Summary
Detta protokoll beskriver in vivo intracellulära inspelningen av råtta ländryggen motoneurons med samtidig trans-spinal direkt nuvarande stimulering. Metoden gör det möjligt för oss att mäta membranegenskaper och att registrera rytmisk bränning av motoneuroner före, under och efter anodal eller katodalpolarisering av ryggmärgen.
Abstract
Intracellulära inspelning av spinal motoneurons in vivo ger en "guldmyntfot" för att bestämma cellernas elektrofysiologiska egenskaper i intakt spinal nätverket och har betydande fördelar i förhållande till klassisk in vitro eller extracellulära inspelningstekniker. En fördel med in vivo intracellulära inspelningar är att denna metod kan utföras på vuxna djur med ett fullt moget nervsystem, och därför kan många observerade fysiologiska mekanismer översättas till praktiska tillämpningar. I denna metodologiska papper beskriver vi detta förfarande i kombination med externt tillämpas konstant ström stimulering, som härmar polarisering processer som förekommer inom spinal neuronala nätverk. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) är en innovativ metod som alltmer används som en neuromodulatorisk intervention i rehabilitering efter olika neurologiska skador samt inom idrott. Påverkan av tsDCS på nervsystemet förblir dåligt förstådd och de fysiologiska mekanismerna bakom dess handlingar är till stor del okända. Tillämpningen av tsDCS samtidigt med intracellulära inspelningar gör det möjligt för oss att direkt observera förändringar av motoneuron membran egenskaper och egenskaper rytmisk bränning som svar på polariseringen av spinal neuronala nätverket, vilket är avgörande för förståelsen av tsDCS åtgärder. Dessutom, när det presenterade protokollet omfattar identifiering av motoneuron med avseende på en innervated muskel och dess funktion (flexor kontra extensor) samt den fysiologiska typen (snabb kontra långsam) det ger en möjlighet att selektivt undersöka påverkan av tsDCS på identifierade komponenter i spinal kretsar, som verkar vara annorlunda påverkas av polarisering. Det presenterade förfarandet fokuserar på kirurgiska förberedelser för intracellulära inspelningar och stimulering med tonvikt på de steg som är nödvändiga för att uppnå förberedelse stabilitet och reproducerbarhet av resultat. Detaljerna i metodiken för anodal- eller cathodal tsDCS-applikationen diskuteras samtidigt som man uppmärksammar praktiska frågor och säkerhetsfrågor.
Introduction
Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) vinner erkännande som en potent metod för att modifiera spinal krets retbarhet i hälsa och sjukdom1,2,3. I denna teknik, en konstant ström skickas mellan en aktiv elektrod som ligger ovanför utvalda spinal segment, med en referenselektrod belägen antingen ventrally eller mer rostrally4. Flera studier har redan bekräftat att tsDCS kan användas vid hantering av vissa patologiska tillstånd, såsom neuropatisksmärta 5, spasticitet6, ryggmärgsskada7 eller för att underlätta rehabilitering8. Forskare föreslår att tsDCS framkallar förändringar i jonfördelningen mellan det intracellulära och det extracellulära utrymmet över cellmembranet, och detta kan antingen underlätta eller hämma neuronal aktivitet beroende på den nuvarandeinriktningen 9,10,11. Men tills nyligen, en direkt bekräftelse av detta inflytande på motoneurons saknades.
Här beskriver vi ett utförligt protokoll för att genomföra in vivo intracellulära registrering av elektriska potentialer från ryggradens spinal motoneurons i den sövda råttan med samtidig tillämpning av tsDCS, i syfte att observera förändringar i motoneuron membran och bränning egenskaper som svar på anodal eller cathodal polarisation av spinal neuronala nätverket. Intracellulära inspelningar öppna flera områden av utredning av neuron egenskaper, otillgänglig för tidigare använt extracelluläratekniker 9,12. Till exempel är det möjligt att exakt mäta motoneuron membran spänningsrespons på direktströmsflöde som induceras av tsDCS, för att indikera spänningströskel för spike generation, eller att analysera åtgärder potentiella parametrar. Dessutom gör denna teknik oss att bestämma motoneuron passiva membran egenskaper, såsom ingångsmotstånd, och att observera förhållandet mellan intracellulär stimuleringsström och frekvens av rytmisk bränning av motoneurons. Antidromic identifiering av inspelade motoneuron, baserat på stimulering av funktionellt identifierade nerver (dvs. nerver ger efferents till flexors eller extensors) tillåter oss att dessutom identifiera typer av innervated motor enheter (snabb kontra långsam), vilket ger en möjlighet att testa om polarisering påverkar olika enskilda delar av mogna spinal neuronala systemet. På grund av omfattande kirurgi föregår inspelningen och höga krav på stabilitet och tillförlitlighet av inspelningar, är denna teknik mycket utmanande men tillåter direkt och långsiktig bedömning av elektrofysiologiska egenskaper hos en motoneuron: före, under och efter tillämpning av tsDCS, som är avgörande för att avgöra både dess akuta åtgärder och långlivade effekter13. Som en motoneuron direkt aktiverar extrafusal muskelfibrer14 och tar del i återkoppling kontroll av en muskelkontraktion och utvecklat kraft15,16 någon observerad påverkan av tsDCS på motorenheten eller muskel kontraktil egenskaper kan kopplas till modulationer av motoneuron retbarhet eller bränning egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som är anslutna till detta protokoll har godtagits av lämpliga myndigheter (t.ex. lokala etikkommittén) och följer de nationella och internationella bestämmelserna om djurskydd och förvaltning.
OBS: Varje deltagare som deltar i förfarandet måste vara ordentligt utbildad i grundläggande kirurgiska ingrepp och måste ha en giltig licens för att utföra djurförsök.
1. Anestesi och premedicinering
- Söva en råtta med intraperitoneala injektioner av natriumpentobarbital (en initial dos på 60 mg·kg-1 för 6 månader gamla manliga Wistar-råttor som väger 400\u2012550g).
OBS: Detta protokoll är inte begränsat till den angivna stam, kön eller ålder av råttor. Också, alternativ anestesi såsom ketamin-xylazine mix, alfa-kloralose eller fentanyl +midazolam+medetomidin kan användas om mer lämpade för olika forskningsmål eller när det krävs av etikkommittén. - Efter ungefär 5 min, kontrollera anestesidjupet genom att nypa råttans bakbenstå med trubbiga tövråkar. Fortsätt med nästa steg i protokollet endast när ingen reflexåtgärd observeras.
- Injicera 0,05 mL atropin subkutant för att minska slemproduktionen efter intubation.
- Injicera subkutant 5 mL fosfatbuffert innehållande 4% glukoslösning, NaHCO3 (1 %) och gelatin (14%). Denna buffert kommer att absorberas av de testningskärl under hela ett experiment och kommer att bidra till att upprätthålla vätskebalansen.
- Under hela operationen, kontrollera regelbundet djuret för reflex åtgärder och komplettera anestesi om det behövs (10 mg·kg-1·h-1av natrium pentobarbital).
2. Kirurgi
- Förbered djuret för kirurgisk behandling genom rakpäls över den ryggasala delen av den vänstra bakklättern, från vristen till höften, baksidan, från svans till de höga bröstkorgssegmenten, vänster sida av bröstet och halsområdets ventrala sida ovanför bröstbenet
- Placering av den intravenösa linjen
- Placera råttan på ryggen på en sluten värmedyna (och säkra den med lemfixeringar).
- Med hjälp av en 21 blad, gör en längsgående skär genom huden från ett bröstben till en haka.
- Håll huden med tuts och separera den från den underliggande vävnaden.
- Använda trubbiga dissektion tekniker exponera rätt halsvenen. Dissekera försiktigt venen från omgivande vävnader.
- Leta upp den del av venen utan förgreningspunkter, slip två 4-0 ligaturer under den.
- Gör en lös knut på den proximala änden av den tidigare identifierade icke-förgrening segment av venen och en lös knut på den distala änden av detta segment av venen. Kläm venen proximalt till hjärtat, och sedan ligate den distala delen av venen.
- Använda iris sax, gör ett snitt mellan klämman och avlägsna ligatur. Håll en flik av venen, och införa en förfylld kateter till den punkt där den blockeras av klämman.
- Medan du håller venen och katetern tillsammans med tänjas, ta bort klämman och tryck katetern flera millimeter i venen. Säkra båda ändarna av katetern till venen, och lägg till en extra fixeringspunkt på huden.
- Introduktion av trakealröret
- Använda trubbiga tuppar separera de två mandibular körtlar som täcker sternohyoid musklerna. Separata sternohyoid muskler vid mittlinjen att exponera luftstrupen.
- Slip tre 4-0 ligaturer under luftstrupen, gör sedan två knop under trakeal tube insättningspunkten och en knut ovan.
- Lokalisera cricoid brosk av struphuvudet och göra ett snitt under den tredje trakeal brosk.
- Sätt i ett trakealrör ner i luftstrupen och säkra röret på plats med förberedda ligaturer, tillsätt sedan ytterligare en ligatur i huden.
- Placera en liten bit bomullsull ovanför de separerade musklerna, och suturera huden över det opererade området.
- Dissektion av bakben nerver
- Använda 21 blad, gör en längsgående snitt på den bakre sidan av den vänstra bakbenen, från hälsenan till höften.
- Ta tag i huden med tärna, och med hjälp av trubbiga dissektion tekniker separera huden från underliggande muskler på båda sidor av snittet.
- Lokalisera popliteal fossa på baksidan av knäleden, som omfattas av biceps femoris muskel, och med hjälp av sax göra ett snitt mellan den främre och bakre delen av denna muskel.
- Flytta uppåt skära två huvuden av biceps femoris hela vägen till höften för att exponera den sciatic nerven. Cauterize efter behov för att förhindra blödning.
- Identifiera skulotiska, tibial och gemensamma peroneal grenar av sciatic nerv.
- Med hjälp av sax, separera laterala från mediala huvudet av gastrocnemius muskeln att exponera tibial nerv och dess grenar.
- Använda 55 tlyckor ta den distala änden av sural nerv, skär den distalt och dissekera så långt som möjligt.
- Upprepa proceduren med den gemensamma peronealnerven.
- Med hjälp av en trubbig glasstav separera tibial nerven från omgivande vävnader, var noga med att inte skada blodkärlen, och skär den distally.
- Identifiera de mediala gastrocnemius (MG) och de laterala gastrocnemius och soleus (LGS) nerver.
- Med hjälp av 55 tlysningar, försiktigt dissekera MG och LGS nerver, koppla bort dem från omgivande vävnader, men behålla sin anslutning till respektive muskler.
- Placera en saltlösning-indränkt bit bomullsull under de exponerade nerverna.
- Stäng huden över det opererade området.
- Laminektomi
- Använda 21 blad göra en längsgående snitt från korsbenet upp till bröstkotorna.
- Separera huden från underliggande muskler.
- Skär longissimus muskeln på båda sidor av bröst- och ländryggen spinous processer.
- Använda trubbig kantad skalpell dra tillbaka musklerna från ryggraden för att exponera de tvärgående processerna i varje kota.
- Använda trubbig spets sax skära senor av muskler som är anslutna till de tvärgående processer längs den exponerade ryggraden. Applicera hemostatiska medel om det behövs.
- Identifiera Th13-kotan som det lägsta bröstsegmentet med revbensinsättning och med hjälp av fina rongeurs avlägsna spinösa processer och laminae från Th13 till L2 kotor för att exponera ländryggen segment av ryggmärgen. Kom ihåg att inte skada L3 spinous process som kommer att användas som en fixeringspunkt för ryggraden stabilisering.
- Ta bort Th12-spinous-processen och jämna ut ryggkotans yta så mycket som möjligt.
- Använda trubbiga dissektion tekniker separera musklerna från Th11 kota för att skapa hållare insättningspunkter.
- Placera tunn saltlösningsindränkt bomullsull över de exponerade ryggmärgssegmenten.
- Flytta råttan till den specialtillverkade metallramen med två parallella stänger och två justerbara armar med klämmor för att stödja och stabilisera ryggraden.
3. Förberedelse för inspelningen och stimuleringen
- Kotpelare fixering och nerv arrangemang
- Placera råttan i den specialtillverkade ramen på en värmedyna, ansluten till värmesystemet med sluten slinga för att bibehålla djurens kroppstemperatur vid 37 ± 1°C.
- Sätt in EKG-elektroder under huden och anslut till en förstärkare för pulsövervakning.
- Med hjälp av hudflikarna, bilda en djup pool över den exponerade ryggmärgen.
- Med hjälp av metallklämmor, fixera kotpelaren genom att sätta klämmor under Th12 tvärgående processer och vid L3 spinous process.
- Se till att kotpelaren är säkrad och anordnad horisontellt, och applicera sedan dorso-ventralt tryck på båda sidor av kolonnen för att dra tillbaka musklerna.
- Fyll poolen med varm (37 °C) mineralolja och bibehåll den vid denna temperatur.
- Trä en 4-0 ligatur genom hälsenan, lyft och sträck den opererade vänstra bakbenen så att fotleden är planad med höften.
- Använda huden klaffar göra en djup pool över den exponerade tibial, MG och LGS nerver.
- Fyll poolen med varm (37 °C) mineralolja.
- Placera MG och LGS nerver på bipolär silver-tråd stimulerande elektroder och anslut dem till en kvadratisk puls stimulator. Använd separata stimuleringskanaler för varje nerv.
- Placering av ytelektrod
- Placera en silverkulelektrod på den vänstra caudalsidan av den exponerade ryggmärgen, med en referenselektrod insatt i ryggmusklerna, och anslut båda elektroderna till differential-DC-förstärkaren. Ytan bollen elektrod kommer att användas för att spela in afferent volleys från nerver.
- Med hjälp av en konstantströmsstimulator stimulerar du MG- och LGS-nerverna med kvadratiska pulser på 0,1 ms varaktighet, upprepas med en frekvens på 3 Hz och observera afferenta volleys.
- Bestäm tröskeln (T) för nervaktivering, stimulera varje nerv vid ungefär 3· T intensitet, och spela in amplitud av afferent volley för varje nerv.
- Flytta ytan elektrod rostral och upprepa förfarandet för att identifiera spinal segment där amplituderna av volleys är den högsta för varje nerv. Efter att ha fastställt den maximala volleyplatsen, flytta ytelektroden till ett säkert avstånd från ryggmärgen.
- Muskelförlamning och bildar en lungkollaps för att minska andningsrörelser
- Paralysera råttan intravenöst med en neuromuskulär blockerare och anslut trakealröret till en extern ventilator i linje med en gnagarkompatibel capnometer (Pancuroniumbromid, vid en initial dos på 0,4 mg·kg-1, kompletterad var 30 min i doser på 0,2 mg·kg-1)
- Övervaka ändvatten-TIDAL CO2-koncentrationen och bibehåll den vid ca 3\u20124% genom att justera ventilationsparametrar (frekvens, lufttryck och flödesvolymer).
- Gör ett längsgående snitt i huden mellan 5:e och 6:e revbenet på en sida av inspelningen.
- Med hjälp av trubbig spets sax skära överlydande muskler för att visualisera intercostal utrymme mellan revbenen.
- Använda små skarpa saxar, gör ett litet snitt i interkosamusklerna och i lungsäcken, sätt sedan in en spets av en trubbig kant tåta i öppningen, var noga med att inte trycka på lungorna.
- Låt tlysen att expandera eller sätta in ett litet rör för att hålla pneumothorax öppen under hela experimentet.
- Efter neuromuskulära blocket, övervaka anestesidjup genom att kontrollera EKG frekvens, och komplettera bedövningsmedel om hjärtfrekvensen överstiger 400 bpm. Muskelförlamning och bildar en lungkollaps för att minska andningsrörelser, vilket kommer att förbättra registreringen stabilitet
- Öppna dura och pia mater
- Använd #55 tuppar, lyft försiktigt dura mater, och skär den caudally från L5 segmentet, rostrally upp till L4 segmentet.
- Med hjälp av ett par ultratunna 5SF-pinjerna gör ett litet plåster i pia som täcker dorsala kolonnen, mellan blodkärlen, exakt på nivån för den maximala afferenta volley från MG eller LGS-nerven.
- Använd små bitar av saltlösningsindränkt och torkat gelskum för att vid behov blockera blödning.
- tsDCS-elektrodplacering
- Gör ett litet snitt i huden på den ventrala sidan av en råtta buk på rostro-caudal nivå som motsvarar platsen för L4-L5 spinal segment.
- Ta tag i den exponerade hudklaffen med ett metallklipp som kommer att fungera som en referenselektrod.
- Placera en saltlösning-indränkt svamp på ryggsidan av Th12 kotan. Kontrollera att svampstorleken är lika stor som hos en aktiv tsDCS-elektrod (cirkelformad rostfri stålplatta på 5 mm i diameter).
- Med hjälp av en fin manipulator trycker du svampen med en aktiv tsDCS-elektrod mot benet och se till att hela ytan på elektroden pressas lika.
- Anslut både referens och aktiva tsDCS-elektroder till en konstantströmsstimulatorenhet, som kan leverera ett kontinuerligt flöde av direktström.
- Beredning av mikropipetter
- Med hjälp av en mikroelektroddragare, förbered en mikroelektrod.
OBS: Både glödtråd och icke-glödtrådselektroder kan användas, dock komma ihåg att skaftet av elektroden måste vara tillräckligt lång för att nå det ventrala hornet samtidigt som den är tillräckligt tunn för att inte komprimera ryggmärgen medan fallande.- Justera dragarinställningen så att skaftet som kommer in i ryggmärgen blir cirka 3 mm långt, medan spetsen på elektroden är högst 1\u20122 μm i diameter och mikroelektrodmotståndet är mellan 10 och 20 MΩ.
- Fyll mikroelektroderna med 2M kaliumcitratelektrolyt.
- Montera den förberedda mikroelektoden på mikromanipulatorn som tillåter 1\u20122 μm stegrörelse och stereotaxisk kalibrering.
- Anslut mikroelektroden till den intracellulära förstärkaren med referenselektroden placerad i ryggmusklerna.
- Med hjälp av en mikroelektroddragare, förbered en mikroelektrod.
- Efter neuromuskulära blocket, övervaka anestesi djup genom att kontrollera EKG frekvens, och komplettera bedövningsmedel så att råtta hjärtfrekvensen inte överstiger 400 bpm.
4. Motoneuron spårning och penetration
- Placera afferent volley inspelning elektrod tillbaka på ryggytan av ryggmärgen, caudally till platsen för inspelningsplatsen, på nivån för L6-segmentet.
- Stimulera MG och LGS nerver med elektriska 0,1 ms pulser vid en frekvens av 3 Hz, och 3T intensitet, att aktivera alla axoner av alfa-motoneurons inom en vald nerv.
- Kör mikropipettet in i ett valt plåster i pia med en medio-lateral vinkel på 15\u201220° (med en spets riktad i laterled).
- Efter fallande under ytan, kalibrera mikroelektroden och kompensera dess kapacitans och spänningsoffset, och fortsätta penetration av ryggmärgen när alla parametrar är stabila. En antidromic fältet potential motoneuron poolen kommer att vara synlig vid microelectrode spänning spår samtidigt närmar sig en dedikerad motor kärna under stimulering av respektive nerv.
- Fortsätt penetration med mikroelektroden vid 1\u20122 μm steg, och med jämna mellanrum använda den intracellulära förstärkarens buzzfunktion för att rensa elektrodspetsen från eventuella rester.
- Observera motoneuron penetration som kommer att kännetecknas av en plötslig hyperpolarisering av den inspelade spänningen spår och utseende av en antidromic spike potential.
5. Registrering motoneuron membran och bränning egenskaper
- I en bro läge av den intracellulära förstärkaren, identifiera motoneuron på grundval av "allt-eller-ingenting" utseende av den antidromic åtgärder potential genom att stimulera respektive nerv grenar. Rekord 20 efterföljande spår för senare genomsnitt.
- Genomföra ett strikt inklusionskriterium för att säkerställa data av hög kvalitet: vilomembranpotential på minst -50 mV i amplitud; åtgärder potentiella amplituder större än 50 mV, med ett positivt överskridande; membranpotentialen stabil i minst 5 min före inspelningen.
- I ett diskontinuerligt läge för ström-kläm (nuvarande växelhastighetsläge 4–8 kHz) av den intracellulära förstärkaren framkallar du en ortodromisk aktionspotential i en motoneuron med hjälp av 0,5 ms intracellulära avpolariserande strömpulser. Upprepa minst 20 gånger för offline medelvärde.
- Stimulera en motoneuron med 40 korta pulser (100 ms) hyperpolariserande ström (1 nA) för att beräkna cellernas ineffektsmotstånd.
- Stimulera en motoneuron med 50 ms fyrkantsvågspulser vid ökande amplituder för att bestämma rheobasevärdet som den minsta amplituden av depolariserande ström som krävs för att framkalla en enda spik.
- Injicera 500 ms square-wave pulser av depolariserande ström, vid ökande amplituder i steg av 0,1–2 nA för att framkalla rytmiska urladdningar av motoneuroner.
6. Trans-spinal direktströmsstimulering (tsDCS)
- Samtidigt som en stabil penetration av motoneuron, starta polariseringsproceduren genom trans-spinal tillämpning av direktström. Justera aktuell intensitet och appliceringstid till experimentdesignen (t.ex. 0,1 mA i 15 min).
- Omedelbart efter att ha slagit på DC, observera motoneuron membranpotentialen. Anodal polarisering (den aktiva elektroden som en anod) bör resultera i depolarisering av membranet potential, medan katodal polarisering (den aktiva elektroden som katod) bör framkalla en motsatt effekt. Observera om en förändring av vilomembranpotentialen som svar på DC-stimulering är konstant, vilket säkerställer att elektrisk fältintensitet inte påverkas.
- Under kontinuerlig aktuell tillämpning upprepar du steg 5.3\u20125.6 i 5 min intervaller.
- Stäng av DC och fortsätta att upprepa steg 5.3\u20125.6 i 5 min intervaller tills inspelningar blir instabila eller inklusionskriterier äventyras.
- Avsluta försöket och avliva djuret med hjälp av intravenös administrering av en dödlig dos av pentobarbital natrium (180 mg·kg-1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parametrar för aktionspotentialer och flera membranegenskaper kan beräknas på basis av intracellulära inspelningar när stabila förhållanden för cellgenomträngning säkerställs. Figur 1A presenterar en typisk orthodromic åtgärder potential framkallas av intracellulära stimulering, som uppfyller alla kriterier för data integration (den vilande membran potentialen på minst -50 mV, och spike amplitud högre än 50 mV, med en positiv överskridande). Åtgärd potentiella parametrar, såsom spike amplituden, den afterhyperpolarization amplitud eller efterhyperpolarization halv-förfall tid (AHP-HDT) kan mätas. Ett värde på den senare parametern i rat motoneurons fungerar som ett tillförlitligt kriterium för att skilja mellan snabba och långsamma motoneurons (AHP-HDT > 20 ms för långsam, medan AHP-HDT <20 ms för snabba motoneurons)17. Bild 1B visar ett cellsvar på en 100 ms hyperpolariserande strömpuls på 1nA, från vilken både topp- och platåingångsmotstånd (IR) hos en motoneuron kan bestämmas från spänningsutböjningen. Figur 1C visar ett expanderat spänningsspår av en rheobasic spike med en tydligt markerad spänningströskel av spiken, som anger nivån av membrandepolarisering vid vilken spänningsgrindade natriumkanaler aktiveras för att initiera aktionspotentialen. Alla dessa inspelningar kan upprepas flera gånger under och efter tsDCS ansökan, vilket gör att vi jämför respektive parametrar så länge som vilomembran potential är stabil och andra kriterier för stimulering och inspelning protokoll är uppfyllda.
Flera studier har indirekt visat att tsDCS förändrar motoneuron retbarhet och bränning mönster9,18. Figur 2 visar exempel på intracellulära spänningsspår från två motoneurons stimuleras intracellulärt med 500 ms kvadratiska pulser av depolariserande ström före, under och efter tsDCS ansökan. Under stabila förhållanden kan inspelningar som upprepas flera minuter efter varandra utföras, och motoneuron bränning mönster kan jämföras på ett tillförlitligt sätt. Anodal (+) tsDCS befanns agera mot ökad motoneuron retbarhet och högre frekvenser av rytmisk bränning (Figur 2A), medan katodal (-) tsDCS agerat mot bränning hämning (Figur 2B). Dessutom, effekterna av båda typerna av tsDCS överlevde perioden av polarisering. det är också värt att notera att de observerade förändringarna i retbarhet och bränning mönster är inte bara ett resultat av cellmembranet depolarisation eller hyperpolarization av anodal eller katodal tsDCS, respektive, men visa djupgående förändringar inte är relaterade till byte av ett membran potential, eftersom de kvarstod trots att denna parameter återvände till en baslinje efter utgången av polarisering.
Slutligen måste det betonas att eventuella avvikelser från det presenterade protokollet sannolikt kommer att resultera i ett misslyckat experiment, på grund av försämring av förberedelserna och/eller en djupgående nedgång av datatillförlitlighet. Figur 3 visar exempel på registreringar när data inklusionskriterier komprometterades antingen på grund av ofullkomlig cellpenetration (Figur 3A), försummelse för att kompensera mikroelektodresistens och kapacitans (Figur 3B) eller en ryggradssmide instabilitet (Figur 3C). Det är viktigt att forskare identifierar sådana icke-optimala inspelningar, och genomför korrekta korrigerande åtgärder eller bortser från sådana resultat från datamängden.
Figur 1: Parametrar för aktionspotentialer och membranegenskaper.
(A) En orthodromic handling potential framkallas genom intracellulär stimulering, med indikerade grundläggande parametrar som kan beräknas från denna post. AP ampl = åtgärd potential amplitud; AHP ampl = efterhyperpolarisering amplitud; AHP-HDT = efterhyperpolarisering halvtidsförfall tid. (B) Spänningsspåret av ett membransvar på en kort (100 ms) depolariserande strömpuls på 1nA-intensitet, vilket gör det möjligt för oss att beräkna inspänningsmotstånd (IR). Lägg märke till toppen av en potentiell nedböjning (IR Peak) följt av en liten minskning och följande platåfas av membranpotentialen (IR-platå). (C) Den utökade spänningen spår av en rheobasic spike med en prickad horisontell linje som anger spike spänningströskeln. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Effekter av polarisering på motoneuron bränning.
(A) Intracellulära poster från en motoneuron stimuleras intracellulärt med 7,5 nA för 500 ms, som gjorts före (vänster), under anodal tsDCS (0,1 mA, mitten), och 10 min efter slutet av polarisering (höger). Notera den gradvisa ökningen av motoneuron retbarheten med samma stimulansintensitet. (B) Intracellulära poster från en annan motoneuron stimuleras intracellulärt med 6 nA för 500 ms, som gjorts före (vänster), under cathodal tsDCS (0,1 mA, mitten), och 10 min efter slutet av polarisering (höger). Notera en gradvis hämning av motoneuron avfyrningsfrekvens med samma stimulansintensitet. Nedan inspelningar tillhandahålls spår av intracellulär stimuleringsström. Kalibreringsstaplarna i den nedre högra gäller för alla presenterade intracellulära inspelningar. Värdena för vilomembranpotentialen tillhandahålls till vänster om varje registrering. Frekvenser av steady-state bränning, beräknas från de medel som de sista tre interspike intervaller, ges ovanför poster. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Exempel på suboptimala poster till följd av avvikelser från försöksprotokollet.
(A) Den antidromic spike registreras från en motoneuron otillräckligt penetrerade. Den vilande membran potentialen är otillräcklig (-45 mV), och trots en lämplig form av spiken med alla på varandra följande faser av depolarisering, repolarisation och hyperpolarisering, dess amplitud är för låg (41 mV) och utan ett överskridande. (B) En rheobasic spike genereras vid en orealistisk spänning tröskel (membran depolarized till +68 mV). Denna typ av fel beror oftast på en blockerad mikroelektrod, med okompenserat motstånd och kapacitans. Man kan också se att denna post är starkt förorenad av 50 Hz elektriskt brus. (C) En motoneuron rytmisk bränning som svar på 500 ms depolariserande ström, med stora fluktuationer av en membranpotential, främst orsakad av instabil mikroelektrodpenetration, eventuellt på grund av överdrivna andningsrörelser. För alla de presenterade fall den beräknade membran eller bränning egenskaper skulle vara otillförlitliga. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om den utförs korrekt, bör den kirurgiska delen av det beskrivna protokollet slutföras inom cirka tre timmar. Man bör vara särskilt noga med att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden hos ett djur under operationen, i synnerhet kroppstemperatur och djup anestesi. Bortsett från uppenbara etiska överväganden, kan en brist på korrekt anestesi resultera i överdriven lem rörelser under nerv dissekering eller laminectomy och leda till skador på preparatet eller en för tidig experiment uppsägning. Vid förlamning ett djur innan penetrerande ryggmärgen med en mikroelektrod, är det avgörande att övervaka djupet av anestesi och hjärtfrekvens och att tillämpa korrekt ventilationsparametrar baserat på djurvikt och lungkapacitet. Eventuella avvikelser från de önskade fysiologiska parametrarna måste ändras omedelbart för att säkerställa förfarandet framgång. Efter operationen bör stabila inspelningsförhållanden vara möjliga att upprätthålla i minst fyra timmar.
Efter penetration av en motoneuron är inspelningsstabiliteten av hög betydelse. Det är absolut nödvändigt att en membranpotential förblir konstant under kontrollinspelningar, eftersom eventuella fluktuationer kommer att påverka reobasströmmen och en tröskel för rytmisk bränning. Korrekt fixering av kotpelaren bör ge grundläggande stabilitet, medan målet med en pneumothorax är att minska ryggmärgen rörelser framkallas genom andning. Dessutom måste man vara säker på att muskelsammandragningar är helt avskaffas innan du försöker penetrationen och neuromuskulära blockerare administreras med jämna mellanrum.
Efter en lyckad penetration antidromic identifiering av den inspelade motoneuron kan utföras genom stimulering av en respektive nerv gren. Detta är en verklig fördel med en in vivo beredning, där motoneuron axoner hålls i kontinuitet med de innervated musklerna i hänvisning till in vitro intracellulära inspelningar utförs på spinal skivor, som först nyligen var möjliga i vuxna djur16, men inte tillåter identifiering av inspelade motoneuron. Det är dock viktigt att forskarna har en klar förståelse för skillnaden mellan antidromic och orthodromic aktivering av motoneuron19 för att undvika feltolkning av data. Det är viktigt att hålla den perifera nervstimuleringen så låg som möjligt (mindre än 0,5 V) för att förhindra aktivering av ytterligare nerver på grund av den aktuella spridningen och att uppmärksamma en konstant och kort latens av den antidromic spike19.
En annan fördel med den presenterade tekniken är att motoneurons kan dessutom klassificeras som snabba eller långsamma typer på grundval av deras åtgärder potentiella parametrar, nämligen den AHP-HDT varaktighet17. Differentiering mellan motoneurons innervating snabb-typ och långsam-typ muskelfibrer är avgörande när det gäller deras olika bidrag till muskelprestanda under rörelser. Dessutom kan snabba och långsamma motoneuroner reagera annorlunda på polarisationen9.
För att säkerställa tillförlitliga resultat av polarisering man bör vara uppmärksam på att ställa in korrekt parametrar för tsDCS. Nuvarande intensitet bör, å ena sidan, ge en önskad fältdensitet vid det valda området för att framkalla effekter på neuronala nätverk, medan å andra sidan bör ligga inom säkerhetsgränser för vävnadsskada20. Storlek på aktiva och referenselektroder och deras placering med avseende på en plats för inspelning är också viktiga delar att överväga4, och tsDCS varaktighet ansökan tid bör vara tillräcklig för att framkalla de önskadeeffekterna 16,17,22. I detta metodpapper erhölls de representativa resultaten genom applicering av 100 μA-katodal eller anodalpolarisering under 15 min. Med hänsyn till elektrodformen och diametern var respektive elektrisk fältintensitet direkt under elektroden 39,25 μA·mm2. Man bör dock förstå att det exakta värdet av det elektriska fältet på den inspelade motoneuron platsen är omöjligt att förbestämma som motoneuron plats med avseende på polarisering elektrod varierar, och e-fältet densitet sjunker betydligt med ökat djup och minskad elektrod storlek4,24. Dessutom är inriktningen på motoneuronfacken i förhållande till det tillämpade elektriska fältet viktigt för generering av aktionspotentialer22,25,26, och detta kan inte förutsägas för enskilda celler. Dessutom är det mycket viktigt att förstå att tsDCS effekter inte är begränsade till en period av polarisering, och att ihållande, långvariga effekter är väl dokumenterade22,27. Därför efter även en enda, kort polarisering session alla successiva inspelningar i samma preparat skulle utföras i post-polarisering villkor, som begränsar antalet möjliga akut polarisering inspelningar till en per djur.
Ytterligare ändringar av det framlagda förfarandet kan göras för att besvara specifika forskningsfrågor. Detta protokoll med minimala modifieringar kan användas som standard för flera experimentella konstruktioner, t.ex. Användning av flera genetiska sjukdomsmodeller (till exempel SOD1 G93A-råttamodell av amyotrofisk lateral skleros) eller olika nerver för antidromisk nervaktivering (peroneal, tibial, saphenous, etc.) är acceptabelt. Man bör dock också vara medveten om förfarandebegränsningar. Till exempel hämmar användningen av barbiturater för anestesi aktiviteten hos ihållande inåtströmmar28, medan det systemiska införandet av specifika blockerare som vanligen används i vitropreparat (t.ex. stryknin för att blockera nikotinreceptorer) kan visa sig vara dödligt för djuret. Det är lämpligt för forskare att överväga dessa begränsningar innan du väljer rätt experimentella protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Center-anslaget nr 2017/25/B/NZ7/00373. Författare skulle vilja erkänna arbete Hanna Drzymała-Celichowska och Włodzimierz Mrówczyński, som båda bidragit till datainsamling och analys av resultaten som presenteras i denna uppsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
