Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-A في كل مكان هو شرط مهم ل CENP-A ترسب في السنترومير، ورثت من خلال تخمير بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية. هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A) البروتين.

Abstract

دراسة بنية وديناميكيات الكينتوتشورات و centromeres مهم في فهم عدم استقرار الكروموسومات (CIN) وتطور السرطان. إن كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) والمشاركة في الفصل الدقيق للكروموسومات هو سؤال أساسي. ويقترح أن يكون مؤشر الحمض النووي غير (علامة وراثية) هوية سنترومير، وCENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في السنترومير، موروثة من خلال التمدن بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية.

هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن يتم حث في كل مكان في ليسين مختلفة بسبب وضع علامات EYFP في البروتين المتحول CENP-A K124R. تم تحديد Lysine 306 (K306) في كل مكان في EYFP-CENP-A K124R بنجاح، والذي يتوافق مع الlysine 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل القياس الطيفي الشامل. ويناقش التحذير في استخدام GFP / EYFP أو وضع علامات على ارتفاع الوزن الجزيئي البروتين كأداة لتحليل وظيفة البروتين. كما يناقش الحد التقني الحالي للكشف عن النطاقات في كل مكان، وتحديد كل مكان في كل مكان (ق) محددة، وتصور في كل مكان في الخلايا الحية أو خلية واحدة محددة خلال دورة الخلية بأكملها.

طريقة تحليل قياس الطيف الشامل المعروضة هنا يمكن تطبيقها على البروتين CENP-A البشري مع علامات مختلفة وغيرها من البروتينات centromere-kinetochore. ويمكن التوصية بهذه الطرق الجمعية التي تتكون من عدة مقايسات/تحليلات للباحثين المهتمين بتحديد الأدوار الوظيفية للدمج في كل مكان.

Introduction

في معظم eukaryotes ، يجب أن تلتصق ميكروتيبولس المغزل إلى منطقة واحدة من كل كروموسوم ، يطلق عليه السنترومير. الكينتوشور هو مجمع من البروتينات التي تقع في السنترومير. دراسة توقيت حركات البروتين السنتروميري و kinetochore وبنية kinetochores و centromeres مهم لفهم عدم الاستقرار الكروموسوم (CIN) وتطور السرطان. وتتمثل الأسئلة الرئيسية في كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) وكيفية مشاركتهم في الفصل الدقيق للكروموسومات. في معظم الأنواع، وجود نواة خاصة تحتوي على بروتين معين يشبه هيستون يسمى CENP-A يحدد هوية السنترومير. ولذلك، يُقترح أن يكون مؤشر CENP-A هو مؤشر غير الحمض النووي (علامة اللاجينية) لهوية الميرومير. من المهم توضيح آلية كيفية تعريف CENP-A لهوية السنترومير في البشر.

إن بروتين التعرف على تقاطع هوليداي (HJURP) هو شابرون CENP-A-محددة الذي يودع CENP-A في نوى 11،2،3. لقد سبق أن ذكرت أن مطلوب CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase لCENP-A في كل مكان على lysine 124 (K124) وتوطين centromere4. كما أن نتائجنا أظهرت أن التوظيف centromere من توليفها حديثا CENP-A يتطلب موجودة من قبل في كل مكان CENP-A5. وهكذا، تم تقديم نموذج يشير إلى أن CENP-A في كل مكان موروثة من خلال التملم بين الانقسامات الخلية.

وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها وتلك التي توصلنا إليها، فقد تم نشر النتائج السلبية المتعلقة بـ CENP-A وتوطينها في المنطقة الوسطى مؤخراً6. وادعى المقال أن CENP-A التعديلات على lysine 124 (K124) هي الاستغناء عن إنشاء، وصيانة، وظيفة طويلة الأجل من تينتروميرس الإنسان، استنادا إلى نتائجها السلبية تبين أن طفرة K124R لم تؤثر على CENP-A centrom توطين لا خلية قابلية البقاء6. ومع ذلك، هناك ما يكفي من النقاش في النتائج والاستنتاجات، وقد سبق أن وصفنا ما هي المشكلة التي يمكن أن تكون هناك في نشرتهم السابقة7. وينبغي إيلاء الاهتمام بأنهم تنصهر البروتينات مع CENP-A، التي لديها أوزان جزيئية أكبر بكثير من حجم CENP-A الذاتية: على سبيل المثال، تنصهر ~ 30 كيلو ادا المعزز البروتين الفلورسنت (EYFP) إلى ~ 16 كيلو ادا CENP-A وتحليل EYFP-CENP-A K124R البروتين الانصهار في نظامهم RPE-1CENP-A-/F خروج المغلوب. لا يتوقع أن يرتبط K124 ubiquitin مباشرة إلى HJURP استناداً إلى التنبؤات الهيكلية4، ومع ذلك ، من المتوقع أن يكون لإضافة أحادية ubiquitin تأثير على بروتين التشكل من CENP-A. يمكن تغيير بروتين CENP-A التشكل من خلال وجود بروتين انصهار كبير ، وهذا التغيير التشكلي قد يخفي التغيرات الهيكلية الناجمة عن فقدان في كل مكان. نقترح أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في lysine غير K124 في EYFP -CENP -A K124R متحولة وهذا في كل مكان في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة. دليل على أن يحدث في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين المتحول K124R CENP-A مع بروتين كبير (EYFP) تم الإبلاغ عنها في نشرتنا السابقة8. ووجد أن علامات EYFP تحفز في كل مكان من موقع ليسين آخر من EYFP -CENP-A K124R وأن EYFP-CENP-A K124R يربط متحولة HJURP. ونتيجة لذلك ، فإن هذا ubiquitylation في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R الأصلي نمط ظاهري متحولة واحدة ، وكلاهما EYFP - CENP - A WT وK124R المسوخ أظهرت تعريب centromere (استخدمنا وقارنا pBabe - EYFP - CENP - A WT و K124R متحولة ، جنبا إلى جنب مع pBabe - EYFP control.). وأظهرت النتائج أن العلم الموسومة أو غير الموسومة CENP- A K124R المسوخ قاتلة ولكن يمكن إنقاذها من قبل الانصهار monoubiquitin، مما يشير إلى أن CENP-A في كل مكان هو لا غنى عنه لقابلية الخلية.

في السنوات الأخيرة، وضعت العديد من الدراسات المقايسات المختلفة لتحديد التعديلات ما بعد التحويل (PTMs) من البروتين CENP-A والبروتينات المركزية-كينتوشور الأخرى سواء في الجسم الحي وفي المختبر9،10،11. مماثلة ل PTMs من بروتينات هيستون التي هي آلية رئيسية تنظم وظيفة الكروماتين، وتشارك أيضا PTMs من مكونات الكروماتين chromatin centromeric في آلية أساسية لتنظيم الهيكل العام ودالة centromeres. معظم مواقع CENP-A PTM محددة للنيات التي تحتوي على CENP-A، على الرغم من أن يتم حفظ عدد قليل منها في H3، مما يشير إلى أن تعديل هذه المخلفات تساهم في وظيفة centromere محددة. PTMs من CENP-A بما في ذلك الفسفر، أستيليشن، methylation، وفي كل مكان كانت قد ذكرت سابقا9، مما يشير إلى أن CENP-A يتعرض لمجموعة متنوعة من PTMs والمصفوفات الخاصة بهم الجمعي على الدلفين الأمينية وC-terminus هيستون أضعاف المجال. وقد كشفت عن أهمية CENP -A التعديلات في وظائف متعددة من قبل العديد من المجموعات بما في ذلك لنا. وتشمل هذه الوظائف CENP-A ترسب في centromeres، واستقرار البروتين، وتوظيف CCAN (الشبكة المرتبطة centromere التأسيسية)9. ومع ذلك، فإن الدراسات والنتائج المحدودة لـ CENP-A PTMs هي preformed حيث يتم إجراء مقارنات مع واحدة من النغمات الكنسية التي تنظم وظيفتها بشكل مباشر أو غير مباشر. كما أن التقارير التقنية التي تركز على منهجية تحديد هذه التدابير CENP-A PTMs محدودة أيضاً.

لأن CENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في12سنترومير ، ورثت من خلال dimerization بين انقسام الخلية5، ولا غنى عنه لقابلية الخلية8، فإن طريقة لتحديد CENP -A في كل مكان يكون من الضروري في المستقبل لدراسة النشاط الوظيفي ، وتحديد المواقع ، وهيكل من centromere. ولذلك، هنا نحن وصف تحليل الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن علامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. كما يتم عرض بروتوكولات من المقايسات وغيرها من التحليلات السيطرة (تحليل المناعةfluorescence، محك مستعمرة خارج نمو، وفي التحليل في كل مكان vivo) لمناقشة نتائج التحليل الرئيسي لقياس الطيف الشامل بشكل صحيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية وvirus retro transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد

ملاحظة: يتم التعبير عن EYFP-CENP-A من pBabe-EYFP-CENP-A على مستوى بروتين مماثل إلى CENP-A الذاتية. يتم استبدال مجموع البروتين الخلوي CENP-A مع هذا EYFP-CENP-A بعد تعطيل CENP-A-/F أليل بواسطة إعادة الكومبينيز Cre كما هو الحال في RPE-1 CENP-A-/- الخلايا6.

  1. إعداد من فوقي يحتوي على الفيروس الرجعي باستخدام خلايا التعبئة والتغليف 293T.
    1. اليوم 0: انتشار خلايا التعبئة والتغليف 293T على لوحة ثقافة 6-جيدا (1.0 × 106 خلايا / جيدا). الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 24 ساعة.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
    2. اليوم 1: إعداد رد فعل transfection حول 23 ساعة بعد انتشار (24 نقطة ساعة هو 0 نقطة ساعة من transfection). عبر العبارة بلازميد من كل pBabe-EYFP (B3182)، pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161)، وpBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (انظر الجدول 1).
    3. اختيار مزيج واحد من plasmids المساعد / التعبئة والتغليف المذكورة في الجدول 2 وإضافتها إلى أنابيب تحتوي على واحدة من plasmids المذكورة أعلاه. هناك في الغالب هذه 3 تركيبات للمساعد / التعبئة والتغليف plasmids(الجدول 2). عملت أي تركيبة في هذه التجارب وأظهرت كفاءة مماثلة transfection.
    4. إعداد 50 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض وخلط 2.0 ميكروغرام من كل pBabe-EYFP (B3182)، pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316 وpBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (انظر الجدول 1)إضافة مزيج واحد من plasmids المساعد /التعبئة والتغليف المذكورة في الجدول 2 (انظر أدناه). احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. هذا الخليط هو الحل A.
    5. إعداد 50 ميكرولتر آخر من متوسط المصل المخفض وخلط 1.5 ميكرولتر من الكواشف عبر I و II على التوالي (جدول المواد). احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. هذا الخليط هو الحل B.
      ملاحظة: اختياريا، إضافة فقط 6.0 ميكرولتر من كاشف transfection الثالث (البولي ايثيلينمين [PEI]؛ 1.0 ملغ / مل) في الحل B أو إضافة 6.0 ميكرولتر من الكثيف الثالث بالإضافة إلى الكواشف عبر الأول والثاني في الحل B(جدول المواد).
    6. مزيج الحلول A و B معا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    7. بعد غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة خليط من الحلول A وB (أي، الحمض النووي الدهون المعقدة) مباشرة إلى كل بئر من 6-بئر لوحة ثقافة التي لديها 500 ميكرولتر انخفاض مصل المتوسطة. التركيز النهائي للبقة هو 3.3 ميكروغرام / مل.
    8. بعد احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 4.5 ح، تغيير متوسطة إلى عالية الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. وضع 2 مل / جيدا من المتوسط الثقافة بعد تغيير المتوسطة في لوحة ثقافة 6-well.
    9. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 48 ح بعد transfection. أداء عدوى الفيروس الرجعي في اليوم 3 باستخدام supernatant التي تحتوي على الفيروس الرجعي.
  2. عدوى الفيروس الرجعي للخلايا المستهدفة CENP-A-/F RPE-1.
    1. اليوم 2: قبل يوم واحد من الإصابة، انتشار الخلايا المستهدفة CENP-A-/F RPE-1 إلى transfect في ثقافة 6-جيدا جيدا (2.25 × 105 الخلايا / جيدا). الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة(جدول المواد)مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين.
      ملاحظة: تنتشر الخلايا لم مقايسات مُنَتَجِمَة المستعمرة، وفلورة المناعة، وتحليل البقعة الغربية كتحكم. للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
    2. اليوم 3 (يوم العدوى من الفيروس): في 48 ساعة بعد transfection من خلايا التعبئة والتغليف 293T، وجمع فائقة تحتوي على الفيروس وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر (لا تستخدم مرشح 0.2 μm التي سوف القص مغلف الفيروس). من المستحسن استخدام مرشحات البولي إيثيرسولفون (PES).
    3. تصيب خلايا CENP-A-/F RPE-1 بالفيروس. للحصول على بئر واحد من لوحة ثقافة 6-جيدا، إضافة 1 مل وسائل الإعلام الطازجة، 1 مل فيروس متكاثر والبوليبرين إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل. احتضان CENP-A-/F RPE-1 الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 لمدة 4 أيام حتى اليوم 7 بعد transfection.
      ملاحظة: يجب تحديد فترة الحضانة لنمو الخلايا CENP-A-/F RPE-1 تجريبيًا باتباع التحليلات لتحقيق النتائج المثلى.

2. تحليل الفلوروسنس المناعي للخلايا التي تحتوي على pBabe-EYFP-CENP-A

  1. اليوم 7: 4 أيام بعد عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A يبني، وإزالة وسيلة الثقافة من قبل الطموح. شطف الخلايا مرة واحدة مع TBS (25 mM تريس-HCl، 7.5 pH؛ 125 mM NaCl). تطبيق TBS إلى جانب الآبار الثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحديد نقطة الوقت الأمثل لتثبيت الخلية تجريبياً. إشارات الفلوروس المناعي لكل من EYFP-CENP-A WT وK124R قابلة للكشف في السنترومير على الأقل 4 أيام بعد عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A يبني حتى بدون عدوى Cre (البيانات غير مبينة، الشكل 1C-E للبيانات مع عدوى Cre).
  2. أداء تثبيت الخلية الميثانول وصبغ المناعةfluorescence كما هو موضح سابقا13.
  3. كما تستخدم الأجسام المضادة الأولية المضادة للجسم المضاد GFP (1:1,000 تخفيف) والأجسام المضادة CENP-B (نسبة التخفيف من 1:200) لعلامة موقع السنترومير في TBS تحتوي على مصل الماعز 4٪ (انظر جدول المواد للأجسام المضادة المستخدمة).
  4. إزالة زيادة تصاعد المتوسطة مع منشفة ورقية وختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر في الخطوة الأخيرة.
  5. الرجوع إلى الطريقة13 الموصوفة سابقاً لمراقبة صورة الفلورة المناعية، والاكتساب، وتحديد الكم، وتحليل الإشارات المتبقية من EYFP-CENP-A في السنترومير.
  6. تنفيذ عملية الحصول على الصور ومعالجتها بما في ذلك فك التكوير، وتحديد الكم، والتحليل باستخدام البرامج A أو البرامج B1 و B2 (انظر جدول المواد). اختياريا استخدام برامج C1-C3 (انظر جدول المواد)لمجهر المسح الضوئي ليزر confocal.
    ملاحظة: راجع 2.6.1 في ملفات ترميز تكميلية لكافة الأوامر المستخدمة في البرنامج A. انظر 2.6.2 في ملفات الترميز التكميلية لكافة الأوامر المستخدمة في البرامج B1 و B2.

3. مستعمرة مُقايسات النمو باستخدام pBabe-EYFP-CENP-A بعد عدوى فيروس الرجعية-Cre

ملاحظة: سبب إجراء هذا الفحص هو مقارنة صلاحية الخلية بين EYFP-CENP-A WT و K124R متحولة بعد تعطيل CENP-A-/F الأليل بواسطة Cre إعادة الكومبينيز (بعد استبدال إجمالي البروتين الخلوي CENP-A).

  1. الفيروس الرجعية transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد.
    1. تنفيذ العدوى بالفيروسة الرجعية للخلايا CENP-A-/F RPE-1 كما هو موضح في القسم 1. الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين ستربتوميسين لمدة 72 ساعة بعد عدوى الفيروس.
    2. بعد ثلاثة أيام من عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّاد (في اليوم 6)، إضافة blasticidin S (10 ميكروغرام/مل) في الآبار التي تحتوي على الخلايا العابرة لعدوى لاستخدامها في مقايسات مستعمرة خارج والسيطرة التجارب. تزرع الخلايا على الأقل بعد 14 يوما من عدوى الفيروس في وجود blasticidin S. تغيير المتوسطة التي تحتوي على blasticidin S كل 5 أيام.
      ملاحظة: إذا وصلت الخلايا إلى حوالي 80٪ التقاء قبل البذر للملمع مستعمرة (3.2.7. و 3.2.8)، مرور الخلايا في 1:2 و 1:5 نسبة عن طريق التربسيني والطلاء في لوحة ثقافة 6 جيدا.
    3. جمع الخلايا للطخة الغربية في اليوم 7 لتأكيد التعبير البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A يبني دون عدوى كري. إجراء تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في القسم 4. وتظهر النتائج في الشكل 1B (الممرات 1-4).
    4. لمستعمرة مقايسة مع عدوى فيروس Cre، والحفاظ على الخلايا التي تنمو لمدة 14 يوما بعد عدوى الفيروس في وجود blasticidin S (أي، تنمو الخلايا في blasticidin S التي تحتوي على المتوسطة حتى يوم 17 للنتائج المقدمة هنا).
  2. عدوى فيروس الرجعية كري من pBabe-بورو-كري
    ملاحظة: يوم 0 في الخطوة 3.2.1 يتوافق مع يوم 13 من في المقطع 3.1.
    1. يوم 0 إلى يوم 3: تنفيذ transfection الفيروسة الرجعية من CENP-A -/F RPE-1 الخلايا باستخدام pBabe-puro-Cre (B3027) كتعبير plasmid (انظر القسم 1 للحصول على التفاصيل). تأكد من إضافة البلاستيسيدين S (10 ميكروغرام/مل) في الوسط المُزَمِر.
    2. اليوم 4: الخلايا التربسينيزي لفصله عن لوحة. لوحة 500 أو 5000 خلية في ثلاث ية في لوحة ثقافة 6-جيدا. الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين.
    3. اليوم 5: إضافة blasticidin S (10 ميكروغرام / مل) إلى الوسط ثقافة. ل5000 أو 500 خلية ' الطلاء, حدد الخلايا مع blasticidin S (10 ميكروغرام / مل) 3-24 يوما (حتى اليوم 14 في [3.2.7]) أو 3-28 يوما (حتى يوم 18 في [3.2.8]) بعد عدوى الفيروس من الانشاءات (pBabe-EYFP-CENP-A الانشاءات).
      ملاحظة: في هذه المستعمرة مُقايسة النمو، يتم إضافة transfection من pBabe-puro-Cre جنبا إلى جنب مع transfection من pBabe-EYFP-CENP-A. يتم تنفيذ نقل pBabe-EYFP-CENP-A في 3.1. يتم تنفيذ transfection من pBabe-puro-Cre في 3.2.1.
    4. اليوم 10 (7 أيام بعد عدوى فيروس الرجعية كري): جمع الخلايا لتحليل النشاف الغربية لتأكيد استنفاد البروتين من CENP-A الذاتية بعد عدوى فيروس الرجعية-كري و/ أو تعبير البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A يبني في نفس اليوم 10.
    5. تنفيذ النشاف الغربية كما هو موضح في القسم 4 في نفس اليوم 10. وتظهر النتائج في الشكل 1B (الممرات 5-7).
    6. إجراء تحليل مناعي (القسم 2 أعلاه) للتأكد من أن كل من EYFP-CENP-A WT وK124R المترجمة إلى centromere 7 أيام بعد تعطيل CENP-A 1000 endnp المتبقية. وتظهر النتائج في الشكل 1C-1E.
    7. اليوم 14: أداء مقايسة المستعمرة خارج مع لوحة بذر مع 5000 الخلايا. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة في الميثانول وصمة عار لمدة 10 دقيقة في حل البنفسجي الكريستال (2.3٪ البنفسجي الكريستال، 0.1٪ أوكسالات الأمونيوم، 20٪ الإيثانول (انظر الشكل 2B). عد عدد المستعمرات باستخدام برنامج OpenCFU (انظر الشكل 2C).
    8. اليوم 18: استخدام لوحة بذر مع 500 خلية. إصلاح وخلايا البقع كما هو موضح في الخطوة 3.2.7 (انظر الشكل 2B). عد عدد المستعمرات (انظر الشكل 2C).

4. الغربية لطخة التحليل باستخدام pBabe -EYFP-CENP-A

ملاحظة: راجع الطريقة13 الموصوفة سابقاً لتحليل البقعة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها في الشكل 1B والشكل 2A وجدول المواد للبروتينات EYFP-CENP-A. Table of Materials

  1. عزل البروتينات عن طريق lysing الخلايا المزروعة مع عدوى فيروس مختلف. ثم، استخدام 20 ميكروغرام من البروتين في بئر واحد من هلام صفحة SDS. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF كما هو موضح سابقا13.
  2. غسل الغشاء 3x بعد الاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية. كشف وتحليل نطاقات البروتين على الغشاء مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء و / أو التصوير chemiluminescence للكشف عن المناعة. وتظهر هذه النتائج في الشكل 1B والشكل 2A.
    1. للحصول على نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء للكشف عن وتحليل نطاقات البروتين، راجع الخطوة 4.2.1 في ملفات التشفير التكميلية.
    2. استخدم مصوّر chemiluminescence للكشف عن نطاقات البروتين وتحليلها، راجع الخطوة 4.2.2 في ملفات التشفير التكميلية. لهذا النظام، استخدم الركيزة chemiluminescent (ECL) الحساسة للغاية(جدول المواد).
    3. اختياريا، استخدم لطخة الغربية تجريد العازلة لتجريد من الأجسام المضادة قبل المحتضنة من غشاء PVDF و reblot مع الأجسام المضادة المختلفة لدور المقبل من التحليل الغربي. تحديد تجريبيا الوقت الأمثل الحضانة ودرجة الحرارة لاستخدامها.

5. خلية الثقافة، transfection، وفي vivo في كل مكان مقايسات باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A

ملاحظة: مستوى البروتين من EYFP-CENP-A أعرب عن من pQCXIP-ناقلات هو ~ 10x أعلى من مستوى البروتين CENP-A الذاتية. إن استخدام هذا المتجه يسهل التحلل المناعي لكمية أعلى من بروتينات EYFP-CENP-A، ومراقبة نطاقات EYFP-CENP-A، وتحديد كل مكان للبروتين EYFP-CENP-A (EYFP-CENP-A) من خلال تحليل قياس الطيف الكتلي.

  1. Transfection لفي vivo في كل مكان مقايسات باستخدام pQCXIP -EYFP-CENP-A.
    1. البذور 36.2 × 105 CENP -A-/F RPE-1 الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم. الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، حدد تجريبيًا كثافة الخلايا التي سيتم استخدامها في البذر. إعداد ما لا يقل عن 2 أطباق لعينة واحدة مناعي (IP) للحصول على ما لا يقل عن 1 ملغ من البروتين الكلي.
    2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 18 ساعة.
    3. في 17 ساعة بعد البذر، وإعداد الكواشف transfection.
    4. جعل الحل عن طريق خلط 6.7 ميكروغرام بلازميد من كل pQCXIP-EYFP (B3252)، pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254)، pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(الجدول 1)في 335 μL من مصل متوسط مخفض، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 6.7 μg plasmid من pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) إلى جميع العينات.
      ملاحظة: يتم سرد كافة المتجهات في الجدول 1.
    5. جعل الحل B عن طريق خلط 10.1 ميكرولتر من الكواشف عبر I و II، على التوالي في 335 ميكرولتر انخفاض مصل المتوسطة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: خطوة اختيارية هي إضافة فقط 40.2 ميكرولتر مكشاف لمعالجة المعادن III (البولي ايثيلينمين [PEI]؛ 1.0 ملغ /مليلتر) في الحل B أو إضافة 40.2 ميكرولتر مكشاف 3 بالإضافة إلى كاشفات transfection I و II في الحل B(جدول المواد).
    6. مزيج الحلول A و B معا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    7. بعد غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة خليط من الحلول A و B (أي، الحمض النووي الدهون المعقدة) مباشرة إلى كل من الفردية 10 سم طبق زراعة الأنسجة التي لديها 3.35 مل μL انخفاض مصل المتوسطة.
      ملاحظة: التركيز النهائي هو 1.67 ميكروغرام / مل من البلازميد.
    8. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل4.5 h. بعد 4.5 ساعة، قم بتغيير متوسط إلى عالي الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بينسلين-ستريبتوميسين.
    9. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل 48 ساعة بعد transfection. جمع الخلايا لإعداد الخلية lysates.
  2. إعداد البروتين الخرز ملزمة مع الأجسام المضادة للجسم العالمي.
    1. خذ 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من البروتين A حبات لتفاعل واحد مناعي (IP). غسل مع A1 العازلة (جدول المواد)على الأقل 3x لإزالة EtOH، وجعل 50% حل مع A1 العازلة (20 mM تريس-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; كاملة EDTA خالية من مثبطات البروتياز كاشف).
    2. إضافة 2.0 μL من الأجسام المضادة لـ GFP (Anti#76: الأجسام المضادة محلية الصنع) إلى الخرزات المعدة أعلاه وإضافة 10x حجم A1 العازلة مقارنة مع صافي حجم الخرز.
    3. أداء تناوب من نهاية إلى نهاية في 4 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة. يجب تحديد الوقت الأمثل لدوران من نهاية إلى نهاية على أساس تجريبي على أساس كفاءة مناعي.
    4. الطرد المركزي الخرز في 100 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة غير منضم فائقة. إضافة A1 العازلة لإعادة جعل 50٪ (الخامس / الخامس) حل من الخرز. استخدم 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من هذا الحل لتفاعل واحد من IP.
  3. مناعي (IP) باستخدام البروتين خرزات sepharose ملزمة بالأجسام المضادة لـ GFP.
    1. الخلايا الLyse التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.9 في A1 العازلة بواسطة sonication وتجميد ذوبان العملية.
    2. قياس تركيزات البروتين وتطبيع كميات البروتين بين عينات IP مختلفة. إزالة 5٪ من العينة من كل أنبوب لتشغيل عينة إدخال 5٪ في SDS-PAGE.
      ملاحظة: يمكن تجميد عينة الإدخال بنسبة 5٪ في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية، إذا لم يتم تحميلها في غضون يوم واحد.
    3. مزيج بقية 95٪ lysate مع 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من البروتين A حبات ملزمة للأجسام المضادة للجسم المضاد لـ GFP التي تم إعدادها في الخطوة 5.2. أداء تناوب من نهاية إلى نهاية في 4 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة.
      ملاحظة: يجب تحديد طول الوقت الأمثل لتناوب نهاية إلى نهاية تجريبياً.
    4. بروتين الطرد المركزي حبات مع البروتين ملزمة به (أي، مناعي) مع 100 × ز لمدة 1 دقيقة، وإزالة نابيرانت. اغسل cipcipitates المناعية مع العازلة A1 عن طريق الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة.
    5. مزيج من 5٪ المدخلات وبقية 95٪ من cippreitates المناعي مع 2x و 4x SDS-PAGE تحميل العازلة14، على التوالي. يغلي هاتان العينتان لمدة 5 دقائق ثم قم بتحميلها على 10.0% denaturing SDS-polyacrylamide هلام لكهربية في الممرات المختلفة. استخدم جل SDS-PAGE أكبر (على سبيل المثال، 17 سم × 15 سم) للكهربية. إذا كانت العينات تعمل في هلام أصغر، قد لا يكون من الممكن مراقبة نطاقات واضحة /واضحة في كل مكان.
    6. إجراء تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في القسم 4 باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها في التقرير السابق8. وتظهر النتيجة في الشكل 2A.
    7. استخدام لطخة الغربية تجريد العازلة لتجريد من الأجسام المضادة قبل المحتضنة من غشاء PVDF و reblot مع الأجسام المضادة المختلفة للجولة المقبلة من تحليل البقعة الغربية.

6. قياس الطيف الشامل لتحديد موقع في كل مكان من EYFP - CENP - K124R متحولة

  1. نقل لتحاليل قياس الطيف الكتلي باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. بذور CENP-A-/F RPE-1 الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم. تحقق من أن كثافة الخلية هي 36.2 × 105 خلايا لكل طبق. الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين. إعداد ما لا يقل عن 20 أطباق لعينة واحدة مناعية (IP)، للحصول على ما لا يقل عن 10 ملغ من البروتين الكلي (انظر 5.3).
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
    2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 18 ح. إعداد الكواشف transfection ~ 23 ساعة بعد انتشار (24 نقطة ساعة هو 0 نقطة ح من transfection).
    3. في 17 ساعة بعد البذر، وإعداد الكواشف transfection وخلايا transfect كما (4.1.3). الخلايا المصابة pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) وpQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 48 ساعة بعد transfection. جمع الخلايا لخلايا الخلايا.
    5. خلايا اللاي في A1 العازلة وإجراء المناعة كما (5.2) و (5.3). تشغيل هذين من lysitation المناعي كما يلي (6.1.6) و (6.1.7).
      ملاحظة: في (6.1.6) ، تشغيل العينة في المواد الهلامية تريس الجليسين القياسية. في (6.1.7) ، تشغيل العينة في 4 ٪ - 12 ٪ المتاحة تجاريا بروتين الهلام Bis-Tris. انظر أيضا المناقشة.
    6. احتفظ بعينة واحدة لـ 10% من إجمالي المثبطات المناعية لتأكيد EYFP-CENP-A في كل مكان ولتحديد موضع EYFP-CENP-A في كل مكان على وجه التحديد كما هو موضح في القسم 5. تشغيل هذه العينة في المواد الهلامية تريس-جليكين القياسية. تم تنفيذ SDS-PAGE ولطخة غربية كـ (5.3).
    7. احتفظ بعينة أخرى لـ 90% من إجمالي المثبطات المناعية لتحليل قياس الطيف الكتلي. تشغيل هذه العينة داخل اثنين من الآبار المتاحة تجاريا 4٪ -12٪ الهلام البروتين Bis-Tris. أداء Coomassie الأزرق تلطيخ باستخدام حل Coomassie الأزرق. مكوس وقطع منطقة هلام من 50-70 كيلوDa (المفترض أحادية UB-EYFP-CENP-A K124R المنطقة). استخدام هذه المنطقة هلام لتحليل الطيف الشامل.
  2. تحليل قياس الطيف الكتلي باستخدام الهضم في الجل.
    1. الزهر كل شريحة هلام من الفائدة في قطع صغيرة (1 مم2) ووضعها في 0.5 مل من أنابيب البروتين ملزمة منخفضة.
    2. غسل مع 100 μL 50٪ (الخامس / الخامس) الأسيتريتريل في 25 mM NH4HCO3، دوامة 10-15 دقيقة ، تدور أسفل ، والتخلص من افرنح ، كرر 3x.
    3. تركيز العينة باستخدام مقاعد البدلاء فراغ المكثف لمدة 30 دقيقة لتجفيف القطع هلام.
    4. إضافة 10 μL من 10 نانوغرام / μL تسلسل التربسين الصف والسماح لقطع هلام لإعادة الترطيب لمدة 5 دقائق.
    5. إضافة 25 mM NH4HCO3 فقط بما يكفي لتغطية القطع هلام، digest في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. نقل هضّب هضّب إلى أنبوب سيليكوني نظيف 0.65 مل. إضافة 50٪ (v/v) الأسيتونيتريل/5٪ (الخامس / الخامس) حمض الفليك (30 ميكرولتر أو ما يكفي لتغطية)، دوامة 10 دقيقة، تدور ونقلها إلى نفس أنبوب الاستخراج. كرر 3x.
    7. إضافة 10 ميكرولتر الأسيتونيتريل إلى القطع هلام, دوامة 5 دقيقة, وتدور إلى أسفل. نقل المُنَاَع إلى نفس الأنبوب.
    8. تركيز العينات باستخدام تركيز فراغ benchtop إلى 2 ميكرولتر، إضافة 8 ميكرولتر 3٪ (الخامس / الخامس) الأسيتونتريل /2٪ (v/v) حمض الفليك إلى العينة، دوامة لمدة 15 دقيقة، وتدور في 16،000 س ز لمدة 30 دقيقة. العينات جاهزة لتحليل الطيف الشامل.
    9. إجراء عملية الحصول على بيانات MS باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل(جدول المواد)بالإضافة إلى أداة قياس الطيف الكتلي (جدول المواد).
    10. حقن 8 ميكرولتر من عينة المعاد تشكيلها على مسار لوني السائل المرحلة العكسية (RPLC) العمود.
    11. فصل الببتيدات مع 2-80% التدرج من المذيب B في 60 دقيقة. تأكد من أن التدرج يتكون من نسبة متزايدة من المذيب B من 2٪ إلى 22٪ في 40 دقيقة، 22٪ إلى 35٪ المذيب B في 12 دقيقة، ثم الصعود إلى 80٪ المذيب B في 4 دقائق، وأخيرا عقد في 80٪ المذيب B لآخر 4 دقائق.
      ملاحظة: المذيب A يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك و 2٪ الأسيتونيتريل، المذيب B يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك و 98٪ الأسيتريتريل. وتظهر جميع التركيزات على أنها وحدة تخزين/حجم.
    12. جمع بيانات قياس الطيف الكتلي باستخدام وضع الاكتساب المعتمد على البيانات. باختصار، جمع أطياف التصلب العصبي المتعدد في 350-1500 م / z ل250 مللي ثانية حدد أعلى 50 السلائف المكثفة مع تهمة 2-5 لمزيد من التفتت. جمع أطياف MS /MS في 100-2000 م / z ل 100 مللي ثانية، استبعاد الأيونات السلائف من إعادة اختيار لمدة 15 ثانية.
    13. للبحث عن قاعدة البيانات، افتح البرنامج التجاري (راجع جدول المواد)لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي على سطح المكتب.
    14. لإجراء بحث جديد، انقر على زر"LC"في القائمة العلوية. ثم انقر فوق "إضافة" زر لتحميل الأصلي MS ملفات البيانات الخام.
    15. حدد "معرف البروتين البشري" في " طريقةالمثل" كأسلوب البحث في قاعدة البيانات. البحث في ملفات البيانات الأولية MS الأصلي مقابل قاعدة بيانات UniProt Homo Sapiens (التي تحتوي على 160,566 تسلسل, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. تعيين المعلمات البحث على النحو التالي: حدد التربسين كما انزيم الهضم، والسماح لما يصل إلى 3 الانقسامات المفقودة، 4 تعديلات و 2-5 التهم لكل الببتيد. تعيين خطأ الكتلة تصل إلى 20 جزء في المليون للبحث الأول، و 0.02 Da للأيونات المجزأة. تحديد عتبات معدل اكتشاف زائف (FDR) للبروتين والببتيد ومواقع التعديل أقل من 1٪. تعيين كافة المعلمات الأخرى في البرنامج إلى القيم الافتراضية (انظر الشكل 3 لتحليل قياس الطيف الشامل).
    17. انقر على الزر "حفظ باسم" على يمين القائمة العلوية، وحدد مجلدا لتخزين نتائج البحث، وأدخل اسم البحث وانقر على "حفظ" زر.
    18. انقر على الزر "معالجة" على يمين القائمة العلوية لبدء البحث. بعد انتهاء البحث، سيتم تخزين البيانات التي تحتوي على اسم البحث الذي تم إدخاله تلقائيًا في المجلد المحدد. يمكن فتح البيانات بسهولة بواسطة برنامج F.
    19. للحصول على أطياف MS/MS لأي ببتيد معين، انقر نقراً مزدوجاً فوق نتائج البحث لفتحه بواسطة Software F. أولا، انقر فوق البروتين في قائمة البروتين في الجزء العلوي من القائمة، ثم انقر فوق الببتيد في منتصف القائمة. يتم عرض MS / MS من هذا الببتيد في الجزء السفلي من القائمة.
    20. لتصدير وحفظ أطياف MS/MS، انقر بزر الماوس الأيمن فوق أطياف MS/MS في أسفل القائمة، وحدد نسخة ثم لصقها في ملف مناسب مثل تنسيق PPT أو doc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EYFP-CENP-A K124 متحولة يظهر في كل مكان، والتفاعل مع HJURP، وليس هناك عيوب في توطين centromere لا الفتك الخلية. هنا تم إعادة تشكيل النظام الذي أبلغ عنه Fachinetti et al. (2017)6: في خلايا الإنسان diploid (RPE-1) التي تحمل واحدة تعطلت وواحدة ''floxed'' CENP-A أليل(CENP-A-/F),تم التعبير عن EYFP-CENP-A من ناقل الفيروس الرجعي pBabe-FP. في هذا النظام، يمكن أن تتعطل التعبير عن CENP-A الذاتية من CENP-A-/F أليل من قبل إعادة الكومبينيز6. بنيات الجينات من EYFP-CENP-A WT أو K124R متحولة(الشكل 1A)،الذي ينقذ فقدان CENP-A الذاتية، وأعرب عن ذلك بشكل ثابت عندما تم تنفيذ التكامل الفيروسي. ثم تعطلت التعبير المتبقية من CENP-A الذاتية من CENP-A-/F allele من قبل إعادة الكومبينيز Cre. لم يتم الكشف عن التعبير عن CENP-A الذاتية بعد 7 أيام من تحريض إعادة الكومبينيز Cre(الشكل 1B، الممرات 5-7). تم العثور على كل من EYFP-CENP-A WT وK124R تعبير البروتينات لتكون في مستوى مماثل لمستوى البروتين CENP-A الذاتية الأولية(الشكل 1B,3, 4, 6, و 7). وأظهرت كل من EYFP-CENP-A WT وK124R المسوخ centromere التعريب في 7 أيام بعد تعطيل التعبير المتبقي من CENP-A الذاتية من CENP-A-/F أليل(الشكل 1C-1E). وأظهرت كل من EYFP-CENP-A WT وK124R متحولة في كل مكان والتفاعل مع HJURP على عكس حالة العلم الموسومة أو غير الموسومة CENP-A WT وK124R متحولة(الشكل 2A; البيانات غير مبينة للعلم الموسومة أو غير مُعلّمة CENP-A)8. كما تم تناول قابلية الخلية للحياة من خلال تنفيذ مقايسة نمو المستعمرة بعد 14 يومًا من تعطيل الأليل CENP-A الداخلي المتبقي(الشكل 2B). وأظهرت كل من EYFP-CENP-A WT وK124R المسوخ عدد مماثل من ''إنقاذ'' المستعمرات بعد 14 يوما من تعطيل CENP - A المتبقية الذاتية(الشكل 2B و 2C). وهكذا، فإن نتائجنا تتماشى مع تلك التي أبلغ عنها Fachinetti وآخرون6.

تم الكشف عن Ubiquitylation في lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R من خلال تحليل قياس الطيف الشامل. ووجد أن كلا من EYFP-CENP-A WT وK124R متحولة يظهر في كل مكان والتفاعل مع HJURP على عكس حالة العلم الموسومة أو untagged CENP-A WT وK124R متحولة(الشكل 2A; البيانات غير مبينة للعلم الموسومة أو غير مُعلّم CENP-A)8. هذه النتائج تشير إلى أن الانصهار من بروتين EYFP يدفع في كل مكان في ال ليسين غير K124 في EYFP-CENP-A K124R متحولة، وهذا في كل مكان في موقع آخر تعزيز التفاعل بين EYFP-CENP-A K124R مع HJURP. تم الكشف عن Ubiquitylation في lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R في خلايا CENP-A-/F بواسطة تحليل قياس الطيف الكتل IP(الشكل 3A والشكل 3B). ويعادل 306 lysine (K306) في EYFP -CENP-A K124R إلى lysine 56 (K56) في CENP-A. معا، نتائجنا تشير إلى أن الانصهار من البروتين كبير الحجم (على سبيل المثال، EYFP-العلامات) يدفع في كل مكان في ليسين غير K124 في CENP-A، وهذا في كل مكان في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R نمط ظاهري متحولة واحدة.

Figure 1
الشكل 1: EYFP-CENP-A K124 مترجم متحولة في سينتروميريس. (أ)تمثيلات لمختلف CENP-A بناءات البروتين الموسومة مع EYFP (محسنة البروتين الفلورسنت الأصفر) في N المدى. الحروف الحمراء علامة موقف استبدال K124R الأحماض الأمينية في بناء المشار إليها (يسار). تظهر نتائج الأقوال التي أجريت في هذه الدراسة (يمين). (ب)لم يظهر تحليل البقعة الغربية وجود CENP-A الذاتية القابلة للكشف. تحليل مناعي للتحقق من وجود التعبير عن بناءات الإنقاذ المشار إليها (ca. 45 كيلو Da) قبل وبعد الإصابة بالكري. تم تأكيد التعبير البروتيني للـ pBabe-EYFP-Constructs قبل الإصابة بعد عدوى Cre (الممرات 1-4) ، وكذلك بعد الإصابة بالكري (الممرات 5-6). تم تأكيد عدم وجود بروتين CENP-A الداخلي (ca. 15 kDa) في خطوط CENP-A-/- الخلايا التي تم جمعها بعد 7 أيام من الإصابة بالكري (الممرات 5-6). تم استخدام بروتين GAPDH كتحكم في التحميل. (C) EYFP-CENP-A K124 مترجمة متحولة في سينتروميريس. كانت خلايا CENP-A-/F RPE-1 مصابة ببنيات مُشار إليها، وجرى استزراعها بعد 7 أيام من الإصابة بفيروس الريبة الرجعية، والمثبطات المناعية. تصور DAPI (الأزرق) ، EYFP (الأخضر) ، و CENP -B (الأحمر) الداخلي ، والتي كانت بمثابة التحكم في موقع السنترومير. شريط مقياس، 10 ميكرومتر. (D) أنماط التعريب الموضحة في (C) ملخصة على شكل مدرجات. تم عد أكثر من 200 خلية بين المراحل مع إشارات إيجابية EYFP لكل تجربة (ن ≥ 3 تجارب)، وتظهر النسب المئوية المتوسطة (±SD). ''الآخرين (غير سنتيروميري)' يصور خلايا معظمها معطوبة، أو خلايا ميتة، أو خلايا ذات تعريب نوكلولار في المراحل البينية، والتي لوحظت بسبب التواليف أو غيرها من العلاجات. لم يلاحظ أي فرق (n.s.) في K124R مقارنة بـ WT (اختبار T للطالب). (هـ)الإشارات المستمدة من EYFP في النتروميات الموضحة في (C) تم تحديدها كمياً. تم تطبيع الإشارات إلى إشارات WT، وتظهر النسب المئوية الوسط (±SEM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: EYFP-CENP-A K124 متحولة في كل مكان وتتفاعل مع HJURP، ولم تتأثر قابلية الخلية بالطفرة K124R من EYFP-CENP-A. (أ)وEYFP-CENP-A K124 متحولة في كل مكان ويتفاعل مع HJURP. في فحص vivo في كل مكان. تم نقل خلايا CENP-A-/F RPE-1 مع الانشاءات المشار إليها. تم الكشف عن البروتينات في 5٪ من الخلايا الإجمالية (المدخلات) والمناعة (IP) باستخدام الأجسام المضادة المضادة للأرانب المضادة للجف، بواسطة تحليل البقعة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها. يشار إلى مُتَفَضِيّة di-Ub-EYFP-CENP-A (**) ومُتدلَة بِيُنّ أحادية EYFP-CENP-A (*). وقد تم تعديل هذا الرقم من Niikura وآخرون8. (B) صور تمثيلية من مقايسة المستعمرة كما هو موضح في المخطط (أعلى) من شرطين مختلفين ([1] و [2]) للمتحولين المشار إليها من EYFP-CENP-A. (C) المدرجات البيانية تلخص بقاء مستعمرة من التجارب في (ب). يتم تطبيع النسب المئوية المتوسطة (±SEM) لأكثر من 3 تجارب مستقلة (ن ≥ 3) مع النسبة المئوية للمستعمرات الباقية في EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0.0001 و **p < 0.01 مقارنة بتحكم EYFP (اختبار t للطالب). لم يلاحظ أي فرق (n.s.) في K124R مقارنة بـ WT (اختبار T للطالب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تم الكشف عن شظايا من الببتيدات EYFP-CENP-A-A المُقدمة في كل مكان بواسطة تحليل قياس الطيف الكتلي. (أ) دليل على انتشار في كل مكان في lysine 306 (K306) من EYFP-CENP-A K124R في RPE-1 CENP-A-/F الخلايا. ويقابل lysine 306 (K306) من EYFP-CENP-A K124R إلى lysine 56 (K56) في CENP-A. وLQKLRGGSTHLLIR الببتيد (التغطية 95.9٪، الثقة 87.8٪) يتم عرض تحديدها بواسطة تحليل الانفصام الناجم عن الاصطدام. يتم تمييز قيم m/z (Da) للأيونات b (الأخضر) و y (الأحمر) في أطياف (A) التي تم اكتشافها أثناء التجزؤ باللون الأخضر في جدول (B). ويؤكد كل مكان من K306 من قبل LRGG عزر (انشقاق غير مكتمل) من أيون B-3 (م / ض 753.4730) وy - 8 أيون (م / ض 1350.8328). (ب)يسلط الجدول الضوء على قيم m/z (Da) للأيونات (الخضراء) و y (الحمراء) في أطياف (A). LQK[Umc]STHLLIR في جدول (ب) يشير إلى LQKLRGGSTHLLIR الببتيد المبين في (A). وقد تم تعديل هذه الأرقام من Niikura وآخرون8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

باء رقم الخصائص ذات الصلة(الخصائص) مرجع مصدر
B3027 pBabe-puro-Cre Niikura وآخرون، 2019 الدكتور عمروتا أشتيكار، الدكتور لورانس س. كيرشنر
B3182 pBabe-EYFP Niikura وآخرون، 2019 -
B3161 pBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura وآخرون، 2019 الدكتور دانييلي فاشينيتي، الدكتور دون و. كليفلاند
B3164 pBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura وآخرون، 2019 الدكتور دانييلي فاشينيتي، الدكتور دون و. كليفلاند
B3031 psPAX2 Niikura وآخرون، 2019 الدكتور جون تومسون، الدكتور غوستافو و.
D3032 pMD2.g Niikura وآخرون، 2019 الدكتور جون تومسون، الدكتور غوستافو و.
B3189 بغب Niikura وآخرون، 2019 الدكتور كينجي تاغو (جامعة جيتشي الطبية، اليابان)
B3190 pCI-VSVG Niikura وآخرون، 2019 الدكتور كينجي تاغو (جامعة جيتشي الطبية، اليابان)
B3001 pPAM Niikura وآخرون، 2019 -
B3252 pQCXIP-EYFP Niikura وآخرون، 2019 -
B3254 pQCXIP-EYFP-CENP-A WT Niikura وآخرون، 2019 -
B3256 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura وآخرون، 2019 -
B2806 pCGN-HA-Ubiquitin Niikura وآخرون، 2019 -

الجدول 1: ناقلات البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة.

باء رقم المساعد / التعبئة والتغليف ناقلات plasmid تركيبة 1 تركيبة 2 تركيبة 3
B3031 psPAX2 (هفوة العدسي الفيروسية / ناقلات pol) 2μg
D3032 pMD2.g (متجه فيروسي الرونتيفير) 2μg
B3189 pGP (هفوة الفيروسات الرجعية / ناقلات pol) 2μg
B3190 pCI-VSVG (ناقل فيروسي فيروسي) 2μg
B3001 pPAM (أمفرهوروبيك ناقلات ترميز هفوة retroviral بول-env) 2μg

الجدول 2: مجموعات من ناقلات البلازميد المساعد/التعبئةية المستخدمة في (1.1.3): الفيروس الرجعي transfection من بنيات pBabe-EYFP-CENP-A.

ملفات ترميز تكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا وصفنا طرق تحليل القياس الطيفي الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن وضع العلامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. في نتائجنا، نجحنا في تحديد في كل مكان على lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R، وهذا هو المقابلة لايزين 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل قياس الطيف الشامل. تحليل قياس الطيف الشامل الموصوف هنا هو أسلوب تقليد كما سبق لنا تحديد lysine 124 (K124) موقع في كل مكان من CENP-A WT-العلم12. لذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة على البروتين CENP-A الإنسان مع علامات مختلفة والبروتينات centromere-kinetochore الأخرى. إن تحليل قياس الطيف الكتلي المستند إلى LC-MS/MS مقبول بشكل شائع لتحديد التعديلات المحتملة بعد التحويل (PTMs) لمجموعة واسعة من البروتينات. يمكن أن يوصى بطرقنا الجمعية التي تتكون من عدة مقايسات / تحليلات (أي ، في اختبار vivo ubiquitylation ، مقايسة المستعمرة ، وتحليل قياس الطيف الشامل) للباحثين المهتمين بتحديد الأدوار الوظيفية للانبثاج البسيوبي (s) للبروتين المستهدف(s).

ومع ذلك، لا يغطي هذا البروتوكول الكشف عن النطاقات المُوجَّهة في كل مكان و/أو تحديد كل مكان لكلية من هذه البروتينات في الخلايا الحية أو خلية مفردة محددة خلال دورة الخلية بأكملها. هذه السنوات يتم تطوير النهج optogenetic بشكل كبير وإعطاء تأثير كبير على الدراسات الكمية لأنظمة إشارات الخلية. وقد قدمت Optogenetics في الأصل النهج التي تنشط بدقة أو تمنع الخلايا العصبية الفردية باستخدام مكون واحد، ونظم القائمة على opsin الميكروبية. حاليا، يمكن السيطرة على نشاط البروتين مع دقة ارقائية غير مسبوقة من خلال استغلال ناسخات فوتورية مشفرة وراثيا الطبيعية، ومختلف الأدوات المشفرة وراثيا تسمح للرقابة الخفيفة من العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك فوسفيجيليشن البروتين15. ولذلك، optogenetics هو نظام واعد للتحقيق في كيناز البروتين ازنائي الصدغي إشارات في الخلوية والمستويات الكائن الحي بأكمله. عدد كيناز البروتين التي يتم التحكم فيها بالضوء يتوسع بسرعة، على الرغم من أن العدد الحالي لا يزال محدودا. ومع ذلك، يتم تأخير تطوير البروتين التي تسيطر عليها الضوء في كل مكان، وارتفاع الوزن الجزيئي وضع العلامات من مستقبلات ضوئية قد تعطل في كل مكان من كل من WT والبروتينات المتحولة وتغيير وظيفيا وظيفة البروتين الأصلي كما aforestated. لذلك، فإن تطوير الوزن الجزيئي السفلي وضع العلامات أو تقنية التحقيق مطلوب على وجه السرعة لتصور في كل مكان و / أو للتحقيق في جليات البروتين اسخائي الزماني إشارات في الخلية الحية ومستويات الكائن الحي بأكمله.

في هذه الدراسة، EYFP مكافحة ناقلات ضرورية لمكافحة المقايسات والتحليلات (تحليل المناعة، مقايسة مستعمرة خارج، وفي التحليل في كل مكان vivo) لمناقشة نتائج التحليل الطيفي الشامل الرئيسي بشكل صحيح. التفاعل غير المحدد مع بروتين EYFP غالباً ما يلاحظ في تجربة المناعة، وبالتالي فإن مكافحة ناقلات EYFP لا غنى عنها لتقييم التفاعل الحقيقي للبروتينات (البروتينات) المُنصهرة في EYFP. لم يظهر تحليلنا لقياس الطيف الكتلي باستخدام EYFP-CENP-A K124R المعبّر-/F عنه في خلايا RPE-1 CENP-A-/F وجود ubiquitylation على مواقع اللين في تسلسل بوليبيبيد EYFP. ومع ذلك ، في ظروف أخرى غير معروفة ، يمكن توقع أن موقع اللين في تسلسل EYFP متعدد الببتيد هو في كل مكان في EYFP و / أو بروتين الانصهار الموسومة الأخرى ذات الوزن الجزيئي العالي.

لمستعمرة مُجرّسات النمو، فمن المستحسن جمع الخلايا لتحليل البقعة الغربية لتأكيد استنفاد البروتين من CENP-A الذاتية بعد عدوى فيروس كري الرجعية والتعبير عن البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A الثوابت. وبهذه الطريقة، يمكننا الحكم إذا كان النمط الظاهري للمستعمرة هو حقا بسبب التعبير الوحيد من CENP-A WT أو المسوخ. بالنسبة لأي تحليل لللطخة الغربية ، إذا تم إجراء تجريد لتكليل الغشاء مع الأجسام المضادة المختلفة لتحول المقبل من تحليل البقعة الغربية ، يجب استخدام نظام الكشف الكمي نفسه كلطخة منعطف سابق للطخة بدوره المقبل مع الأجسام المضادة المختلفة. ينبغي للمرء أن يتأكد من أن العصابات في لطخة المنعطف السابق غير قابلة للكشف في المنطقة التي تهدف إلى الغشاء في لطخة بدوره المقبل مع الأجسام المضادة المختلفة. أو استخدام نفس نظام الكشف الكمي كما في لطخة الدورة السابقة والتحقق مما إذا كان الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية مجرد المستخدمة في لطخة الدورة السابقة لا يؤدي إلى الكشف عن عصابات البروتين قبل البدء في لطخة بدوره المقبل مع الأجسام المضادة المختلفة. لفي vivo ubiquitylation المقايسة، من المهم لتشغيل أكبر هلام SDS-PAGE باستخدام الجهاز لتشغيل أكبر هلام SDS-PAGE (جل جل الكهربائية الجهاز الأول أو الثاني). تجريبيا، أكبر هلام SDS-PAGE من شأنه أن يفصل بين عصابات البروتين بوضوح وتعزيز حساسية الكشف عن العصابات الخافتة التي كان يمكن الكشف عنها بشكل سيئ في هلام أصغر (أي، عصابات البروتين تظهر أكثر وضوحا في هلام أكبر).

من المهم للغاية اختيار هلام SDS-PAGE المناسب لرسم خريطة التعديلات اللاحقة لترجمة (PTMs) لبروتين دقيق محدد LC-MS/MS. نظام الجل الأكثر استخداما لSDS-PAGE هو نظام Laemmli، الذي يستخدم الهلام تريس-جليكين التي تتألف من عنصر هلام التراص ومكون هلام حل. في هذا النظام الكلاسيكي، تختلف درجة حُكّة الH وقوة الأيونية للمخازن العازلة المستخدمة في هلام التراص (تريس، 6.8) وجل حلّه (تريس، 8.8 درجة حُكمية) عن العازلة المستخدمة لتشغيل الجل (تريس، درجة حِسّ 8.3). قد يكون سبب تشويه الفرقة أو فقدان الدقة أو النطاقات الأثرية درجة درجة PH التشغيل القلوية العالية لنظام Laemmli. وصف التقرير السابق الأسباب الرئيسية لضعف دقة الفرقة مع نظام Laemmli16، بما في ذلك عدم الاستقرار وفترة انتهاء قصيرة من حل هلام بسبب التحلل المائي من البولي أكريلامايد في درجة ح التعديلات الكيميائية من البروتينات عينة، وتكصد من انخفاض الكبريتيدات من بقايا السيستين من البروتينات، وانشقاق من Asp برو السندات من البروتينات مع التدفئة في 95-100 درجة مئوية في Laemmli عينة العازلة في درجة حر 5.2. ال 4% -12% الهلام البروتينات البيس-تريس هي الهلامة الـ Bis-Tris HCI-buffered (pH 6.4) وتعمل في السّاية 7.0 على عكس الهلامات التقليدية من مادة تريس-جليكين16. يتم إنشاء العديد من المزايا مقارنة مع نظام Laemmli من درجة حَسِّ التشغيل المحايدة لأنظمة Bis-Tris16، بما في ذلك الاستقرار العالي وفترة انتهاء الصلاحية الطويلة للجل الحل ، وتعزيز استقرار البروتين العينة خلال الكهرباء في درجة حَس محايدة مما يؤدي إلى دقة أكثر دقة في الفرقة ونتائج دقيقة ، والحد الكامل من البروفيتيدات وعدم وجود انشقاق من سندات Asp-Pro. في هذا التقرير، يمكننا بنجاح خريطة PTMs من بروتين EYFP-CENP-A K124R(الشكل 3)باستخدام الهلام البروتينات 4% -12% البيس-تريس المتاحة تجاريا. لذلك، ينصح بشدة المواد الهلامية البروتين 4% -12% المتاحة تجارياً لاستخدامها لهذا الغرض.

لرسم خرائط التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) من بروتين معين، في هلام الهضم من البروتين المستهدف إلى جانب LC-MS / MS يستخدم على نطاق واسع. في هذه الدراسة ، سعينا إلى تحديد مواقع EYFP-CENP-A K124R التي تستخدم استراتيجية قياس الطيف الكتلي (AP-MS). لذلك ، فإن الخطوة الرئيسية الأولى هي الحصول على كمية كبيرة من البروتين EYFP-CENP-A-A المطبّق في كل مكان مع نقاء عالي باستخدام الاعوّان من خلايا EYFP-CENP-A K124R المفرطة في التعبير، والتي يمكن أن تسهل إلى حد كبير تحديد وتأكيد مواقع EYFP-CENP-A K124R بواسطة LC-MS/MS. للحد من تدخل بروتين EYFP-CENP-A K124R غير المُوَكّن في كل مكان، تم تنفيذ بقع الغربية من المضادة لـ GFP، ها (Ub)، مكافحة Ubiquitin (انظر القسم [6.1.6])، وCoomassie تلطيخ الأزرق (انظر القسم [6.1.7]) لتحديد موقف EYFP-CENP-A على SDS-PAGE جل بدقة. وأخيرا، تم استئصال منطقة فقط من الحد الأدنى من النطاق هلام التي تحتوي على كل مكان EYFP-CENP-A K124R لعملية الهضم في هلام مقرونة مع LC-MS / MS للحصول على نتائج أفضل. عندما يتم إعادة تشكيل الببتيدات المجففة قبل التشغيل LC-MS/MS، 3٪ (v/v) الأسيتونيتريل /2٪ (v/v) حمض الفليك تم استخدامه للمساعدة في تحسين الذوبان ومعدل الاسترداد من الببتيدات. في بعض الأحيان يمكن أن يؤدي البحث في قاعدة البيانات في PTMs التي لا توجد حقا بسبب خوارزمية تعيين التقريبي من محرك البحث. وهكذا ، خطوة أخرى حاسمة هي تأكيد مواقع EYFP-CENP-A Ubiquitination عن طريق مراجعة MS / MS يدويًا من الببتيدات الموباءة بمساعدة البرامج F (جدول المواد) ، والتي يمكن أن تقضي على مواقع "غير واقعي" في كل مكان والتي تم إدخالها من قبل تعيين تقريبي من خلال البحث في قاعدة البيانات. وباختصار، فإن هذه الاستراتيجية AP-MS قد أنشأت خط أنابيب فعال وقوي لتحديد مواقع EYFP-CENP-A في كل مكان ذات أهمية بيولوجية حاسمة. والأهم من ذلك، يمكن توسيع نطاق هذا الأنبوب على نطاق واسع للتحقيق في PTMs من البروتينات الوظيفية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نشكر تشاو جون لي في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، جامعة نانجينغ لتحليل القياس الطيفي الكتلي. نشكر يانميني دلال، وتاتسو فوكاغاوا، والباحثين الحاليين في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، وجامعة نانجينغ ومعهد أبحاث سرطان الأطفال في غريهي على مناقشتهم المفيدة، والتوجيه التجريبي، والكواشف. نشكر دون و. كليفلاند، دانييلي فاشينيتي، يانميني دلال، مينه بوي، غوستافو دبليو ليون، جون طومسون، لورانس س. كيرشنر، عمروتا أشتيكار، بن إي بلاك، غلينيس أ. لوجسدون، كينجي تاغو، وداون س. تشاندلر على هداياهم السخية من الكواشف. وقد تم دعم Y.N. من قبل مقاطعة جيانغسو 'مزدوجة - من الدرجة الأولى' صندوق البناء ، صندوق العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (SBK2019021248)، ومقاطعة جيانغسو 16th ستة صندوق قمم المواهب الكبرى (TD-SWYY-001)، مقاطعة جيانغسو "برنامج المواهب مائة الخبراء الأجانب" صندوق (SBK2019010048)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970665). وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل NCI منحة R21 CA205659.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

علم الأحياء، الإصدار 160، السنترومير، الكينتوشوري، الانقسام، CENP-A، تعديل ما بعد الترجمة، PTM، في كل مكان، تحليل قياس الطيف الكتلي
تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter