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Biology

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Abstract

El estudio de la estructura y la dinámica de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. La forma en que se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y participan en la segregación cromosómica precisa es una cuestión fundamental. Se propone que CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere, y se requiere la ubicuación CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular.

Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que la ubicuidad en una lisina diferente se induce debido al etiquetado EYFP en la proteína mutante CENP-A K124R. Se identificó con éxito la ubiquilación de lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en el ANálisis de espectrometría de masas CENP-A. Una advertencia se discute en el uso de GFP/EYFP o el etiquetado de proteína de alto peso molecular como herramienta para analizar la función de una proteína. También se discute el límite técnico actual para la detección de bandas ubiquitidas, la identificación de la ubiculación específica del sitio y la visualización de la ubicuidad en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular.

El método de análisis de espectrometría de masas presentado aquí se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. Estos métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar funciones funcionales de ubiculación.

Introduction

En la mayoría de los eucariotas, los microtúbulos del husillo deben adherirse a una sola región de cada cromosoma, llamado centromere. El kinetochore es un complejo de proteínas que se encuentran en el centromere. Estudiar el momento de los movimientos de la proteína centromere y kinetochore y la estructura de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. Las preguntas clave son cómo se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y cómo participan en la segregación cromosómica precisa. En la mayoría de las especies, la presencia de un nucleosoma especial que contiene una proteína específica similar a la histona llamada CENP-A define la identidad centromere. Por lo tanto, se propone que el CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere. Es importante dilucidar el mecanismo de cómo CENP-A define la identidad centromere en los seres humanos.

La proteína de reconocimiento de unión Holliday (HJURP) es el chaperon específico de CENP-A que deposita CENP-A en nucleosomas centroméricos1,,2,,3. Hemos informado previamente que la ligasa CUL4A-RBX1-COPS8 E3 es necesaria para la ubiculación CENP-A en la lisina 124 (K124) y la localización de centromere4. Además, nuestros resultados mostraron que el reclutamiento de centromere de CENP-A recién sintetizado requiere una ubicuidad preexistente CENP-A5. Por lo tanto, se proporcionó un modelo que sugiere que la ubicuidad CENP-A se hereda a través de la dimerización entre divisiones celulares.

En contraste con nuestros hallazgos y los de Yu et al., los resultados negativos sobre el CENP-A y su localización centromérica se publicaron recientemente6. El artículo afirmaba que las modificaciones CENP-A en la lisina 124 (K124) son prescindibles para el establecimiento, mantenimiento y función a largo plazo de los centromeres humanos, basándose en sus resultados negativos que demuestran que la mutación de K124R no afectó a la localización del centromere CENP-A ni la viabilidad celular6. Sin embargo, hay suficiente margen para el debate en sus resultados y conclusiones, y ya hemos descrito qué problema podría haber en su publicación anterior7. Se debe prestar atención a que fusionaron proteínas con CENP-A, que tienen pesos moleculares mucho mayores que el tamaño de CENP-A endógeno: por ejemplo, fusionaron la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) de 30 kDa a 16 kDa CENP-A y analizaron la proteína de fusión EYFP-CENP-A K124R en su sistema RPE-1 CENP-A-/F knockout. No se espera que la ubiquitina K124 se una directamente al HJURP sobre la base de las predicciones estructurales4,sin embargo, se prevé que la adición de monoubiquitina tenga un impacto en la conformación proteica de CENP-A. La proteína de la conformación CENP-A puede ser cambiada por la presencia de una gran proteína de fusión, y este cambio conformacional puede enmascarar los cambios estructurales causados por la pérdida de ubiculación. Sugerimos que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de la K124 en el mutante EYFP-CENP-A K124R y esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único original K124R. La evidencia de que la ubicuidad ocurre en diferentes lisina en la proteína mutante CENP-A K124R con una proteína de etiqueta grande (EYFP) fue reportada en nuestra publicación anterior8. Se encontró que el etiquetado EYFP induce la ubiquitinación de otro sitio de lisina de EYFP-CENP-A K124R y que el mutante EYFP-CENP-A K124R se une a HJURP. Como resultado, esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único K124R original, y tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron localización de centromere (usamos y comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT y mutante K124R, junto con el control pBabe-EYFP.). Los resultados demostraron que los mutantes CENP-A K124R con etiqueta de bandera o sin etiquetar son letales, pero pueden ser rescatados por una fusión monoubiquitina, lo que sugiere que la ubicuidad CENP-A es indispensable para la viabilidad celular.

En los últimos años, muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos para identificar las modificaciones posttranslacionales (PTM) de la proteína CENP-A y otras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo como in vitro9,,10,,11. Análogos a los PTM de las proteínas histonas que son un mecanismo importante que regula la función de la cromatina, los PTM de los componentes centroméricos de cromatina también participan en un mecanismo esencial para regular la estructura general y la función de los centromeros. La mayoría de los sitios CENP-A PTM son específicos de los nucleosomas que contienen CENP-A, aunque algunos de ellos se conservan en la histona H3, lo que sugiere que la modificación de estos residuos contribuye a la función específica del centromere. Las PTM de CENP-A, incluyendo la fosforilación, la acetilación, la metilación y la ubicuidad, se notificaron previamente9, lo que sugiere que CENP-A está sujeta a una variedad de TPM y sus matrices combinatorias en su dominio amino terminus y C-terminus histone-fold. La importancia de las modificaciones CENP-A en múltiples funciones fue revelada por muchos grupos, incluyendo el nuestro. Estas funciones implican la deposición CENP-A en los centromeres, la estabilidad proteica y el reclutamiento de la CCAN (red asociada al centromere constitutivo)9. Sin embargo, los estudios y hallazgos limitados de las PTM CENP-A se preforman cuando se realizan comparaciones con una de las histonas canónicas que regulan directa o indirectamente su función. Los informes técnicos centrados en la metodología para identificar estos PTM CENP-A también son limitados.

Debido a que se requiere la ubicuidad CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere12,heredada a través de la dimerización entre la división celular5,e indispensable para la viabilidad celular8, el método para identificar la ubiculación CENP-A sería esencial en el futuro para estudiar la actividad funcional, el posicionamiento y la estructura del centromere. Por lo tanto, aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. También se presentan protocolos de otros ensayos y análisis de control (análisis de inmunofluorescencia, ensayo de crecimiento de colonias y ensayo de ubicuidad in vivo) para discutir el resultado del análisis de espectrometría de masas importante correctamente.

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Protocol

1. Cultivo celular y transfección de retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: EYFP-CENP-A se expresa desde pBabe-EYFP-CENP-A a un nivel de proteína similar al CENP-A endógeno. La proteína CENP-A celular total se sustituye por esta EYFP-CENP-A después de la interrupción del alelo CENP-A-/F por Cre recombinase como en las células RPE-1 CENP-A-/-6.

  1. Preparación del sobrenadante que contiene retrovirus utilizando células de envasado 293T.
    1. Día 0: Extienda las celdas de embalaje 293T en la placa de cultivo de 6 pozos (1,0 x 106 celdas/pozo). Células de cultivo en DMEM de alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 24 h.
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, determine empíricamente la densidad de celdas que se utilizará en la siembra.
    2. Día 1: Preparar la reacción de transfección alrededor de 23 h después de la propagación (punto 24 h es 0 h punto de la transfección). Plásmido de expresión transfecto de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) y pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (véase el Cuadro 1).
    3. Elija una combinación de plásmidos auxiliares/envasados enumerados en la Tabla 2 y agréguelos a los tubos que contengan uno de los plásmidos mencionados anteriormente. En su mayoría existen estas 3 combinaciones para plásmidos auxiliares/envasados(Tabla 2). Cualquier combinación funcionó en estos experimentos y mostró una eficiencia de transfección similar.
    4. Preparar 50 l de medio sérico reducido y mezclar 2,0 g de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) y pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (véase el Cuadro 1) añadiendo una combinación de plásmidos auxiliares/envasados enumerados en el Cuadro 2 (véase más adelante). Incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante 5 min. Esta mezcla es la solución A.
    5. Preparar otros 50 l de medio sérico reducido y mezclar 1,5 ml de reactivos de transfección I y II, respectivamente (Tabla de materiales). Incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante 5 min. Esta mezcla es la solución B.
      NOTA: Opcionalmente, añada sólo 6,0 ml de reactivo de transfección III (polietilenimina [PEI]; 1,0 mg/ml) en la solución B o añada 6,0 ml de reactivo de transfección III además de los reactivos de transfección I y II en la solución B(Tabla de materiales).
    6. Mezclar las soluciones A y B juntas, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    7. Después de lavar las células cultivadas una vez con PBS, agregue la mezcla de las soluciones A y B (es decir, el complejo DNA-lipid) directamente a cada pocóculo de la placa de cultivo de 6 pocillos que tiene un medio sérico reducido de 500 l. La concentración final del plásmido es de 3,3 g/ml.
    8. Después de incubar las células a 37oC en una atmósfera de 5% co de CO2 durante 4,5 h, cambie el DMEM de media a alta glucosa con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Poner 2 ml/pozo de medio de cultivo después del cambio medio en la placa de cultivo de 6 pozos.
    9. Cultivar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 48 h después de la transfección. Realizar la infección por retrovirus el día 3 utilizando el sobrenadante que contiene retrovirus.
  2. Infección por retrovirus de las células dianaCENP-A -/F RPE-1.
    1. Día 2: Un día antes de la infección, propagar las células diana CENP-A-/F RPE-1 para transfecar en el pozo de cultivo de 6 pozos (2.25 x 105 células/pozo). Células de cultivo en DMEM: F12 medio(Tabla de Materiales)con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Extienda las células para ensayos de crecimiento de colonias, inmunofluorescencia y análisis de manchas occidentales como control. Para obtener resultados óptimos, determina empíricamente la densidad celular que se utilizará en la siembra.
    2. Día 3 (día de infección del virus): A las 48 h después de la transfección de las células de embalaje 293T, recoja el virus que contiene el sobrenadante y filtre a través del filtro de 0,45 m (no utilice un filtro de 0,2 m que cizallará el sobre del virus). Se recomienda utilizar filtros de poliédersulfona (PES).
    3. Infectar células CENP-A-/F RPE-1 con el virus. Para un pozo de la placa de cultivo de 6 pocillos, agregue 1 mL de medios frescos, 1 sobrenadante del virus mL y polibrena a una concentración final de 8 g/ml. Incubar las células CENP-A-/F RPE-1 a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 4 días hasta el día 7 después de la transfección.
      NOTA: El período de incubación para el crecimiento celularCENP-A -/F RPE-1 debe determinarse empíricamente siguiendo los análisis para obtener resultados óptimos.

2. Análisis de inmunofluorescencia de células que contienen pBabe-EYFP-CENP-A

  1. Día 7: 4 días después de la infección por retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A, eliminar el medio de cultivo por aspiración. Enjuagar las células una vez con TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Aplique TBS en el lado de los pozos de cultivo para evitar perturbar la superficie de las células.
    NOTA: El punto de tiempo óptimo para la fijación de celdas debe determinarse empíricamente. Las señales de inmunofluorescencia de las construcciones EYFP-CENP-A WT y K124R son detectables en el centromere al menos 4 días después de la infección por retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A incluso sin infección de Cre (datos no mostrados, Figura 1C-E para los datos con infección de Cre).
  2. Realizar la fijación de la célula de metanol y la tinción de inmunofluorescencia como se describió anteriormente13.
  3. Como anticuerpos primarios utilizan un anticuerpo anti-GFP (1:1.000 dilución) y un anticuerpo anti-CENP-B (relación de dilución de 1:200) para un marcador de ubicación de centromere en TBS que contiene 4% de suero de cabra (ver Tabla de materiales para los anticuerpos utilizados).
  4. Retire el exceso de medio de montaje con una toalla de papel y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas en el último paso.
  5. Consulte el método13 descrito anteriormente para la observación de la imagen de inmunofluorescencia, adquisición, cuantificación y análisis de las señales restantes de EYFP-CENP-A en el centromere.
  6. Realice la adquisición de imágenes, el procesamiento, incluida la desconvolución, la cuantificación y el análisis mediante softwares A o softwares B1 y B2 (consulte Tabla de materiales). Opcionalmente, utilice los softwares C1-C3 (ver Tabla de materiales)para un microscopio de escaneo láser confocal.
    NOTA: Consulte 2.6.1 en Archivos de codificación suplementarios para todos los comandos utilizados en el software A. Consulte 2.6.2 en Archivos de codificación suplementarios para todos los comandos utilizados en los softwares B1 y B2.

3. Ensayos de crecimiento de colonias utilizando pBabe-EYFP-CENP-A después de la infección por el virus retro-Cre

NOTA: La razón para realizar este ensayo es comparar la viabilidad celular entre EYFP-CENP-A WT y K124R mutante después de la interrupción del alelo CENP-A-/F por Cre recombinase (después de la sustitución de la proteína celular total CENP-A).

  1. Transfección de retrovirus de construcciones pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Realice la transfección de retrovirus de las células CENP-A-/F RPE-1 como se describe en la sección 1. Células de cultivo en DMEM: F12 medio con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina durante 72 h después de la infección por el virus.
    2. Tres días después de la infección por retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A (el día 6), agregue blasticidin S (10 g/ml) en pozos que contengan células trans infectadas que se utilizarán para ensayos de crecimiento de colonias y experimentos de control. Las células se cultivan al menos 14 días después de la infección por virus en presencia de blasticidina S. Cambiar el medio que contiene blasticidina S cada 5 días.
      NOTA: Si las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia antes de la siembra para el ensayo de colonia (3.2.7. y 3.2.8), asegue las células a la proporción 1:2 y 1:5 por trippsinización y chapado en una placa de cultivo de 6 pozos.
    3. Recoger células para la mancha occidental en el día 7 para confirmar la expresión proteica de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A sin infección de Cre. Realice el análisis de manchas occidentales como se describe en la sección 4. Los resultados se muestran en la Figura 1B (carriles 1-4).
    4. Para el ensayo de crecimiento de colonias con infección por el virus Cre, mantenga las células creciendo durante 14 días después de la infección por el virus en presencia de blasticidina S (es decir, células de crecimiento en blasticidina S que contiene medio hasta el día 17 para los resultados presentados aquí).
  2. Infección por el virus Retro-Cre de pBabe-puro-Cre
    NOTA: El día 0 en el paso 3.2.1 corresponde al día 13 de la sección 3.1.
    1. Día 0 al Día 3: Realizar la transfección de retrovirus de las células CENP-A-/F RPE-1 utilizando pBabe-puro-Cre (B3027) como plásmido de expresión (ver sección 1 para más detalles). Asegúrese de que blasticidin S (10 g/ml) se añade en el medio de cultivo.
    2. Día 4: Pruebe las células para separarlas de la placa. Placa 500 o 5.000 células en triplicado en la placa de cultivo de 6 pozos. Células de cultivo en DMEM: F12 medio con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
    3. Día 5: Añadir blasticidina S (10 g/ml) al medio de cultivo. Durante 5.000 o 500 células' de chapado, seleccione celdas con blasticidina S (10 g/ml) 3-24 días (hasta el día 14 en [3.2.7]) o 3-28 días (hasta el día 18 en [3.2.8]) después de la infección por virus de construcciones (pBabe-EYFP-CENP-A construct).
      NOTA: En este ensayo de crecimiento de colonia, se añade la transfección de pBabe-puro-Cre junto con la transfección de pBabe-EYFP-CENP-A. La transfección de pBabe-EYFP-CENP-A se realiza en 3.1. La transfección de pBabe-puro-Cre se realiza en 3.2.1.
    4. Día 10 (7 días después de la infección por el virus retro-Cre): Recoger células para el análisis de hinchazón occidental para confirmar el agotamiento de proteínas de CENP-A endógeno después de la infección por el virus retro-Cre y/o la expresión proteica de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A en el mismo día 10.
    5. Realice la hinchazón occidental como se describe en la sección 4 en el mismo día 10. Los resultados se muestran en la Figura 1B (carriles 5-7).
    6. Realizar análisis de inmunofluorescencia (sección 2 anterior) para confirmar que EYFP-CENP-A WT y K124R localizados al centromere 7 días después de la inactivación del alelo CENP-A endógeno restante. Los resultados se muestran en la Figura 1C-1E.
    7. Día 14: Realizar el ensayo de crecimiento de la colonia con la placa sembrada con 5.000 células. Fijar células durante 10 minutos en metanol y manchar durante 10 minutos en una solución violeta cristalina (2,3% violeta cristalino, 0,1% oxalato de amonio, 20% etanol (ver Figura 2B). Cuente el número de colonias utilizando el software OpenCFU (consulte la figura 2C).
    8. Día 18: Utilice la placa sembrada con 500 células. Corrija y manche las celdas como se describe en el paso 3.2.7 (consulte la figura 2B). Cuente el número de colonias (véase la figura 2C).

4. Análisis de manchas occidentales utilizando pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: Consulte el método13 descrito anteriormente para el análisis de manchas occidentales utilizando anticuerpos indicados en la Figura 1B y la Figura 2A y tabla de materiales para proteínas EYFP-CENP-A.

  1. Aísle las proteínas mediante el análisis de las células cultivadas con diferentes infecciones por el virus. A continuación, utilice 20 g de proteína en un recipiente de GEL SDS PAGE. Transfiera las proteínas a una membrana PVDF como se describió anteriormente13.
  2. Lavar la membrana 3x después de las incubaciones con anticuerpos primario-secundarios. Detectar y analizar las bandas de proteínas en la membrana con el sistema de imágenes infrarrojas y/o el generador de imágenes quimiuminescencia para la detección de inmunoblots. Estos resultados se muestran en la Figura 1B y la Figura 2A.
    1. Para que el sistema de imágenes infrarrojas detecte y analice las bandas de proteínas, consulte el paso 4.2.1 en Archivos de codificación suplementarios.
    2. Utilice el imager de quimiuminescencia para detectar y analizar las bandas de proteínas, consulte el paso 4.2.2 en Archivos de codificación suplementarios. Para este sistema, utilice un sustrato quimioilumíncent (ECL) mejorado ultrasensible(Tabla de Materiales).
    3. Opcionalmente, utilice el tampón de desmontaje de manchas occidentales para eliminar los anticuerpos pre-incubados de la membrana PVDF y reblot con diferentes anticuerpos para el siguiente giro del análisis occidental. Determinar empíricamente el tiempo de incubación optimizado y la temperatura a utilizar.

5. Cultivo celular, transfección y ensayos de ubicuidad in vivo utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A

NOTA: El nivel proteico de EYFP-CENP-A expresado a partir del vector pQCXIP es 10 veces mayor que el nivel de proteína CENP-A endógeno. El uso de este vector facilita la inmunoprecipitación de una mayor cantidad de proteínas EYFP-CENP-A, la observación de las bandas de ubicuilación de la proteína EYFP-CENP-A, y la identificación de la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP a través del análisis de espectrometría de masas.

  1. Transfección para ensayos de ubicuidad in vivo utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Semilla 36,2 x 105 células CENP-A-/F RPE-1 en un plato de cultivo de tejido de 10 cm. Células de cultivo en DMEM de alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, determine empíricamente la densidad celular que se utilizará en la siembra. Preparar al menos 2 platos para una muestra de inmunoprecipitación (IP) para obtener un mínimo de 1 mg de proteína total.
    2. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 18 h.
    3. A las 17 h después de la siembra, prepare los reactivos de transfección.
    4. Haga la solución A mezclando 6,7 g de plásmido de cada pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabla 1) en 335 l de medio suero reducido, y incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 6,7 g de plásmido de pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) a todas las muestras.
      NOTA: Todos los vectores se enumeran en la Tabla 1.
    5. Haga la solución B mezclando 10,1 ml de los reactivos de transfección I y II, respectivamente, en un medio sérico reducido de 335 l, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Un paso opcional consiste en añadir sólo un reactivo de transfección de 40,2 l III (polietilenimina [PEI]; 1,0 mg/ml) en la solución B o añadir un reactivo de transfección III de 40,2 l además de los reactivos de transfección I y II en la solución B(Tabla de materiales).
    6. Mezclar las soluciones A y B juntas, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    7. Después de lavar las células cultivadas una vez con PBS, agregue la mezcla de las soluciones A y B (es decir, el complejo DNA-lipid) directamente a cada uno de los 10 cm individuales de la placa de cultivo de tejido que tiene 3,35 ml de medio sérico reducido.
      NOTA: La concentración final es de 1,67 g/ml de plásmido.
    8. Incubar las células a 37oC con 5% deCO2 durante 4,5 h. Después de 4.5 h, cambiar el DMEM de media a alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
    9. Cultivo de las células a 37 oC con 5% deCO2 durante 48 h después de la transfección. Recoger las células para la preparación de los lysates celulares.
  2. Preparación de las cuentas de proteína A unidas con anticuerpos anti-GFP.
    1. Tomar 25 l (50% v/v) de las cuentas de proteína A para una reacción de inmunoprecipitación (IP). Lavar con tampón A1 (Tabla de Materiales) al menos 3x para eliminar EtOH, y hacer una solución del 50% con buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% desoxicolato; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; reagente de inhibidor de proteasa completo libre de EDTA).
    2. Añadir 2,0 l de anticuerpo anti-GFP (Anti-76: Anticuerpo casero) a las cuentas preparadas anteriormente y añadir un volumen de 10x de buffer A1 en comparación con el volumen de perlas netas.
    3. Realice la rotación de extremo a extremo a 4 oC durante 4-18 h. La longitud de tiempo óptima para la rotación de extremo a extremo debe determinarse empíricamente en función de la eficiencia de la inmunoprecipitación.
    4. Centrifugar las perlas a 100 x g durante 1 min y retire el sobrenadante sin ataduras. Agregue el búfer A1 para volver a crear una solución del 50% (v/v) de los cordones. Utilice 25 l (50% v/v) de esta solución para una reacción de IP.
  3. Inmunoprecipitación (IP) utilizando perlas de sepharose de proteína A unidas con anticuerpos anti-GFP.
    1. Células de lyse obtenidas en el paso 5.1.9 en el buffer A1 por sonicación y proceso de congelación y descongelación.
    2. Mida las concentraciones de proteínas y normalice las cantidades de proteínas entre las diferentes muestras de IP. Retire el 5% de la muestra de cada tubo para que se ejecute como muestra de entrada del 5% en SDS-PAGE.
      NOTA: La muestra de entrada del 5% se puede congelar en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 oC, si no se carga en un día.
    3. Mezclar el resto del 95% de izado con 25 ml (50% v/v) de las cuentas de proteína A unidas a anticuerpos anti-GFP que se prepararon en el paso 5.2. Realice la rotación de extremo a extremo a 4 oC durante 4-18 h.
      NOTA: La longitud de tiempo óptima para la rotación de extremo a extremo debe determinarse empíricamente.
    4. Proteína centrífuga A cuentas con la proteína unida a ella (es decir, inmunoprecipitaciones) con 100 x g durante 1 min, y eliminar el sobrenadante. Lavar los inmunoprecipitados con tampón A1 centrifugando a 100 x g durante 1 min. Realice este paso 4x.
    5. Mezclar el 5% de entrada y el resto de 95% inmunoprecipitados con 2x y 4x SDS-PAGE buffer de carga14, respectivamente. Hervir estas dos muestras durante 5 minutos y luego cargarlas en un gel SDS-poliacrilamida desnaturalidad del 10,0% para electroforesis en diferentes carriles. Utilice gel SDS-PAGE más grande (por ejemplo, 17 cm x 15 cm) para la electroforesis. Si las muestras se ejecutan en gel más pequeño, es posible que no sea posible observar bandas de ubicuidad claras/nítidas.
    6. Realizar análisis de manchas occidentales como se describe en la sección 4 utilizando los anticuerpos indicados en el informe anterior8. El resultado se muestra en la Figura 2A.
    7. Utilice el tampón de desmontaje de manchas occidentales para eliminar los anticuerpos pre-incubados de la membrana PVDF y reblot con diferentes anticuerpos para la siguiente ronda de análisis de manchas occidentales.

6. Espectrometría de masas para identificar el sitio de ubicuidad del mutante EYFP-CENP-A K124R

  1. Transfección para el análisis de espectrometría de masas utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Semilla CENP-A-/F células RPE-1 en una placa de cultivo de tejido de 10 cm. Compruebe que la densidad celular es de 36,2 x 105 celdas por plato. Células de cultivo en DMEM de alta glucosa con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina. Preparar al menos 20 platos para una muestra de inmunoprecipitación (IP) para obtener al menos 10 mg de proteína total (ver 5.3).
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, determine empíricamente la densidad de celdas que se utilizará en la siembra.
    2. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% de CO2 durante 18 h. Preparar los reactivos de transfección a 23 h después de la propagación (punto de 24 h es 0 h punto de la transfección).
    3. A las 17 h después de la siembra, prepare los reactivos de transfección y las células transfectas como (4.1.3). Las células trans infectadas tienen pCGN-HA-Ubiquitina (B2806) y pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Incubar las células a 37oC en una atmósfera del 5% deCO2 durante 48 h después de la transfección. Recoger celdas para los lysates celulares.
    5. Lyse cells in buffer A1 and perform immunoprecipitation as (5.2) and (5.3). Ejecute estos dos de los lysatos de inmunoprecipitación como sigue (6.1.6) y (6.1.7).
      NOTA: En (6.1.6), ejecute la muestra en geles estándar de trisglicina. En (6.1.7), ejecute la muestra en los geles proteicos Bis-Tris disponibles comercialmente 4%-12%. Véase también Discusión.
    6. Conservar una muestra del 10% del total de inmunoprecipitantes para confirmar la ubicuidad EYFP-CENP-A y determinar con precisión la posición de EYFP-CENP-A ubiquitinado como se describe en la sección 5. Ejecute esta muestra en geles estándar de trislicecina. SDS-PAGE y western blot se realizaron como (5.3).
    7. Conservar otra muestra para el 90% del total de inmunoprecipitantes para el análisis de espectrometría de masas. Ejecute esta muestra dentro de dos pozos de los geles proteicos Bis-Tris disponibles comercialmente 4%-12%. Realice la tinción azul de Coomassie con la solución azul Coomassie. Consumo y corte la región de gel de 50-70 kDa (región putativa mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R). Utilice esta región de gel para el análisis de espectrometría de masas.
  2. Análisis de espectrometría de masas utilizando digestión en gel.
    1. En dados cada rebanada de gel de interés en trozos pequeños (1 mm2) y colóquelo en 0,5 ml de tubos de baja unión proteica.
    2. Lavar con acetonitrilo de 100 l 50% (v/v) en 25 mM NH4HCO3, vórtice 10-15 min, girar hacia abajo, desechar el sobrenadante, repetir 3x.
    3. Concentrar la muestra utilizando el concentrador de vacío de sobremesa durante 30 minutos para secar las piezas de gel.
    4. Añadir 10 l de 10 ng/l de grado de secuenciación de la trippsina y dejar que las piezas de gel se rehidraten durante 5 min.
    5. Añadir 25 mM NH4HCO3 lo suficiente para cubrir las piezas de gel, digerir a 37 oC durante la noche.
    6. Transfiera el sobrenadante digerido en un tubo limpio de 0,65 ml siliconizado. Añadir 50% (v/v) acetonitrilo/5% (v/v) ácido fórmico (30 oL suficiente para cubrir), vórtice 10 min, girar y transferir en el mismo tubo de extracción. Repita 3x.
    7. Añadir acetonitrilo de 10 l a las piezas de gel, vórtice 5 min, y girar hacia abajo. Transfiera el sobrenadante al mismo tubo.
    8. Concentrar las muestras utilizando el concentrador de vacío de sobremesa a 2 l, añadir 8 l 3% (v/v) acetonitrilo /2% (v/v) ácido fórmico a la muestra, vórtice durante 15 minutos y girar hacia abajo a 16.000 x g durante 30 min. Las muestras están listas para el análisis de espectrometría de masas.
    9. Realizar la adquisición de datos MS con LC-MS/MS utilizando un sistema de cromatografía líquida (Tabla de materiales) junto con un instrumento de espectrometría demasas( Tabla de materiales ).
    10. Inyectar 8 ml de muestra reconstituida en una columna de cromatografía líquida en fase inversa (RPLC).
    11. Separe los péptidos con un gradiente de 2-80% del disolvente B en 60 min. Asegúrese de que el gradiente consiste en un porcentaje creciente de disolvente B del 2% al 22% en 40 min, de 22% a 35% de disolvente B en 12 min, luego subiendo al 80% del disolvente B en 4 min, y finalmente manteniendo en 80% disolvente B durante los últimos 4 min. Ajuste la constante del caudal a 300 nL/min.
      NOTA: El disolvente A contiene 0,1% de ácido fórmico y 2% de acetonitrilo, el disolvente B contiene 0,1% de ácido fórmico y 98% de acetonitrilo. Todas las concentraciones se muestran como volumen/volumen.
    12. Recopile datos de espectrometría de masas utilizando el modo de adquisición dependiente de datos. En resumen, recoja los espectros de MS en 350–1500 m/z para 250 ms. Seleccione los 50 mejores precursores intensos con carga 2-5 para una mayor fragmentación. Recoger espectros MS/MS en 100–2000 m/z para 100 ms, Excluir iones precursores de la reelección durante 15 s.
    13. Para la búsqueda de bases dedatos, abra el software comercial (consulte Tabla de materiales ) para analizar los datos de espectrometría de masas en el escritorio.
    14. Para realizar una nueva búsqueda, haga clic en el botón "LC"en el menú superior. A continuación, haga clic en el botón "Agregar" para cargar los archivos de datos sin procesar de MS originales.
    15. Seleccione "Human Protein ID" en el " MétodoParagon" como método de búsqueda de base de datos. Busque los archivos de datos sin procesar de MS originales en la base de datos UniProt Homo Sapiens (que contiene 160.566 secuencias, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Establezca los parámetros de búsqueda como los siguientes: seleccione la trippsina como la enzima de digestión, permita hasta 3 escotes faltantes, 4 modificaciones y 2-5 cargas por péptido. Establezca un error de masa de hasta 20 ppm para la primera búsqueda y 0,02 Da para iones fragmentados. Especifique umbrales de tasa de detección falsa (FDR) para sitios de proteínas, péptidos y modificaciones inferiores al 1%. Establezca todos los demás parámetros del software en valores predeterminados (consulte la figura 3 para el análisis de espectrometría de masas).
    17. Haga clic en el botón "Guardar como" a la derecha del menú superior, seleccione una carpeta para almacenar los resultados de búsqueda, introduzca el nombre de la búsqueda y haga clic en el botón "Guardar".
    18. Haga clic en el botón"Procesar"a la derecha del menú superior para iniciar la búsqueda. Una vez finalizada la búsqueda, los datos con el nombre de búsqueda introducido se almacenarán automáticamente en la carpeta seleccionada. Los datos pueden ser abiertos fácilmente por el Software F.
    19. Para obtener espectros de MS/MS de cualquier péptido específico, haga doble clic en los resultados de búsqueda para abrirlo por Software F. En primer lugar, haga clic en la proteína en la lista de proteínas en la parte superior del menú y, a continuación, haga clic en el péptido en el centro del menú. El MS/MS de este péptido se muestra en la parte inferior del menú.
    20. Para exportar y guardar espectros de MS/MS, haga clic con el botón derecho en los espectros de MS/MS en la parte inferior del menú, seleccione copiar y, a continuación, pegue en un archivo adecuado, como PPT o doc.

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Representative Results

El mutante EYFP-CENP-A K124 muestra ubiculación, interacción con HJURP y ningún defecto en la localización de centromere ni la letalidad celular. Aquí se re-constituyó el sistema reportado por Fachinetti et al. (2017)6: en células humanas diploides (RPE-1) que transportaban un interrumpido y un ''floxed'' CENP-A alelo (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A se expresó desde el vector retrovirus pBabe-EYFP. En este sistema, la expresión de CENP-A endógeno del alelo CENP-A-/F podría ser interrumpida por Cre recombinase6. Las construcciones genéticas de EYFP- CENP-A WT o mutante K124R (Figura 1A), que rescata la pérdida de CENP-A endógeno, se expresaron de forma estable cuando se realizó la integración retroviral. La expresión restante de CENP-A endógeno del alelo CENP-A-/F fue entonces interrumpida por Cre recombinase. La expresión de CENP-A endógeno no se detectó 7 días después de la inducción de Cre recombinase (Figura 1B, carriles 5-7). Se encontró que tanto la expresión de proteínas EYFP-CENP-A WT como la expresión de proteínas K124R estaban en un nivel similar al nivel de proteína CENP-A endógeno inicial(Figura 1B, carriles 3, 4, 6 y 7). Tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron localización de centromere a los 7 días después de la interrupción de la expresión restante de CENP-A endógeno del aleloCENP-A-/F (Figura 1C-1E). CENP-A Tanto EYFP-CENP-A WT como el mutante K124R mostraron ubiquitylation e interacción con HJURP a diferencia del caso de FLAG-tagged o untagged CENP-A WT y el mutante K124R (Figura 2A; datos no mostrados para Flag-tagged o untagged CENP-A)8. La viabilidad celular también se solucionó realizando el ensayo de crecimiento de la colonia 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante (Figura 2B). Tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron un número similar de colonias ''rescatadas'' 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante (Figura 2B y 2C). Por lo tanto, nuestros resultados están en línea con los reportados por Fachinetti et al.6.

La ubiquitirlación a lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R fue revelada por el análisis de espectrometría de masas. Se encontró que tanto EYFP-CENP-A WT como el mutante K124R muestran ubiculación e interacción con HJURP a diferencia del caso de CENP-A WT con etiqueta con bandera o sin etiquetar y el mutante K124R (Figura 2A; datos no mostrados para CENP-A con etiqueta de bandera o sin etiquetar)8. Estos resultados sugieren que la fusión de la proteína EYFP induce la ubiculación en una lisina distinta de la K124 en el mutante EYFP-CENP-A K124R, y esta ubiculación en otro sitio promueve la interacción de EYFP-CENP-A K124R con HJURP. La ubiquitirlación a lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R se reveló en célulasCENP-A-/F mediante el análisis de espectrometría de masas IP(Figura 3A y Figura 3B). La lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la fusión de proteína de gran tamaño (por ejemplo, etiquetado EYFP) induce la ubiculación en una lisina distinta de K124 en CENP-A, y esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo único original K124R.

Figure 1
Figura 1: EYFP-CENP-A K124 mutante se localiza en los centromeres. (A) Representaciones de las diferentes construcciones de proteína CENP-A etiquetadas con EYFP (proteína fluorescente amarilla mejorada) en la terminal N. Las letras rojas marcan la posición de la sustitución de aminoácidos K124R en la construcción indicada (izquierda). Se muestran los resultados de los ensayos realizados en este estudio (derecha). (B) El análisis de la mancha occidental no mostró la presencia de CENP-A endógeno detectable. Análisis de inmunoblots para comprobar la presencia de la expresión de las construcciones de rescate indicadas (ca. 45 kDa) antes y después de la infección por Cre. La expresión proteica de las construcciones pBabe-EYFP se confirmó antes de la infección de Cre (carriles 1-4), así como después de la infección de Cre (carriles 5-6). La ausencia de la proteína CENP-A endógena (ca. 15 kDa) se confirmó en las líneas celulares CENP-A-/- recogidas a los 7 días después de la infección por Cre (carriles 5-6). La proteína GAPDH se utilizó como control de carga. (C) EYFP-CENP-A K124 mutante localiza en los centromeres. Las célulasCENP-A -/F RPE-1 fueron cotransfectadas con construcciones indicadas, cultivadas 7 días después de la infección por el virus retro-Cre e inmunosuradas. Visualización de DAPI (azul), EYFP (verde) y CENP-B endógeno (rojo), que sirvió como control de ubicación centromere. Barra de escala, 10 m. (D) Los patrones de localización que se muestran en (C) se resumen como histogramas. Se contaron más de 200 células interfásicas con señales EYFP positivas por experimento (n x 3 experimentos), y se muestran los porcentajes medios (-SD). ''Otros (No-centromere)'' representa en su mayoría células dañadas, células muertas o células con localización nucleolar en interfases, que se observaron debido a la transfección u otros tratamientos. No se observó ninguna diferencia significativa (n.s.) en K124R en comparación con WT (Prueba t del estudiante). (E) Se cuantificaron las señales derivadas de EYFP en los centromeres mostrados en (C). Las señales se normalizaron a las de WT, y se muestran los porcentajes medios (-SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El mutante EYFP-CENP-A K124 es ubicuidad e interactúa con HJURP, y la viabilidad celular no se vio afectada por la mutación K124R de EYFP-CENP-A. (A) El mutante EYFP-CENP-A K124 está ubiculo e interactúa con HJURP. Ensayo de ubicuidad in vivo. Las célulasCENP-A -/F RPE-1 fueron transfectadas con las construcciones indicadas. Las proteínas en el 5% de los analios celulares totales (Entrada) e inmunoprecipitados (IP) que utilizan anticuerpos policlonales de conejo anti-GFP fueron detectadas por análisis de manchas occidentales utilizando los anticuerpos indicados. Se indican la colocación di-Ub-EYFP-CENP-A (**) y la putativa mono-Ub-EYFP-CENP-A (*). Esta figura ha sido modificada de Niikura et al.8. (B) Las imágenes representativas del ensayo de crecimiento de la colonia, tal como se muestra en el esquema (superior) de dos condiciones diferentes ([1] y [2]) para los transfectantes indicados de EYFP-CENP-A. (C) Histogramas que resumen la supervivencia de colonias de los experimentos en (B). Los porcentajes medios de más de 3 experimentos independientes (n n x 3) se normalizan con el porcentaje de colonias supervivientes en EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0.0001 y **p < 0.01 en comparación con el control EYFP (prueba t del estudiante). No se observó ninguna diferencia significativa (n.s.) en K124R en comparación con WT (Prueba t del estudiante). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Se detectaron fragmentos de péptidos EYFP-CENP-A K124R ubiquitidos mediante el análisis de espectrometría de masas. (A) Evidencia de ubiculación en lisina 306 (K306) de células EYFP-CENP-A K124R en células RPE-1 CENP-A-/F. La lisina 306 (K306) de EYFP-CENP-A K124R corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A. El péptido LQKLRGGSTHLLIR (cobertura 95,9%, confianza 87,8%) identificado por el análisis de disociación inducido por colisión. Los valores m/z (Da) de los iones b (verde) e y (rojo) en los espectros de (A) detectados durante la fragmentación se resaltan con verde en la tabla de (B). La ubicuidad de K306 se confirma por el motivo LRGG (escote incompleto) del ion b-3 (m/z 753.4730) y y-8 ion (m/z 1350.8328). (B) La tabla resalta los valores m/z (Da) de los iones b (verde) e y (rojo) en los espectros de (A). LQK[Umc]STHLLIR en la tabla de (B) indica el péptido LQKLRGGSTHLLIR mostrado en (A). Estas cifras han sido modificadas de Niikura et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Número B Características pertinentes Referencia Fuente
B3027 pBabe-puro-Cre Niikura et al., 2019 Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner
B3182 pBabe-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3161 pBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3164 pBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3031 psPAX2 Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
D3032 pMD2.g Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
B3189 Pgp Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japón)
B3190 pCI-VSVG Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japón)
B3001 pPAM Niikura et al., 2019 -
B3252 pQCXIP-EYFP Niikura et al., 2019 -
B3254 pQCXIP-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 -
B3256 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 -
B2806 pCGN-HA-Ubiquitin Niikura et al., 2019 -

Tabla 1: Vectores de Plásmido utilizados en este estudio.

Número B Vectores de plásmido de ayudante/envasado Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3
B3031 psPAX2 (vector de mordaza/pol de lentiviral) 2 g
D3032 pMD2.g (vector env lentiviral) 2 g
B3189 pGP (vector retroviral gag/pol) 2 g
B3190 pCI-VSVG (vector env retroviral) 2 g
B3001 pPAM (codificación vectorial auxiliar amphotropic retroviral gag-pol-env) 2 g

Tabla 2: Combinaciones de vectores de plásmido auxiliar/envasado utilizados en (1.1.3): Transfección de retrovirus de construcciones pBabe-EYFP-CENP-A.

Archivos de codificación suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos archivos.

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Discussion

Aquí describimos métodos de análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. En nuestros resultados, identificamos con éxito la ubiculación en lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A a través del análisis de espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas descrito aquí es un método de imitación ya que anteriormente identificamos el sitio de ubicuidad 124 (K124) de CENP-A WT-Flag12. Por lo tanto, este método se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. El análisis de espectrometría de masas basado en LC-MS/MS se acepta comúnmente para identificar posibles modificaciones posttranslacionales (PTM) de un amplio espectro de proteínas. Nuestros métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis (es decir, ensayo de ubicuidad in vivo, ensayo de crecimiento de colonias y análisis de espectrometría de masas) podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar roles funcionales de ubicuidad(es) de sus proteínas diana.

Sin embargo, este protocolo no cubre la detección de bandas ubiquitidas y/o la identificación de la ubiculación específica del sitio de estas proteínas en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular. Estos años los enfoques optogenéticos se desarrollan dramáticamente y dan un alto impacto en los estudios cuantitativos de los sistemas de señalización celular. Optogenetics ha proporcionado originalmente enfoques que activan o inhiben con precisión neuronas individuales utilizando sistemas basados en operaciones microbianas de un solo componente. Actualmente, la actividad proteica con una precisión espaciotemporal sin precedentes se puede controlar explotando fotorreceptores naturales codificados genéticamente, y varias herramientas codificadas genéticamente permiten el control de la luz de muchos procesos biológicos, incluida la fosforilación de proteínas15. Por lo tanto, la optogenética es un sistema prometedor para investigar la señalización de la proteína quinasa espaciotemporal a nivel celular y de todo el organismo. El número de quinasas proteicas controladas por la luz se está expandiendo rápidamente, aunque el número actual sigue siendo limitado. Sin embargo, el desarrollo de la ubiculación de proteínas controladas por la luz se retrasa, y el etiquetado de alto peso molecular de los fotorreceptores puede alterar la ubicuidad de las proteínas WT y mutantes y alterar funcionalmente la función proteica nativa como se ha indicado anteriormente. Por lo tanto, el desarrollo de una técnica de etiquetado o sondeo de menor peso molecular es urgente para visualizar la ubiculación y/o investigar la señalización de la ubiquitylación de proteínas espaciotemporales en el celular vivo y a los niveles de todo el organismo.

En el presente estudio, el control de vectores EYFP es esencial para los ensayos y análisis de control (análisis de inmunofluorescencia, ensayo de crecimiento de colonias y ensayo de ubicuidad in vivo) para discutir el resultado del análisis de espectrometría de masas importante correctamente. La interacción no específica con la proteína EYFP se observa a menudo en el experimento de inmunoprecipitación, por lo que el control vectorial EYFP es indispensable para evaluar la verdadera interacción de las proteínas fusionadas con EYFP. Nuestro análisis de espectrometría de masas utilizando EYFP-CENP-A K124R expresado en las células RPE-1CENP-A -/F no mostró ubiculación en sitios de lisina en la secuencia de polipéptidos EYFP. Sin embargo, en otras condiciones desconocidas, cabía esperar que el sitio de lisina en la secuencia de polipéptidos EYFP esté ubiculo en EYFP- y/u otra proteína de fusión etiquetada de alto peso molecular.

Para los ensayos de crecimiento de colonias, se recomienda recolectar células para el análisis de manchas occidentales para confirmar el agotamiento de proteínas de CENP-A endógeno después de la infección por el virus retro-Cre y la expresión proteica de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A. De esta manera, podemos juzgar si el fenotipo de crecimiento de la colonia se debe realmente a la única expresión de CENP-A WT o mutantes exógenos. Para cualquier análisis de manchas occidentales, si se realiza stripping para reblot la membrana con diferentes anticuerpos para el siguiente giro del análisis de manchas occidentales, se debe utilizar el mismo sistema de detección cuantitativa que la mancha de un giro anterior para la mancha del siguiente giro con diferentes anticuerpos. Uno debe asegurarse de que las bandas en la mancha del giro anterior son indetectables en la región de apuntada de la membrana en la mancha del siguiente turno con diferentes anticuerpos. O utilice el mismo sistema de detección cuantitativa que la mancha del giro anterior y compruebe si la incubación con el mero anticuerpo secundario utilizado en la mancha del giro anterior no conduce a la detección de bandas de proteínas antes de iniciar la mancha del siguiente giro con diferentes anticuerpos. Para el ensayo de ubicuidad in vivo, es importante ejecutar gel SDS-PAGE más grande utilizando el aparato para ejecutar gel SDS-PAGE más grande (gel de electroforesis de gel I o II). Empíricamente, el gel SDS-PAGE más grande separaría las bandas de proteínas claramente y mejoraría la sensibilidad de la detección de las bandas débiles que podrían haber sido mal detectadas en el gel más pequeño (es decir, las bandas de proteínas parecen más nítidas en gel más grande).

Es extremadamente importante elegir el gel SDS-PAGE adecuado para mapear las modificaciones post-traduccionales (TPM) de una proteína específica completa LC-MS/MS. El sistema de gel más utilizado para SDS-PAGE es el sistema Laemmli, que utiliza geles de tris-glicina que comprenden un componente de gel de apilamiento y el componente de gel de resolución. En este sistema clásico, el pH y la resistencia iónica de los tampones utilizados en el gel de apilamiento (Tris, pH 6.8) y el gel de resolución (Tris, pH 8.8) son diferentes del tampón utilizado para ejecutar el gel (Tris, pH 8.3). La distorsión de banda, la pérdida de resolución o las bandas de artefactos pueden ser causadas por el pH de funcionamiento altamente alcalino del sistema Laemmli. En el informe anterior se describieron las principales causas de mala resolución de la banda con el sistema Laemmli16, incluida la inestabilidad y el corto período de expiración del gel de resolución debido a la hidrólisis de poliacrilamida a pH alto, alteraciones químicas de las proteínas de la muestra, reoxidación de disulfuros reducidos de residuos de cisteína de proteínas y escisión de los enlaces Asp-Pro de proteínas con calentamiento a 95-100 oC en el tampón de la muestra de Laemmli a pH 5.2. Los geles proteicos Bis-Tris disponibles comercialmente al 4%-12% son bis-tris HCI-buffered (pH 6.4) y operados a pH aprox. 7.0 a diferencia de los geles tradicionales de tris-glicina16. Los numerosos méritos comparados con el sistema Laemmli son generados por el pH de funcionamiento neutro de los sistemas Bis-Tris16,incluyendo alta estabilidad y largo período de expiración del gel de resolución, mayor estabilidad de la proteína de muestra durante la electroforesis a pH neutro que conduce a una resolución de banda más nítida y resultados precisos, y la reducción completa de disulfuros y ausencia de escisión de enlaces Asp-Pro. En este informe, podríamos mapear con éxito las PTM de la proteína EYFP-CENP-A K124R (Figura 3) utilizando los geles de proteína Bis-Tris disponibles comercialmente. Por lo tanto, los geles de proteína Bis-Tris disponibles comercialmente 4%-12% son altamente recomendables para su uso para este propósito.

Para mapear las modificaciones post-traduccionales (TCM) de una proteína específica, se utiliza ampliamente la digestión en gel de la proteína diana junto con LC-MS/MS. En este estudio, buscamos identificar sitios de ubiquitinación EYFP-CENP-A K124R utilizando la estrategia de purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS). Por lo tanto, el primer paso clave es obtener una gran cantidad de células sobreexpresantes EYFP-CENP-A K124R ubiquitinadas con alta pureza utilizando inmunoprecipitación de células sobreexpresantes EYFP-CENP-A K124R, lo que podría facilitar en gran medida la identificación y confirmación de sitios de ubicutinación de EYFP-CENP-A K124R por LC-MS/MS. Para reducir la interferencia de la proteína EYFP-CENP-A K124R no ubiquitinada, Se realizaron manchas occidentales de tinción azul anti-GFP, anti-HA (Ub), anti-Ubiquitina (ver sección [6.1.6]) y Coomassie (ver sección [6.1.7]) para determinar con precisión la posición de EYFP-CENP-A K124R ubiquitinado en gel SDS-PAGE. Por último, sólo se extirpó un área minimizada de banda de gel que contiene EYFP-CENP-A K124R ubiquitinado para la digestión en gel junto con LC-MS/MS para obtener resultados optimizados. Cuando los péptidos secos se reconstituyen antes de operar LC-MS/MS, se utilizó ácido fórmico de acetonitrilo del 3% (v/v) para ayudar a una mejor solubilidad y tasa de recuperación de péptidos. A veces, la búsqueda de la base de datos podría dar lugar a TTM que realmente no existe debido al algoritmo de asignación aproximada del motor de búsqueda. Por lo tanto, otro paso crítico es confirmar los sitios de ubicuidad EYFP-CENP-A K124R mediante la revisión manual de MS/MS de péptidos ubiquitinados con ayuda de Software F(Tabla de Materiales),lo que podría eliminar los sitios de ubicutinación "irreales" introducidos por la asignación aproximada por la búsqueda de bases de datos. En resumen, esta estrategia AP-MS ha establecido un gasoducto eficiente y robusto para la identificación de sitios de ubicutinación EYFP-CENP-A K124R con significado biológico crucial. Más importante aún, esta tubería también podría ampliarse ampliamente para investigar los PTM de varias proteínas funcionales.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses en competencia.

Acknowledgments

Agradecemos a Chao-Jun Li en el Model Animal Research Center de la Universidad de Nanjing por el análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa y a los investigadores actuales del Model Animal Research Center, Nanjing University y Greehey Children's Cancer Research Institute por su útil discusión, orientación experimental y reactivos. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago y Dawn S. Chandler por sus generosos dones de reactivos. Y.N. con el apoyo fue apoyado por el Fondo de Construcción de la Provincia de Jiangsu ''Doble- Primera Clase'', Fondo de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (SBK2019021248), Fondo deSeis Picos de Talento Grande de la Provincia de Jiangsu (TD-SWYY-001), Fondo "Programa de Expertos Cien Talentos" de la Provincia de Jiangsu (SBK2019010048) y National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudio fue apoyado en parte por la subvención NCI R21 CA205659.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

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References

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Tags

Biología Número 160 centromere kinetochore mitosis CENP-A modificación post-traduccional PTM ubiculación análisis de espectrometría de masas
Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)
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Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

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