Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

Abstract

לימוד המבנה והדינמיקה של קינטומטלות וצנטורמרים חשובים בהבנת אי יציבות כרומוזומלית (CIN) והתקדמות הסרטן. כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, זהות צנטוררה) נקבעים ומשתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום היא שאלה יסודית. CENP-A מוצע להיות אינדיקטור non-DNA (מארק אפיגנטי) של זהות מרוכזת, ו-CENP-A אובידילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, הכרחי הכדאיות התא.

כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי אובילילציה ב ליזין שונים נגרמת בגלל תיוג EYFP ב-K124R מוטציה חלבון CENP. ליזין 306 (K306) אוביזלציה ב-EYFP-K124R התגלתה בהצלחה, המתאימה ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה. אזהרה נדונה בשימוש GFP/EYFP או תיוג של חלבון משקל מולקולרי גבוה ככלי לנתח את הפונקציה של חלבון. המגבלה הטכנית הנוכחית נדונה גם לאיתור להקות אוביקווילבטים, זיהוי אוביקווילציה ספציפיים לאתר, ויזואליזציה של אובידלציה בתאים חיים או תא יחיד מסוים במהלך מחזור התא כולו.

השיטה של ניתוח ספקטרומטר המסה המוצג כאן ניתן להחיל על האנושי CENP-חלבון עם תגים שונים ושאר מרכז החלבונים-הקיטוכורה. ניתן להמליץ על שיטות שונות הכוללות מספר בדיקות/ניתוח שנועדו לחוקרים המעוניינים לזהות תפקידים פונקציונליים של אובילציה.

Introduction

ברוב eukaryotes, מיקרוטובוקלס ציר חייב לצרף לאזור אחד של כל כרומוזום, כינה ריכוז. קינטוכור הוא קומפלקס של חלבונים הנמצאים במרכז הריכוז. לימוד העיתוי של התנועה של מרכז ומעטפת החלבון והמבנה של קינטומאז חשוב להבנת אי-יציבות כרומוזום (CIN) והתקדמות הסרטן. השאלות העיקריות הן כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, הזהות הצנטורלית) נקבעים וכיצד הם משתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום. ברוב המינים, הנוכחות של נוקלאוטיס מיוחד המכיל חלבון דומה histone הנקרא מגדיר את הזהות צנטרומר. לכן, מוצע כי CENP-A הוא מחוון שאינו DNA (סימן אפיגנטי) של הזהות צנטרומר. חשוב להבהיר את המנגנון של האופן שבו CENP-A מגדיר את הזהות הצנטרומר בבני אדם.

זיהוי של צומת הולידיי-היומי חלבון (hjurp) הוא המלווה cenp-a-מיוחד שעליו הפיקדונות cenp-a ב מרכז הריכוז של היום1,2,3. אנו דיווחו בעבר כי CUL4A-RBX1-COPS8 E3 לליגאז נדרש עבור cenp-A אובילציה על ליזין 124 (K124) ו צנטוררה לוקליזציה4. כמו כן, התוצאות שלנו הראו כי הגיוס צנטרומר של החדש מסונתז CENP-A דורש מראש הקיים אוביp-A5. לפיכך, מודל נמסר רומז כי CENP-A אובילציה עוברת בירושה דרך דימריזציה בין חטיבות התאים.

בניגוד לממצאים שלנו ולאלה של יו ואח ', התוצאות השליליות בנוגע ל-CENP-A והלוקליזציה הצנטגוניות שלה פורסמו לאחרונה6. המאמר טען כי CENP-A שינויים על ליזין 124 (K124) הם לוותר על הקמתה, תחזוקה, ותפקוד לטווח ארוך של מרכז האדם, מבוסס על התוצאות השליליות שלהם מראה כי מוטציה של K124R לא להשפיע על CENP-A צנטורייר לוקליזציה לא תאים6. עם זאת, יש מספיק מקום לדיון בתוצאות ובמסקנות שלהם, וכבר תיארנו איזו בעיה יכולה להיות בפרסום הקודם שלהם7. יש לשלם שימו לב כי הם התמזגו חלבונים עם CENP-A, שיש להם הרבה משקולות מולקולריות יותר מאשר בגודל של האנדוגניים CENP-A: למשל, הם התמזגו ~ 30 kDa חלבון פלורסנט משופרת (EYFP) כדי ~ 16 kDa CENP-A וניתח EYFP-CENP-K124R היתוך חלבון במערכת RPE-1 CENP-A-/F מערכת. K124 אוביקוויב לא צפוי לאגד ישירות HJURP מבוסס על תחזיות מבנית4, עם זאת, תוספת של מונו-אוביקוויב הוא ניבא יש השפעה על היווצרות חלבון של Cenp-A. החלבון של CENP-A קונפורמציה יכול להיות שונה על ידי נוכחות של חלבון פיוז'ן גדול, ושינוי זה התאמות עשוי להסוות את השינויים מבניים שנגרמו על ידי אובדן אוביפורמציה. אנו מציעים כי המיזוג של חלבון בגודל גדול גורם אוביקווילציה על ליזין אחר מאשר K124 ב-EYFP-CENP-A K124R מוטציה ואת זה אוביקווילציה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R המוטציה פנוטיפים. ראיות כי אובילציה מתרחשת על ליזין שונים ב-CENP-A K124R חלבון מוטציה עם חלבון תג גדול (EYFP) דווחה בפרסום הקודם שלנו8. נמצא כי התיוג EYFP גורמת אוביקווינציה של אתר ליזין אחר של EYFP-CENP-A K124R וכי EYFP-CENP-K124R מוטציה נקשר HJURP. כתוצאה מכך, אובילציה זה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R יחיד מוטציה פנוטיפ, ושניהם EYFP-CENP-מוטציות K124R הראו צנטרומר לוקליזציה (השתמשנו והשוו pBabe-EYFP-CENP-A WT ו K124R מוטציה, יחד עם בקרת pBabe-EYFP.). התוצאות הראו כי דגל-מתויג או לא מתויגים CENP-A K124R מוטציות קטלניות אבל ניתן להציל על ידי פיוז ' ן monoubi, מציע כי CENP-A אובילציה היא הכרחית לכדאיות התא.

בשנים האחרונות, מחקרים רבים פיתחו בחני שונים לזהות שינויים פוסטטרנסלוניים (לפטין) של cenp-חלבון ואחרים מרכז-החלבונים קיטומודים, הן בvivo והן במבחנה9,10,11. מקביל לפטין של חלבונים היסטון, כי הם מנגנון מרכזי המסדיר את הפונקציה של כרומטין, לפטין של רכיבים מרוכזת של כרוממיה מעורבים גם במנגנון חיוני כדי לווסת את המבנה הכולל ואת התפקוד של צנטרומרים. רוב האתרים של cenp-a ptm הם ספציפיים ל-cenp-a המכיל נוקלאוטיזומים, למרות כמה מהם נשמרים ב היסטון H3, מציע כי שינוי של שאריות אלה תורמים לפונקציה הספציפית צנטרומר. בשנת הבית, מתילציה, מתיונין, ואוביזלציה דווחו בעבר9, מציע כי cenp-A נתון למגוון מגוון של מערכי הקומבינטורית ומערכים שלהם על הטרמינוס האמינית והתחום הקיפול C-טרמינוס. חשיבותו של CENP-A שינויים בפונקציות מרובות נחשף על ידי קבוצות רבות כולל שלנו. פונקציות אלה כרוכות בתצהיר של CENP-A בריכוז, יציבות חלבונים, וגיוס של CCAN (הרשת המשויכת למרכז)9. עם זאת, מחקרים מוגבלים וממצאים של CENP-A השני מראש היכן ההשוואות נעשים עם אחד האבנים קאנוני כי ישירות או עקיף להסדיר את תפקידם. דוחות טכניים התמקדות במתודולוגיה כדי לזהות אלה CENP-A לפטין מוגבלים גם.

בגלל CENP-A אוביקווילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר12, ירש דרך dimerization בין חלוקת התא5, והכרחית לכדאיות התאים8, השיטה לזהות cenp-A אובילציה יהיה חיוני בעתיד כדי ללמוד את הפעילות הפונקציונלית, מיצוב, ומבנה של צנטרומר. לכן, כאן אנו מתארים בניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון8. פרוטוקולים של בקרת שליטה אחרים וניתוחים (ניתוח אימונוoforסנס, המושבה התרחבות הגידול, ו בvivo אוביקווילציה) מוצגים גם כדי לדון את התוצאה של ניתוח המסה הגדולה ספקטרומטריה כראוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים ורטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים

הערה: EYFP-CENP-A מתבטא pBabe-EYFP-CENP-A ברמת חלבון דומה כדי אנדוסוגני CENP-A. סך הכל הסלולר cenp-חלבון מוחלף זה eyfp-cenp-a לאחר שיבוש של cenp-a-/f אלל על ידי recombinase כמו ב rpe-1 cenp-a-/-תאים6.

  1. הכנת הסופרנטנט המכיל רטרווירוס באמצעות תאי אריזה 293T.
    1. יום 0: התפשטות 293T בתאי אריזה על צלחת התרבות 6-היטב (1.0 x 106 תאים/טוב). תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מודיית את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 24 h.
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
    2. יום 1: הכנת תגובת החצייה סביב 23 שעות לאחר התפשטות (24 שעות הנקודה היא 0 h נקודת ההעברה). ביטוי transfect בפלסאמצע של כל pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), ו pBabe-EYFP-CENP-K124R (B3164) (ראה טבלה 1).
    3. בחרו שילוב אחד של מארזים המסייעים/אריזות המפורטים בטבלה 2 והוסיפו אותם לצינורות המכילים את אחד הפלמידים המפורטים לעיל. יש בעיקר אלה 3 שילובים עבור המסייע/אריזות פלמידים (שולחן 2). כל שילוב עבד בניסויים אלה והראה יעילות מעבר דומה.
    4. להכין 50 μL של בינוני סרום מופחת ו לערבב 2.0 μg של כל pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), ו pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ראה טבלה 1) הוספת שילוב אחד של המסייע/אריזות מארזים המפורטים בטבלה 2 מודקון תערובת זו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התערובת הזאת היא פתרון A.
    5. הכינו עוד 50 μL של בינוני סרום מופחת ו לערבב 1.5 μL של החצייה ריאגנטים אני ו II, בהתאמה (טבלה של חומרים). מודקון תערובת זו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התערובת הזאת היא פתרון ב.
      הערה: באופן אופציונלי, להוסיף רק 6.0 μL של החצייה מגיב השלישי (פוליאתילן [הפיי]; 1.0 mg/mL) בפתרון B או להוסיף 6.0 μL של החצייה הכימית השלישי בנוסף לחומרים ריאגנטים I ו-II בפתרון B (שולחן חומרי).
    6. פתרונות מערבבים A ו-B ביחד, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
    7. לאחר שטיפת תאים תרבותיים פעם אחת עם PBS, להוסיף את התערובת של פתרונות A ו-B (כלומר, מורכבות DNA-ליפיד) ישירות לכל טוב של צלחת התרבות 6-היטב כי יש 500 μL מופחת סרום בינוני. הריכוז הסופי של הפלסמיד הוא 3.3 μg/mL.
    8. לאחר הדגירה של התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 4.5 h, לשנות את המדיום כדי הגלוקוז גבוהה dmem עם 10% fbs ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. שים 2 מ ל/טוב של תרבות בינונית לאחר שינוי בינוני בצלחת התרבות 6-היטב.
    9. תרבות התאים בשעה 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 48 h לאחר הזיהום. לבצע זיהום רטרווירוס ביום 3 באמצעות supernatant המכיל רטרווירוס.
  2. הידבקות רטרווירוס של התאים היעד של CENP-A-/F rpe-1.
    1. יום 2: יום לפני זיהום, להפיץ את CENP-A-/F rpe-1 תאים היעד כדי transfect ב 6-טוב התרבות היטב (2.25x 10 תאים /טוב). התאים התרבותיים ב-Dמאמ: F12 בינונית (שולחן חומרים) עם 10% fbs ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: כפולת תאים למושבת המושבה, מאימונוצילונציה וניתוח כתמי אבן מערביים כשליטה. לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
    2. יום 3 (זיהום היום של הווירוס): ב 48 h לאחר העברת בתאי אריזה 293t, לאסוף את supernatant המכיל וירוס ומסנן באמצעות 0.45 יקרומטר מסנן (לא להשתמש במסנן 0.2 יקרומטר אשר להטות את המעטפה וירוס). מומלץ להשתמש במסננים polyethersulfone (PES).
    3. להדביק CENP-A-/f -1 תאים עם הווירוס. עבור אחד טוב של לוחית 6-היטב התרבות, להוסיף 1 mL מדיה טרייה, 1 mL וירוס supernatant ו polybrene לריכוז הסופי של 8 μg/mL. מודטה CENP-A-/F rpe-1 תאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 4 ימים עד יום 7 לאחר הזיהום.
      הערה: תקופת הדגירה של הגדילה של CENP-A-/F rpe-1 צריכה להיקבע באמצעות ניתוחים לקבלת תוצאות אופטימליות.

2. ניתוח של התאים המכילים pBabe-EYFP-CENP-A

  1. יום 7:4 ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנה, להסיר את מדיום התרבות על ידי שאיפה. לשטוף את התאים פעם אחת עם TBS (25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5; 125 מ"מ הנאל). החל TBS על הצד של בארות התרבות כדי למנוע הפרעה פני השטח של תאים.
    הערה: נקודת הזמן המיטבית לקיבוע התא חייבת להיקבע באמצעות המידע האמפירי. האותות של immunofluorescence הן EYFP-CENP-A WT ו K124R מוצגים במרכז לפחות 4 ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-בנייה גם ללא זיהום היצורים (נתונים לא מוצגים, איור 1C-E עבור הנתונים עם הידבקות ביצורים).
  2. בצע קיבוע תא מתנול ו immunofluorescence כמתואר בעבר13.
  3. כמו נוגדנים העיקרי להשתמש בנוגדן אנטי GFP (1:1000 דילול) ו נוגדן אנטי-CENP-B (יחס דילול של 1:200) עבור סמן מיקום צנטרומר ב-TBS המכיל 4% סרום עז (ראה טבלת חומרים עבור נוגדנים בשימוש).
  4. הסרת מדיום הרכבה עודפת עם מגבת נייר לאטום את קצות שמיכות עם לק ציפורניים בשלב האחרון.
  5. עיין בשיטה שתוארה בעבר13 עבור התבוננות בתמונה immunofluorescence רכישה, כימות וניתוח של האותות הנותרים של EYFP-Cenp-A ב צנטרומר.
  6. בצע רכישת תמונה, עיבוד כולל פירוק, כימות וניתוח באמצעות תוכנות A או תוכנות B1 ו-B2 (ראה טבלת חומרים). באופן אופציונלי להשתמש תוכנות C1-C3 (ראה טבלת חומרים) עבור מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה.
    הערה: ראה 2.6.1 בקבצי קידוד משלימים עבור כל הפקודות המשמשות בתוכנה A. ראה 2.6.2 בקבצי קידוד משלים עבור כל הפקודות המשמשות תוכנות B1 ו-B2.

3. המושבה מוצלח בחני אומר באמצעות pbabe-eyfp-cenp-לאחר דלקת וירוס בסגנון רטרו

הערה: הסיבה לביצוע מעשה זה היא להשוות את הכדאיות התאית בין eyfp-cenp-a WT ו K124R מוטציה לאחר השיבוש של cenp-a-/f אלל על ידי המין recombinase (לאחר החלפת הכולל של הסלולר cenp-חלבון).

  1. רטרו וירוס-העברה של pBabe-EYFP-מבנים.
    1. בצע העברה רטרווירוס של CENP-A-/F rpe-1 תאים כפי שמתואר בסעיף 1. בתאי תרבות ב-DMEM: בינונית F12 עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין עבור 72 h לאחר זיהום וירוס.
    2. שלושה ימים לאחר זיהום רטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים (ביום 6), להוסיף בלפסיפידין (10 μg/mL) בבארות המכילות תאים מזוהמים לשמש עבור המושבה מעבר הצמיחה וניסויים בקרה. התאים מגודלים לפחות 14 יום לאחר זיהום וירוס בנוכחות של בלטות S. לשנות את המדיום המכיל בלטות כל 5 ימים.
      הערה: אם התאים מגיעים למפגש של 80% לפני הזריעה של שיטת המושבה (3.2.7. ו-3.2.8), העבר את התאים ב 1:2 ו-1:5 באמצעות טריסיזציה וציפוי בצלחת של 6 מיטב התרבות.
    3. לאסוף תאים עבור הכתם המערבי ביום 7 כדי לאשר את ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-CENP-בנייה ללא זיהום היצורים. בצע ניתוח כתמי אבן מערבי כמתואר בסעיף 4. התוצאות מוצגות באיור 1B (נתיבים 1-4).
    4. עבור שיטת מושבה מחוץ לגידול עם זיהום וירוס היצור, לשמור על התאים גדלים 14 ימים לאחר זיהום וירוס בנוכחות של בלטות S (כלומר, לגדל תאים בתוך בלטות S המכיל בינוני עד יום 17 עבור התוצאות המוצגות כאן).
  2. הדלקת וירוס בסגנון רטרו של pBabe-puro.
    הערה: יום 0 בשלב 3.2.1 מקביל ליום 13 בסעיף 3.1.
    1. היום 0 עד יום 3: לבצע העברה רטרווירוס של CENP-A-/F rpe-1 תאים באמצעות pbabe-Puro (B3027) כמו ביטוי פלפמיד (ראה סעיף 1 לפרטים). הקפידו להוסיף בינונית תרבותית (10 μg/mL).
    2. יום 4: טריזיסיזציה לתאים כדי להתנתק מלוחית הרישוי. צלחת 500 או 5,000 תאים בטריליטה בלוח התרבות 6-היטב. בתאי תרבות ב-Dמאמ: F12 בינונית עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    3. יום 5: הוספת בלטות S (10 μg/mL) למדיום התרבותי. עבור 5,000 או 500 תאים, לבחור תאים עם בלטות S (10 μg/ml) 3-24 ימים (עד יום 14 ב [3.2.7]) או 3-28 ימים (עד יום 18 ב [3.2.8]) לאחר זיהום וירוס של בנייה (pBabe-EYFP-CENP-מבנים).
      הערה: בתוך שיטת ההתפשטות הזאת, השילוב של היצור החדש של pBabe-puro מתווסף יחד עם ההתפתחות של pBabe-EYFP-CENP-A. ההעברה של pBabe-EYFP-CENP-A מבוצעת ב 3.1. הזיהום של היצור של pBabe-פורו מבוצע ב3.2.1.
    4. יום 10 (7 ימים לאחר זיהום וירוס בסגנון רטרו): לאסוף תאים עבור ניתוח בלוק המערבי כדי לאשר את המחסור בחלבון של שאנדוגני CENP-לאחר הידבקות וירוס של הרטרו ו/או ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-CENP-מבנים באותו יום 10.
    5. בצע בלוק מערבי כמתואר בסעיף 4 באותו יום 10. התוצאות מוצגות באיור 1B (נתיבים 5-7).
    6. בצע ניתוח immunofluorescence (סעיף 2 לעיל) כדי לאשר כי הן EYFP-CENP-A WT ו K124R מקומי לריכוז 7 ימים לאחר הפעלת האנדוגניים הנותרים CENP-A allele. התוצאות מוצגות באיור 1ג-1e.
    7. יום 14: לבצע את המושבה מוצלח שיטת עם הצלחת הנזרע עם 5,000 תאים. תקן תאים עבור 10 דקות מתנול והכתם עבור 10 דקות בתמיסת קריסטל סגול (2.3% קריסטל סגול, 0.1% אמוניום oxalate, 20% אתנול (ראה איור 2B). לספור את מספר המושבות באמצעות תוכנת OpenCFU (ראה איור 2C).
    8. יום 18: השימוש לוחית הזרע עם 500 תאים. תאים לתקן ולהכתים כמתואר בשלב 3.2.7 (ראה איור 2B). לספור את מספר המושבות (ראה איור 2 ג).

4. ניתוח כתמי מערביות באמצעות pBabe-EYFP-CENP-A

הערה: עיין בשיטה שתוארה בעבר13 עבור ניתוח כתמי אבן מערבית באמצעות נוגדנים המצוינים באיור 1B ואיור 2a וטבלת חומרים עבור eyfp-cenp-חלבונים.

  1. לבודד חלבונים על ידי lysing את התאים גדל עם זיהום וירוס שונים. לאחר מכן, השתמש 20 μg של חלבון בבאר אחת של SDS דף ג'ל. להעביר את החלבונים לקרום PVDF כמתואר בעבר13.
  2. לשטוף את הממברנה 3x לאחר incubations עם נוגדנים משני הראשי. לזהות ולנתח את להקות החלבון על הקרום עם מערכת הדמיה אינפרא אדום ו/או המיגראואניוליבורגר לזיהוי חיסוני. תוצאות אלה מוצגות באיור 1B ובאיור 2a.
    1. למערכת הדמיה אינפרא-אדום כדי לאתר ולנתח את להקות החלבון, ראה שלב 4.2.1 בקבצי קידוד משלימים.
    2. השתמש במקלינסנציה כדי לזהות ולנתח את להקות החלבון, ראה שלב 4.2.2 בקבצי קידוד משלימים. עבור מערכת זו, השתמש במצע כימי (טבלת חומרים) הרגישה במיוחד (ecl).
    3. באופן אופציונלי, השתמש בכתם המערבי להתפשט מאגר להסיר נוגדנים מראש מחדש מקרום PVDF למחוק אותו עם נוגדנים שונים לקראת הבא של ניתוח מערבי. מדעית לקבוע את זמן הדגירה אופטימיזציה הטמפרטורה להשתמש.

5. התרבות התא, העברה, ו ב vivo אוביקטלציה באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A

הערה: רמת החלבון של EYFP-CENP-A ביטא pQCXIP-וקטור הוא ~ 10x גבוה יותר מאשר האנדוגניים ברמת החלבון. השימוש וקטור זה מקל immunoprecipitation של כמות גבוהה יותר של EYFP-CENP-חלבונים, התבוננות של להקות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A, וזיהוי של אוביקווילציה של EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה.

  1. הvivo באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. הזרע 36.2 x 105 Cenp-A-/f rpe-1 תאים בצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה. תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית קובעת את צפיפות התא המשמשת בזריעה. הכינו לפחות 2 מנות לדוגמה אחת immunoprecipitation (IP) כדי לקבל מינימום של חלבון מוחלט של 1 מ"ג.
    2. דגירה את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 18 h.
    3. , ב -17 לאחר זריעה. הכן את ריאגנטים החצייה
    4. להפוך את הפתרון על ידי ערבוב 6.7 μg פלאבין של כל pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-מK124R (B3256) (שולחן 1) ב 335 μl של בינוני סרום מופחת, ו-מודטה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 6.7 μg פלאמיד של pcgn-האוביקוויב (B2806) לכל הדגימות.
      הערה: כל הווקטורים מפורטים בטבלה 1.
    5. להפוך את הפתרון B על ידי ערבוב 10.1 μL של החוצה ריאגנטים האני ו II, בהתאמה 335 μL סרום מופחת בינוני, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
      הערה: צעד אופציונלי הוא להוסיף רק 40.2 μL החצייה מגיב השלישי (פוליאתילן [הפיי]; 1.0 mg/mL) בפתרון B או להוסיף 40.2 μL החצייה מגיב השלישי בנוסף ריאגנטים החצייה אני ו II בפתרון B (טבלת חומרים).
    6. פתרונות מערבבים A ו-B ביחד, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
    7. לאחר שטיפת תאים תרבותיים פעם אחת עם PBS, להוסיף את התערובת של פתרונות A ו-B (כלומר, מורכבות DNA-ליפיד) ישירות לכל אחד בודד 10 ס מ רקמת העור התבשיל כי יש 3.35 mL μL מופחת סרום בינוני.
      הערה: הריכוז הסופי הוא 1.67 μg/mL של פלסמיד.
    8. מודטה את התאים ב37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עבור 4.5 h. לאחר 4.5 h, לשנות את המדיום כדי הגלוקוז גבוהה DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    9. תרבות התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 48 h לאחר הזיהום. לאסוף תאים עבור הכנה lysates תא.
  2. הכנת חלבון חרוזים הקשורים בנוגדן אנטי-GFP.
    1. קח 25 μL (50% v/v) של חלבון חרוזים לתגובה אחת של immunoprecipitation (IP). לשטוף עם מאגר A1 (הטבלה של חומרים) לפחות 3x כדי להסיר את אטוח, ולעשות 50% פתרון עם מאגר A1 (20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4; 50 MM הנאל; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% הסרת מעכב פרוטאז בחינם).
    2. הוסף 2.0 μL של נוגדן אנטי-GFP (Anti 76: נוגדן תוצרת בית) לחרוזים שהוכנו לעיל ולהוסיף נפח 10x של מאגר A1 השוואת עם נפח חרוזים נטו.
    3. בצע סיבוב מקצה לקצה ב-4 ° צלזיוס עבור 4-18 h. אורך הזמן האופטימלי לסיבוב מקצה לקצה חייב להיקבע בהתאם ליעילות הimmunoprecipitation.
    4. צנטריפוגה את החרוזים ב 100 x g עבור 1 דקות ולהסיר את supernatant לא מאוגד. הוסף מאגר A1 כדי לבצע מחדש 50% (v/v) פתרון של החרוזים. השתמש 25 μL (50% v/v) של פתרון זה עבור תגובה אחת של IP.
  3. Immunoprecipitation (IP) באמצעות חלבון חרוזים מספרד הקשורים בנוגדן אנטי-GFP.
    1. התאים lyse שהתקבלו בשלב 5.1.9 במאגר A1 על-ידי sonication ותהליך הקפאת הפשרה.
    2. מדידת ריכוזי חלבון ולנרמל כמויות חלבון בין דגימות IP שונות. הסר 5% מהדוגמה מכל צינור כדי לפעול כ-5% כדוגמת קלט ב-SDS-PAGE.
      הערה: מדגם הקלט 5% יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי ומצויד ב-80 ° c, אם הוא לא טעון תוך יום.
    3. מערבבים את שאר 95% ליפוסט עם 25 μL (50% v/v) של חלבון חרוזים הקשורים לנוגדן אנטי-GFP שהוכן בשלב 5.2. בצע סיבוב מקצה לקצה ב-4 ° צלזיוס עבור 4-18 h.
      הערה: אורך הזמן האופטימלי לסיבוב מקצה לקצה חייב להיקבע כאמפירי.
    4. חלבון צנטריפוגה חרוזים עם חלבון מאוגד (כלומר, immunoprecipitates) עם 100 x g עבור 1 דקות, ולהסיר את supernatant. לשטוף את immunoprecipitates עם מאגר A1 על-ידי תפרידו ב 100 x g עבור 1 דקות. לבצע שלב זה 4x.
    5. מערבבים את הקלט 5% ואת שאר 95% הimmunoprecipitates עם מאגר טעינה של 2x ו-4x SDS-עמוד14, בהתאמה. מרתיחים שתי דגימות אלה עבור 5 דקות ולאחר מכן לטעון אותם על 10.0% הרפתקאות SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל עבור אלקטרופורזה בנתיבים שונים. השתמש ביותר גדול SDS-דף ג'ל (למשל, 17 ס"מ x 15 ס מ) עבור אלקטרופורזה. אם מדובר בדגימות של ג'ל קטן יותר, ייתכן שלא ניתן יהיה להבחין בלהקות אוביקטלציה ברורות/חדות.
    6. בצע ניתוח כתמי מערבי כמתואר בסעיף 4 באמצעות הנוגדנים המצוינים בדוח הקודם8. התוצאה מופיעה באיור 2A.
    7. השתמש בכתם המערבי להתפשט מאגר להסיר את הנוגדנים טרום הדגירה של קרום PVDF למחוק אותו עם נוגדנים שונים לסיבוב הבא של ניתוח כתמי מערביות.

6. ספקטרומטר מסה כדי לזהות את האתר אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה

  1. העברה לניתוח ספקטרומטר המסה באמצעות pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. זרעים CENP-A-/F rpe-1 תאים בצלחת 10 ס מ רקמת הרקמה. בדוק כי צפיפות התא היא 36.2 x 105 תאים לכל מנה. תאי תרבות ברמת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. הכינו לפחות 20 מנות עבור אחד immunoprecipitation (IP) לדוגמה, כדי לקבל לפחות 10 מ"ג חלבון כולל (לראות 5.3).
      הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, בדיקה מדעית את צפיפות התא לשימוש בזריעה.
    2. מודחת את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 18 h. הכינו את המזרעות העירוי ~ 23 שעות לאחר התפשטות (24 שעות הנקודה היא 0 h נקודת ההעברה).
    3. ב -17 לאחר זריעה, הכינו את התאים הללו לטיפול בתאי העור (4.1.3). תאים מזוהמים יש pCGN-הא-אוביקוויב (B2806) ו-pQCXIP-EYFP-מK124R (B3256).
    4. מודיית את התאים ב 37 ° c באווירה של 5% CO2 עבור 48 h לאחר החצייה. לאסוף תאים עבור ליסביטים תא.
    5. Lyse תאים במאגר A1 ולבצע immunoprecipitation as (5.2) ו (5.3). הפעל את שני immunoprecipitation lysates כדלקמן (6.1.6) ו (6.1.7).
      הערה: ב (6.1.6), הפעל את המדגם בתקן טריס-גליצין רגיל. In (6.1.7), להפעיל את המדגם של הזמין מסחרית 4%-12% החלבון Bis-Tris. ראה גם דיון.
    6. שמור דוגמה אחת עבור 10% של סך immunoprecipitants כדי לאשר EYFP-CENP-אובילציה ו לקבוע בדיוק את המיקום של EYFP מחולק אוביקוויל-CENP כמתואר בסעיף 5. הפעל דוגמה זו ב-ג'לים סטנדרטיים של טריס-גליצין. SDS-העמודים והכתם המערבי בוצעו כמו (5.3).
    7. שמור דוגמה נוספת עבור 90% של סך immunoprecipitants עבור ניתוח ספקטרומטר המסה. הפעל מדגם זה בתוך שתי בארות של זמין מסחרית 4%-12% Bis-Tris חלבונים. בצע כתמים כחולים coomassie באמצעות הפתרון הכחול coomassie. בלו וחותכים את אזור הג של 50-70 kDa (מונו-רוב-EYFP-CENP-A K124R אזור). השתמש באזור ג'ל זה לניתוח ספקטרומטר המסה.
  2. ניתוח ספקטרומטר מסה באמצעות העיכול בתוך ג'ל.
    1. חותכים כל פיסת ג'ל של עניין לחתיכות קטנות (1 מ"מ2) ומניחים אותו לתוך 0.5 mL של חלבון מחייב נמוך צינורות.
    2. לשטוף עם 100 μL 50% (v/v) acetonitrile ב 25 מ"מ NH4hco3, מערבולת 10-15 min, ספין למטה, להיפטר supernatant, לחזור על 3x.
    3. לרכז את המדגם באמצעות מרכז ואקום שחקן הספסל עבור 30 דקות לייבש את חתיכות ג'ל.
    4. הוסף 10 μL של 10 ng/μL רצף של כיתה ולתת את חתיכות ג'ל כדי לעבור מחדש עבור 5 דקות.
    5. הוסף 25 מ"מ NH4hco3 פשוט מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל, לעכל ב 37 ° c לילה.
    6. העבר את הסופרנטנט המיתעכל לתוך שפופרת נקי 0.65 mL. הוסף 50% (v/v) acetonitrile/5% (v/v) החומצה הפורמית (30 μL או מספיק כדי לכסות), מערבולת 10 דקות, ספין להעביר לתוך צינור החילוץ אותו. חזור על 3x.
    7. הוסף 10 μL acetonitrile לחתיכות ג'ל, מערבולת 5 דקות, ו ספין למטה. העבר את הסופרנטאנט לאותה צינורית.
    8. לרכז את הדגימות באמצעות מרכז ואקום הספסל כדי 2 μl, להוסיף 8 μl 3% (v/v) acetonitrile/2% (v/v) החומצה פורמית למדגם, מערבולת עבור 15 דקות, ו ספין למטה ב 16,000 x g עבור 30 דקות. דגימות מוכנות לניתוח ספקטרומטר המסה.
    9. בצע ייבוא נתונים MS עם LC-MS/MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מערכת (טבלת חומרים) ביחד עם כלי ספקטרומטר מסה (טבלת חומרים).
    10. הכנס 8 μL של מדגם מחדש לעמודה כרומטוגרפית נוזלית בשלב הפוך (RPLC).
    11. הפרד את הפפטידים עם 2-80% הדרגתי של הממס B ב 60 דקות. ודא כי מעבר הצבע מורכב אחוז הולך וגובר של B ממס מ 2% עד 22% ב 40 דקות, 22% כדי 35% מומס B ב 12 דקות, ולאחר מכן לטפס על 80% מומס B ב 4 דקות, ולבסוף החזקת 80% הומס b עבור 4 הדקות האחרונות. הגדר את קבוע קצב הזרימה ב-300
      הערה: ממיס A מכיל 0.1% החומצה פורמית ו 2% acetonitrile, ממס B מכיל 0.1% החומצה פורמית ו 98% acetonitrile. כל הריכוזים מוצגים כאמצעי אחסון/אמצעי אחסון.
    12. איסוף נתונים מבוססי-ספקטרומטר מסה באמצעות מצב רכישה תלוי-נתונים. בקצרה, לאסוף MS ספקטרום ב 350 – 1500 m/z עבור 250 MS. בחר את למעלה 50 מקדם מקדים אינטנסיבי עם טעינה 2 – 5 עבור פיצול נוסף. לאסוף MS/MS ספקטרום ב 100 – 2000 m/z עבור 100 MS, להוציא יונים מקודמן מחדש בחירה עבור 15 s.
    13. לחיפוש במסד הנתונים, פתח את התוכנה המסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח נתונים ספקטרומוטוריקה מאסיבית בשולחן העבודה.
    14. כדי לבצע חיפוש חדש, לחץ על כפתור "LC" בתפריט העליון. לאחר מכן לחץ על "Add" כפתור כדי להעלות את המקורי MS נתונים raw קבצים.
    15. בחר "מזהה חלבון אנושי"בשיטה "פרגון" כשיטת חיפוש במסד הנתונים. חפש את קבצי MS המקורי של נתונים גולמיים נגד מסד הנתונים של יוניפרוט הומו-ספיינס (המכיל 160,566 רצפים, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. הגדר את הפרמטרים לחיפוש כדלקמן: בחירת טריפסין כאנזים העיכול, מאפשרים עד 3 ביקנים חסרים, 4 שינויים ו-2-5 חיובים לכל פפטיד. הגדר שגיאת מסה עד 20 עמודים לדקה עבור החיפוש הראשון ו-0.02 Da עבור יונים מפוצלים. ציין ספי שיעור גילוי כוזב (רוזוולט) עבור אתרי חלבונים, פפטיד ושינויים שפחות מ-1%. הגדר את כל הפרמטרים האחרים בתוכנה לערכי ברירת מחדל (ראה איור 3 לניתוח ספקטרומטר המסה).
    17. לחץ עלכפתור "שמירה בשם" בזכות התפריט העליון, בחר תיקיה לאחסון תוצאות החיפוש, הזן את שם החיפוש ולחץ על כפתור "שמור".
    18. לחץ על "תהליך" כפתור בצד ימין של התפריט העליון כדי להתחיל את החיפוש. לאחר סיום החיפוש, הנתונים עם שם החיפוש שהוזן יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיה שנבחרה. ניתן לפתוח את הנתונים בקלות על-ידי תוכנה F.
    19. כדי לקבל את ספקטרום MS/MS של כל פפטיד ספציפי, לחץ פעמיים על תוצאות החיפוש כדי לפתוח אותו על ידי תוכנה F. ראשית, לחץ על החלבון ברשימת החלבונים בחלק העליון של התפריט, ולאחר מכן לחץ על פפטיד באמצע התפריט. MS/MS של פפטיד זה מוצג בתחתית התפריט.
    20. כדי לייצא ולשמור של MS/MS ספקטרום, לחיצה ימנית על MS/MS ספקטרום בחלק התחתון של התפריט, בחר להעתיק ולאחר מכן להדביק קובץ מתאים כגון PPT או doc. בפורמט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eyfp-CENP-מוטציה K124 מראה אוביקווילציה, אינטראקציה עם HJURP, ואין פגמים בלוקליזציה של מרכז התקשורת לא תאים. כאן המערכת דיווחה על ידי fachinetti ואח '. (2017)6 היה re-היווה: ב דיפלואידי אנושי (rpe-1) תאים נושא אחד שיבשו ואחד ' ' מכוסל ' ' cenp-a אלל (cenp-a-/f), eyfp-cenp-a היה ביטא את וקטור pbabe-ey במערכת זו, הביטוי של האנדודוגני cenp-a מ- cenp-a-/f אלל יכול להיות מופרת על ידי היצור recombinase6. בונה גנים של EYFP-CENP-A WT או K124R מוטציה (איור 1A), אשר מצילה את אובדן של האנדודוגני cenp-A, היו בלתי נשכח כאשר שילוב retroviral יעיל בוצעה. הביטוי הנותר של האנדודוגני cenp-a מ- cenp-a-/f אלל הופרשו על ידי הrecombinase. הביטוי של האנדודוגני CENP-A לא זוהה 7 ימים לאחר אינדוקציה של הrecombinase היצורים (איור 1B, נתיבים 5-7). הן EYFP-CENP-A WT ו K124R חלבונים הביטוי נמצא להיות ברמה דומה ל-CENP הראשונית ברמת חלבון (איור 1B, נתיבים 3, 4, 6, ו -7). הן eyfp-cenp-A WT ו-K124R מוטציות הראו לוקליזציה צנטרומר ב 7 ימים לאחר השיבוש של הביטוי הנותרים של שמירה על cenp-a מתוך cenp-a-/f אלל (איור 1ג-1e). הן EYFP-CENP-A WT ו מוטציה K124R הראה אוביקווילציה ואינטראקציה עם HJURP בניגוד למקרה של דגל-מתויג או מתויג CENP-A WT ו K124R המוטציה (איור 2A; הנתונים לא מוצגים עבור דגל-מתויג או לא מתויגים cenp-A)8. הכדאיות התאית טופלה גם על ידי ביצוע המושבה מוצלח שיטת הצמיחה 14 ימים לאחר השיבוש של הנותרים אנדוגניים שנותרו השני של אלל (איור 2b). הן eyfp-cenp-A WT ו K124R מוטציות הראו מספר דומה של ' ' הצילה ' ' המושבות 14 ימים לאחר השיבוש של הנותרים אנדוגניים שנותרו cenp-a אלל (איור 2b ו- 2b). כך, התוצאות שלנו בשורה עם אלה שדווחו על ידי Fachinetti ואח '6.

אוביקווילציה ב ליזין 306 (K306) ב-EYFP-CENP-K124R נחשף על ידי ניתוח ספקטרומטר המסה. נמצא כי הן EYFP-CENP-A WT ו מוטציה K124R מציג אוביקווילציה ואינטראקציה עם HJURP בניגוד למקרה של דגל-מתויג או מתויג CENP-A WT ו K124R המוטציה (איור 2A; נתונים לא מוצגים עבור דגל-מתויג או לא מתויגים cenp-A)8. תוצאות אלה מרמזות על המיזוג של החלבון EYFP שגורם אוביקילציה על ליזין אחר מאשר K124 ב EYFP-CENP-K124R מוטציה, ואת זה אוביקילציה באתר אחר לקדם את האינטראקציה של EYFP-CENP-A K124R עם HJURP. אוביקולציה ב ליזין 306 (K306) ב-EYFP-CENP-K124R נחשף ב-CENP-A-בתאי ה- IP של ניתוח הספקטרומטר המסה (איור 3A ואיור 3a). ליזין 306 (K306) ב EYFP-CENP-K124R מתאים ליזין 56 (K56) ב-CENP-A. יחד, התוצאות שלנו מראים כי המיזוג של חלבון גדול בגודל (g., תיוג EYFP) גורם אוביקווילציה על ליזין אחר מ K124 ב-CENP-A, ואת זה אובילציה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R בודד פנוטיפים.

Figure 1
איור 1: EYFP-CENP-K124 מוטציה במרכז הריכוז. (A) ייצוגים של שונים cenp-A חלבון מבנים מתויג עם eyfp (חלבון פלורסנט צהוב משופר) בטרמינוס N. אותיות אדומות לסמן את המיקום של K124R חומצת אמינו החלפת במבנה המצוין (משמאל). תוצאות ההסכמה שבוצעה במחקר זה מוצגות (מימין). (ב) ניתוח כתמי אבן מערבי לא הראה נוכחות אנדוגניים אנדוגני-A לזיהוי. ניתוח חיסוני כדי לבדוק את נוכחות הביטוי של בונה ההצלה המצוין (ca. 45 kDa) לפני ואחרי זיהום של היצורים. ביטוי החלבון של pBabe-EYFP-בנייה אושרה לפני זיהום היצורים (נתיבים 1-4), כמו גם לאחר זיהום היצורים (נתיבים 5-6). העדר של ה-CENP אנדוגני-חלבון (ca. 15 kDa) אושרה ב-CENP-A- תא קווים שנאספו 7 ימים לאחר זיהום של היצורים (נתיבים 5-6). חלבון הגנד שימש כבקרת טעינה. (ג) אייfp-מוטציה K124 המתרכזת במרכז הריכוז. CENP-A-/F rpe-1 תאים היו מזוהמים במבנים המצוין, תרבותי 7 ימים לאחר הדלקת וירוס בסגנון רטרו, ומוכתם חיסוני. ויזואליזציה של DAPI (כחול), EYFP (ירוק), ואנדוגניים CENP-B (אדום), אשר שימש בקרת מיקום ריכוז. סרגל בקנה מידה, 10 μm. (ד) תבניות הלוקליזציה המוצגות ב-(C) המסוכמות כהדגרמות. יותר מ 200 תאים הבינפאזה עם האותות EYFP-חיוביים נספרו לכל ניסוי (n ≥ 3 ניסויים), ואת האחוזים ממוצע (± SD) מוצגים. ' ' אחרים (ללא ריכוז) ' ' מתארת תאים פגומים בעיקר, תאים מתים, או תאים עם לוקליזציה נוקלאוקולאר ב interphase, אשר נצפו בגלל החצייה או טיפולים אחרים. אין הבדל משמעותי (נ) נצפתה ב K124R השוואת WT (t-test של סטודנט). (ה) האותות הנגזרים מריכוז המוצגים במרכז (C). אותות היו מנורמלים לאלה של WT, והאחוזים הממוצע (± SEM) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: EYFP-CENP-K124 מוטציה היא אוביקווילated ואינטראקציה עם HJURP, הכדאיות תא לא הושפע על ידי K124R מוטציה של EYFP-CENP-a. (א) EYFP-Cenp-K124 מוטציה הוא אוביקווילנטי ואינטראקציה עם HJURP. . בvivo אובילציה CENP-A-/F rpe-1 תאים היו מזוהמים עם המבנים שצוין. חלבונים ב 5% הכולל התאים lysates (קלט) ו immunoprecipitates (IP) באמצעות נוגדנים אנטי-GFP הארנב polyclonal זוהו על ידי ניתוח כתמי המערבי באמצעות נוגדנים שצוין. ובכן-ועוד-מונו-עין-איימפ-א (* *) ובו (*) המצוינים. דמות זו השתנתה מניאיקורה ואח '8. (ב) תמונות מייצגות מתוך שיטת המושבה, כפי שמוצג בערכה (למעלה) של שני תנאים שונים ([1] ו-[2]) עבור הטרנסלירים המצוינים של EYFP-Cenp-A. (ג) היסטגרמות בסיכום הישרדות המושבה של הניסויים ב (ב). האחוזים הממוצע (± SEM) של יותר מ 3 ניסויים עצמאיים (n ≥ 3) הם מנורמל עם אחוז של מושבות ששרדו ב-EYFP-CENP-WT (EYFP-WT). p < 0.0001 ו * * p < 0.01 לעומת בקרת EYFP (t-test של סטודנט). אין הבדל משמעותי (נ) נצפתה ב K124R השוואת WT (t-test של סטודנט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שברים של אוביקווילבטים EYFP-הפפטידים K124R זוהו על ידי ניתוח ספקטרומטר המסה. (א) עדות של אוביקווילציה ב ליזין 306 (K306) של EYFP-CENP-K124R ב rpe-1 Cenp-a- התאים/f. ליזין 306 (K306) של EYFP-CENP-K124R מתאים ליזין 56 (K56) ב-CENP-A. פפטיד LQKLRGGsthllir (כיסוי 95.9%, ביטחון 87.8%) המזוהה על-ידי ניתוח הדיסוציאציה מושרה בהתנגשות. ערכי m/z (Da) של היונים b (ירוק) ו-y (אדום) בספקטרום של (א) שזוהו במהלך הפיצול מסומנים בירוק בטבלה (ב). האובילציה של K306 מאושר על ידי מוטיב הארווין (מחשוף שלם) של יון b-3 (m/z 753.4730) ו-y-8 יון (ז/ז 1350.8328). (ב) הטבלה מדגישה את ערכי m/z (Da) של היונים B (ירוק) ו-y (אדום) בספקטרום של (א). LQK[Umc]sthליום בטבלה של (ב) מציין את הפפטידlqkSthהמוצג ב (א). נתונים אלה שונו מתוך Niikura ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מספר B מאפיינים רלוונטיים פניה מקור
B3027 פבייב-פורו ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר אמרוטה אשטקר, ד ר לורנס ס. קירשנר
B3182 pBabe-EYFP ניאכסורה ואח ', 2019 -
B3161 בייבי-איימפ-סנפ-בWT ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר דנילה פצ'נטי, ד ר דון קליבלנד
B3164 פבייב-איימפ-סנפ-K124R ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר דנילה פצ'נטי, ד ר דון קליבלנד
B3031 psPAX2 ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר ג'ון תומפסון, ד ר גוסטבו לאונה
D3032 pMD2. ג'י ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר ג'ון תומפסון, ד ר גוסטבו לאונה
B3189 pGP ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר קנג'י טאגו (האוניברסיטה הרפואית Jichi, יפן)
B3190 pCI-VSVG ניאכסורה ואח ', 2019 ד ר קנג'י טאגו (האוניברסיטה הרפואית Jichi, יפן)
B3001 הוראות המשך ניאכסורה ואח ', 2019 -
B3252 המדריך היווני-EYFP ניאכסורה ואח ', 2019 -
B3254 המדריך החדש-EYFP-A WT ניאכסורה ואח ', 2019 -
B3256 מK124R-עין-מערב ניאכסורה ואח ', 2019 -
B2806 pCGN-האוביקוויניה ניאכסורה ואח ', 2019 -

שולחן 1: וקטורים פלביניים המשמשים במחקר זה.

מספר B מסייע/אריזה בוקטורים בינוניים שילוב 1 שילוב 2 שילוב 3
B3031 psPAX2 (מחסום-ויראלי/פול וקטור) 2μg
D3032 pMD2. g (וקטור עטפה) 2μg
B3189 pGP (כפוף מחסום/פול וקטור) 2μg
B3190 pCI-vsvg (וקטור עטפה) 2μg
B3001 pPAM (אמופטרופי עוזר וקטורי קידוד כפוף מחסום-פול-env) 2μg

שולחן 2: שילובים של המסייע/אריזות פלמיד וקטורים המשמשים ב (1.1.3): וירוס החצייה של pBabe-EYFP-מבנים.

משלים קבצי קידוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן תיארנו שיטות של ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון8. בתוצאות שלנו, זיהינו בהצלחה אוביקווילציה על ליזין 306 (K306) ב-EYFP-CENP-K124R, המתאים ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה. ניתוח ספקטרומטר המסה המתואר כאן הוא שיטת חיקוי כפי שאנו מזהים בעבר את ליזין 124 (K124) האתר אוביקווילציה של CENP-A WT-דגל12. לכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על-ידי חלבון CENP אנושי עם תגים שונים ומרכז החלבונים אחרים. ניתוח הספקטרומטר ההמוני המבוסס על LC-MS/MS מתקבל בדרך כלל כדי לזהות שינויים פוטנציאליים של posttranslational (לפטין) של ספקטרום רחב של חלבונים. שיטות הצירוף שלנו המורכב ממספר שמות/ניתוחים (כלומר, בvivo אוביזלציה מושבה, שיטת ההתפשטות ההמונית וניתוח ספקטרומטר המסה) יכול להיות מומלץ עבור חוקרים המעוניינים לזהות תפקידים פונקציונליים של אובילציה (s) של חלבון היעד שלהם (s).

עם זאת, פרוטוקול זה אינו מכסה את הזיהוי של להקות אוביקווילקות ו/או זיהוי אוביקווילציה ספציפיים לאתר של חלבונים אלה בתאים חיים או תא יחיד מסוים במהלך מחזור התא כולו. שנים אלה הגישות אלקטרואופטיקה מפותחים באופן דרמטי ונותן השפעה גבוהה על מחקרים כמותיים של מערכות איתות תאים. אלקטרואופטיקה סיפקה במקור גישות כי בדיוק להפעיל או לעכב נוירונים בודדים באמצעות רכיב יחיד, מערכות מבוססות מיקרוביאלית. כיום, ניתן לשלוט בפעילות החלבונים עם דיוק הזמן הזמני החסר תקדים, ולנצל את השימוש בכלי מקודד גנטי טבעי, וכלים מקודדים שונים מאפשרים שליטה קלה בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל זרחון חלבון15. לכן, אלקטרואופטיקה היא מערכת מבטיחה לחקור את החלבון הזמני איתות באמצעות הסלולר ואת רמות האורגניזם כולו. מספר הקינסים של חלבון מבוקר אור מתרחב במהירות, למרות שהמספר הנוכחי עדיין מוגבל. עם זאת, התפתחות החלבון מבוקר האור אוביקווילציה מתעכב, ותיוג משקל מולקולרי גבוה של photoreceptors עשוי לשבש את האובילציה של החלבונים הן WT ו מוטציה מבחינה פונקציונלית לשנות את פונקציית החלבון הטבעי כמו יער. לכן, התפתחות של משקל מולקולרי נמוך התיוג או טכניקת בדיקה הוא נדרש בדחיפות כדי להמחיש אוביקווילציה ו/או לחקור את שליטת החלבון הזמני מאותת על הסלולר החיים ואת רמות האורגניזם כולו.

במחקר הנוכחי, בקרת וקטור eyfp הוא חיוני עבור בחני בקרת וניתוחים (ניתוח אימונוofor, המושבה ושיטת הצמיחה, ו ב אובילציה) כדי לדון את התוצאה של ניתוח משמעותי ספקטרומטר המסה כראוי. אינטראקציה שאינה ספציפית עם EYFP-חלבון הוא נצפה לעתים קרובות בניסוי immunoprecipitation, ובכך בקרת EYFP וקטורי היא הכרחית כדי להעריך את האינטראקציה האמיתית של חלבון התמזגו EYFP (s). ניתוח ספקטרומטר המסה שלנו תוך שימוש ב-EYFP-CENP-A K124R מבוטא RPE-1 CENP-A- התאים לא הראו אוביסקולציה על אתרי ליזין ברצף הפוליפפטיד eyfp. עם זאת, בתנאים לא מוכרים אחרים, זה יכול להיות צפוי כי האתר ליזין ברצף פוליפטידים eyfp הוא אוביקווילated ב-eyfp-ו/או מתויג אחרים חלבון היתוך של משקל מולקולרי גבוה.

עבור המושבה מוצלח assays, מומלץ לאסוף תאים עבור ניתוח כתמי המערבי כדי לאשר את המחסור בחלבון של האנדודוגני cenp-לאחר הידבקות וירוס בסגנון רטרו וביטוי חלבון של pbabe-eyfp-cenp-מבנים. בדרך זו, אנו יכולים לשפוט אם המושבה מוצלח הצמיחה מושגים באמת בשל הביטוי הבלעדי של האקסוגני cenp-A WT או מוטציות. עבור כל ניתוח כתמי מערביות, אם החשפנות מבוצע כדי למחוק את הקרום עם נוגדנים שונים לקראת הבא של ניתוח כתמי מערבי, צריך להשתמש במערכת זהה כמותית של התור הקודם של התור הראשון של התור הבאה עם נוגדנים שונים. יש לוודא שהלהקות באבן החשופה של הסיבוב הקודם אינן בלתי מורגשת באזור המיועד של הקרום באבן החשופה של הפנייה הבאה עם נוגדנים שונים. או להשתמש באותה מערכת זיהוי כמותי כמו אבן החשופה של התור הקודם ולבדוק אם הדגירה עם הנוגדן המשני בלבד המשמש באבן החשופה של הסיבוב הקודם אינו מוביל לגילוי של להקות חלבונים לפני התחלת הכתם הבא של התור עם נוגדנים שונים. עבור בvivo אובילציה, חשוב להפעיל את הג הגדול יותר SDS-דף באמצעות המנגנון להפעיל SDS גדול יותר-דף ג'ל (ג'ל אלקטרופורזה מנגנון I או II). באופן אמפירי, גדול יותר SDS-ג ' ל דף להפריד להקות חלבונים בבירור ולשפר את הרגישות של גילוי של להקות קלוש כי היה יכול להיות מזוהה בצורה גרועה בג הקטן יותר (כלומר, להקות חלבונים מופיעים חד יותר ג'ל).

זה חשוב מאוד לבחור את SDS הנכון בעמוד כדי למפות שינויים שלאחר ההעברה (לפטין) של חלבון ספציפי מעמיק LC-MS/MS. מערכת הג הנפוצה ביותר עבור SDS-PAGE היא מערכת Laemmli, אשר משתמשת בג טריס-גליצין הכולל רכיב ג'ל לערימה ורכיב ג'ל בפתרון. במערכת קלאסית זו, את ה-pH ואת החוזק היונית של המאגרים המשמשים את הערימה ג'ל (טריס, pH 6.8) ובפתרון ג'ל (טריס, pH 8.8) שונים מהמאגר המשמש להפעלת ג'ל (טריס, pH 8.3). עיוות הלהקה, אובדן הרזולוציה, או להקות החפץ עלול להיגרם על ידי החומציות הפעילה הגבוהה ביותר של מערכת Laemmli. הדו ח הקודם תיאר את הסיבות העיקריות של החלטה הלהקה עניים עם מערכת laemmli16, כולל אי יציבות ותקופת תפוגה קצרה של ג'ל הפתרון בשל הידרוליזה של פוליאקרילאמיד ב-pH גבוה, שינויים כימיים של חלבונים לדוגמה, מחדש של disulfides מופחתת של שאריות ציסטאין של חלבונים, ומחשוף של הקשרים Asp-Pro של חלבונים עם חימום ב 95-100 ° c ב laemmli מאגר לדוגמה ב 5.2 מסחרית זמין 4%-12% Bis-Tris חלבון הם Bis-Tris HCI-באגירה (pH 6.4) ומופעל ב-pH ca. 7.0 בניגוד מסורתי טריס-גליצין ג'ל16. היתרונות רבים השוואת עם מערכת Laemmli מופקים על ידי ה-pH ההפעלה הנייטרלית של מערכות Bis-Tris16, כולל יציבות גבוהה ותקופת תפוגה ארוכה של ג'ל לפתרון, משופר ביציבות חלבון לדוגמה במהלך אלקטרופורזה ב-pH נייטרלי המוביל החלטה להקה חדה ותוצאות מדויקות, והפחתה מלאה של disulfides בדו ח זה, היינו יכולים למפות בהצלחה את המפה של לפטין של EYFP-CENP-K124R חלבון (איור 3) באמצעות מסחרית זמין 4%-12% החלבון Bis-טריס ג'לים. לכן, הזמין מסחרית 4%-12% Bis-Tris חלבון מומלץ מאוד לשימוש למטרה זו.

למיפוי שינויים שלאחר ההעברה (לפטין) של חלבון ספציפי, העיכול ב-gel של חלבון היעד בשילוב עם LC-MS/MS הוא נפוץ. במחקר זה, אנו ביקשו לזהות אתרים אוביקווינציה EYFP-CENP-A K124R באמצעות אהדה לטיהור-המסה ספקטרומטריה (AP-MS) אסטרטגיה. לכן, הצעד הראשון המפתח הוא להשיג כמות גדולה של EYFP-CENP-K124R חלבון עם טוהר גבוהה באמצעות immunoprecipitation מ-EYFP-CENP-K124R מבטא תאים, אשר יכול מאוד להקל על זיהוי ואישור של אתרים אוביקווינציה של EYFP-CENP-A K124R על ידי LC-MS/MS. כדי להפחית את ההפרעה של eyfp לא אוביקטילי-cenp-חלבון K124R, הכלים המערבי של אנטי gfp, anti-HA (רוב), anti-אוביקוויב (ראה סעיף [6.1.6]), ו coomassie כחול כתמים (ראה סעיף [6.1.7]) בוצעו כדי לקבוע בדיוק את המיקום של eyfp מתויקות-cenp-A K124R על sds-דף ג'ל. לבסוף, רק אזור ממוזער של הלהקה ג ' ל המכיל EYFP-CENP-K124R היה מגורש עבור העיכול ב-ג'ל ביחד עם LC-MS/MS כדי לקבל תוצאות ממוטבת. כאשר הפפטידים מיובש מחדש לפני הפעלת LC-ms/MS, 3% (v/v) acetonitrile/2% (v/v) החומצה פורמית שימש כדי לסייע מסיסות טובה יותר שיעור ההתאוששות של פפטידים. לפעמים חיפוש מסד הנתונים יכול לגרום לפטין שאינו קיים באמת עקב אלגוריתם הקצאה משוער של מנוע החיפוש. כך, צעד קריטי נוסף הוא לאשר EYFP-CENP-K124R האתרים אוביקווינציה באמצעות סקירה ידנית של MS/ms של פפטידים אוביקווילביים עם עזרה של תוכנה F (טבלה של חומרים), אשר יכול לחסל "מציאותי" אתרים אוביקווינציה שהוצגו על ידי הקצאה משוער על ידי חיפוש מסד נתונים. לסיכום, זו אסטרטגיה AP-MS הקימה צינור יעיל וחזק לזיהוי של EYFP-CENP-K124R אוביקווינציה האתרים עם משמעות ביולוגית מכרעת. חשוב יותר, צינור זה יכול להיות גם מורחב באופן נרחב כדי לחקור את מספר הסוגים של חלבונים פונקציונליים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לצ-ג'ון לי במרכז לחקר בעלי חיים במודל, באוניברסיטת נאנג'ינג לניתוח ספקטרומטר המסה. אנו מודים ליאנמיני דלאל, טאסואו פאקאגאווה, והחוקרים הנוכחיים במרכז לחקר בעלי חיים במודל, אוניברסיטת נאנג'ינג ומכון המחקר לחקר הסרטן של הילדים למען הדיון המועיל שלהם, הדרכה ניסויית וריאגנטים. אנו מודים לדון ולקליבלנד, דנילה פצ'נטי, יאנמיני דלאל, מין ובאר, גוסטבו ולאונה, ג'ון תומפסון, לורנס ס. קירשנר, אמרוטה אשקאר, בן א. שחור, גלניס א. לוגסדון, קנג'י טאגו, ודון ס. צ'נדלר על המתנות הנדיבות שלהם של ריאגנטים. Y.N. היה נתמך על ידי מחוז ג'יאנגסו ' ' כפול ממדרגה ראשונה ' ' קרן בנייה, ג'יאנגסו מחוז המדע הטבעי קרן (SBK2019021248), מחוז ג'יאנגסו 16th שישה כישרון גדול פסגות 31970665 הקרן (TD-swyy-001), מחוז ג'יאנגסו "מומחה זר 100 כשרונות תוכנית" קרן (SBK2019010048), ו הלאומית למדעי הטבע ה מחקר זה היה נתמך באופן חלקי NCI גרנט R21 CA205659.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

ביולוגיה סוגיה 160 מרכז העיר קינטוכורה מיטוזיס CENP-A שינוי פוסט-טרנסלייתי PTM אוביפרלציה מחקר ספקטרומטר מסה
ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter