Summary
CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.
Abstract
운동장과 원로메머의 구조와 역학을 연구하는 것은 염색체 불안정성(CIN) 및 암 진행을 이해하는 데 중요합니다. 센트로메르의 염색체 위치와 기능(즉, 중심정체성)이 어떻게 결정되고 정확한 염색체 분리에 참여하는가하는 것은 근본적인 질문입니다. CENP-A는 원로메르 정체성의 비DNA 지표(후생유전학 마크)로 제안되며, CENP-A 유비쿼터틸화는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적이다.
여기서 우리는 CENP-A K124R 돌연변이 단백질에 EYFP 태그로 인해 다른 리신에서 유비쿼터틸화가 유도된다는 것을 건의하는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위해 질량 분광 분석을 설명합니다. EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306) 유비쿼터티션이 성공적으로 확인되었으며, 이는 대량 분석 분석을 통해 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당하는 것으로 확인되었다. 주의 사항은 단백질의 기능을 분석하는 도구로서 GFP/EYFP 또는 고분자량 단백질의 태깅을 사용하는 데 대해 논의된다. 현재 기술적 한계는 또한 보편성 대역의 검출, 사이트별 유비쿼터틸화(들)의 식별, 그리고 전체 세포 주기 동안 살아있는 세포 또는 특정 단일 세포에서 의 편형의 시각화를 위해 논의된다.
여기에 제시된 질량 분광분석 방법은 다른 태그 및 기타 센트로메레-키네토초레 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있다. 여러 분석/분석으로 구성된 이러한 결합 방법은 유비쿼터틸레이션의 기능적 역할을 식별하는 데 관심이 있는 연구자에게 권장될 수 있습니다.
Introduction
대부분의 진핵생물에서 스핀들 마이크로투볼은 각 염색체의 단일 영역에 부착해야 하며, 이는 센트로메르라고 불릴 것이다. 운동장은 센트로메르에 있는 단백질의 복합체입니다. 센트로메트와 운동장 단백질의 움직임과 운동장 및 백혈구의 구조를 연구하는 것은 염색체 불안정성(CIN) 및 암 진행을 이해하는 데 중요합니다. 주요 질문은 센트로메어의 염색체 위치와 기능(즉, 센트로메어 정체성)이 어떻게 결정되고 정확한 염색체 분리에 어떻게 참여하는지입니다. 대부분의 종에서 CENP-A라고 불리는 특정 히스톤과 같은 단백질을 함유한 특수 뉴클레오종의 존재는 원로메르 정체성을 정의합니다. 따라서 CENP-A는 센트로메르 정체성의 비 DNA 지표(후생유전학 마크)가 될 것을 제안된다. CENP-A가 인간의 중심 정체성을 정의하는 방법의 메커니즘을 해명하는 것이 중요합니다.
홀리데이 접합 인식 단백질(HJURP)은 CENP-A-특이적 샤페론으로 향로골 뉴클레오좀1,,2,,3로CENP-A를 침전시한다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1-COPS8 E3 리개구세가 리신 124 (K124) 및 센트로메어 국소화4에CENP-A 유비쿼터션에 필요하다고 보고했다. 또한, 우리의 결과는 새로 합성 CENP-A의 센트로메어 모집이 기존의 유비쿼터스 CENP-A 를 필요로 하는 것으로 나타났다5. 따라서 CENP-A 유비쿼터틸레이션이 세포 분열 간의 분화를 통해 상속된다는 것을 시사하는 모델이 제공되었다.
우리의 연구 결과와 Yu et al.의 결과와는 달리, CENP-A및 그것의 센트로메릭 현지화에 관하여 부정적인 결과는 최근에66간행되었습니다. 이 기사는 리신 124 (K124)에 CENP-A 수정은 K124R의 돌연변이가 CENP-A centromere 국소화 세포 생존도6에영향을 미치지 않았다는 것을 보여주는 부정적인 결과에 기초하여 인간 센트로메머의 설립, 유지 보수 및 장기 기능에 분산되어 있다고 주장했다. 그러나, 그들의 결과 와 결론에 토론을 위한 충분 한 여지가 있다, 그리고 우리는 이미 그들의 이전 간행물 7에 있을 수 있는 어떤 문제가 있을 수 있습니다 설명했다. 내인성 CENP-A의 크기보다 훨씬 더 큰 분자량을 가진 CENP-A와 단백질을 융합시키는 것에 주의를 기울여야 합니다: 예를 들어, 30kDa강화된 노란 형광 단백질(EYFP)을 ~16kDaCENP-A로 융합하고 EYFP-CENP-A K124R 단백질융합을 분석하여 1-1-1-1-1-1-1-RPE 계통의 EFP-CENP-A K124R 단백질 융합을 분석하였다. K124 유비퀴틴은 구조적 예측4에기초하여 HJURP에 직접 결합할 것으로 예상되지 는 않았지만, 모노 유비퀴틴의 첨가는 CENP-A의 단백질 형성에 영향을 미칠 것으로 예상된다. CENP-A 형성의 단백질은 큰 융합 단백질의 존재에 의해 변경될 수 있고, 이러한 형태 변화는 유비쿼터틸화의 손실로 인한 구조적 변화를 가리킬 수 있다. 우리는 대형 단백질의 융합이 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이체에서 K124 이외의 리신에서 유비쿼터스화를 유도하고 다른 부위에서 이러한 보비쿼터션은 원래 K124R 단일 돌연변이 표현형을 억제/마스크하는 것이 좋습니다. 큰 태그 단백질 (EYFP)을 가진 CENP-A K124R 돌연변이 단백질에서 다른 리신에서 유비쿼터션이 발생한다는 증거는 우리의 이전 간행물8에서보고되었다. EYFP 태깅은 EYFP-CENP-A K124R의 다른 리신 부위의 유비쿼터티케이션을 유도하고 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이가 HJURP에 결합한다는 것을 발견했습니다. 그 결과, 다른 부위의 이 유비쿼터션은 원래 K124R 단일 돌연변이 표현형을 억제/마스크하며, EYFP-CENP-A WT와 K124R 돌연변이체 모두 센트로메르 현지화를 보였다(pBabe-EYFP-CENP-A WT 및 K124R 돌연변이를 pBafp-EYFP와 함께 사용하고 비교하였다). 그 결과, 플래그 태그가 지정되거나 태그가 지정되지 않은 CENP-A K124R 돌연변이가 치명적이지만 단일비비퀴틴 융합에 의해 구조될 수 있음을 보여주었으며, 이는 CENP-A 유비쿼터션이 세포 생존에 필수적임을 시사합니다.
최근 몇 년 동안, 많은 연구는 CENP-A 단백질및 기타 센트로메트르-키네토초레 단백질의 번역 후 변형(PTM)을 생체 내 및 시험관내 9,10,,11모두에서 식별하기 위해 다른 분석법을개발하였다., 크로마틴의 기능을 조절하는 주요 메커니즘인 히스톤 단백질의 PTM과 유사하게, 센트로메릭 크로마틴 성분의 PTM은 또한 센트로메어의 전반적인 구조와 기능을 조절하는 필수적인 메커니즘에 관여한다. CENP-A PTM 사이트의 대다수는 CENP-A 함유 뉴클레오소머에 특이적이지만, 그 중 일부는 히스톤 H3에 보존되어 있지만, 이러한 잔류물의 수정이 centromere-특정 기능에 기여한다는 것을 시사한다. 인산화, 아세틸화, 메틸화 및 유비쿼터틸레이션을 포함한 CENP-A의 PTM은 이전에보고되었다 9,CENP-A는 그것의 아미노산 종점 및 C-terminus 그의 톤 접이식 도메인에 PTM및 그들의 조합 배열의 다양한 복종을 실시하는 것을 건의합니다. 여러 기능에서 CENP-A 수정의 중요성은 우리의 등 많은 그룹에 의해 밝혀졌다. 이러한 기능은 센트로메어에서 CENP-A 증착을 포함, 단백질 안정성, 및 CCAN의 모집 (구성 중심-관련 네트워크)9. 그러나 CENP-A PTM의 제한된 연구 와 연구 결과는 직접 또는 간접적으로 기능을 조절하는 표준 히스톤 중 하나로 비교가 이루어지는 곳에서 미리 형성됩니다. 이러한 CENP-A PTM을 식별하는 방법론에 초점을 맞춘 기술 보고서도 제한됩니다.
CENP-A 유비쿼터셜화는 세포 분열5사이의 분무를 통해 상속되고 세포생존가능성에필수적이지 않은12개의CENTromere에서 CENP-A 증착이 필요하기 때문에, CENP-A 유비쿼터션을 식별하는 방법은 향후 원롬의 기능적 활동, 포지셔닝 및 구조를 연구하는 데 필수적일 것이다. 따라서, 여기서 우리는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명하며, EYFP 태깅이 CENP-A K124R 돌연변이 단백질8에서다른 리신에서 유비쿼터티화를 유도한다는 것을 시사한다. 다른 제어 분석 및 분석의 프로토콜 (면역 형광 분석, 식민지 아웃 성장 분석, 및 생체 유비쿼터션 분석)도 주요 질량 분석 분석의 결과를 제대로 논의하기 위해 제시됩니다.
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Protocol
1. pBabe-EYFP-CENP-A 구문의 세포 배양 및 레트로바이러스 트랜스페션
참고: EYFP-CENP-A는 pBabe-EYFP-CENP-A로부터 내인성 CENP-A와 유사한 단백질 수준에서 발현된다. 총 세포 CENP-A 단백질은 RPE-1 CENP-A-/-세포6에서와같이 Cre 재조합에 의한CENP-A-/F 본선의 중단 후 이 EYFP-CENP-A로 대체된다.
- 293T 패키징 셀을 사용하여 레트로바이러스를 함유하는 상체제제의 제제.
- 일 0: 6웰 배양 판에 293T 포장 셀을 확산 (1.0 x 106 셀 / 잘). 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포. 24h에 대해 5% CO2의 대기에서 37°C의 세포를 배양한다.
참고: 최적의 결과를 얻으려면 시딩에 사용할 세포 밀도를 경험적으로 결정합니다. - 1일차: 확산 후 23시간 전후의 경유 반응을 준비한다(24h 포인트는 0h 포인트). 각 pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), 및 pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (표 1참조)의 Transfect 발현 플라스미드.
- 표 2에 나열된 도우미/패키징 플라스미드의 조합을 선택하고 위에 나열된 플라스미드 중 하나가 들어 있는 튜브에 추가합니다. 대부분 도우미/포장 플라스미드(표2)에대한 3가지 조합이 있습니다. 모든 조합은 이러한 실험에서 효과가 있었고 유사한 경질 효율을 보였습니다.
- 50 μL의 감소된 혈청 매체를 준비하고 각 pBabe-EYFP(B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161), pBabe-EYFP-CENP-A K124R(B3164 참조) (표 1참조) 제2의 헬더/플라미드 포장의 조합을 추가하는 데. Table 2 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 이 혼합물은 용액 A입니다.
- 또 다른 50 μL의 감소된 혈청 매체를 준비하고 각각 1.5 μL의 형질 전환 시약 I및 II를혼합한다(재료표). 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 이 혼합물은 용액 B입니다.
참고: 선택적으로, 용액 B에 6.0 μL의 형질 시약 III(폴리에틸렌네이민[PEI]; 1.0 mg/mL)만 추가하거나 용액 B(재료표)에서 트랜스페이션 시약 I 및 II 이외에 6.0 μL의 트랜스페션 시약 III를추가합니다. - 솔루션 A와 B를 함께 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- PBS로 배양 된 세포를 한 번 세척 한 후, 500 μL 감소 혈청 배지를 가진 6 웰 배양 판의 각 웰에 직접 솔루션 A와 B (즉, DNA 지질 복합체)의 혼합물을 추가합니다. 플라스미드의 최종 농도는 3.3 μg/mL입니다.
- 4.5h에 대해 5%CO2의 대기에서 37°C에서 세포를 배양한 후, 10% FBS 및 1% 페니실린-연쇄상 구균신으로 배지를 고혈당 DMEM으로 변경한다. 6웰 배양판의 중간 변화 후 배양 배지의 2mL/웰을 넣습니다.
- 세포는 37°C의 대기에서 5%CO2의 대기로 48시간 동안 배양한다. 레트로바이러스를 함유한 상수체를 사용하여 3일째에 레트로바이러스 감염을 수행합니다.
- 일 0: 6웰 배양 판에 293T 포장 셀을 확산 (1.0 x 106 셀 / 잘). 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포. 24h에 대해 5% CO2의 대기에서 37°C의 세포를 배양한다.
- CENP-A-/F RPE-1 표적 세포의 레트로바이러스 감염.
- 2일: 감염 전날, CENP-A-/F RPE-1 표적 세포를 6웰 배양우물(2.25 x 105 세포/웰)에서 트랜스펙트에 퍼뜨리세요.-/F DMEM의 배양 세포: F12배지(재료 표)10% FBS 및 1% 페니실린-연쇄절제술.
참고: 식민지 아웃성장 분석, 면역 형광 및 서부 얼룩 분석을 대조군으로 전염시. 최적의 결과를 얻으려면 시딩에 사용할 세포 밀도를 경험적으로 결정합니다. - 3일 (바이러스의 감염일): 293T 패키징 셀의 트랜스퍼빙 후 48시간에서 0.45 μm 필터를 통해 바이러스및 필터를 함유하는 슈퍼네탄을 수집합니다(바이러스 봉투를 전단하는 0.2 μm 필터를 사용하지 마십시오). polyethersulfone (PES) 필터를 사용하는 것이 좋습니다.
- CENP-A-/F RPE-1 세포를 바이러스로 감염시다. 6웰 배양 플레이트 의 한 웰의 경우, 8 μg/mL의 최종 농도에 1mL 신선한 매체, 1 mL 바이러스 상수 및 폴리브레인을 추가합니다. CENP-A-/F RPE-1 세포를 37°C의 대기에서 5%CO2의 대기로 4일~7일째까지 배양후.
참고:CENP-A-/F RPE-1 세포 성장에 대한 인큐베이션 기간은 최적의 결과를 위해 분석을 수행하여 경험적으로 결정되어야 합니다.
- 2일: 감염 전날, CENP-A-/F RPE-1 표적 세포를 6웰 배양우물(2.25 x 105 세포/웰)에서 트랜스펙트에 퍼뜨리세요.-/F DMEM의 배양 세포: F12배지(재료 표)10% FBS 및 1% 페니실린-연쇄절제술.
2. pBabe-EYFP-CENP-A를 포함하는 세포의 면역 형광 분석
- 7일: pBabe-EYFP-CENP-A 구문소의 레트로바이러스 감염 후 4일 후, 포부로 배양 배지를 제거한다. TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl)로 한 번 세포를 헹구십시오. 세포의 표면을 방해하지 않도록 배양 우물의 측면에 TBS를 적용합니다.
참고: 세포 고정을 위한 최적의 시간점은 경험적으로 결정해야 합니다. EYFP-CENP-A WT 및 K124R의 면역형광 신호는 크레 감염 없이도 pBabe-EYFP-CENP-A 구문의 레트로바이러스 감염 후 적어도 4일 동안 센트로머에서 검출할 수 있습니다(데이터가 표시되지 않음, Cre 감염을 가진 데이터에 대한 그림 1C-E). - 이전에 설명된 바와 같이 메탄올 세포 고정 및 면역 형광 염색을수행13.
- 1차 항체로서 항-GFP 항체(1:1,000 희석) 및 항CENP-B 항체(희석비 1:200)를 TBS에서 4% 염소 혈청을 함유한 센트로메어 위치 마커에 대해(사용되는 항체를 위한 재료표 참조).
- 종이 타월로 과도한 장착 매체를 제거하고 마지막 단계에서 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하십시오.
- 백혈구에서 EYFP-CENP-A의 남은 신호의 면역형광 영상 관찰, 획득, 정량화 및 분석을 위한 이전에 설명된방법(13)을 참조한다.
- 소프트웨어 A 또는 소프트웨어 B1 및 B2를 사용하여 이미지 수집, 절전, 정량화 및 분석을 포함한 처리를 수행합니다(자료표참조). 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 소프트웨어 C1-C3(재료 표참조)를 선택적으로 사용합니다.
참고: 소프트웨어 A에서 사용되는 모든 명령에 대해 보충 코딩 파일에서 2.6.1을 참조하십시오. 소프트웨어 B1 및 B2에 사용되는 모든 명령에 대한 보충 코딩 파일에서 2.6.2를 참조하십시오.
3. 레트로 크레 바이러스 감염 후 pBabe-EYFP-CENP-A를 사용하여 식민지 아웃 성장 분석을 사용 하 여
참고: 이 분석행위를 수행하는 이유는 CRE 재조합에 의한CENP-A-/F 항문(총 세포 CENP-A 단백질의 교체 후)의 중단 후 EYFP-CENP-A WT 및 K124R 돌연변이 사이의 세포 생존가능성을 비교하기 때문이다.
- pBabe-EYFP-CENP-A 구문의 레트로바이러스 트랜스페션.
- 섹션 1에 설명된 바와 같이CENP-A-/F RPE-1 세포의 레트로바이러스 트랜스페션을 수행한다. DMEM에 있는 배양 세포: 바이러스 감염 후에 72 시간 동안 10% FBS 및 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 F12 배지.
- pBabe-EYFP-CENP-A 구문 (6일째)의 레트로바이러스 감염 후 3일 후, 콜로니 아웃성장 분석 및 대조 실험에 사용되는 전염된 세포를 포함하는 우물에 블라스티시딘 S(10 μg/mL)를 첨가한다. 세포는 블라스팅시딘 S.의 존재에서 바이러스 감염 후 적어도 14일 씩 성장하여 5일마다 블라스팅시딘 S를 함유하는 배지를 변경한다.
참고: 세포가 식민지 분석서(3.2.7 및 3.2.8)를 시드하기 전에 약 80%의 합류에 도달하면, 6웰 배양판에서 트립시화 및 도금에 의해 세포를 1:2 및 1:5 비율로 통과시한다. - 7일째에 웨스턴 블롯세포를 수집하여 Cre 감염 없이 pBabe-EYFP-CENP-A 구조의 단백질 발현을 확인한다. 섹션 4에 설명된 대로 서부 얼룩 분석을 수행합니다. 결과는 도 1B(차선 1-4)에 표시됩니다.
- Cre 바이러스 감염을 가진 식민지 아웃성장 분석의 경우, 블라시치딘 S의 존재에서 바이러스 감염 후 14 일 동안 성장하는 세포를 유지 (즉, 여기에 제시 된 결과에 대한 17 일까지 배지를 포함하는 블라시딘 S에서 세포를 성장).
- pBabe-puro-Cre의 레트로 Cre 바이러스 감염
참고: 3.2.1 단계의 0일은 3.1절의 13일째에 해당합니다.- 0일에서 3일째: pBabe-puro-Cre(B3027)를 사용하여CENP-A-/F RPE-1 세포의 레트로바이러스 전환을 발현 플라스미드(자세한 내용은 1항 참조)로 수행합니다. 배양 배지에 블라스팅시딘 S(10 μg/mL)가 추가되었는지 확인합니다.
- 4일차: 트립시니게스세포가 접시에서 분리합니다. 플레이트 500 또는 5,000 개의 세포가 6 웰 배양 플레이트에서 삼중 구배판에 있습니다. DMEM의 배양 세포: 10% FBS및 1% 페니실린-연쇄절제술을 가진 F12 배지.
- 5일차: 배양 배지에 블라스팅디딘 S(10 μg/mL)를 추가합니다. 5,000 또는 500 개의 세포도금의 경우, 블라스티시딘 S (10 μg /ml) 3-24 일 (14 일 14 일까지 [3.2.7]) 또는 3-28 일 (18 일까지 [3.2.8]) 구조의 바이러스 감염 후 (pBabe-EYFP-CENP-A)를 가진 세포를 선택하십시오.
참고 : 이 식민지 아웃 성장 분석에서, pBabe-puro-Cre의 트랜스퍼는 pBabe-EYFP-CENP-A의 트랜스퍼와 함께 추가됩니다. pBabe-EYFP-CENP-A의 트랜스페션은 3.1에서 수행됩니다. pBabe-puro-Cre의 트랜스페션은 3.2.1에서 수행됩니다. - 10일(레트로-크레 바이러스 감염 후 7일) : 같은 날 pBabe-EYFP-CENP-A 의 레트로-크레 바이러스 감염 및/또는 단백질 발현 후 내생 CENP-A의 단백질 고갈을 확인하기 위해 서부 블로팅 분석을 위한 세포를 수집한다.
- 같은 날 10일 4절에 설명된 대로 서부 블로팅을 수행한다. 결과는 도 1B(차선 5-7)에 표시됩니다.
- 면역형광분석(위 2편)을 수행하여 EYFP-CENP-A WT와 K124R이 나머지 내인성 CENP-A 알레의 불활성화 후 7일 동안 중등유로 국소화된 것을 확인한다. 결과는 그림 1C-1E에표시됩니다.
- 일 14: 5,000 개의 세포로 시드 된 플레이트로 식민지 아웃 성장 분석작업을 수행하십시오. 메탄올과 얼룩에서 10분 동안 을 고정하여 크리스탈 바이올렛용액(크리스탈 바이올렛 2.3%, 암모늄 옥살레이트 0.1%, 에탄올 20%)으로 고정합니다(그림 2B참조). OpenCFU 소프트웨어를 사용하여 콜로니 수를 계산합니다(그림 2C참조).
- 18일: 500개의 셀로 시드된 플레이트를 사용합니다. 단계 3.2.7에 설명된 바와 같이 세포를 고정 하고 얼룩지게 한다(그림 2B참조). 식민지 수를 계산합니다(그림 2C참조).
4. pBabe-EYFP-CENP-A를 이용한 서양 블롯 분석
참고: EYFP-CENP-A 단백질을 위한 도 1B 및 도 2A 및 재료 표에 표시된 항체를 사용하여 서양 블롯 분석을 위한 이전에 설명된 방법(13)을 지칭한다.13
- 다른 바이러스 감염으로 성장 하는 세포를 lysing 하 여 단백질을 격리. 그런 다음 SDS PAGE 젤 의 한 웰에 단백질 20 μg를 사용합니다. 이전에 설명된 바와 같이 단백질을 PVDF 멤브레인으로이전하던 13.
- 1 차 이차 항체로 인큐베이션 후 멤브레인 3배 세척한다. 면역블롯 검출을 위해 적외선 이미징 시스템 및/또는 화학 발광 이미저를 통해 멤브레인의 단백질 밴드를 감지하고 분석합니다. 이러한 결과는 도 1B 및 도 2A에표시됩니다.
- 적외선 이미징 시스템이 단백질 밴드를 감지하고 분석하려면 보충 코딩 파일에서4.2.1 단계를 참조하십시오.
- 화학 발광 이미저를 사용하여 단백질 밴드를 감지하고 분석하고 보충 코딩 파일에서4.2.2 단계를 참조하십시오. 이 시스템의 경우 매우 민감한 향상된 화학 발광 (ECL) 기판(재료 표)을사용합니다.
- 선택적으로, 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼를 사용하여 PVDF 멤브레인에서 사전 배양 된 항체를 제거하고 서부 분석의 다음 차례를 위해 다른 항체로 재할당하십시오. 경험적으로 사용할 최적화된 잠복기 시간과 온도를 결정합니다.
5. pQCXIP-EYFP-CENP-A를 이용한 세포 배양, 형질 및 생체 내 유비쿼터틸화 액약
참고: pQCXIP-벡터로부터 발현된 EYFP-CENP-A의 단백질 수준은 내인성 CENP-A 단백질 수준보다 10배 높다. 이 벡터의 사용은 EYFP-CENP-A 단백질의 더 높은 양의 면역 침전을 용이하게 하고, EYFP-CENP-A의 유비쿼터션 대역의 관찰, 대량 분광분석을 통해 EYFP 태그된 CENP-A(EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터스 식별을 용이하게 한다.
- pQCXIP-EYFP-CENP-A를 사용하여 생체 내 유비쿼터틸화 어설션에 대한 트랜스포메이션.
- 씨앗 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 세포10cm 조직 배양 접시에. 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포.
참고: 최적의 결과를 얻으려면 시딩에 사용할 세포 밀도를 경험적으로 결정합니다. 최소 1mg의 총 단백질을 얻기 위해 면역 강수량(IP) 샘플 1개에 대해 최소 2개의 접시를 준비합니다. - 18h에 대해 5% CO2의 대기에서 37°C의 세포를 배양한다.
- 시드 후 17h에서, 트랜스펙트 시약을 준비한다.
- 각 pQCXIP-EYFP(B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT(B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R(B3256)(표 1)의6.7 μg 플라스미드를 혼합하여 솔루션 A를 335μL의 저감심형 심럼의 335μL에 혼합하여 실온에서 5분 동안 배양하십시오. 모든 샘플에 pCGN-HA-유비퀴틴(B2806)의 6.7 μg 플라스미드를 추가합니다.
참고: 모든 벡터가 표 1에나열됩니다. - 335 μL감소혈청 배지에 각각 10.1 μL의 형질 시약 I와 II를 혼합하여 용액 B를 만들고 실온에서 5분 동안 배양한다.
참고: 선택적 단계는 용액 B에 40.2 μL 형질 산염 시약 III(polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/mL)만 추가하거나 용액B(재료표)에서트랜스펙션 시약 I 및 II 외에 40.2 μL 트랜스페이션 시약 III를 추가하는 것입니다. - 솔루션 A와 B를 함께 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- PBS로 배양된 세포를 한 번 세척한 후, 3.35mL μL 감소혈청 배지를 가진 개별 10cm 조직 배양 접시각각에 직접 용액 A및 B(즉, DNA 지질 복합체)의 혼합물을 첨가한다.
참고: 최종 농도는 플라스미드의 1.67 μg/mL입니다. - 세포를 37°C 인큐베이터에서 4.5h에 대해 5% CO2로 배양한다. 4.5 h 후, 10% FBS와 1% 페니실린-연쇄 절제술로 고혈당 DMEM으로 배지를 변경합니다.
- 37°C에서 세포를 배양하여 5%CO2를 48h에 대한 배양후. 세포 용액 준비를 위해 세포를 수집합니다.
- 씨앗 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 세포10cm 조직 배양 접시에. 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포.
- 단백질 A 구슬의 제조는 항 GFP 항체로 결합됩니다.
- 면역 침전물(IP)의 한 반응에 대해 단백질 A 비드의 25 μL(50% v/v)을 섭취하십시오. 완충A1(재료표)으로 세척하여 EtOH를 제거하고 완충 A1(20m Tris-HCl, pH 7.4; 50mM NaCl; 0.5% 노니데트 P-40; 0.5% 디옥시콜레이트; 0.5% SDS; 1mM EDTA) 및 1mM EDTA를 제거하여 1mM EDTA를 억제합니다.Table of Materials
- 2.0 μL의 항GFP 항체(Anti#76: 홈메이드 항체)를 위에 준비된 비드에 추가하고 순 구슬 부피와 비교하여 10배 의 버퍼 A1을 추가합니다.
- 4-18h에 대해 4°C에서 종단 간 회전을 수행합니다. 종단 간 회전을 위한 최적 시간 길이는 면역 침전의 효율성을 기반으로 경험적으로 결정되어야 합니다.
- 구슬을 100 x g에서 1분 동안 원심분리하고 언바운드 상신을 제거합니다. 버퍼 A1을 추가하여 구슬의 50%(v/v) 솔루션을 다시 만듭니다. IP의 한 반응에 대해 이 솔루션의 25 μL(50% v/v)을 사용합니다.
- 단백질 A 세파로즈 구슬을 이용한 면역침전(IP)은 항GFP 항체로 결합된다.
- 용해 세포는 초음파 처리 및 동결 해동 공정에 의해 완충 A1에서 5.1.9 단계에서 수득하였다.
- 단백질 농도를 측정하고 다른 IP 샘플 중 단백질 양을 정상화합니다. SDS-PAGE에서 5% 입력 샘플로 실행하려면 각 튜브에서 샘플의 5%를 제거합니다.
참고: 5% 입력 샘플은 액체 질소로 동결되어 하루 내에 로드되지 않으면 -80°C로 비축할 수 있습니다. - 나머지 95% lysate를 25 μL(50% v/v)의 단백질 A 비드를 5.2단계에서 제조한 항GFP 항체에 결합하였다. 4-18h에 대해 4°C에서 종단 간 회전을 수행합니다.
참고: 종단 간 회전을 위한 최적의 시간 길이는 경험적으로 결정해야 합니다. - 원심분리기 단백질 1분 동안 100 x g로 단백질(즉, 면역 침전염)을 결합한 구슬을 제거하고 상체를 제거합니다. 1분 동안 100 x g에서 원심분리하여 완충A1로 면역침전염을 세척합니다.
- 5% 입력과 나머지 95%의 면역 침전염을 각각 2배 및 4배 SDS-PAGE 로딩 버퍼14와혼합합니다. 이 두 샘플을 5분 동안 끓인 다음 다른 차선의 전기 전광을 위해 SDS-polyacrylamide 젤을 10.0% 분해합니다. 전기 포에 더 큰 SDS 페이지 젤 (예 : 17cm x 15cm)을 사용합니다. 샘플이 더 작은 젤로 실행되는 경우 명확하고 선명한 유비쿼터티드 밴드를 관찰하지 못할 수 있습니다.
- 이전 보고서8에표시된 항체를 사용하여 섹션 4에 설명된 바와 같이 서양 얼룩 분석을 수행한다. 결과는 그림 2A에표시됩니다.
- 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼를 사용하여 PVDF 멤브레인에서 미리 배양된 항체를 제거하고 다음 서부 블롯 분석을 위해 다른 항체로 재할당합니다.
6. EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터션 부위를 식별하는 질량 분석
- pQCXIP-EYFP-CENP-A를 사용하여 질량 분석 분석을 위한 경전.
- 10cm 조직 배양 접시에 종자 CENP-A-/F RPE-1 세포. 세포 밀도가 접시 당 36.2 x 105 세포임을 확인하십시오. 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포. 1개의 면역 침전물 (IP) 견본을 위한 적어도 20개의 접시를 준비하고, 적어도 10 mg총 단백질을 얻기 위하여 (참조 5.3).
참고: 최적의 결과를 얻으려면 시딩에 사용할 세포 밀도를 경험적으로 결정합니다. - 18시간 동안 5%CO2의 대기에서 37°C의 세포배양. 확산 후 ~23h의 트랜스페션 시약을 준비한다(24h 포인트는 트랜스펙트의 0h 점).
- 시드 후 17h에서, (4.1.3)로 형질 시약 및 트랜스펙트 세포를 준비한다. 감염된 세포에는 pCGN-HA-유비퀴틴(B2806) 및 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R(B3256)이 있다.
- 형질 전환 후 48시간 동안 5%CO2의 대기에서 37°C의 세포를 배양한다. 세포 용액을 위한 세포를 수집합니다.
- 완충A1에서 세포를 lyse하고 (5.2) 및 (5.3)로 면역 침전을 수행한다. 이 두 가지 면역 침전물 은 다음과 같이 실행 (6.1.6) 및 (6.1.7).
참고: (6.1.6)에서 표준 트리스 글리신 젤로 샘플을 실행합니다. (6.1.7)에서, 시판되는 4%-12% 비스 트리스 단백질 젤에서 샘플을 실행한다. 토론도 참조하십시오. - 총 면역 침전제의 10%를 위해 1개의 샘플을 보관하여 EYFP-CENP-A 유비쿼터틸레이션을 확인하고 5항에 설명된 바와 같이 유비쿼터티된 EYFP-CENP-A의 위치를 정확하게 결정한다. 표준 트리스 글리신 젤에서이 샘플을 실행합니다. SDS-PAGE 및 서부 블롯은 (5.3)로 수행되었다.
- 질량 분석 분석을 위해 전체 면역 침전제의 90 %에 대한 다른 샘플을 보관하십시오. 시판되는 4%-12% 비스 트리스 단백질 젤의 2개의 우물 내에서 이 샘플을 실행하십시오. 쿠마시 블루 솔루션을 사용하여 쿠마시 블루 염색을 수행합니다. 소비제와 50-70 kDa의 젤 영역을 잘라 (putative 모노- Ub-EYFP-CENP-A K124R 영역). 질량 분석 분석을 위해 이 젤 영역을 사용합니다.
- 10cm 조직 배양 접시에 종자 CENP-A-/F RPE-1 세포. 세포 밀도가 접시 당 36.2 x 105 세포임을 확인하십시오. 10% FBS와 1% 페니실린 연쇄 절제술을 가진 고혈당 DMEM에 있는 배양 세포. 1개의 면역 침전물 (IP) 견본을 위한 적어도 20개의 접시를 준비하고, 적어도 10 mg총 단백질을 얻기 위하여 (참조 5.3).
- 겔 소화를 이용한 질량 분광분석.
- 관심있는 각 젤 조각을 작은 조각 (1mm2)에주사위와 단백질 저결합 튜브0.5 mL에 넣습니다.
- 25m NH4HCO3에서100 μL 50 % (v /v) 아세토닐로 세척하고, 소용돌이 10-15 분, 스핀 다운, 슈퍼 네티얼을 버리고 3 배 반복하십시오.
- 30분 동안 벤치탑 진공 농축기를 사용하여 샘플을 농축하여 젤 조각을 건조시합니다.
- 10 ng/μL 시퀀싱 등급 트립신의 10 μL을 추가하고 젤 조각이 5 분 동안 수분을 보충하도록합니다.
- 젤 조각을 커버하기에 충분한 25m M NH4HCO3를 추가하고 밤새 37 °C에서 소화하십시오.
- 소화된 상체를 깨끗한 0.65 mL 실리콘 튜브로 옮기다. 50% (v/v) 아세토닐레/5% (v/v) 포름산(30 μL 또는 커버하기에 충분), 소용돌이 10분, 동일한 추출 튜브로 스핀 및 이송합니다. 3배 반복합니다.
- 젤 조각에 10 μL 아세토나이트를 추가하고, 소용돌이 5분 동안 회전합니다. 상체를 동일한 튜브로 옮기.
- 벤치탑 진공 농축기를 사용하여 샘플을 2 μL에 농축하고, 8 μL 3% (v/v) 아세토니틀 /2% (v/v) 포름산을 샘플에 넣고, 15분 동안 소용돌이를 만들고, 30분 동안 16,000 x g에서 스핀다운합니다.
- 액상 크로마토그래피시스템(재료표)을대량 분광계계(재료표)와 결합하여 LC-MS/MS로 MS 데이터 수집을 수행합니다.Table of Materials
- 재구성된 시료 8μL을 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 컬럼에 주입한다.
- 60분 만에 용매 B의 2-80% 그라데이션을 분리합니다. 그라데이션은 용매 B의 2%에서 22%로 40분, 12분 만에 22%에서 35%로 증가한 비율로 구성되며, 최종적으로 40%의 용매 B를 80%로 상승시켜 40분 동안 지속시 30분 동안 80%를 유지하도록 한다.
참고: 용매 A는 0.1% 포믹산과 2% 아세토나이트, 용매 B는 0.1% 포믹산과 98%의 아세토나이트를 함유하고 있다. 모든 농도는 볼륨/볼륨으로 표시됩니다. - 데이터 종속 획득 모드를 사용하여 대량 분광법 데이터를 수집합니다. 간단히, 350-1500 m/z에서 MS 스펙트럼을 수집 250 ms. 추가 단편화를 위해 충전 2-5 상위 50 강렬한 전구체를 선택합니다. 100ms에 대해 100-2000 m/z에서 MS/MS 스펙트럼을 수집하고 전구체 이온을 15s에 대한 재선택에서 제외합니다.
- 데이터베이스 검색의 경우 상용 소프트웨어(재료 표 참조)를 열어 데스크톱의질량 분석 데이터를 분석합니다.
- 새 검색을 하려면 상단 메뉴의"LC"버튼을 클릭합니다. 그런 다음"추가"버튼을 클릭하여 원래 MS 원시 데이터 파일을 업로드합니다.
- 데이터베이스 검색 방법으로"파라곤 방법"에서"인간 단백질 ID"를선택합니다. UniProt 호모 사피엔스 데이터베이스(160,566시퀀스, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640 포함)에 대한 원본 MS 원시 데이터 파일을 검색합니다.
- 다음과 같이 검색 매개 변수를 설정 : 소화 효소로 트립신을 선택, 최대 3 누락 된 분열, 4 수정 및 펩티드 당 2-5 충전을 허용합니다. 첫 번째 검색을 위해 질량 오류를 최대 20 ppm로 설정하고 조각난 이온에 대해 0.02 Da를 설정합니다. 단백질, 펩타이드 및 수정 부위에 대한 거짓 발견률(FDR) 임계값을 1% 미만으로 지정합니다. 소프트웨어의 다른 모든 매개 변수를 기본 값으로 설정합니다(질량 분석의 경우 그림 3 참조).
- "상단 메뉴의 오른쪽에있는"버튼으로 저장"을클릭검색 결과를 저장하기위한 폴더를 선택하고 검색 이름을 입력하고"저장"버튼을 클릭합니다.
- 상단 메뉴 의 오른쪽에있는"프로세스"버튼을 클릭하여 검색을 시작합니다. 검색이 끝나면 입력된 검색 이름이 있는 데이터가 선택한 폴더에 자동으로 저장됩니다. 데이터는 소프트웨어 F에서 쉽게 열 수 있습니다.
- 특정 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼을 얻으려면 검색 결과를 두 번 클릭하여 소프트웨어 F로 엽니다. 먼저 메뉴 상단의 단백질 목록에서 단백질을 클릭한 다음 메뉴 중간에 있는 펩티드를 클릭합니다. 이 펩티드의 MS/MS는 메뉴 하단에 표시됩니다.
- MS/MS 스펙트럼을 내보내고 저장하려면 메뉴 하단의 MS/MS 스펙트럼을 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 복사한 다음 PPT 또는 doc. 형식과 같은 적절한 파일에 붙여 넣습니다.
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Representative Results
EYFP-CENP-A K124 돌연변이는 유비쿼터틸화, HJURP와의 상호 작용 및 백혈구 국소화의 결함 없음을 나타내며 세포 치사성도 없다. 여기서 파키네티 외(2017)6에 의해 보고된 시스템은 재구성되었다: 디플로이드 인간(RPE-1) 세포에서 하나의 중단및 하나의 ''플로시드'를 운반하는 CENP-A 대립구(CENP-A-/F), EYFP-CENP-A는 pBabe-EYFP 레트로바이러스 벡터로부터 발현되었다.CENP-A-/F 이 시스템에서는CENP-A-/F 제일로부터 내인성 CENP-A의발현이 Cre재조합6에의해 중단될 수 있다. 내인성 CENP-A의 손실을 구출하는 EYFP-CENP-A WT 또는 K124R돌연변이(도 1A)의유전자 구조는 레트로바이러스 통합이 수행되었을 때 안정적으로 발현되었다. CENP-A-/F 알레에서 내인성 CENP-A의남은 표현은 Cre 재조합에 의해 중단되었습니다. 내인성 CENP-A의 발현은 Cre 재조합(도1B,차선 5-7)을 유도한 후 7일 후에 검출되지 않았다. EYFP-CENP-A WT 및 K124R 단백질 발현은 초기 내인성 CENP-A 단백질수준(도 1B,차선 3, 4, 6 및 7)과 유사한 수준으로 나타났습니다. EYFP-CENP-A WT와 K124R 돌연변이는 CENP-A-/F-/F 알렐(그림 1Figure 1C-1E)으로부터내인성 CENP-A의 남은 발현이 중단된 후 7일 만에 중등도화를 보였다. EYFP-CENP-A WT와 K124R 돌연변이체 모두 플래그 태그또는 태그가 지정되지 않은 CENP-A WT 및 K124R 돌연변이의 경우와 달리 HJURP와의 유비쿼터션 및 상호 작용을보였다(그림 2A;플래그 태그또는 태그가 없는 CENP-A에 대해 표시되지 않은 데이터)8. 세포 생존가능성은 또한 남은 내인성 CENP-A 알렐(그림2B)의붕괴 후 14일 동안 콜로니 아웃성장 분석체를 수행하여 해결되었다. EYFP-CENP-A WT와 K124R 돌연변이는 남은 내인성 CENP-A 알렐(그림2B 및 2C)의붕괴 후 14일 만에 비슷한 수의 '구조'를 보였다. 따라서, 우리의 결과는 Fachinetti 외6에의해 보고된 것과 일치합니다.
EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306)의 유비쿼터션은 대량 분광분석분석을 통해 밝혀졌다. EYFP-CENP-A WT와 K124R 돌연변이모두 플래그 태그또는 태그가 지정되지 않은 CENP-A WT 및 K124R 돌연변이의 경우와 달리 HJURP와의 유비쿼터티 및 상호 작용을 보여 주는 것으로나타났습니다(그림 2A;플래그 태그또는 태그가 없는 CENP-A)8. 이러한 결과는 EYFP 단백질의 융합이 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이체에서 K124 이외의 리신에서 유비쿼터티화를 유도하고, 다른 부위에서 이러한 유비쿼터티화는 HJURP와 EYFP-CENP-A K124R의 상호 작용을 촉진한다는 것을 시사한다. EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306)의 유비쿼터션은 IP 질량분석(도 3A 및 도 3B)에의해CENP-A-/F 세포에서 밝혀졌다. EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306)은 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당한다. 종합하면, 우리의 결과는 대형 단백질의 융합(예를 들어, EYFP-태깅)이 CENP-A에서 K124 이외의 리신에서 유비쿼터셜화를 유도하고, 다른 부위에서 이러한 유비쿼터션은 원래 K124R 단일 돌연변이 표현형을 억제/마스크한다는 것을 시사한다.
그림 1: EYFP-CENP-A K124 돌연변이는 센트로메르에서 국소화됩니다. (A)N 종자에서 EYFP(향상된 황색 형광 단백질)로 태그된 상이한 CENP-A 단백질 구조의 표현. 빨간색 문자는 표시된 구조(왼쪽)에서 K124R 아미노산 대체의 위치를 표시합니다. 이 연구에서 수행 된 에세이의 결과는 (오른쪽)에 표시됩니다. (B)서양 얼룩 분석은 검출 가능한 내인성 CENP-A의 존재를 나타내지 않았다. 면역블롯 분석은 Cre 감염 전후에 표시된 구조 구조물(ca. 45 kDa)의 발현의 존재를 검사한다. pBabe-EYFP-구조의 단백질 발현은 Cre 감염(차선 1-4) 전과 Cre 감염(lanes 5-6)이 확인되었다. 내인성 CENP-A 단백질(ca. 15 kDa)의 부재는 Cre 감염 후 7일 후에 수집된CENP-A-/-세포주에서 확인되었다(차선 5-6). GAPDH 단백질은 로딩 제어로 사용되었습니다. (C)EYFP-CENP-A K124 돌연변이는 센트로머에서 국소화된다. CENP-A-/F RPE-1 세포는 표시된 구조와 결합되었고, 레트로-Cre 바이러스 감염 후 7일 배양하고, 면역염색하였다. DAPI(파란색), EYFP(녹색), 내인성 CENP-B(빨간색)의 시각화는 센트로메어 위치 제어 역할을 합니다. 스케일 바, 10 μm. (D)(C)에 도시된 국소화 패턴은 히스토그램으로 요약하였다. EYFP 양성 신호를 가진 200개 이상의 단계 간 세포는 실험당 계산되었다(n≥ 3 실험), 평균 백분율(±SD)이 나타났다. ''다른 사람 (비 중심)'' 주로 손상된 세포를 묘사, 죽은 세포, 또는 중간 에 뉴클레오라 국소화와 세포, 이는 때문에 트랜스 포션 또는 다른 치료관찰 되었다. K124R에서는 WT(학생의 t-test)와 비교하여 중요한 차이(n.s.s.)가 관찰되지 않았다. (E)(C)에 도시된 백로메레에서 EYFP 유래 신호는 정량화되었다. 신호는 WT로 정규화되었으며 평균 백분율(±SEM)이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: EYFP-CENP-A K124 돌연변이는 보편화되어 HJURP와 상호 작용하며, 세포 생존능력은 EYFP-CENP-A의 K124R 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. (A)EYFP-CENP-A K124 돌연변이체는 보편화되어 HJURP와 상호 작용합니다. 생체 유비쿼터틸레이션 분석. CENP-A-/F RPE-1 세포는 표시된 구조로 전염되었다. 단백질은 항GFP 토끼 폴리클론 항체를 이용한 전체 세포 용액(Input) 및 면역침전염(IP)의 5%에서 나타내기 된 항체를 사용하여 서양 블롯 분석에 의해 검출되었다. putative 디-Ub-EYFP-CENP-A (**) 및 퍼티드 모노-UB-EYFP-CENP-A(*)가 표시됩니다. 이 수치는 니쿠라 등에서수정되었습니다. 8. (B)EYFP-CENP-A의 표시된 트랜스펙트에 대한 두 가지 조건([1] 및 [2])의 계획(위)에 도시된 바와 같이 식민지 아웃성장 분석에서 대표적인 이미지. (C)실험의 식민지 생존을 요약한 히스토그램(B). 3개 이상의 독립적인 실험(n≥3)의 평균 백분율(±SEM)은 EYFP-CENP-A WT(EYFP-WT)에서 살아남은 식민지의 백분율로 정규화된다. p< 0.0001 및 **p< 0.01 EYFP 제어(학생의 t-테스트)와 비교. K124R에서는 WT(학생의 t-test)와 비교하여 중요한 차이(n.s.s.)가 관찰되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 유비쿼터스 EYFP-CENP-A K124R 펩타이드의 단편은 질량 분광분석 분석에 의해 검출되었다. (A)RPE-1 CENP-A-/F 셀에서 EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306)에서 의 유비쿼터스화의 증거. EYFP-CENP-A K124R의 리신 306(K306)은 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당한다. LQKLRGGSTHLLIR 펩타이드(커버리지 95.9%, 신뢰 87.8%) 충돌 유도 해리 분석에 의해 식별된 것이 표시됩니다. 단편화 중에 검출된 (A)의 스펙트럼에서 b(녹색) 및 y(빨간색) 이온의 m/z(Da) 값이 (B)의 표에서 녹색으로 강조 표시됩니다. K306의 유비쿼터션은 b-3 이온(m/z 753.4730)과 y-8 이온(m/z 1350.8328)의 LRGG 모티프(불완전골)에 의해 확인된다. (B)표는 (A)의 스펙트럼에서 b(녹색) 및 y(빨간색) 이온의 m/z(Da) 값을 강조 표시합니다. LQK[Umc]STHLLIR의 표에서 (B)는 (A)에 도시된 LQKLRGGSTHLLIR 펩티드를 나타낸다. 이 수치는 니쿠라 등에서수정되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| B 번호 | 관련 특성 | 참조 | 소스 |
| B3027 | pBabe 푸로-크레 | 니쿠라 외, 2019 | 암루타 아슈테카르 박사, 로렌스 S. 커슈너 박사 |
| B3182 | pBabe-EYFP | 니쿠라 외, 2019 | - |
| B3161 | pBabe-EYFP-CENP-A WT | 니쿠라 외, 2019 | 다니엘레 파키네티 박사, 돈 W. 클리블랜드 박사 |
| B3164 | pBabe-EYFP-CENP-A K124R | 니쿠라 외, 2019 | 다니엘레 파키네티 박사, 돈 W. 클리블랜드 박사 |
| B3031 | psPAX2 | 니쿠라 외, 2019 | 존 톰슨 박사, 구스타보 더블유 리온 박사 |
| D3032 | pMD2.g | 니쿠라 외, 2019 | 존 톰슨 박사, 구스타보 더블유 리온 박사 |
| B3189 | Pgp | 니쿠라 외, 2019 | 타고 겐지 박사 (일본 지치 의학 유니버티티) |
| B3190 | pCI-VSVG | 니쿠라 외, 2019 | 타고 겐지 박사 (일본 지치 의학 유니버티티) |
| B3001 | pPAM | 니쿠라 외, 2019 | - |
| B3252 | pQCXIP-EYFP | 니쿠라 외, 2019 | - |
| B3254 | pQCXIP-EYFP-CENP-A WT | 니쿠라 외, 2019 | - |
| B3256 | pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R | 니쿠라 외, 2019 | - |
| B2806 | pCGN-HA-유비퀴틴 | 니쿠라 외, 2019 | - |
표 1: 이 연구에서 사용되는 플라스미드 벡터.
| B 번호 | 도우미/패키징 플라스미드 벡터 | 콤비네이션 1 | 콤비네이션 2 | 콤비네이션 3 |
| B3031 | psPAX2 (렌티바이러스 개그/폴 벡터) | 2μg | ||
| D3032 | pMD2.g (렌티바이러스 env 벡터) | 2μg | ||
| B3189 | pGP (레트로바이러스 개그/폴 벡터) | 2μg | ||
| B3190 | pCI-VSVG (레트로바이러스 env 벡터) | 2μg | ||
| B3001 | pPAM (amphotropic 도우미 벡터 인코딩 레트로 바이러스 개그 폴 env) | 2μg |
표 2: (1.1.3) 에 사용되는 도우미/패키징 플라스미드 벡터의 조합: pBabe-EYFP-CENP-A 구문의 레트로바이러스 트랜스포메이션.
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Discussion
여기서 우리는 EYFP-CENP-A K124R 돌연변이의 유비쿼터티화를 식별하기 위한 질량 분광분석 방법을 설명하여 EYFP 태깅이 CENP-A K124R 돌연변이 단백질8에서다른 리신에서 유비쿼터티화를 유도한다는 것을 시사한다. 그 결과, EYFP-CENP-A K124R에서 리신 306(K306)에 대한 유비쿼터션을 성공적으로 확인했으며, 이는 대량 분석 분석을 통해 CENP-A의 리신 56(K56)에 해당합니다. 여기서 설명된 질량 분광분석은 CENP-A WT-Flag12의리신 124(K124) 유비쿼터티화 부위를 이전에 식별하는 모방 방법이다. 따라서, 이 방법은 다른 태그 및 그밖 centromere 운동장 단백질을 가진 인간 CENP-A 단백질에 적용될 수 있습니다. LC-MS/MS를 기반으로 하는 질량 분광분석은 일반적으로 광범위한 단백질의 잠재적인 번역 후 변형(PTM)을 식별하도록 허용됩니다. 여러 분석/분석(즉, 생체 유비쿼터스 분석, 식민지 아웃growth 분석 및 질량 분석)으로 구성된 당사의 결합 방법은 대상 단백질의 유비쿼터션(들)의 기능적 역할을 식별하는 데 관심이 있는 연구자에게 추천될 수 있습니다.
그러나, 이 프로토콜은 전체 세포 주기 동안 살아있는 세포 또는 특정 단일 세포에서 이러한 단백질의 편평성 대역의 검출 및/또는 특이적 유비쿼터틸화(들)의 검출을 다루지 않는다. 이 년 광유전학 접근은 극적으로 개발되고 세포 신호 시스템의 정량적 연구에 높은 충격을 주는. 광유전학은 원래 단일 구성 요소, 미생물 opsin 기반 시스템을 사용하여 개별 뉴런을 정밀하게 활성화하거나 억제하는 접근법을 제공했습니다. 현재, 전례 없는 스파티오측정밀을 가진 단백질 활성은 천연 유전적 인코딩된 광수용체를 이활용하여 조절될 수 있으며, 다양한 유전자 인코딩 된 도구는 단백질인산화(15)를포함한 많은 생물학적 공정의 광 제어를 허용한다. 따라서, 광유전학은 세포 및 전체 유기체 수준에서 현면성 단백질 키나아제 신호를 조사하는 유망한 시스템입니다. 현재 수는 여전히 제한되어 있지만 빛 조절 단백질 키나아제의 수는 급속히 증가하고 있습니다. 그러나, 광수용체의 고분자량 태깅은 지연되고, 광수용체의 높은 분자량 태깅은 WT와 돌연변이 단백질의 유비쿼터스화를 방해하고 기능적으로 상기된 대로 네이티브 단백질 기능을 변화시킬 수 있다. 따라서, 낮은 분자량 태깅 또는 프로빙 기술의 발달은 유비쿼터스 및/또는 살아있는 세포 및 전체 유기체 수준에서 스파티오 측량 단백질 유비쿼터션 신호를 조사하기 위해 긴급하게 요구된다.
본 연구에서EYFP 벡터 제어는 주요 질량 분석 분석의 결과를 제대로 논의하기 위해 제어 분석 및 분석(면역 형광 분석, 콜로니어 아웃성장 분석 및 생체 유비쿼터틸레이션 분석)에 필수적입니다. EYFP-단백질과의 비특이적 상호 작용은 종종 면역 침전 실험에서 관찰되므로 EYFP 벡터 제어는 EYFP-융합 단백질의 진정한 상호 작용을 평가하는 데 필수적입니다. RPE-1CENP-A-A-/F 세포에 발현된 EYFP-CENP-A K124R을 이용한 당사의 질량 분광분석은 EYFP 폴리펩티드 서열에서 리신 부위에 유비쿼터스균을 나타내지 않았다. 그러나, 다른 알려지지 않은 조건에서, EYFP 폴리펩티드 서열의 리신 부위가 EYFP-및/또는 고분자량의 다른 태그융합 단백질에서 보편화될 것으로 예상될 수 있다.
콜로니 아웃성장 분석의 경우, 레트로-Cre 바이러스 감염 및 pBabe-EYFP-CENP-A 구조의 단백질 발현 후 내생 CENP-A의 단백질 고갈을 확인하기 위해 서양 얼룩 분석을 위한 세포를 수집하는 것이 좋습니다. 이런 식으로, 식민지 아웃성장 표현형이 진정으로 외인성 CENP-A WT 또는 돌연변이의 유일한 표현 때문인지 판단할 수 있습니다. 어떤 서부 블롯 분석에 대해, 스트리핑이 서방 블롯 분석의 다음 차례에 대해 다른 항체로 멤브레인을 재할당하기 위해 수행된다면, 다른 항체를 가진 다음 턴의 블롯에 대해 이전 턴의 블롯과 동일한 정량적 검출 시스템을 사용해야 한다. 하나는 이전 턴의 블롯의 밴드가 다른 항체와 다음 턴의 얼룩에서 멤브레인의 조준 영역에서 감지 할 수없는지 확인해야합니다. 또는 이전 턴의 블롯과 동일한 정량적 검출 시스템을 사용하고 이전 턴의 블롯에 사용되는 단순한 이차 항체와의 배양이 다른 항체로 다음 턴의 블롯을 시작하기 전에 단백질 밴드의 검출으로 이어지지 않는지 확인한다. 생체 내 유비쿼터틸화 분석의 경우, 더 큰 SDS-PAGE 젤(Gel 전기전도 장치 I 또는 II)을 실행하는 장치를 사용하여 더 큰 SDS-PAGE 젤을 실행하는 것이 중요하다. 경험적으로, 더 큰 SDS-PAGE 젤은 단백질 밴드를 명확하게 분리하고 작은 젤에서 제대로 검출될 수 있던 희미한 밴드의 검출의 감도를 향상시킵니다 (즉, 단백질 밴드는 더 큰 젤에서 선명하게 나타납니다).
특정 단백질 철저한 LC-MS/MS의 번역 후 변형(PTM)을 매핑하기 위해 적절한 SDS-PAGE 젤을 선택하는 것이 매우 중요합니다. SDS-PAGE에 가장 널리 사용되는 젤 시스템은 스태킹 젤 성분과 분해 젤 성분을 포함하는 트리스 글리신 젤을 사용하는 Laemmli 시스템입니다. 본 고전 시스템에서, 스태킹 젤(Tris, pH 6.8) 및 해결 젤(Tris, pH 8.8)에 사용되는 버퍼의 pH 및 이온 강도는 젤(Tris, pH 8.3)을 실행하는 데 사용되는 버퍼와 다릅니다. 대역 왜곡, 해상도 손실 또는 아티팩트 대역은 Laemmli 시스템의 고음질 작동 pH에 의해 발생할 수 있습니다. 이전 보고서는 높은 pH에서 폴리 아크릴아미드의 가수분해로 인한 해결 젤의 불안정성 및 짧은 만료 기간을 포함하여 Laemmli시스템(16)을사용하여 불량 한 대역 해상도의 주요 원인을 설명, 샘플 단백질의 화학적 변화, 단백질의 시스테인 잔류물의 감소된 이황피의 재산화, pH 5.2의 Laemmli 샘플 완충액에서 95-100°C에서 가열된 단백질의 Asp-Pro 결합의 분열. 시판되는 4%-12% 비스트리스 단백질 젤은 비스트리스 HCI-버퍼링(pH 6.4)이며, 기존의 트리스 글리신젤(16)과달리 pH ca. 7.0에서 작동한다. Laemmli 시스템과 비교하는 수많은 장점은 비스-트리스시스템(16)의중성 작동 pH에 의해 생성되며, 이는 해결 젤의 높은 안정성 과 긴 만료 기간을 포함하여, 중성 pH에서 전기포광 시 시 시료 단백질 안정성 향상을 통해 선명한 대역 해상도와 정확한 결과, 이설화물의 완전한 감소 및 아스프-프로 결합의 분열부재에 의해 생성된다. 본 보고서에서는 시판시 이용 가능한 4%-12% 비스-트리스 단백질 젤을 사용하여 EYFP-CENP-A K124R단백질(그림 3)의PTM을 성공적으로 매핑할 수 있었습니다. 따라서, 시판되는 4%-12% 비스-트리스 단백질 젤은 이러한 목적을 위해 사용하는 것이 좋습니다.
특정 단백질의 번역 후 변형(PTM)을 매핑하기 위해 LC-MS/MS와 결합된 표적 단백질의 인겔 소화가 널리 사용된다. 이 연구에서는 선호도 정화 질량 분광법(AP-MS) 전략을 사용하여 유비쿼터티션 사이트 EYFP-CENP-A K124R을 식별하기 위해 노력했습니다. 따라서, 첫 번째 핵심 단계는 EYFP-CENP-A K124R 과발압 세포를 사용하여 고순도를 가진 다량의 유비쿼터티EYFP-CENP-A K124R 단백질을 획득하여 EYFP-CENP-A K124R의 유비퀴티닝 부위의 식별 및 확인을 크게 용이하게 할 수 있다. 비유비퀴티드 EYFP-CENP-A K124R 단백질의 간섭을 줄이기 위해, 안티 GFP의 서쪽 얼룩, 안티 HA (Ub), 안티 유비 퀴틴 (섹션 [6.1.6]), 쿠마시 블루 스테인링 (섹션 [6.1.7]참조) 정확하게 SDS-PAGE 젤에 유비쿼터팅 EYFP-CENP-A K124R의 위치를 결정하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 유비퀴티드 EYFP-CENP-A K124R을 함유한 젤 밴드의 최소화된 영역만이 LC-MS/MS와 결합된 인겔 소화를 위해 절제되었다. 건조 펩티드가 LC-MS/MS를 작동하기 전에 재구성될 때, 3% (v/v) 아세토닐릴/2% (v/v) 포름산이 펩타이드의 용해도 및 회수율을 높이는 데 사용되었다. 경우에 따라 데이터베이스 검색으로 인해 검색 엔진의 대략적인 할당 알고리즘으로 인해 실제로 존재하지 않는 PTM이 발생할 수 있습니다. 따라서, 또 다른 중요한 단계는 소프트웨어F(재료의 표)의도움으로 유비쿼터티 펩티드의 MS/MS를 수동으로 검토하여 EYFP-CENP-A K124R 유비쿼터티닝 부위를 확인하여 데이터베이스 검색을 통해 대략적인 할당에 의해 도입된 "비현실적"유비쿼터티먼트 사이트를 제거할 수 있다는 것입니다. 요약하면, 이 AP-MS 전략은 EYFP-CENP-A K124R 유비퀴티니션 사이트를 식별하는 효율적이고 강력한 파이프라인을 설립하여 생물학적 중요성을 중요하게 생각합니다. 더 중요한 것은, 이 파이프라인은 또한 각종 기능성 단백질의 PTM을 조사하기 위하여 넓게 확장될 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
난징대학교 모델동물연구센터의 리차오준 에게 대량 분석해 주셔서 감사합니다. Yanmini Dalal, 후카가와 타츠오, 모델 동물 연구 센터, 난징 대학 및 Greehey 어린이 암 연구소의 현재 연구원들에게 유용한 토론, 실험 지도 및 시약에 감사드립니다. 돈 W. 클리블랜드, 다니엘레 파치네티, 얀미니 달, 민부이, 구스타보 더블유 리온, 존 톰슨, 로렌스 S. 커쉬너, 암루타 아슈테카르, 벤 E. 블랙, 글레니스 A. 로그스돈, 겐지 토고, 새벽 S. 챈들러에게 절경 선물을 주셔서 감사합니다. Y.N. 장쑤성 '이중일급' 건설기금, 장쑤성 자연과학기금(SBK2019021248), 장쑤성제16대 6대 인재봉우리펀드(TD-SWYY-001), 장쑤성 '외국인 전문가 백인재 프로그램' 기금(SBK2019000000000000000000000000000000), 309개 국립과학재단(306998년) 이 연구는 부분적으로 NCI 보조금 R21 CA205659에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | - | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | - | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | - | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | - | - | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | - | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | - | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | - | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | - | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | - | - | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | - | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | - | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | - | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | - | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | - | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | - | Software B2 |
References
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- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
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- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
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- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
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- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
