Detta protokoll beskriver in vivo intracellulära inspelningen av råtta ländryggen motoneurons med samtidig trans-spinal direkt nuvarande stimulering. Metoden gör det möjligt för oss att mäta membranegenskaper och att registrera rytmisk bränning av motoneuroner före, under och efter anodal eller katodalpolarisering av ryggmärgen.
Intracellulära inspelning av spinal motoneurons in vivo ger en “guldmyntfot” för att bestämma cellernas elektrofysiologiska egenskaper i intakt spinal nätverket och har betydande fördelar i förhållande till klassisk in vitro eller extracellulära inspelningstekniker. En fördel med in vivo intracellulära inspelningar är att denna metod kan utföras på vuxna djur med ett fullt moget nervsystem, och därför kan många observerade fysiologiska mekanismer översättas till praktiska tillämpningar. I denna metodologiska papper beskriver vi detta förfarande i kombination med externt tillämpas konstant ström stimulering, som härmar polarisering processer som förekommer inom spinal neuronala nätverk. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) är en innovativ metod som alltmer används som en neuromodulatorisk intervention i rehabilitering efter olika neurologiska skador samt inom idrott. Påverkan av tsDCS på nervsystemet förblir dåligt förstådd och de fysiologiska mekanismerna bakom dess handlingar är till stor del okända. Tillämpningen av tsDCS samtidigt med intracellulära inspelningar gör det möjligt för oss att direkt observera förändringar av motoneuron membran egenskaper och egenskaper rytmisk bränning som svar på polariseringen av spinal neuronala nätverket, vilket är avgörande för förståelsen av tsDCS åtgärder. Dessutom, när det presenterade protokollet omfattar identifiering av motoneuron med avseende på en innervated muskel och dess funktion (flexor kontra extensor) samt den fysiologiska typen (snabb kontra långsam) det ger en möjlighet att selektivt undersöka påverkan av tsDCS på identifierade komponenter i spinal kretsar, som verkar vara annorlunda påverkas av polarisering. Det presenterade förfarandet fokuserar på kirurgiska förberedelser för intracellulära inspelningar och stimulering med tonvikt på de steg som är nödvändiga för att uppnå förberedelse stabilitet och reproducerbarhet av resultat. Detaljerna i metodiken för anodal- eller cathodal tsDCS-applikationen diskuteras samtidigt som man uppmärksammar praktiska frågor och säkerhetsfrågor.
Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) vinner erkännande som en potent metod för att modifiera spinal krets retbarhet i hälsa och sjukdom1,2,3. I denna teknik, en konstant ström skickas mellan en aktiv elektrod som ligger ovanför utvalda spinal segment, med en referenselektrod belägen antingen ventrally eller mer rostrally4. Flera studier har redan bekräftat att tsDCS kan användas vid hantering av vissa patologiska tillstånd, såsom neuropatisksmärta 5, spasticitet6, ryggmärgsskada7 eller för att underlätta rehabilitering8. Forskare föreslår att tsDCS framkallar förändringar i jonfördelningen mellan det intracellulära och det extracellulära utrymmet över cellmembranet, och detta kan antingen underlätta eller hämma neuronal aktivitet beroende på den nuvarandeinriktningen 9,10,11. Men tills nyligen, en direkt bekräftelse av detta inflytande på motoneurons saknades.
Här beskriver vi ett utförligt protokoll för att genomföra in vivo intracellulära registrering av elektriska potentialer från ryggradens spinal motoneurons i den sövda råttan med samtidig tillämpning av tsDCS, i syfte att observera förändringar i motoneuron membran och bränning egenskaper som svar på anodal eller cathodal polarisation av spinal neuronala nätverket. Intracellulära inspelningar öppna flera områden av utredning av neuron egenskaper, otillgänglig för tidigare använt extracelluläratekniker 9,12. Till exempel är det möjligt att exakt mäta motoneuron membran spänningsrespons på direktströmsflöde som induceras av tsDCS, för att indikera spänningströskel för spike generation, eller att analysera åtgärder potentiella parametrar. Dessutom gör denna teknik oss att bestämma motoneuron passiva membran egenskaper, såsom ingångsmotstånd, och att observera förhållandet mellan intracellulär stimuleringsström och frekvens av rytmisk bränning av motoneurons. Antidromic identifiering av inspelade motoneuron, baserat på stimulering av funktionellt identifierade nerver (dvs. nerver ger efferents till flexors eller extensors) tillåter oss att dessutom identifiera typer av innervated motor enheter (snabb kontra långsam), vilket ger en möjlighet att testa om polarisering påverkar olika enskilda delar av mogna spinal neuronala systemet. På grund av omfattande kirurgi föregår inspelningen och höga krav på stabilitet och tillförlitlighet av inspelningar, är denna teknik mycket utmanande men tillåter direkt och långsiktig bedömning av elektrofysiologiska egenskaper hos en motoneuron: före, under och efter tillämpning av tsDCS, som är avgörande för att avgöra både dess akuta åtgärder och långlivade effekter13. Som en motoneuron direkt aktiverar extrafusal muskelfibrer14 och tar del i återkoppling kontroll av en muskelkontraktion och utvecklat kraft15,16 någon observerad påverkan av tsDCS på motorenheten eller muskel kontraktil egenskaper kan kopplas till modulationer av motoneuron retbarhet eller bränning egenskaper.
Om den utförs korrekt, bör den kirurgiska delen av det beskrivna protokollet slutföras inom cirka tre timmar. Man bör vara särskilt noga med att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden hos ett djur under operationen, i synnerhet kroppstemperatur och djup anestesi. Bortsett från uppenbara etiska överväganden, kan en brist på korrekt anestesi resultera i överdriven lem rörelser under nerv dissekering eller laminectomy och leda till skador på preparatet eller en för tidig experiment uppsägning. Vid …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Center-anslaget nr 2017/25/B/NZ7/00373. Författare skulle vilja erkänna arbete Hanna Drzymała-Celichowska och Włodzimierz Mrówczyński, som båda bidragit till datainsamling och analys av resultaten som presenteras i denna uppsats.
Durgs and solutions | – | – | – |
Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
Glucose | Merck | 346351 | – |
NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
Tetraspan | Braun | – | HES solution |
Surgical equipment | – | – | – |
21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
Hemostat | FST | 13013-14 | – |
Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
Tracheal tube | – | – | Custom made |
Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
Sugrgical materials | – | – | – |
Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
Equipment | – | – | – |
Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
Miscellaneous | – | – | – |
1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
Cotton wool | – | – | – |
flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
Silver wire | – | – | For nerve electrodes |