Summary
Denne protokol beskriver in vivo intracellulær registrering af rotte lumbal motoneuroner med samtidig trans-spinal jævnstrøm stimulation. Metoden gør det muligt for os at måle membranegenskaber og registrere rytmisk affyring af motoneuroner før, under og efter anodal eller katodal polarisering af rygmarven.
Abstract
Intracellulær registrering af spinal motoneurons in vivo giver en "guldstandard" til bestemmelse af cellernes elektrofysiologiske egenskaber i det intakte spinalnetværk og har betydelige fordele i forhold til klassiske in vitro- eller ekstracellulære optagelsesteknikker. En fordel ved in vivo intracellulære optagelser er, at denne metode kan udføres på voksne dyr med et fuldt modent nervesystem, og derfor kan mange observerede fysiologiske mekanismer oversættes til praktiske anvendelser. I dette metodologiske papir beskriver vi denne procedure kombineret med eksternt anvendt konstant strømstimulation, som efterligner polariseringsprocesser, der forekommer inden for spinal neuronal netværk. Trans-spinal jævnstrøm stimulation (tsDCS) er en innovativ metode i stigende grad anvendes som en neuromodulatorisk intervention i rehabilitering efter forskellige neurologiske skader samt i sport. TsDCS' indflydelse på nervesystemet er fortsat dårligt forstået, og de fysiologiske mekanismer bag dets handlinger er stort set ukendte. Anvendelsen af tsDCS samtidig med intracellulære optagelser gør det muligt for os direkte at observere ændringer af motoneuronmembranegenskaber og karakteristika for rytmisk fyring som reaktion på polariseringen af spinalneuronenettet, hvilket er afgørende for forståelsen af tsDCS-handlinger. Desuden, når den præsenterede protokol omfatter identifikation af motoneuron med hensyn til en innervated muskel og dens funktion (flexor versus extensor) samt den fysiologiske type (hurtig versus langsom) det giver mulighed for selektivt at undersøge indflydelse tsDCS på identificerede komponenter af spinal kredsløb, som synes at være forskelligt påvirket af polarisering. Den præsenterede procedure fokuserer på kirurgisk forberedelse til intracellulære optagelser og stimulering med vægt på de trin, der er nødvendige for at opnå forberedelsestabilitet og reproducerbarhed af resultater. Detaljerne i metoden til anodal eller katodal tsDCS ansøgning drøftes, mens der lægges vægt på praktiske og sikkerhedsmæssige spørgsmål.
Introduction
Trans-spinal jævnstrøm stimulation (tsDCS) vinder anerkendelse som en potent metode til at ændre spinal kredsløb ophidselse i sundhedogsygdom1,2,3. I denne teknik overføres der en konstant strøm mellem en aktiv elektrode placeret over udvalgte spinalsegmenter, med en referenceelektrode placeret enten ventralt eller mere rostrally4. Flere undersøgelser har allerede bekræftet, at tsDCS kan anvendes til at styre visse patologiske tilstande, såsom neuropatiskesmerter 5,spasticitet6, rygmarvsskade7 eller for at lette rehabilitering8. Forskere tyder på, at tsDCS fremkalder ændringer i ionfordelingen mellem det intracellulære og det ekstracellulære rum på tværs af cellemembranen, og dette kan enten lette eller hæmme neuronal aktivitet afhængigt af den aktuelle orientering9,10,11. Indtil for nylig manglede der imidlertid en direkte bekræftelse af denne indflydelse på motoneuroner.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at foretage in vivo intracellulær registrering af elektriske potentialer fra lumbal spinal motoneurons i bedøvet rotte med samtidig anvendelse af tsDCS, med henblik på at observere ændringer i motoneuron membran og fyring egenskaber som reaktion på anodal eller katodal polarisering af spinal neuronal netværk. Intracellulære optagelser åbner flere undersøgelsesområder af neuronegenskaber, som ikke er tilgængelige for tidligere anvendte ekstracellulæreteknikker 9,12. For eksempel er det muligt præcist at måle motoneuronmembranspændingsrespons på jævnstrømsstrøm forårsaget af tsDCS, for at angive spændingstærskel for spike-generering eller at analysere handlingspotentialeparametre. Desuden giver denne teknik os mulighed for at bestemme motoneuron passive membranegenskaber, såsom inputresistens, og observere forholdet mellem intracellulær stimulationsstrøm og hyppigheden af rytmisk affyring af motoneuroner. Antidromic identifikation af indspillet motoneuron, baseret på stimulering af funktionelt identificerede nerver (dvs. nerver giver efferents til flexors eller extensors) giver os mulighed for yderligere at identificere typer af innervated motorenheder (hurtig versus langsom), hvilket giver mulighed for at teste, om polarisering forskelligt påvirker de enkelte elementer i den modne spinal neuronal system. På grund af omfattende kirurgi forud for optagelsen og høje krav til stabilitet og pålidelighed af optagelser, denne teknik er meget udfordrende, men giver mulighed for direkte og langsigtet vurdering af elektrofysiologiske egenskaber af en motoneuron: før, under og efter anvendelse af tsDCS, som er afgørende for at bestemme både dens akutte handlinger og vedvarende virkninger13. Som en motoneuron direkte aktiverer ekstrafusal muskelfibre14 og deltager i feedback kontrol af en muskelsammentrækning og udviklet kraft15,16 enhver observeret indflydelse tsDCS på motorenheden eller muskel kontraktile egenskaber kan være knyttet til modulationer af motoneuron excitability eller fyring egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i forbindelse med denne protokol er blevet accepteret af de relevante myndigheder (f.eks. den lokale etiske komité) og følger de nationale og internationale regler om dyrevelfærd og -forvaltning.
BEMÆRK: Hver deltager, der er involveret i proceduren, skal være ordentligt uddannet i grundlæggende kirurgiske procedurer og skal have en gyldig licens til at udføre dyreforsøg.
1. Anæstesi og præmedicinering
- Bedøve en rotte med intraperitoneal injektioner af natrium pentobarbital (en indledende dosis på 60 mg·kg-1 for 6-måneder gamle mandlige Wistar rotter vejer 400\u2012550g).
BEMÆRK: Denne protokol er ikke begrænset til den angivne stamme, køn eller alder af rotter. Også alternativ anæstesi såsom ketamin-xylazine mix, alfa-chloralose eller fentanyl + midazolam + medetomidin kan anvendes, hvis mere egnet til forskellige forskningsmål eller når det kræves af den etiske komité. - Efter ca. 5 min, kontrollere dybden af anæstesi ved at klemme rottens bagben tå med stumpe scerpper. Fortsæt kun med de næste trin i protokollen, når der ikke overholdes nogen reflekshandling.
- Injicer 0,05 ml atropin subkutane for at reducere slimproduktionen efter intubation.
- Injicer subkutant 5 ml fosfatbuffer indeholdende 4% glukoseopløsning, NaHCO3 (1 %) gelatine (14 %). Denne buffer vil blive absorberet af de kutane fartøjer i hele et eksperiment og vil bidrage til at opretholde væskebalancen.
- Under hele operationen, regelmæssigt kontrollere dyret for refleks handlinger og supplere anæstesi hvis det kræves (10 mg·kg-1·h-1af natrium pentobarbital).
2. Kirurgi
- Forbered dyret til kirurgisk behandling ved barbering pels over rygdelen af venstre hindlimb, fra anklen til hoften, bagsiden, fra hale til den høje thorax segmenter, venstre side af brystet, og den ventrale side af halsen området over brystbenet
- Placering af den intravenøse linje
- Placer rotten på ryggen på en lukket-loop varmepude (og fastgør den med lemmer fikseringer).
- Ved hjælp af en 21 klinge, lave en langsgående snit gennem huden fra en brystbenet til en hage.
- Hold huden med sænt og adskille det fra det underliggende væv.
- Ved hjælp af stumpdissektion teknikker udsætte højre halspulsåre. Disseker forsigtigt venen fra det omgivende væv.
- Find den del af venen uden forgrening punkter, slip to 4-0 ligaturer under den.
- Lav en løs knude på den proksimale ende af det tidligere identificerede ikke-forgrenede segment af venen og en løs knude i den distale ende af dette segment af venen. Klem venen proksimale til hjertet, og derefter ligte den distale del af venen.
- Brug iris saks, lave et snit mellem klemmen og fjerne ligatur. Hold en klap af venen, og indføre en fyldt kateter til det punkt, hvor det er blokeret af klemmen.
- Mens du holder venen og kateteret sammen med stænt, skal du fjerne klemmen og skubbe kateteret flere millimeter ind i venen. Fastgør begge ender af kateteret til venen, og tilsæt et ekstra fikseringspunkt til huden.
- Indførelse af luftrøret
- Ved hjælp af stumpe kraftbecer adskille de to mandibular kirtler, der dækker sternohyoid muskler. Separate sternohyoid muskler på midterlinjen for at eksponere luftrøret.
- Slip tre 4-0 ligaturer under luftrøret, derefter gøre to knob under luftrøret indsættelse punkt og en knude ovenfor.
- Find cricoid brusk af strubehovedet og foretage et snit under den tredje trakeal brusk.
- Indsæt et luftrør rør ned i luftrøret og fastgør røret på plads med præ-forberedt ligaturer, derefter tilføje en ekstra ligatur til huden.
- Placer et lille stykke vat over de adskilte muskler, og sutur huden over det opererede område.
- Dissektion af baglempiner nerver
- Brug 21 klinge, lave en langsgående snit på den bageste side af venstre bagben, fra akillessenen til hoften.
- Grab huden med skler, og ved hjælp af stumpe dissektion teknikker adskille huden fra underliggende muskler på begge sider af snittet.
- Find popliteal fossa på bagsiden af knæleddet, som er omfattet af biceps femoris muskel, og ved hjælp af en saks foretage et snit mellem den forreste og bageste del af denne muskel.
- Bevæger sig opad skære to hoveder af biceps femoris hele vejen til hoften for at udsætte iskiasnerven. Ætse efter behov for at forhindre blødning.
- Identificer de sural, tibial og fælles peroneal grene af iskiasnerven.
- Ved hjælp af en saks, adskille lateral fra den mediale hovedet af gastrocnemius musklen til at udsætte tibial nerve og dens grene.
- Brug 55 kraftaffekt fat i den distale ende af suralnerven, skær det distalt og disseker så vidt muligt.
- Gentag proceduren med den fælles peroneal nerve.
- Ved hjælp af en stump glasstang adskille tibial nerve fra omkringliggende væv, passe på ikke at beskadige blodkarrene, og skær det distally.
- Identificer den mediale gastrocnemius (MG) og de laterale gastrocnemius og soleus (LGS) nerver.
- Ved hjælp af 55 scef, omhyggeligt dissekere MG og LGS nerver, afbryde dem fra omgivende væv, men opretholde deres forbindelse til de respektive muskler.
- Placer et saltvands-gennemblødt stykke vat under de udsatte nerver.
- Luk huden over det opererede område.
- Laminectomy
- Ved hjælp af 21 klinge gøre en langsgående snit fra korsbenet op til brysthvirvler.
- Adskæld huden fra underliggende muskler.
- Skær longissimus musklen på begge sider af thorax og lumbal spinous processer.
- Ved hjælp af stump-kantet skalpel trække musklerne tilbage fra rygsøjlen til at afsløre de tværgående processer i hver ryghvirvel.
- Ved hjælp af stumpe spids saks skære sener af muskler forbundet til de tværgående processer langs den eksponerede rygsøjlen. Påfør hæmostatiske midler, hvis det er nødvendigt.
- Identificer Th13 ryghvirvlen som det laveste brystsegment med ribindføring og brug af fine rongeurs fjerne spinøse processer og laminae fra Th13 til L2 ryghvirvler til at eksponere lændesegmenter af rygmarven. Husk ikke at beskadige L3 spinøse proces, som vil blive brugt som et fikseringspunkt for rygsøjlen stabilisering.
- Fjern Th12 spinous processen og glat ryghvirvel ryg rygsøjlen overflade så meget som muligt.
- Ved hjælp af stumpe dissektion teknikker adskille musklerne fra Th11 ryghvirvel for at skabe indehaveren indsættelse punkter.
- Placer tynd saltvand-gennemblødt vat over de udsatte rygmarv segmenter.
- Flyt rotten til den specialfremstillede metalramme med to parallelle stænger og to justerbare arme med klemmer til at støtte og stabilisere rygsøjlen.
3. Forberedelse til optagelse og stimulering
- Vertebrale kolonne fiksering og nerve arrangement
- Læg rotten i den specialfremstillede ramme på en varmepude, der er forbundet med det lukkede varmesystem for at opretholde dyrenes kropstemperatur ved 37 ± 1°C.
- Indsæt EKG-elektroder under huden og tilslut til en forstærker til pulsovervågning.
- Brug huden flapper, danne en dyb pool over den udsatte rygmarv.
- Ved hjælp af metalklemmer fastgør rygsøjlen ved at sætte klemmer under Th12 tværgående processer og ved L3 spinous proces.
- Sørg for, at rygsøjlen er fastgjort og anbragt vandret, og derefter anvende dorso-ventrale tryk på begge sider af kolonnen for at trække musklerne.
- Fyld poolen med varm (37 °C) mineralsk olie og vedligeholde det ved denne temperatur.
- Tråd en 4-0 ligatur gennem akillessenen, løft og strække den opererede venstre bagben, således at anklen er jævnet med hoften.
- Brug af huden flapper gøre en dyb pool over de udsatte tibial, MG og LGS nerver.
- Fyld poolen med varm (37 °C) mineralsk olie.
- Placer MG og LGS nerver på bipolar sølv-wire stimulerende elektroder og forbinde dem til en firkantet puls stimulator. Brug separate stimuleringskanaler til hver nerve.
- Placering af overfladeelektrode
- Placer en sølvkugleelektrode på venstre haleside af den eksponerede rygmarv med en referenceelektrode indsat i rygmusklerne, og tilslut begge elektroder til differential-DC-forstærkeren. Overfladen bolden elektrode vil blive brugt til at registrere afferent salver fra nerver.
- Ved hjælp af en konstant-strøm stimulator, stimulere MG og LGS nerver med firkantede impulser på 0,1 ms varighed, gentages med en frekvens på 3 Hz, og observere afferent salver.
- Fastgør tærsklen (T) for nerveaktivering, stimulere hver nerve på ca. 3· T intensitet, og registrere amplitude af afferent volley for hver nerve.
- Flyt overfladeelektroden rostral og gentag proceduren for at identificere spinal segmenter, hvor amplituder af salver er de højeste for hver nerve. Når overfladeelektroden er afgørende, skal overfladeelektroden flyttes til en sikker afstand fra rygmarven.
- Muskellammelse og danner en pneumothorax for at reducere respiratoriske bevægelser
- Lammer rotten intravenøst med en neuromuskulær blokker og tilslut luftrørsrøret til en ekstern ventilator på linje med et gnaverkompatibelt capnometer (Pancuroniumbromid, ved en indledende dosis på 0,4 mg·kg-1, suppleret hver 30 min. i doser på 0,2 mg·kg-1)
- Overvåg den samlede CO2-koncentration, og vedligehold den med ca. 3\u20124 % ved at justere ventilationsparametrene (frekvens, lufttryk og strømningsvolumen).
- Lav et langsgående snit i huden mellem det femte og 6.
- Ved hjælp af stumpe spids saks skære de overliggende muskler til at visualisere interkostale plads mellem ribbenene.
- Ved hjælp af små skarpe saks, lave et lille snit i interkostale muskler og i lungehinden, derefter indsætte en spids af en stump kant pincet i åbningen, passe på ikke at trykke på lungerne.
- Tillad, at der kan indsættes en lille tube, så pneumothoraxen kan være åben under hele forsøget.
- Efter neuromuskulær blok, overvåge anæstesi dybde ved at kontrollere EKG frekvens, og supplere bedøvelsesmiddel, hvis pulsen overstiger 400 bpm. Muskellammelse og danner en pneumothorax for at reducere respiratoriske bevægelser, hvilket vil forbedre optagelsestabiliteten
- Åbning af dura og pia mater
- Brug #55, forsigtigt løfte dura mater, og skær det caudally fra L5 segment, rostrally op til L4 segmentet.
- Ved hjælp af et par ultra-tynde 5SF spånninger gøre en lille patch i pia dækker dorsale kolonne, mellem blodkarrene, præcis på niveau med den maksimale affeent volley fra MG eller LGS nerve.
- Brug små stykker saltvand-gennemblødt og tørret gel skum til at blokere blødning, hvis det er nødvendigt.
- placering af tsDCS-elektrode
- Lav et lille snit i huden på den ventrale side af en rotte mave på rostro-caudal niveau svarende til placeringen af L4-L5 spinal segmenter.
- Grib den udsatte hudflap med en metalclips, der vil tjene som referenceelektrode.
- Placer en saltvands-gennemblødt svamp på rygsiden af Th12 ryghvirvel. Sørg for, at svampens størrelse er lig med en aktiv tsDCS-elektrode (cirkelformet rustfrit stålplade med en diameter på 5 mm).
- Ved hjælp af en fin manipulator skal du trykke svampen med en aktiv tsDCS-elektrode til knoglen og sørge for, at hele elektrodens overflade trykkes lige.
- Tilslut både reference- og aktive tsDCS-elektroder til en konstantstrømsstimulatorenhed, der kan levere en kontinuerlig strøm af jævnstrøm.
- Fremstilling af mikropipetter
- Ved hjælp af en mikroelektrode puller, forberede en mikroelektrode.
BEMÆRK: Både glødetråd og ikke-glødelektroder kan anvendes, men husk, at elektrodens skaft skal være langt nok til at nå ventralhornet, samtidig med at den er tynd nok til ikke at komprimere rygmarven, mens den går ned.- Juster pullerindstillingen, så skaftet, der trænger ind i rygmarven, er ca. 3 mm lang, mens spidsen af elektroden ikke er mere end 1\u20122 μm i diameter, og mikroelektrodebestandigheden er mellem 10 og 20 MΩ.
- Fyld mikroelektroderne med 2M kaliumcitratelektrolyt.
- Monter den forberedte mikroelektrode på mikromanipulatoren, så 1\u20122 μm trædebevægelse og stereoaxisk kalibrering.
- Tilslut mikroelektroden til den intracellulære forstærker med referenceelektroden placeret i rygmusklerne.
- Ved hjælp af en mikroelektrode puller, forberede en mikroelektrode.
- Efter neuromuskulær blok, overvåge anæstesi dybde ved at kontrollere EKG frekvens, og supplere bedøvelsesmiddel, således at rotten puls ikke overstiger 400 bpm.
4. Motoneuron sporing og penetration
- Anlæt afferentvolleyoptagelseselektroden tilbage på rygmarvens rygoverflade, caudally til placeringen af registreringsstedet, på niveau med L6-segmentet.
- Stimulere MG og LGS nerver med elektriske 0,1 ms impulser med en frekvens på 3 Hz, og 3T intensitet, at aktivere alle axoner af alfa-motoneuroner i en valgt nerve.
- Kør mikropipetten ind i et valgt plaster i pia med en medio-lateral vinkel på 15\u201220° (med en spids rettet side om side).
- Efter nedstigning under overfladen kalibreres mikroelektroden og kompenseres for kapacitans- og spændingsforskydningen, og rygmarven fortsættes, når alle parametre er stabile. En antidromic felt potentiale af motoneuron puljen vil være synlig på mikroelektrode spænding spor, mens nærmer sig en dedikeret motorkerne under stimulering af de respektive nerve.
- Fortsæt gennemtrængningen med mikroelektroden ved 1\u20122 μm trin, og brug jævnligt den intracellulære forstærkers buzzfunktion til at fjerne elektrodespidsen fra eventuelle rester.
- Overhold motoneuron penetration, som vil være karakteriseret ved en pludselig hyperpolarisering af den registrerede spænding spor og udseende af en antidromic spike potentiale.
5. Optagelse af motoneuronmembran og affyringsegenskaber
- I en bro tilstand af den intracellulære forstærker, identificere motoneuron på grundlag af "alt-eller-intet" udseende af den antidromiske virkning potentiale ved at stimulere respektive nervegrene. Optag 20 efterfølgende spor til senere gennemsnit.
- Gennemføre et strengt inklusionskriterium for at sikre data af høj kvalitet: hvilemembranpotentiale på mindst -50 mV i amplitude; aktion potentielle amplituder større end 50 mV, med en positiv overskridelse; membranpotentiale stabil i mindst 5 minutter før optagelse.
- I en diskontinuerlig strøm-clamp-tilstand (aktuel switchhastighedstilstand 4-8 kHz) af den intracellulære forstærker fremkalder der et ortodemiksk virkningspotentiale i en motoneuron ved hjælp af 0,5 ms intracellulære depolarisering af aktuelle impulser. Gentag mindst 20 gange for offline gennemsnit.
- Stimulere en motoneuron med 40 korte impulser (100 ms) af hyperpolariseringsstrøm (1 nA) for at beregne celleinputmodstand.
- Stimulere en motoneuron med 50 ms kvadrat-bølge impulser på stigende amplituder til at bestemme reobase værdi som den mindste amplitude af depolarisering strøm, der kræves for at fremkalde en enkelt spike.
- Injicer 500 ms kvadrat-bølge impulser af depolarizing strøm, ved at øge amplituder i trin på 0,1-2 nA at fremkalde rytmiske udledninger af motoneuroner.
6. Trans-spinal jævnstrømstimulation (tsDCS)
- Samtidig med at en stabil penetration af motoneuron, starte polarisering procedure ved trans-spinal anvendelse af jævnstrøm. Juster den aktuelle intensitet og anvendelsestiden til eksperimentdesignet (f.eks. 0,1 mA i 15 min.).
- Umiddelbart efter tænding af DC, observere motoneuron membran potentiale. Anodal polarisering (den aktive elektrode som en anode) bør resultere i depolarisering af membranpotentialet, mens katodal polarisering (den aktive elektrode som katode) bør fremkalde en modsat effekt. Vær opmærksom på, om en ændring i hvilemembranens potentiale som reaktion på DC-stimulation er konstant, hvilket sikrer, at elektrisk feltintensitet ikke påvirkes.
- Under kontinuerligt aktuelle program gentages trin 5.3\u20125.6 i intervaller på 5 minutter.
- Sluk for dc og fortsætte med at gentage trin 5.3\u20125.6 i 5 min intervaller, indtil optagelser bliver ustabil eller optagelse kriterier er kompromitteret.
- Afslutte forsøget og aflive dyret ved hjælp af intravenøs administration af en dødelig dosis pentobarbital natrium (180 mg·kg-1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parametre for virkningspotentialer og flere membranegenskaber kan beregnes på grundlag af intracellulære optagelser, når stabile forhold for celleindtrængning sikres. Figur 1A præsenterer et typisk ortoromisk virkningspotentiale fremkaldt ved intracellulær stimulation, som opfylder alle kriterier for datainflusion (hvilemembranpotentialet på mindst -50 mV og spike amplitude højere end 50 mV med en positiv overskridelse). Action potentielle parametre, såsom spike amplitude, efterhyperpolarisering amplitude eller efterhyperpolarisering halv-henfald tid (AHP-HDT) kan måles. En værdi af sidstnævnte parameter i rottemotoneuroner tjener som et pålideligt kriterium for at skelne mellem hurtige og langsomme motoneuroner (AHP-HDT > 20 ms for langsom, mens AHP-HDT <20 ms for hurtige motoneuroner)17. Figur 1B viser en cellerespons på en 100 ms hyperpolarizing strømpuls på 1nA, hvorfra både top- og plateauinputmodstand (IR) af en motoneuron kan bestemmes ud fra spændingsafbøjningen. Figur 1C viser et udvidet spændingsspor af en reobasisk spike med en tydeligt markeret spændingstærskel for spidsen, hvilket indikerer det niveau af afpolarisering af membranen, hvor spændingsgatede natriumkanaler aktiveres for at starte handlingspotentialet. Alle disse optagelser kan gentages flere gange under og efter tsDCS ansøgning, som giver os mulighed for at sammenligne respektive parametre, så længe hvilemembranen potentiale er stabil og andre kriterier for stimulation og optagelse protokol er opfyldt.
Flere undersøgelser har indirekte vist, at tsDCS ændrer motoneuron ophidselse og fyring mønster9,18. Figur 2 viser eksempler på intracellulære spændingsspor fra to motoneuroner stimuleret intracellularly med 500 ms kvadratimpulser af depolariseringsstrøm før, under og efter tsDCS ansøgning. Under stabile forhold, optagelser gentages flere minutter efter den anden kan udføres, og motoneuron fyring mønstre kan pålideligt sammenlignes. Anodal (+) tsDCS blev fundet at handle i retning af øget motoneuron ophidselse og højere frekvenser af rytmisk fyring (Figur 2A), mens cathodal (-) tsDCS handlet i retning af fyring hæmning (Figur 2B). Desuden overlevede virkningerne af begge typer tsDCS polariseringsperioden. Det er også værd at bemærke, at de observerede ændringer i ophidselse og fyring mønster er ikke blot et resultat af cellemembranen depolarisering eller hyperpolarisering ved anodal eller cathodal tsDCS, henholdsvis, men vise dybtgående ændringer ikke er relateret til ændringen af en membran potentiale, da de fortsatte på trods af, at denne parameter vendte tilbage til en baseline efter afslutningen af polarisering.
Endelig skal det understreges, at eventuelle afvigelser fra den fremlagte protokol sandsynligvis vil resultere i et mislykket forsøg på grund af forringelse af præparatet og/eller en kraftig nedgang i datapålideligheden. Figur 3 viser eksempler på optagelser, hvor kriterierne for optagelse af data blev kompromitteret enten på grund af ufuldstændig celleindtrængning (figur 3A), forsømmelse for at kompensere for mikroelektroderesistens og kapacitans (figur 3B) eller en ustabilitet i rygmarven (figur 3C). Det er vigtigt, at forskerne identificerer sådanne ikke-optimale optagelser og gennemfører passende korrigerende foranstaltninger eller ser bort fra sådanne resultater fra datasættet.
Figur 1: Parametre for handlingspotentialer og membranegenskaber.
a )Enortodemisk virkningspotentiale fremkaldt ved intracellulær stimulering med angivne grundlæggende parametre, som kan beregnes ud fra denne post. AP ampl = action potentielle amplitude; AHP ampl = efterhyperpolarisering amplitud; AHP-HDT = efterhyperpolarisering halv-henfald tid. (B) Spændingssporingen af en membranrespons på en kort (100 ms) depolarerende strømimpuls på 1nA-intensitet, hvilket gør det muligt for os at beregne indgangsmodstand (IR). Læg mærke til toppen af en potentiel afbøjning (IR Peak) efterfulgt af et lille fald og den følgende plateaufase af membranpotentialet (IR-plateauet). (C) Den udvidede spænding spor af en reobasic spike med en stiplet vandret linje, der angiver spike spænding tærskel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Virkninger af polarisering på motoneuron fyring.
(A) Intracellulære optegnelser fra en motoneuron stimuleret intracellularly med 7,5 nA for 500 ms, lavet før (venstre), under anodal tsDCS (0,1 mA, midten), og 10 min efter afslutningen af polarisering (højre). Bemærk den gradvise stigning i motoneuron ophidselse på samme stimulus intensitet. (B) Intracellulære optegnelser fra en anden motoneuron stimuleret intracellularly med 6 nA for 500 ms, lavet før (venstre), under katodal tsDCS (0,1 mA, midten), og 10 min efter afslutningen af polarisering (højre). Bemærk en gradvis hæmning af motoneuron fyring frekvens på samme stimulus intensitet. Under optagelser, spor af intracellulære stimulation strøm er forudsat. Kalibreringsstængerne nederst til højre gælder for alle præsenterede intracellulære optagelser. Værdierne af hvilemembranpotentialet leveres til venstre for hver optagelse. Hyppigheden af steady-state fyring, beregnet ud fra de sidste tre interspike intervaller, er angivet ovenstående poster. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempler på suboptimale optegnelser som følge af afvigelser fra forsøgsprotokollen.
(A) Den antidromiske spike registreret fra en motoneuron utilstrækkeligt trængt. Hvilemembranen potentiale er utilstrækkelig (-45 mV), og på trods af en passende form af spike med alle på hinanden følgende faser af depolarisering, repolarisering, og hyperpolarisering, dens amplitude er for lav (41 mV) og uden en overskridelse. (B) En reobasisk spike genereret ved en urealistisk spændingstærskel (membran depolariseret til +68 mV). Denne form for fejl skyldes normalt en blokeret mikroelektrode, med ukompenseret modstand og kapacitans. Man kan også se, at denne rekord er stærkt forurenet med 50 Hz elektrisk støj. (C) En motoneuron rytmisk fyring som reaktion på 500 ms depolarizing strøm, med store udsving i en membran potentiale, overvejende forårsaget af ustabile mikroelektrode penetration, muligvis på grund af overdreven respiratoriske bevægelser. For alle de præsenterede tilfælde ville den beregnede membran eller fyring egenskaber være upålidelige. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hvis den udføres korrekt, skal den kirurgiske del af den beskrevne protokol være afsluttet inden for ca. tre timer. Man bør være særlig forsigtig med at opretholde stabile fysiologiske forhold for et dyr under operationen, især kropstemperatur og dybde af anæstesi. Bortset fra indlysende etiske overvejelser, en mangel på ordentlig anæstesi kan resultere i overdreven lemmer bevægelser under nervedissektion eller laminectomy og føre til skader på præparatet eller en for tidlig eksperiment opsigelse. Ved lammelse af et dyr før trængende rygmarven med en mikroelektrode, er det afgørende at overvåge dybden af anæstesi og puls og til at anvende ordentlig ventilation parametre baseret på dyrs vægt og lungekapacitet. Eventuelle afvigelser fra de ønskede fysiologiske parametre skal ændres straks for at sikre procedurens succes. Efter operationen bør stabile registreringsforhold være mulige at opretholde i mindst fire timer.
Efter indtrængning af en motoneuron, optagelsen stabilitet er af stor betydning. Det er bydende nødvendigt, at et membranpotentiale forbliver konstant under kontroloptagelser, da eventuelle udsving i væsentlig grad vil påvirke reobasestrømen og en tærskel for rytmisk fyring. Korrekt fiksering af rygsøjlen bør give grundlæggende stabilitet, mens målet med en pneumothorax er at mindske rygmarvsbevægelser fremkaldt af respiration. Desuden skal man være sikker på, at muskelsammentrækninger er helt afskaffet, før du forsøger penetration og neuromuskulær blokker administreres med jævne mellemrum.
Efter en vellykket penetration antidromic identifikation af den registrerede motoneuron kan udføres ved stimulering af en respektive nerve gren. Dette er en reel fordel ved en in vivo præparat, hvor motoneuron axoner holdes i kontinuitet med de innervated muskler med henvisning til in vitro intracellulære optagelser udført på spinal skiver, som først for nylig var muligt i voksnedyr 16, men tillader ikke identifikation af registrerede motoneuron. Men, Det er vigtigt, at forskerne har en klar forståelse af forskellen mellem antidromic og ortodromic aktivering af motoneuron19 for at undgå fejlfortolkning af data. Det er vigtigt at holde den perifere nervestimulation så lav som muligt (mindre end 0,5 V) for at forhindre aktivering af yderligere nerver på grund af den aktuelle spredning og være opmærksom på en konstant og kort ventetid af den antidromiske spike19.
En anden fordel ved den præsenterede teknik er, at motoneuroner desuden kan klassificeres som hurtige eller langsomme typer på grundlag af deres virkning potentielle parametre, nemlig AHP-HDT varighed17. Differentiering mellem motoneurons innervating fast-type og langsom-type muskelfibre er afgørende med hensyn til deres forskellige bidrag til muskel ydeevne under bevægelser. Desuden kan hurtige og langsomme motoneuroner reagere forskelligt på polarisering9.
For at sikre pålidelige resultater af polarisering bør man være opmærksom på at fastsætte korrekte parametre for tsDCS. Den nuværende intensitet bør på den ene side give den ønskede felttæthed på det valgte område for at fremkalde virkninger på neuronale netværk, mens den på den anden side bør være inden for sikkerhedsgrænserne for vævsskader20. Størrelsen af aktive elektroder og referenceelektroder og deres placering i forbindelse med et registreringssted er også vigtige elementer, derskal overvejes 4, og anvendelsestiden for tsDCS-varighed bør være tilstrækkelig til at fremkalde deønskede virkninger 16,17,22. I denne metode papir, de repræsentative resultater blev opnået ved anvendelse af 100 μA katodal eller anodal polarisering i 15 min. Under hensyntagen til elektrodeformen og diameteren var den respektive elektriske feltintensitet direkte under elektroden 39,25 μA·mm2. Man bør dog forstå, at den præcise værdi af det elektriske felt på det registrerede motoneuronsted er umuligt at pre-bestemme som motoneuron placering med hensyn til polarisering elektrode varierer, og e-felt tæthed falder betydeligt med øget dybde og nedsat elektrode størrelse4,24. Desuden er orienteringen af motoneuron rum i forhold til den anvendte elektriske felt er vigtig for generering af virkning potentialer22,25,26, og dette kan ikke forudsiges for de enkelte celler. Desuden er det meget vigtigt at forstå, at tsDCS effekter ikke er begrænset til en periode med polarisering, og at vedvarende, langvarige virkninger er veldokumenterede22,27. Derfor, efter selv en enkelt, kort polarisering session alle successive optagelser i samme præparat ville blive udført i post-polarisering betingelser, som begrænser antallet af mulige akutte polarisering optagelser til en per dyr.
Der kan foretages yderligere ændringer af den præsenterede procedure for at besvare specifikke forskningsspørgsmål. Denne protokol med minimale ændringer kan anvendes som standard for flere eksperimentelle design, fx ved afprøvning af forskellige varigheder og/eller amplituder af anvendt tsDCS eller ved sammenligning af kort- eller langsigtede virkninger af tsDCS i forskellige pools motoneurons. Brug af flere genetiske sygdomsmodeller (for eksempel SOD1 G93A rottemodel af amyotrofisk lateral sklerose) eller forskellige nerver til antidromisk nerveaktivering (peroneal, tibial, saphenous osv.) er acceptabel. Man skal dog også være opmærksom på procedurebegrænsninger. For eksempel hæmmer brugen af barbiturater til anæstesi aktiviteten af vedvarende indadgående strømme28, mens den systemiske indførelse af specifikke blokkere, der almindeligvis anvendes i in vitro-præparater (f.eks. stryknin til at blokere nikotinreceptorer) kan vise sig at være dødelig for dyret. Det er tilrådeligt for forskere at overveje disse begrænsninger, før du vælger den korrekte eksperimentelle protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Center tilskud nr. Forfatterne vil gerne anerkende arbejdet i Hanna Drzymała-Celichowska og Włodzimierz Mrówczyński, der både bidrog til dataindsamling og analyse af resultaterne præsenteres i dette papir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
