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Biology

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Abstract

Studiare la struttura e la dinamica dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l'instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Il modo in cui la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l'identità del centromero) sono determinate e partecipano alla segregazione accurata del cromosoma è una questione fondamentale. Il CENP-A è proposto come l'indicatore non-DNA (segno epigenetico) dell'identità del centromero, e l'ubiquililazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A al centromero, ereditata dalla dimerizzazione tra divisione cellulare e indispensabile alla vitalità cellulare.

Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che l'ubiquilazione in una lisina diversa è indotta a causa dell'etichettatura EYFP nella proteina mutante CENP-A K124R. L'ubiquilità di lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R è stata identificata con successo, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l'analisi della spettrometria di massa. Un avvertimento è discusso nell'uso di GFP/EYFP o l'etichettatura di proteine ad alto peso molecolare come strumento per analizzare la funzione di una proteina. L'attuale limite tecnico è discusso anche per l'individuazione di bande oniquilate, l'identificazione di ubiquilazione site-specific, e la visualizzazione dell'ubiquilazione nelle cellule viventi o una singola cellula specifica durante l'intero ciclo cellulare.

Il metodo di analisi della spettrometria di massa qui presentato può essere applicato alla proteina umana CENP-A con diversi tag e altre proteine del centromere-kinetochore. Questi metodi combinatori costituiti da diversi saggi / analisi potrebbero essere raccomandati per i ricercatori che sono interessati a identificare i ruoli funzionali dell'ubiquilazione.

Introduction

Nella maggior parte degli eucarioti, i microtubuli del mandrino devono essere attaccati a una singola regione di ogni cromosoma, definito centromero. Il cinetochore è un complesso di proteine che si trovano al centromero. Lo studio dei tempi dei movimenti della proteina centromera e cinetochore e la struttura dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l'instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Le domande chiave sono come vengono determinate la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l'identità del centromero) e come partecipano alla segregazione cromosomica accurata. Nella maggior parte delle specie, la presenza di un nucleomatoma speciale contenente una proteina simile a un istone specifica chiamata CENP-A definisce l'identità del centromero. Pertanto, si propone che il CENP-A sia l'indicatore non DNA (segno epigenetico) dell'identità del centromero. È importante chiarire il meccanismo di come CENP-A definisce l'identità del centromero negli esseri umani.

La proteina di riconoscimento della giunzione di Holliday (HJURP) è l'accompagnatore specifico CENP-A che deposita CENP-A nei nucleosomeri centromerici1,2,3. Abbiamo già riferito che il CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase è richiesto per l'ubiquilazione CENP-A sulla lisina 124 (K124) e la localizzazione del centromero4. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che il reclutamento di centrimeri di CENP-A di5nuova sintesi richiede CENP-A oniquizzato preesistente. Così, è stato fornito un modello che suggerisce che l'ubiquilinazione CENP-A viene ereditata attraverso la dimerizzazione tra le divisioni cellulari.

In contrasto con le nostre scoperte e quelle di Yu et al., risultati negativi per quanto riguarda il CENP-A e la sua localizzazione centromerica sono stati recentemente pubblicati6. L'articolo affermava che le modifiche del CENP-A sulla lisina 124 (K124) sono dispensabili per l'istituzione, la manutenzione e la funzione a lungo termine dei centrimeri umani, sulla base dei loro risultati negativi che mostravano che la mutazione di K124R non influenzava la localizzazione del centromero CENP-A né la vitalità cellulare6. Tuttavia, c'è abbastanza spazio per discutere nei loro risultati e conclusioni, e abbiamo già descritto quale problema ci potrebbe essere nella loro precedente pubblicazione7. Occorre prestare attenzione al fatto che fondessero le proteine con il CENP-A, che hanno pesi molecolari molto più grandi delle dimensioni del CENP-A endogeno: ad esempio, hanno fuso la proteina fluorescente gialla avanzata da 30 kDa (EYFP) a 16 kDa CE-A e hanno analizzato la fusione delle proteine EYFP-CENP-A K124R nel loro sistema RPE-1CE-A-Knockout.-/F L'ubiquitina K124 non dovrebbe legarsi direttamente all'HJURP sulla base di previsioni strutturali4, tuttavia si prevede che l'aggiunta di monoubiquitina avrà un impatto sulla conformazione proteica del CENP-A. La proteina della conformazione CENP-A può essere modificata dalla presenza di una grande proteina di fusione, e questo cambiamento conformazionale può mascherare i cambiamenti strutturali causati dalla perdita di ubiquilazione. Suggeriamo che la fusione di proteine di grandi dimensioni induca l'ubiquililazione in una lisina diversa da K124 nel mutante EYFP-CENP-A K124R e questa ubiquililazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante. La prova che l'ubiquilazione si verifica in lisina diversa nella proteina mutante CENP-A K124R con una grande proteina tag (EYFP) è stata riportata nella nostra precedente pubblicazione8. Si è scoperto che il tagging EYFP induce l'ubiquitinazione di un altro sito lisina di EYFP-CENP-A K124R e che EYFP-CENP-A K124R mutante lega a HJURP. Di conseguenza, questa ubiquilazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante, e sia EYFP-CENP-A WT che K124R mutanti hanno mostrato la localizzazione del centromero (abbiamo usato e confrontato pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutante, insieme al controllo pBabe-EFP). I risultati hanno dimostrato che i mutanti CENP-A K124R marcati con bandiera sono letali, ma possono essere salvati da una fusione monoubiquitina, suggerendo che l'ubiquilazione CENP-A è indispensabile per la vitalità cellulare.

Negli ultimi anni, molti studi hanno sviluppato diversi saggi per identificare le modifiche post-traduzionali (PTM) della proteina CENP-A e di altre proteine centromere-cinetochore sia in vivo che in vitro9,10,11. Analogo ai PTM delle proteine istone che sono un importante meccanismo che regola la funzione della cromatina, i PTM dei componenti della cromatina centromerici sono anche coinvolti in un meccanismo essenziale per regolare la struttura complessiva e la funzione dei centrimeri. La maggior parte dei siti CENP-A PTM sono specifici dei nucleosomi che contengono CENP-A, anche se alcuni di essi sono conservati nell'istone H3, suggerendo che la modifica di questi residui contribuisce alla funzione specifica del centromero. I PTM del CENP-A, tra cui il fosfororylazione, l'acetilazione, la metilazione e l'ubiquilazione sono stati precedentemente segnalati9, suggerendo che il CENP-A è sottoposto a una varietà di PTM e dei loro array combinatori sul suo dominio aminofileterminus e C-terminus histone-fold. L'importanza delle modifiche CENP-A in più funzioni è stata rivelata da molti gruppi, tra cui la nostra. Queste funzioni comportano la deposizione CENP-A ai centrimeri, la stabilità delle proteine e il reclutamento del CCAN (rete costitutiva associata a centrimere)9. Tuttavia, studi limitati e risultati dei PTM CENP-A sono preformati quando si fanno confronti con uno degli istoni canonici che regolano direttamente o indirettamente la loro funzione. Anche le relazioni tecniche che si concentrano sulla metodologia per identificare questi PTM CENP-A sono limitate.

Poiché l'ubiquilazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A alcentromero 12, ereditata dalla dimerizzazione tra la divisione cellulare5e indispensabile alla vitalità cellulare8, il metodo per identificare l'ubiquilazione CENP-A sarebbe essenziale in futuro per studiare l'attività funzionale, il posizionamento e la struttura del centromero. Pertanto, qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l'ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. I protocolli di altri saggi e analisi di controllo (analisi dell'immunofluorescenza, analisi della crescita della colonia e analisi dell'ubiquilazione in vivo) sono anche presentati per discutere correttamente l'esito di un'analisi della spettrometria di massa maggiore.

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Protocol

1. La coltura cellulare e la trafezione retrovirus dei costrutti pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: EYFP-CENP-A è espresso da pBabe-EYFP-CENP-A a un livello proteico simile a quello endogeno CENP-A. La proteina EYFP-CENP-A cellulare totale viene sostituita da questa proteina EYFP-CENP-A dopo l'interruzione dell'alleloCENP-A -/F da parte della ricombinabile Cre come nelle celle RPE-1 CENP-A-/-6 .

  1. Preparazione del superatante contenente retrovirus utilizzando cellule di imballaggio 293T.
    1. Giorno 0: Stendere 293T cellule di imballaggio sulla piastra di coltura 6-well (1.0 x 106 cellule / bene). Cellule di coltura in DMEM ad alto glucosio con 10% FBS e 1% penicillina-streptomycin. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 24 h.
      NOTA: per ottenere risultati ottimali, determinare empiricamente la densità cellulare da utilizzare nel seeding.
    2. Giorno 1: Preparare la reazione di trasfezione intorno 23 h dopo la diffusione (24 h punto è 0 h punto della trasfezione). Plasmide dell'espressione transfect di ogni pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) e pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (cfr. tabella 1).
    3. Scegliere una combinazione di plasmidi di supporto/imballaggio elencati nella tabella 2 e aggiungerli ai tubi contenenti uno dei plasmidi sopra elencati. Ci sono per lo più queste 3 combinazioni per helper / imballaggio plasmidi (Tabella 2). Qualsiasi combinazione ha funzionato in questi esperimenti e ha mostrato un'efficienza di trasfezione simile.
    4. Preparare 50 -L di mezzo siero ridotto e mescolare 2,0 g di ogni pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) e pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (vedi tabella 1)aggiungendo una combinazione di plotoni helper/packaging elencati nella tabella 2. Incubare questa miscela a temperatura ambiente per 5 min. Questa miscela è la soluzione A.
    5. Preparare altri 50 lll di mezzo siero ridotto e mescolare 1,5 L di reagenti di trasfezione I e II, rispettivamente (Tabella dei materiali). Incubare questa miscela a temperatura ambiente per 5 min. Questa miscela è la soluzione B.
      NOTA: Se lo si desidera, aggiungere solo 6,0 l di reagente di trasfezione III (polyethyleneimine [PEI]; 1,0 mg/mL) nella soluzione B o aggiungere 6,0 l di reagente di trasfezione III oltre ai reagenti di trasfezione I e II nella soluzione B (Tabella dei materiali).
    6. Mescolare le soluzioni A e B e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    7. Dopo aver lavato le cellule coltivate una volta con PBS, aggiungere la miscela di soluzioni A e B (cioè, complesso DNA-lipidico) direttamente ad ogni pozzo della piastra di coltura a 6 pozze che ha 500 gradi ridotti per siero. La concentrazione finale del plasmide è di 3,3 g/mL.
    8. Dopo aver incubato le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 4,5 h, cambiare il DMEM medio-alto glucosio con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Mettere 2 mL / bene di mezzo di coltura dopo il cambiamento medio nella piastra di coltura 6-well.
    9. Colture le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 48 h dopo la trasfezione. Eseguire l'infezione da retrovirus il giorno 3 utilizzando il super-natante contenente retrovirus.
  2. Infezione retrovirus delle cellule bersaglio CENP-A-/F RPE-1.
    1. Giorno 2: Un giorno prima dell'infezione, diffondere cellule bersaglio CENP-A-/F RPE-1 a trasfecto nel pozzo di coltura a 6 pozzetti (2,25 x 105 cellule / pozzo). Cellule di coltura in DMEM: F12 medio (Tabella dei materiali) con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina.
      NOTA: Stendere le cellule per i saggi di escrescenza della colonia, l'immunofluorescenza e l'analisi delle macchie occidentali come controllo. Per ottenere risultati ottimali, determinare empiricamente la densità cellulare da utilizzare nel seeding.
    2. Giorno 3 (giorno dell'infezione del virus): a 48 h dopo la trasfezione di 293T cellule di imballaggio, raccogliere il supernatante contenente virus e filtrare attraverso 0,45 sm filtro (non utilizzare un filtro 0.2 m che si inclina busta del virus). Si consiglia di utilizzare filtri in poliethersulfone (PES).
    3. Infettare le cellule CENP-A-/F RPE-1 con il virus. Per un pozzo della piastra di coltura a 6 pozze, aggiungere 1 mL di supporti freschi, 1 mL virus supernatant e polibrene ad una concentrazione finale di 8 g/mL. Incubare le cellule CENP-A-/F RPE-1 a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 4 giorni fino al giorno 7 dopo la trasfezione.
      NOTA: Il periodo di incubazione per la crescita delle cellule CENP-A-/F RPE-1 deve essere determinato empiricamente seguendo le analisi per ottenere risultati ottimali.

2. Analisi dell'immunofluorescenza delle cellule contenenti pBabe-EYFP-CENP-A

  1. Giorno 7: 4 giorni dopo l'infezione da retrovirus di pBabe-EYFP-CENP-A costruisce, rimuovere il mezzo di coltura per aspirazione. Risciacquare le cellule una volta con TBS (25 mM-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl). Applicare TBS sul lato dei pozzi di coltura per evitare di disturbare la superficie delle cellule.
    NOTA: il punto temporale ottimale per la fissazione delle celle deve essere determinato empiricamente. I segnali di immunofluorescenza sia del WT EYFP-CENP-A che del K124R sono rilevabili al centromero almeno 4 giorni dopo l'infezione retrovirus di pBabe-EYFP-CENP-A costruisce anche senza infezione da Cre (dati non mostrati, Figura 1C-E per i dati con infezione da Cre).
  2. Eseguire la fissazione delle cellule di metanolo e la colorazione dell'immunofluorescenza come descritto in precedenza13.
  3. Poiché gli anticorpi primari utilizzano un anticorpo anti-GFP (1:1.000 di diluizione) e un anticorpo anti-CENP-B (rapporto di diluizione di 1:200) per un marcatore di posizione del centromero in TBS contenente il 4% del siero di capra (vedi Tabella dei materiali per gli anticorpi utilizzati).
  4. Rimuovere il supporto di montaggio in eccesso con un tovagliolo di carta e sigillare i bordi della coverslip con smalto all'ultimo passo.
  5. Fare riferimento al metodo13 descritto in precedenza per l'osservazione dell'immagine immunofluorescenza, l'acquisizione, la quantificazione e l'analisi dei segnali rimanenti di EYFP-CENP-A al centromero.
  6. Eseguire l'acquisizione di immagini, l'elaborazione, inclusa la deconvoluzione, la quantificazione e l'analisi utilizzando i Software A o i Software B1 e B2 (vedere Tabella dei materiali). Se lo si desidera, utilizzare Softwarec-C3 (vedere Tabella dei materiali) per un microscopio a scansione laser confocale.
    NOTA: vedere 2.6.1 in File di codifica supplementari per tutti i comandi utilizzati nel Software A. Vedere 2.6.2 nei file di codifica supplementari per tutti i comandi utilizzati in Software B1 e B2.

3. I saggi di escrescenza della colonia usando pBabe-EYFP-CENP-A dopo l'infezione da virus retro-Cre

NOTA: Il motivo per eseguire questo saggio è quello di confrontare la vitalità cellulare tra EYFP-CENP-A WT e K124R mutante dopo l'interruzione dell'allele CENP-A-/F da cre ricombinarsi (dopo la sostituzione della proteina CENP-A cellulare totale).

  1. La trafezione retrovirus dei costrutti pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Eseguire la trafezione retrovirus delle cellule CENP-A-/F RPE-1 come descritto nella sezione 1. Cellule di coltura in DMEM: Mezzo F12 con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina per 72 h dopo l'infezione da virus.
    2. Tre giorni dopo l'infezione da retrovirus di pBabe-EYFP-CENP-A costruisce (il giorno 6), aggiungere blasticidin S (10 g/mL) in pozzi contenenti cellule trasfette da utilizzare per esperimenti di analisi e controllo di crescita della colonia. Le cellule vengono coltivate almeno 14 giorni dopo l'infezione da virus in presenza di blasticidin S. Cambiare il mezzo contenente blasticidin S ogni 5 giorni.
      NOTA: Se le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza prima della semina per il saggio della colonia (3.2.7. e 3.2.8), passare le cellule a 1:2 e 1:5 rapporto a metripsinizzazione e placcatura in una piastra di 6 pozzi.
    3. Raccogliere le cellule per la macchia occidentale il giorno 7 per confermare l'espressione proteica di pBabe-EYFP-CENP-A costruisce senza infezione da Cre. Eseguire l'analisi delle macchie occidentali come descritto nella sezione 4. I risultati sono illustrati nella Figura 1B (corsie 1-4).
    4. Per l'analisi dell'escrescenza della colonia con l'infezione da virus Cre, mantenere le cellule in crescita per 14 giorni dopo l'infezione da virus in presenza di blasticidin S (cioè, far crescere le cellule in blasticidin S contenente mezzo fino al giorno 17 per i risultati presentati qui).
  2. Infezione da virus retro-Cre di pBabe-puro-Cre
    NOTA: il giorno 0 nel passaggio 3.2.1 corrisponde al Giorno 13 della sezione 3.1.
    1. Dal giorno 0 al giorno 3: Eseguire la trasfezione retrovirus delle cellule CENP-A-/F RPE-1 utilizzando pBabe-puro-Cre (B3027) come espressione plasmid (vedere la sezione 1 per i dettagli). Assicurarsi che il blasticidin S (10 g/mL) venga aggiunto nel mezzo di coltura.
    2. Giorno 4: prova le cellule per staccarlo dalla piastra. Piastra 500 o 5.000 cellule in triplice copia nella piastra di coltura a 6 bengeti. Cellule di coltura in DMEM: F12 medio con 10% FBS e 1% penicillina-streptomycin.
    3. Giorno 5: Aggiungere la blasticidinS S (10 g/mL) al mezzo di coltura. Per 5.000 o 500 plating di cellule, selezionare le cellule con blasticidin S (10 g/ml) 3-24 giorni (fino al giorno 14 in [3.2.7]) o 3-28 giorni (fino al giorno 18 in [3.2.8]) dopo l'infezione da virus dei costrutti (costrutti pBabe-EYFP-CENP-A).
      NOTA: In questo saggio di crescita della colonia, la trasfezione di pBabe-puro-Cre viene aggiunta insieme alla trasfezione di pBabe-EYFP-CENP-A. La trasfezione di pBabe-EYFP-CENP-A viene eseguita in 3.1. La trasfezione di pBabe-puro-Cre viene eseguita in 3.2.1.
    4. Giorno 10 (7 giorni dopo l'infezione da virus retro-Cre): Raccogliere le cellule per l'analisi del gonfiore occidentale per confermare l'esaurimento delle proteine di CENP-A endogeno dopo l'infezione da virus retro-Cre e/o l'espressione proteica di pBabe-EYFP-CENP-A costruisce nello stesso giorno 10.
    5. Esegui il gonfiore occidentale come descritto nella sezione 4 nello stesso giorno 10. I risultati sono illustrati nella Figura 1B (corsie 5-7).
    6. Eseguire l'analisi dell'immunofluorescenza (sezione 2 sopra) per confermare che sia EYFP-CENP-A WT che K124R localizzati al centromero 7 giorni dopo l'inattivazione del restante allele CENP-A endogeno. I risultati sono illustrati nella Figura 1C-1E.
    7. Giorno 14: Eseguire il saggio di crescita della colonia con la piastra semi con 5.000 cellule. Fissare le cellule per 10 min in metanolo e macchia per 10 min in una soluzione viola cristallo (2.3% cristallo viola, 0.1% ossacolo di ammonio, 20% etanolo (vedi Figura 2B). Contare il numero di colonie utilizzando il software OpenCFU (vedere la figura 2C).
    8. Giorno 18: Utilizzare il seme di piastra con 500 celle. Correggere e macchiare le celle come descritto nel passaggio 3.2.7 (vedere la figura 2B). Contare il numero di colonie (vedere la figura 2C).

4. Analisi delle macchie occidentali con pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: Fare riferimento al metodo13 descritto in precedenza per l'analisi delle macchie occidentali utilizzando gli anticorpi indicati nella Figura 1B e nella Figura 2A e nella Tabella dei materiali per le proteine EYFP-CENP-A.

  1. Isolare le proteine lising delle cellule coltivate con diversa infezione da virus. Quindi, utilizzare 20 g di proteine in un pozzo di gel SDS PAGE. Trasferire le proteine in una membrana PVDF come descritto in precedenza13.
  2. Lavare la membrana 3x dopo le incubazioni con anticorpi primari-secondari. Rilevare e analizzare le bande proteiche sulla membrana con il sistema di imaging a infrarossi e/o l'imager di chemiluminescenza per il rilevamento dell'immunoblot. Questi risultati sono illustrati nella Figura 1B e Figura 2A.
    1. Per il sistema di imaging a infrarossi per rilevare e analizzare le bande proteiche, vedere il passaggio 4.2.1 nei file di codifica supplementari.
    2. Utilizzare l'imager chemiluminescenza per rilevare e analizzare le bande proteiche, vedere il passaggio 4.2.2 nei file di codifica supplementari. Per questo sistema, utilizzare un substrato chemiluminescente avanzato (ECL) ultra-sensibile (Tabella dei materiali).
    3. Facoltativamente, utilizzare il buffer di stripping delle macchie occidentali per rimuovere gli anticorpi pre-incubati dalla membrana PVDF e reblotconché con diversi anticorpi per il prossimo turno dell'analisi occidentale. Determina empiricamente il tempo di incubazione e la temperatura ottimizzati da utilizzare.

5. Cultura cellulare, trasfezione e affermazioni di ubiquilazione in vivo utilizzando pQCXIP-EYFP-CENP-A

NOTA: Il livello proteico di EYFP-CENP-A espresso da pQCXIP-vector è superiore di 10 volte rispetto al livello endogeno della proteina CENP-A. L'uso di questo vettore facilita l'immunoprecipitazioni di una maggiore quantità di proteine EYFP-CENP-A, l'osservazione delle bande di ubiquilazione di EYFP-CENP-A e l'identificazione dell'ubiquilazione della proteina eYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) attraverso l'analisi della spettrometria di massa.

  1. Trasfezione per analisi di ubiquilazione in vivo utilizzando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Seme 36,2 x 105 cellule CENP-A-/F RPE-1 in un piatto di coltura dei tessuti di 10 cm. Cellule di coltura in DMEM ad alto glucosio con 10% FBS e 1% penicillina-streptomycin.
      NOTA: per ottenere risultati ottimali, determinare empiricamente la densità cellulare da utilizzare nella semina. Preparare almeno 2 piatti per un campione di immunoprecipitazioni (IP) per ottenere un minimo di 1 mg di proteine totali.
    2. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 18 h.
    3. Alle 17 h dopo la seeding, preparare il reagenti di trasfezione.
    4. Fare la soluzione A mescolando 6,7 g di plasmide di ogni pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabella 1) in 335 e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOTA: tutti i vettori sono elencati nella Tabella 1.
    5. Fare la soluzione B mescolando 10,1 litri di reagenti di trasfezione I e II, rispettivamente in 335 - l-mezzo siero ridotto, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOTA: Un passo opzionale consiste nell'aggiungere solo il reagente III (polyetileneimine [ PEI]; 1,0 mg/mL) nella soluzione B o aggiungere il reagente III di trasfezione 40,2 gradi oltre ai reagenti di trasfezione I e II nella soluzione B (Tabella dei materiali).
    6. Mescolare le soluzioni A e B e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    7. Dopo aver lavato le cellule coltivate una volta con PBS, aggiungere la miscela di soluzioni A e B (ad esempio, complesso DNA-lipidico) direttamente a ciascuno dei singoli 10 cm di coltura dei tessuti che ha un mezzo siero ridotto di 3,35 mL.
      NOTA: La concentrazione finale è di 1,67 g/mL di plasmide.
    8. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 4,5 h. Dopo 4,5 h, cambiare il DMEM medio-alto glucosio con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina.
    9. Colture le cellule a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 48 h dopo la trasfezione. Raccogliere le cellule per la preparazione di lismi cellulari.
  2. Preparazione di proteine A legate con anticorpi anti-GFP.
    1. Prendere 25 L (50% v/v) di proteine A per una reazione di immunoprecipitazioni (IP). Lavare con buffer A1 (Tabella dei materiali) almeno 3volte per rimuovere EtOH, e fare soluzione 50% con buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; completo REagente inibitore protease senza EDTA).
    2. Aggiungere 2,0 l' di anticorpo anti-GFP (Anti-76: anticorpo fatto in casa) alle perline preparate sopra e aggiungere 10x volume di buffer A1 rispetto al volume delle perline nette.
    3. Eseguire la rotazione end-to-end a 4 gradi centigradi per 4-18 h. La durata ottimale per la rotazione end-to-end deve essere determinata empiricamente in base all'efficienza dell'immunoprecipitazioni.
    4. Centrifugare le perline a 100 x g per 1 min e rimuovere il supernatante non legato. Aggiungere il buffer A1 per rifare una soluzione 50% (v/v) delle perline. Utilizzare 25 l (50% v/v) di questa soluzione per una reazione di IP.
  3. Immunoprecipitazioni (IP) con proteine A perline sepharose legate con anticorpi anti-GFP.
    1. Cellule di lissione ottenute nel passaggio 5.1.9 nel buffer A1 mediante il processo di sonicazione e congelamento-scongelamento.
    2. Misurare le concentrazioni proteiche e normalizzare le quantità di proteine tra diversi campioni di IP. Rimuovere il 5% del campione da ogni tubo per l'esecuzione come 5% Campione di ingresso in SDS-PAGE.
      NOTA: Il 5% di campione di ingresso può essere congelato in azoto liquido e stoccato a -80 gradi centigradi, se non viene caricato entro un giorno.
    3. Mescolare il resto del 95% di lisa con 25 luna (50% v/v) di proteine A legate all'anticorpo anti-GFP che è stato preparato al passo 5.2. Eseguire la rotazione end-to-end a 4 gradi centigradi per 4-18 h.
      NOTA: la durata ottimale per la rotazione end-to-end deve essere determinata empiricamente.
    4. Centrifuga proteina A con la proteina legata ad esso (cioè immunoprecipita) con 100 x g per 1 min, e rimuovere il supernatante. Lavare gli immunoprecipitati con il buffer A1 centrifugando a 100 x g per 1 min. Eseguire questo passaggio 4x.
    5. Mescolare il 5% di ingresso e il resto del 95% immunoprecipitati con 2x e 4x SDS-PAGE buffer di caricamento14, rispettivamente. Far bollire questi due campioni per 5 min e poi caricarli su un gel di denacrinazione SDS-polyacritiming al 10,0% per l'elettroforesi in corsie diverse. Utilizzare un gel SDS-PAGE più grande (ad esempio, 17 cm x 15 cm) per l'elettroforesi. Se i campioni vengono eseguiti in gel più piccolo, potrebbe non essere possibile osservare bande di ubiquilazione chiare/affilate.
    6. Eseguire l'analisi delle macchie occidentali come descritto nella sezione 4 utilizzando gli anticorpi indicati nel rapporto precedente8. Il risultato è illustrato nella figura 2A.
    7. Utilizzare il buffer di stripping delle macchie occidentali per rimuovere gli anticorpi pre-incubati dalla membrana PVDF e rebillarlo con diversi anticorpi per il prossimo round di analisi delle macchie occidentali.

6. Spettrometria di massa per identificare il sito di ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R

  1. Trasfezione per analisi della spettrometria di massa utilizzando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Cellule di semi CENP-A-/F RPE-1 in un piatto di coltura dei tessuti di 10 cm. Verificare che la densità delle cellule sia di 36,2 x 105 celle per piatto. Cellule di coltura in DMEM ad alto glucosio con 10% FBS e 1% penicillina-streptomycin. Preparare almeno 20 piatti per un campione di immunoprecipitazioni (IP), per ottenere almeno 10 proteine totali di mg (vedi 5.3).
      NOTA: per ottenere risultati ottimali, determinare empiricamente la densità cellulare da utilizzare nel seeding.
    2. Preparare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 18 h. Preparare i reagenti di trasfezione - 23 h dopo la diffusione (24 h punto è 0 h punto della trasfezione).
    3. A 17 h dopo la semina, preparare il reagenti di trasfezione e le cellule transfetne come (4.1.3). Le cellule transfected hanno pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) e pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 5% di CO2 per 48 h dopo la trasfezione. Raccogliere le cellule per lismi cellulari.
    5. Le cellule di liscisinel buffer A1 ed eseguono l'immunoprecipitazioni come (5.2) e (5.3). Eseguire questi due di immunoprecipitazioni lisati come segue (6.1.6) e (6.1.7).
      NOTA: In (6.1.6), eseguire il campione in gel Tris-glicina standard. In (6.1.7), eseguire il campione nei gel proteici Bis-Tris disponibili in commercio 4%-12%. Vedere anche Discussione.
    6. Conservare un campione per il 10% degli immunoprecipitanti totali per confermare l'ubiquililazione EYFP-CENP-A e per determinare con precisione la posizione dell'ubiquitorato EYFP-CENP-A come descritto nella sezione 5. Eseguire questo esempio in gel Tris-glycine standard. SDS-PAGE e western blot sono stati eseguiti come (5.3).
    7. Conservare un altro campione per il 90% degli immunoprecipitazioni totali per l'analisi della spettrometria di massa. Eseguire questo campione all'interno di due pozze dei gel proteici Bis-Tris disponibili in commercio 4%-12%. Eseguire la colorazione blu Coomassie utilizzando la soluzione blu Coomassie. Accise e tagliare la regione gel di 50-70 kDa (putata mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R regione). Utilizzare questa regione di gel per l'analisi della spettrometria di massa.
  2. Analisi della spettrometria di massa utilizzando la digestione in gel.
    1. Tagliare ogni fetta di gel di interesse in piccoli pezzi (1 mm2) e collocarla in 0,5 mL di tubi proteici a basso legame.
    2. Lavare con 100 l5% di acetonitrile (v/v) in 25 mM NH4HCO3, vortice 10-15 min, girare verso il basso, scartare il supernatante, ripetere 3x.
    3. Concentrare il campione utilizzando il concentratore a vuoto da banco per 30 min per asciugare i pezzi di gel.
    4. Aggiungete 10 luna di 10 ng/L sequenziamento di grado trypsin e lasciate che i pezzi di gel reidratino per 5 min.
    5. Aggiungere 25 mM NH4HCO3 quanto basta per coprire i pezzi di gel, digerire a 37 gradi durante la notte.
    6. Trasferire il supernatante digerito in un tubo siliconizzato pulito da 0,65 ml. Aggiungere il 50% (v/v) acetonitrile/5% (v/v) acido formico (30 o abbastanza da coprire), vortice 10 min, spin e trasferimento nello stesso tubo di estrazione. Ripetere 3x.
    7. Aggiungere 10 acetonitrile l' ai pezzi di gel, vortice 5 min, e girare verso il basso. Trasferire il supernatante nello stesso tubo.
    8. Concentrare i campioni utilizzando il concentratore di vuoto da banco a 2 o ln, aggiungere 8 (v/v) acetonitrile (v/v) acetonitrile /2% (v/v) acido formico al campione, vortice per 15 min e spin down a 16.000 x g per 30 min. I campioni sono pronti per l'analisi della spettrometria di massa.
    9. Eseguire l'acquisizione di dati MS con LC-MS/MS utilizzando un sistema di cromatografia liquida (Tabella dei materiali) accoppiato con uno strumento di spettrometria di massa ( Tabella deimateriali).
    10. Iniettare 8 -L di campione ricostituito in una colonna di cromatografia liquida in fase inversa (RPLC).
    11. Separare i peptidi con un 2-80% di gradiente di solvente B in 60 min. Assicurarsi che il gradiente sia costituito da una percentuale crescente di solvente B dal 2% al 22% in 40 min, dal 22% al 35% di solvente B in 12 min, quindi salire all'80% solvente B in 4 min, e infine trattenendo l'80% di solvente B per gli ultimi 4 min. Impostare la velocità di flusso costante a 300 nL/min.
      NOTA: Il Solvente A contiene lo 0,1% di acido formica e il 2% di acetonitrile, il solvente B contiene lo 0,1% di acido formico e il 98% di acetonitrile. Tutte le concentrazioni sono visualizzate come volume/volume.
    12. Raccogliere dati di spettrometria di massa utilizzando la modalità di acquisizione dipendente dai dati. In breve, raccogliere gli spettri MS in 350-1500 m/z per 250 ms. Selezionare i primi 50 precursori intensi con carica 2–5 per un'ulteriore frammentazione. Raccogliere gli spettri MS/MS in 100-2000 m/z per 100 ms, escludendo gli ioni precursori dalla riselezione per 15 s.
    13. Per la ricerca nel database, aprire il software commerciale (vedere Tabella dei materiali) per analizzare i dati della spettrometria di massa sul desktop.
    14. Per effettuare una nuova ricerca, fare clic sul pulsante "LC" nel menu in alto. Quindi fare clic sul pulsante "Aggiungi" per caricare i file di dati grezzi MS originali.
    15. Selezionare "Human Protein ID" nel " MetodoParagon" come metodo di ricerca nel database. Eseguire una ricerca nei file di dati non elaborati MS originali nel database UniProt Homo Sapiens (contenente 160.566 sequenze http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Impostare i parametri di ricerca come segue: selezionare la trypsin come enzima di digestione, consentire fino a 3 scissioni mancanti, 4 modifiche e 2-5 cariche per peptide. Impostare l'errore di massa fino a 20 ppm per la prima ricerca e 0,02 Da per gli ioni frammentati. Specificare soglie di tasso di scoperta falso (FDR) per i siti di proteine, peptidi e modifiche inferiori all'1%. Impostare tutti gli altri parametri del software sui valori predefiniti (vedere la figura 3 per l'analisi della spettrometria di massa).
    17. Fare clic sul pulsante "Salva con nome" a destra del menu in alto, selezionare una cartella per memorizzare i risultati della ricerca, immettere il nome della ricerca e fare clic sul pulsante "Salva".
    18. Fare clic sul pulsante "Processo" a destra del menu in alto per avviare la ricerca. Al termine della ricerca, i dati con il nome di ricerca immesso verranno automaticamente memorizzati nella cartella selezionata. I dati possono essere facilmente aperti da Software F.
    19. Per ottenere gli spettri MS/MS di qualsiasi peptide specifico, fare doppio clic sui risultati della ricerca per aprirlo con Software F. In primo luogo, fare clic sulla proteina nell'elenco delle proteine nella parte superiore del menu, quindi fare clic sul peptide al centro del menu. La MS/MS di questo peptide è mostrata nella parte inferiore del menu.
    20. Per esportare e salvare gli spettri MS/MS, fare clic con il pulsante destro del mouse sugli spettri MS/MS nella parte inferiore del menu, selezionare copia e quindi incollare in un file adatto, ad esempio il formato PPT o doc.

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Representative Results

Il mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquilazione, interazione con HJURP e nessun difetto nella localizzazione del centromere né la letalità cellulare. Qui il sistema riportato da Fachinetti et al. (2017)6 è stato ricostituito: in cellule umane diploide (RPE-1) che ne trasportavano una perturbata e un CENP-A ''floxed''(CENP-A-/F),-/FEYFP-CENP-A è stato espresso dal vettore retrò pBabe-EYFPvirus. In questo sistema, l'espressione del CENP-A endogeno dall'allele CENP-A-/F potrebbe essere interrotta da Cre ricombinase6. I costrutti genici del mutante EYFP- CENP-A o K124R(Figura 1A), che salva la perdita di CENP-A endogeno, sono stati espressi stabilmente quando è stata eseguita l'integrazione retrovirale. La restante espressione di CENP-A endogena dall'allele CENP-A-/F è stata poi interrotta dalla ricombinasi Cre. L'espressione di CENP-A endogeno non è stata rilevata 7 giorni dopo l'induzione di Cre ricombinase (Figura 1B, corsie 5-7). Si è scoperto che l'espressione delle proteine EYFP-CENP-A e K124R è stata trovata a un livello simile a quello delle proteine CENP-A endogene iniziali(Figura 1B, corsie 3, 4, 6 e 7). Entrambi i mutanti EYFP-CENP-A WT e K124R hanno mostrato la localizzazione dei centrimeri a 7 giorni dopo l'interruzione dell'espressione rimanente del CENP-A endogeno dal CENP-A-/F allele (Figura 1C-1E). Sia EYFP-CENP-A WT che il mutante K124R hanno mostrato ubiquilazione e interazione con HJURP a differenza del caso di Flag-tagged o untagged CENP-WT e il mutante K124R (Figura 2A; dati non mostrati per Flag-tagged o senza tag CENP-A)8. La vitalità cellulare è stata affrontata anche eseguendo il saggio di escrescenza della colonia 14 giorni dopo l'interruzione del restante allele endogeno CENP-A (Figura 2B). Sia i mutanti EYFP-CENP-A WT che K124R hanno mostrato un numero simile di colonie "salvato" 14 giorni dopo l'interruzione del restante allele CENP-A endogeno(Figura 2B e 2C). Pertanto, i nostri risultati sono in linea con quelli riportati da Fachinetti et al.6.

L'ubiquilazione alla lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R è stata rivelata dall'analisi della spettrometria di massa. Si è scoperto che sia EYFP-CENP-A WT che il mutante K124R mostrano ubiquilazione e interazione con HJURP a differenza del caso di Flag-tagged o senza tag CENP-WT e il mutante K124R (Figura 2A; dati non mostrati per marcato a contrassegno o senza tag CENP-A)8. Questi risultati suggeriscono che la fusione della proteina EYFP induce l'ubiquilazione in una lisina diversa da K124 nel mutante EYFP-CENP-A K124R, e questa ubiquilazione in un altro sito promuove l'interazione di EYFP-CENP-A K124R con HJURP. L'ubiquilazione alla lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R è stata rivelata nelle celle CENP-A-/F dall'analisi della spettrometria di massa IP(Figura 3A e Figura 3B). La lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R corrisponde alla lisina 56 (K56) in CENP-A. Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono che la fusione di proteine di grandi dimensioni (ad esempio, EYFP-tagging) induce l'ubiquililazione in una lisina diversa da K124 in CENP-A, e questa ubiquilazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante.

Figure 1
Figura 1: EYFP-CENP-A il mutante K124 si localizza ai centrimeri. (A) Rappresentazioni dei diversi costrutti di proteine CENP-A etichettati con EYFP (proteina fluorescente gialla avanzata) al capolinea N. Le lettere rosse indicano la posizione della sostituzione degli amminoacidi K124R nel costrutto indicato (a sinistra). I risultati dei saggi effettuati in questo studio sono mostrati (a destra). (B) L'analisi western blot non ha mostrato la presenza di CENP-A endogeni rilevabili. Analisi immunoblots per verificare la presenza di espressione dei costrutti di salvataggio indicati (ca. 45 kDa) prima e dopo l'infezione da Cre. L'espressione proteica dei costrutti pBabe-EYFP è stata confermata prima dell'infezione da Cre (corsie 1-4), così come dopo l'infezione da Cre (lane 5-6). L'assenza della proteina CENP-A endogena (ca. 15 kDa) è stata confermata nelle linee cellulari CENP-A-/- raccolte a 7 giorni dopo l'infezione da Cre (lane 5-6). La proteina GAPDH è stata utilizzata come controllo del carico. (C) EYFP-CENP-A il mutante K124 si localizza ai centrimeri. Le celluleCENP-A-/F RPE-1 sono state cotransigiate con costrutti indicati, coltivati 7 giorni dopo l'infezione da virus retro-Cre e immunostained. Visualizzazione di DAPI (blu), EYFP (verde) e CENP-B endogeno (rosso), che fungeva da controllo della posizione del centromero. Barra della scala, 10 m. (D) I modelli di localizzazione mostrati in (C) sono riepilogati come istogrammi. Per ogni esperimento sono state conteggiate più di 200 cellule interfase con segnali positivi EYFP, e vengono mostrate le percentuali medie (SD). ''Altri (non-centromere'' raffigura per lo più cellule danneggiate, cellule morte o cellule con localizzazione nucleolare nell'interfase, che sono state osservate a causa della trasfezione o di altri trattamenti. Nessuna differenza significativa (n.s.) è stata osservata in K124R rispetto a WT (test t di Student). (E) Sono stati quantificati i segnali derivati dall'EAFP ai centrimeri mostrati in (C). I segnali sono stati normalizzati a quelli di WT, e le percentuali medi (-SEM) sono mostrate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Il mutante EYFP-CENP-A K124 è onnitipato e interagisce con HJURP, e la vitalità cellulare non è stata influenzata dalla mutazione K124R di EYFP-CENP-A. (A) Il mutante EYFP-CENP-A K124 è onnipresente e interagisce con HJURP. In vivo onniquilazione saggio. Le cellule CENP-A-/F RPE-1 sono state trascate con i costrutti indicati. Le proteine nel 5% dei listi cellulari totali (Input) e degli immunoprecipitati (IP) che utilizzano anticorpi policlonali anti-GFP del coniglio sono state rilevate dall'analisi delle macchie occidentali utilizzando gli anticorpi indicati. Sono indicati i putative di-Ub-EYFP-CENP-A (sezione ) e mono-Ub-EYFP-CENP-A (a) Questa cifra è stata modificata da Niikura etal. (B) Immagini rappresentative dell'analisi di sprovamenti della colonia, come mostrato nello schema (in alto) di due condizioni diverse ([1] e [2]) per i transfettici indicati di EYFP-CENP-A. (C) Istogrammi che riassumono la sopravvivenza della colonia degli esperimenti in (B). Le percentuali medie di oltre 3 esperimenti indipendenti (n - 3) sono normalizzate con la percentuale di colonie sopravvissute in EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0.0001 e .p < 0.01 rispetto al controllo EYFP (test t di Student). Nessuna differenza significativa (n.s.) è stata osservata in K124R rispetto a WT (test t di Student). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Frammenti di peptidi EYFP-CENP-A K124R onnicettati sono stati rilevati dall'analisi della spettrometria di massa. (A) Prova dell'ubiquilazione a lisina 306 (K306) di EYFP-CENP-A K124R nelle cellule RPE-1 CENP-A-/F. La lisina 306 (K306) di EYFP-CENP-A K124R corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A. Il peptide LQKLRGGSTHLLIR (copertura 95,9%, fiducia 87,8%) identificata dall'analisi della dissociazione indotta da collisioni. I valori m/z (Da) degli ioni b (verde) e y (rosso) negli spettri di (A) rilevati durante la frammentazione sono evidenziati in verde nella tabella di (B). L'ubiquilazione di K306 è confermata dal motivo LRGG (scissione incompleta) dello ione b-3 (m/z 753.4730) e dello ione y-8 (m/z 1350.8328). (B) La tabella evidenzia i valori m/z (Da) degli ioni b (verde) e y (rosso) negli spettri di (A). LQK[Umc]STHLLIR nella tabella di (B) indica il peptideLQK LRGGSTHLLIR mostrato in (A). Queste cifre sono state modificate da Niikura etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Numero B Caratteristiche rilevanti Riferimento fonte
B3027 (in questo singhio1o pBabe-puro-Cre Niikura et al., 2019 Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner
B3182 (in questo sin) B3182 pBabe-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3161 (in inglese) pBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3164 (in inglese) pBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3031 psPAX2 (in base al sistema psPAX2) Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
D3032 pMD2.g Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
B3189 (in questo s). Pgp Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Giappone)
B3190 (in questo s). pCI-VSVG Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Giappone)
B3001 PPAM Niikura et al., 2019 -
B3252 (in questo sin) pQCXIP-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3254 pQCXIP-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 -
B3256 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 -
B2806 pCGN-HA-Ubiquitin Niikura et al., 2019 -

Tabella 1: Vettori plasmici utilizzati in questo studio.

Numero B Vettori di plasmie helper/imballaggio Combinazione 1 Combinazione 2 Combinazione 3
B3031 psPAX2 (gag lentivirale/pol vettore) 2 .g
D3032 pMD2.g (lentiviral env vector) 2 .g
B3189 (in questo s). pGP (vettore gag retrovirale/pol) 2 .g
B3190 (in questo s). pCI-VSVG (retroviral env vector) 2 .g
B3001 pPAM (codifica del vettore helper ampotropico con codifica retrovirale gag-pol-env) 2 .g

Tabella 2: Combinazioni di vettori di plasmide helper/imballaggio utilizzati nei costrutti (1.1.3): retrovirus trasfection di pBabe-EYFP-CENP-A costrutti.

File di codifica supplementari. Fare clic qui per scaricare questi file.

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Discussion

Qui abbiamo descritto i metodi di analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l'ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. Nei nostri risultati, abbiamo identificato con successo l'ubiquilazione sulla lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l'analisi della spettrometria di massa. L'analisi della spettrometria di massa descritta qui è un metodo mimetico in quanto in precedenza identifichiamo il sito di ubiquilazione lisina 124 (K124) del CENP-A WT-Flag12. Pertanto, questo metodo può essere applicato alla proteina umana CENP-A con diversi tag e altre proteine centromere-kinetochore. L'analisi della spettrometria di massa basata su LC-MS/MS è comunemente accettata per identificare potenziali modifiche post-traduzionali (PTM) di un ampio spettro di proteine. I nostri metodi combinatori costituiti da diversi saggi/analisi (ad esempio, analisi dell'ubiquilazione in vivo, analisi della crescita delle cozze e analisi della spettrometria di massa) potrebbero essere raccomandati per i ricercatori interessati a identificare i ruoli funzionali dell'ubiquilazione delle loro proteine bersaglio.

Tuttavia, questo protocollo non copre il rilevamento di bande oniquilate e/o l'identificazione di ubiquilazione site-specific di queste proteine nelle cellule viventi o in una singola cellula specifica durante l'intero ciclo cellulare. Questi anni gli approcci optogenetici sono sviluppati drasticamente e danno un grande impatto sugli studi quantitativi dei sistemi di segnalazione cellulare. L'optogenetica ha originariamente fornito approcci che attivano o inibiscono con precisione i singoli neuroni utilizzando sistemi a base di opsina microbica singolo componente. Attualmente, l'attività proteica con una precisione spatiotemporale senza precedenti può essere controllata sfruttando i fotorecettori geneticamente codificati naturali, e vari strumenti geneticamente codificati consentono il controllo della luce di molti processi biologici, tra cui la fosforolante delle proteine15. Pertanto, l'optogenetica è un sistema promettente per studiare la segnalazione della chinasi della proteina patiotemporale a livello cellulare e dell'intero organismo. Il numero di chinasi proteiche controllate dalla luce è in rapida espansione, anche se il numero attuale è ancora limitato. Tuttavia, lo sviluppo dell'ubiquilazione delle proteine controllate dalla luce è ritardato e l'etichettatura ad alto peso molecolare dei fotorecettori può interrompere l'ubiquilinazione delle proteine WT e mutanti e alterare funzionalmente la funzione della proteina nativa come aforestated. Pertanto, lo sviluppo di una tecnica di etichettatura o sonda di peso molecolare inferiore è urgentemente necessario per visualizzare l'ubiquililazione e/o per studiare la segnalazione dell'ubiquililazione delle proteine spatiotemporali a livello cellulare vivente e dell'intero organismo.

Nel presente studio, il controllo vettoriale EYFP è essenziale per le analisi di controllo (analisi dell'immunofluorescenza, analisi della crescita della colonia e analisi dell'ubiquililazione in vivo) per discutere correttamente l'esito dell'analisi della spettrometria di massa maggiore. L'interazione non specifica con la proteina EYFP è spesso osservata nell'esperimento di immunoprecipitazioni, quindi il controllo vettoriale EYFP è indispensabile per valutare la reale interazione delle proteine fuse EYFP. La nostra analisi della spettrometria di massa utilizzando EYFP-CENP-A K124R espressa nelle cellule RPE-1 CENP-A-/F non ha mostrato l'ubiquilazione sui siti di lisina nella sequenza di polipeptide EYFP. Tuttavia, in altre condizioni sconosciute, ci si potrebbe aspettare che il sito di lisina nella sequenza di polipeptide EYFP sia onnitipato in EYFP- e/o altre proteine di fusione marcate di alto peso molecolare.

Per i saggi di escrescenza della colonia, si raccomanda di raccogliere le cellule per l'analisi delle macchie occidentali per confermare l'esaurimento delle proteine di CENP-A endogeno dopo l'infezione da virus retro-Cre e l'espressione proteica dei costrutti pBabe-EYFP-CENP-A. In questo modo, possiamo giudicare se la colonia escresce il fenotipo è veramente dovuto alla sola espressione di UN NPNP-A o mutanti esogeni. Per qualsiasi analisi western blot, se lo stripping viene eseguito per reblotla con anticorpi diversi per il prossimo turno dell'analisi delle macchie occidentali, si dovrebbe utilizzare lo stesso sistema di rilevamento quantitativo della macchia di un turno precedente per la macchia del turno successivo con diversi anticorpi. Si dovrebbe fare in modo che le bande nella macchia del turno precedente siano non rilevabili nella regione mirata della membrana nella macchia del turno successivo con diversi anticorpi. Oppure utilizzare lo stesso sistema di rilevamento quantitativo della macchia del turno precedente e verificare se l'incubazione con il semplice anticorpo secondario utilizzato nella macchia del turno precedente non porta al rilevamento delle bande proteiche prima di iniziare la macchia del turno successivo con diversi anticorpi. Per il test dell'ubiquilazione in vivo, è importante eseguire un gel SDS-PAGE più grande utilizzando l'apparato per eseguire un gel SDS-PAGE più grande (Gel electrophoresis apparatus I o II). Empiricamente, più grande gel SDS-PAGE sarebbe separare le bande proteiche chiaramente e migliorare la sensibilità del rilevamento delle bande deboli che avrebbero potuto essere scarsamente rilevati nel gel più piccolo (cioè, le bande proteiche appaiono più nitide nel gel più grande).

È estremamente importante scegliere un gel SDS-PAGE adeguato per mappare le modifiche post-traduzionali (PTM) di una specifica proteina approfondita LC-MS/MS. Il sistema gel più utilizzato per SDS-PAGE è il sistema Laemmli, che utilizza gel Tris-glicina che comprendono un componente gel di impilamento e il componente gel di risoluzione. In questo sistema classico, il pH e la forza ionica dei buffer utilizzati nel gel di impilamento (Tris, pH 6.8) e gel di risoluzione (Tris, pH 8.8) sono diversi dal buffer utilizzato per l'esecuzione del gel (Tris, pH 8.3). Distorsione della banda, perdita di risoluzione o bande artefatto possono essere causate dal pH di funzionamento altamente alcalino del sistema Laemmli. La relazione precedente descriveva le principali cause di scarsa risoluzione della banda con il sistema Laemmli16, tra cui instabilità e breve periodo di scadenza del gel di risoluzione a causa dell'idrolisi della poliacrilammide ad alta pH, alterazioni chimiche delle proteine campione, reossidazione di disulfidi ridotti di residui di cisteina delle proteine e scissione di legami Asp-Pro di proteine con riscaldamento a 95-100 gradi centigradi nel buffer del campione di Laemmli a pH 5.2. I gel proteici Bis-Tris disponibili in commercio sono Bis-Tris HCI-buffered (pH 6.4) e operati al pH ca. 7.0 a differenza dei tradizionali gel Tris-glicina16. I numerosi meriti raffronto con il sistema Laemmli sono generati dal pH operativo neutro dei sistemi Bis-Tris16, tra cui alta stabilità e lungo periodo di scadenza del gel di risoluzione, una maggiore stabilità proteica campione durante l'elettroforesi al pH neutro che porta a una risoluzione della banda più nitida e risultati accurati, e la completa riduzione dei disulfidi e l'assenza di scissione dei legami Asp-Pro. In questo rapporto, abbiamo potuto mappare con successo PTM di EYFP-CENP-A proteina K124R (Figura 3) utilizzando i gel proteici Bis-Tris disponibili in commercio 4%. Pertanto, i gel proteici Bis-Tris disponibili in commercio 4%-12% sono altamente raccomandati da utilizzare per questo scopo.

Per mappare le modifiche post-traduzionali (PTM) di una proteina specifica, è ampiamente utilizzata la digestione in gel della proteina bersaglio abbinata a LC-MS/MS. In questo studio, abbiamo cercato di identificare i siti di ubiquitinazione EYFP-CENP-A K124R utilizzando la strategia di spettrometria di massa di purificazione dell'affinità (AP-MS). Pertanto, il primo passo chiave consiste nell'ottenere una grande quantità di proteine EYFP-CENP-A K124R ubiquitarate con elevata purezza utilizzando l'immunoprecipitazioni da cellule eYFP-CENP-A K124R, che potrebbero facilitare notevolmente l'identificazione e la conferma di siti di ubiquitinazione di EYFP-CENP-A K124R da parte delle cellule LC-MS/MS. Per ridurre l'interferenza della proteina EYFP-CENP-A K124R non ubiquitata, sono state eseguite macchie occidentali di anti-GFP, anti-HA (Ubiquitina), anti-Ubiquitin (cfr. sezione [6.1.6]) e colorazione blu Coomassie (cfr. sezione [6.1.7]) per determinare con precisione la posizione di eYFP-CENP-A K124R onniquitated. Infine, solo un'area ridotta al minimo di banda gel contenente eYFP-CENP-A K124R ubiquitata è stata asportata per la digestione in gel accoppiata con LC-MS/MS per ottenere risultati ottimizzati. Quando i peptidi secchi vengono ricostituiti prima di operare LC-MS/MS, il 3% (v/v) acetonitrile /2% (v/v) dell'acido formico è stato utilizzato per aiutare una migliore solubilità e tasso di recupero dei peptidi. A volte la ricerca nel database potrebbe risultare in PTM che non esiste veramente a causa dell'algoritmo di assegnazione approssimativa del motore di ricerca. Pertanto, un altro passo critico è quello di confermare i siti di ubiquitinazione EYFP-CENP-A K124R attraverso la revisione manuale di MS/MS di peptidi onniquitati con l'aiuto di Software F (Tabella dei materiali),che potrebbe eliminare i siti di ubiquitazione "irreali" introdotti mediante assegnazione approssimativa mediante la ricerca nel database. In sintesi, questa strategia AP-MS ha istituito un gasdotto efficiente e robusto per l'identificazione di siti di ubiquitinazione EYFP-CENP-A K124R con un significato biologico cruciale. Ancora più importante, questa pipeline potrebbe anche essere ampiamente estesa per studiare le PTM di varie proteine funzionali.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo Chao-Jun Li presso il Model Animal Research Center della Nanjing University per l'analisi della spettrometria di massa. Ringraziamo Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e gli attuali ricercatori del Model Animal Research Center, della Nanjing University e del Greehey Children's Cancer Research Institute per la loro utile discussione, guida sperimentale e reagenti. Ringraziamo Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler per i loro generosi doni di reagenti. Y.N. è stato sostenuto dal Fondo di costruzione della provincia di Jiangsu ''Doppia-Prima Classe'', Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Provincia di Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Provincia "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in Cina (31970665). Questo studio è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione NCI R21 CA205659.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

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References

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Biologia Numero 160 centromero cinetocoro mitosi CENP-A modifica post-traduzionale PTM ubiquilazione analisi della spettrometria di massa
Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)
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Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

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