifizierung und Bestätigung von Ubiquitinationsstellen von EYFP-CENP-A K124R durch LC-MS/MS erheblich erleichtern könnte. Um die Interferenzen von nicht ubiquitiniertem EYFP-CENP-A K124R-Protein zu reduzieren, Westliche Flecken Anti-GFP, Anti-HA (Ub), Anti-Ubiquitin (siehe Abschnitt [6.1.6]) und Coomassie-Blaufärbung (siehe Abschnitt [6.1.7]) wurden durchgeführt, um die Position des ubiquitinierten EYFP-CENP-A K124R auf SDS-PAGE Gel genau zu bestimmen. Schließlich wurde nur ein minimierter Bereich des Gelbandes, der ubiquitinierte EYFP-CENP-A K124R enthält, für die In-Gel-Verdauung in Verbindung mit LC-MS/MS ausgeschnitten, um optimierte Ergebnisse zu erzielen. Wenn die getrockneten Peptide vor dem Betrieb von LC-MS/MS rekonstituiert werden, wurde 3% (v/v) Acetonitril /2% (v/v) Ameisensäure verwendet, um eine bessere Löslichkeit und Rückgewinnungsrate von Peptiden zu unterstützen. Manchmal kann die Datenbanksuche zu PTMs führen, die aufgrund des ungefähren Zuweisungsalgorithmus der Suchmaschine nicht wirklich existieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Bestätigung von EYFP-CENP-A K124R-Ubiquitinationsseiten durch manuelle Überprüfung von MS/MS von ubiquitinierten Peptiden mit Hilfe von Software F (Tabelle der Materialien), die "unwirkliche" Ubiquitinationsseiten beseitigen könnte, die durch ungefähre Zuweisung durch Datenbanksuche eingeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese AP-MS-Strategie eine effiziente und robuste Pipeline für die Identifizierung von EYFP-CENP-A K124R-Ubiquitinationsstandorten mit entscheidender biologischer Bedeutung etabliert hat. Noch wichtiger ist, dass diese Pipeline auch weit ausgedehnt werden könnte, um die PTMs verschiedener funktioneller Proteine zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

Wir danken Chao-Jun Li vom Model Animal Research Center der Universität Nanjing für die Analyse der Massenspektrometrie. Wir danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa und aktuellen Forschern am Model Animal Research Center, der Nanjing University und dem Greehey Children es Cancer Research Institute für ihre hilfreiche Diskussion, experimentelle Beratung und Reagenzien. Wir danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago und Dawn S. Chandler für ihre großzügigen Reagenziengeschenke. Y.N. wurde vom Jiangsu Province ''Double-First-Class'' Construction Fund, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) und National Natural Science Foundation in China (31970665) unterstützt. Diese Studie wurde teilweise durch das NGI-Stipendium R21 CA205659 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

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References

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Tags

Biologie Ausgabe 160 Zentromer Kinetochore Mitose CENP-A posttranslationale Modifikation PTM Ubiquitylierung Massenspektrometrieanalyse
Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)
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Cite this Article

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

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