Summary
यह प्रोटोकॉल एक साथ ट्रांस-स्पाइनल डायरेक्ट करंट उत्तेजना के साथ चूहे काठ के मोटोन्यूरॉन्स की वीवो इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग में वर्णन करता है। यह विधि हमें झिल्ली गुणों को मापने और रीढ़ की हड्डी के एक नोडल या कैथोडल ध्रुवीकरण के दौरान और बाद में मोटोन्यूरॉन्स की लयबद्ध गोलीबारी को रिकॉर्ड करने में सक्षम बनाती है।
Abstract
वीवो में स्पाइनल मोटोन्यूरॉन्स की इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग बरकरार स्पाइनल नेटवर्क में कोशिकाओं की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" प्रदान करती है और शास्त्रीय इन विट्रो या एक्सट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग तकनीकों के सापेक्ष महत्वपूर्ण लाभ रखती है। वीवो इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग में एक लाभ यह है कि इस विधि को वयस्क जानवरों पर पूरी तरह से परिपक्व तंत्रिका तंत्र के साथ किया जा सकता है, और इसलिए कई मनाया गया शारीरिक तंत्र व्यावहारिक अनुप्रयोगों में अनुवाद किया जा सकता है। इस पद्धतिगत पत्र में, हम बाहरी रूप से लागू निरंतर वर्तमान उत्तेजना के साथ संयुक्त इस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी के न्यूरोनल नेटवर्क के भीतर होने वाली ध्रुवीकरण प्रक्रियाओं की नकल करता है। ट्रांस-स्पाइनल डायरेक्ट करंट उत्तेजना (टीएसडीसी) एक अभिनव विधि है जिसका उपयोग विभिन्न न्यूरोलॉजिकल चोटों के साथ-साथ खेलों में पुनर्वास में न्यूरोमोडुलेटरी हस्तक्षेप के रूप में तेजी से किया जाता है। तंत्रिका तंत्र पर टीएसडीसी का प्रभाव खराब समझ में आता है और इसके कार्यों के पीछे शारीरिक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं। इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग के साथ टीएसडीसी का अनुप्रयोग हमें रीढ़ की हड्डी के न्यूरोनल नेटवर्क के ध्रुवीकरण के जवाब में मोटोन्यूरॉन झिल्ली गुणों और लयबद्ध गोलीबारी की विशेषताओं के परिवर्तनों को सीधे देखने में सक्षम बनाता है, जो टीएसडीसी कार्यों की समझ के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जब प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक इनरवेट्ड मांसपेशी और उसके कार्य (फ्लेक्सर बनाम एक्सटेंसर) के साथ-साथ शारीरिक प्रकार (तेज बनाम धीमी) के संबंध में मोटोन्यूरॉन की पहचान शामिल है, तो यह रीढ़ की हड्डी के सर्किटरी के पहचाने गए घटकों पर टीएसडीसी के प्रभाव की चुनिंदा जांच करने का अवसर प्रदान करता है, जो ध्रुवीकरण से अलग तरह से प्रभावित प्रतीत होता है। प्रस्तुत प्रक्रिया इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए शल्य चिकित्सा तैयारी पर केंद्रित है, जो तैयारी स्थिरता और परिणामों की प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदमों पर जोर देते हैं। व्यावहारिक और सुरक्षा मुद्दों पर ध्यान देते समय नोडल या कैथोडल टीएसडीसी आवेदन की कार्यप्रणाली के विवरण पर चर्चा की जाती है।
Introduction
ट्रांस-स्पाइनल डायरेक्ट करंट उत्तेजना (टीएसडीसी) स्वास्थ्य और रोग में स्पाइनल सर्किट उत्तेजना को संशोधित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में मान्यता प्राप्त कर रहा है1,,2,,3। इस तकनीक में, चयनित रीढ़ की हड्डी के खंडों के ऊपर स्थित एक सक्रिय इलेक्ट्रोड के बीच एक निरंतर धारा पारित की जाती है, जिसमें एक संदर्भ इलेक्ट्रोड या तो वेंट्रेली या अधिक रोस्ट्रली 4 स्थितहोताहै। कई अध्ययनों ने पहले ही पुष्टि कर दी है कि टीएसडीसी का उपयोग कुछ रोग स्थितियों के प्रबंधन में किया जा सकता है, जैसे न्यूरोपैथिक दर्द5,स्पास्टिकिटी6, रीढ़की हड्डी की चोट7 या पुनर्वास8की सुविधा के लिए। शोधकर्ताओं का सुझाव है कि टीएसडीसी कोशिका झिल्ली में इंट्रासेलुलर और बाहकालीन स्थान के बीच आयन वितरण में परिवर्तन पैदा करता है, और,यह वर्तमान अभिविन्यास9,10,11के आधार पर न्यूरोनल गतिविधि को सुविधाजनक या बाधित कर सकता है।, हालांकि, हाल ही में जब तक, motoneurons पर इस प्रभाव की एक सीधी पुष्टि की कमी थी ।
यहां, हम रीढ़ की हड्डी के न्यूरोनल नेटवर्क के एक नोडल या कैथोडल ध्रुवीकरण के जवाब में मोटोन्यूरॉन झिल्ली और फायरिंग गुणों में परिवर्तन का पालन करने के लिए, टीएसडीसी के एक साथ आवेदन के साथ एनेस्थेटाइज्ड चूहे में काठ की रीढ़ की हड्डी के मोटोन्यूरॉन से विद्युत क्षमता की वीवो इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग में आचरण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग न्यूरॉन गुणों की जांच के कई क्षेत्रों को खोलती है, जो पहले इस्तेमाल की जाने वाले बाहुलर तकनीकों9,12केलिए अनुपलब्ध है। उदाहरण के लिए, टीएसडीसी द्वारा प्रेरित प्रत्यक्ष वर्तमान प्रवाह के लिए मोटोन्यूरॉन झिल्ली वोल्टेज प्रतिक्रिया को ठीक से मापना संभव है, स्पाइक उत्पादन के लिए वोल्टेज सीमा को इंगित करने के लिए, या कार्रवाई संभावित मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए। इसके अलावा, यह तकनीक हमें मोटिवेरॉन निष्क्रिय झिल्ली गुणों को निर्धारित करने की अनुमति देती है, जैसे इनपुट प्रतिरोध, और इंट्रासेलर उत्तेजना वर्तमान और मोटोन्यूरॉन की लयबद्ध गोलीबारी की आवृत्ति के बीच संबंधों का निरीक्षण करने के लिए। कार्यात्मक रूप से पहचानकी गई नसों (यानी, फ्लेक्सर्स या एक्सटेंसर को एफेरेंट्स प्रदान करने वाली नसों) की उत्तेजना के आधार पर रिकॉर्ड किए गए मोटोन्यूरॉन की एंटीड्रोमिक पहचान हमें अतिरिक्त रूप से इनरवेटेड मोटर इकाइयों (तेज बनाम धीमी गति) की पहचान करने की अनुमति देती है, जो यह परीक्षण करने का अवसर देती है कि ध्रुवीकरण अलग-अलग परिपक्व रीढ़ की हड्डी के न्यूरोनल सिस्टम के व्यक्तिगत तत्वों को प्रभावित करता है या नहीं। रिकॉर्डिंग की स्थिरता और विश्वसनीयता पर रिकॉर्डिंग और उच्च आवश्यकताओं से पहले व्यापक सर्जरी के कारण, यह तकनीक अत्यधिक चुनौतीपूर्ण है, लेकिन एक मोटोन्यूरॉन की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के प्रत्यक्ष और दीर्घकालिक मूल्यांकन की अनुमति देती है: टीएसडीसी के आवेदन के दौरान और बाद में, जो इसके तीव्र कार्यों और लगातार प्रभाव13दोनों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक मोटोन्यूरॉन सीधे एक्स्ट्राफ्यूसल मांसपेशी फाइबर14 को सक्रिय करता है और मांसपेशियों के संकुचन और विकसित बल15के फीडबैक नियंत्रण में भाग लेताहै,16 मोटर इकाई या मांसपेशियों के संकुचन गुणों पर टीएसडीसी के किसी भी मनाया प्रभाव को मोटोन्यूरॉन उत्तेजना या फायरिंग विशेषताओं के मॉड्यूलेशन से जोड़ा जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को उपयुक्त प्राधिकरणों (जैसे स्थानीय आचार समिति) द्वारा स्वीकार किया गया है और पशु कल्याण और प्रबंधन पर राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय नियमों का पालन करें ।
नोट: प्रक्रिया में शामिल प्रत्येक प्रतिभागी को बुनियादी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में ठीक से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और पशु प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए एक वैध लाइसेंस होना चाहिए ।
1. संज्ञाहरण और पूर्व चिकित्सा
- सोडियम पेंटोबार्बिटल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ एक चूहे को एनेस्थेटाइज करें (6 महीने के पुरुष विस्टार चूहों के लिए 60 मिलीग्राम-1 की प्रारंभिक खुराक 400\u2012550g) वजनी है।
नोट: यह प्रोटोकॉल संकेत तनाव, सेक्स या चूहों की उम्र तक ही सीमित नहीं है। इसके अलावा, वैकल्पिक संज्ञाहरण जैसे केटामाइन-जाइलाज़ीन मिश्रण, अल्फा-क्लोरलोज या फेन्टनाइल + मिडाजोलम + मेडेटोमिडीन का उपयोग किया जा सकता है यदि विभिन्न अनुसंधान लक्ष्यों के लिए अधिक उपयुक्त या आचार समिति द्वारा आवश्यक होने पर। - लगभग 5 मिनट के बाद, चूहे के पिछले अंग पैर की अंगुली को कुंद संदंश के साथ चुटकी लेकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। प्रोटोकॉल के अगले चरणों के साथ तभी आगे बढ़ें जब कोई पलटा कार्रवाई नहीं की जाती है।
- इंडबेशन के बाद बलगम उत्पादन को कम करने के लिए एट्रोपाइन के 0.05 एमएल को सुबूत रूप से इंजेक्ट करें।
- 4% ग्लूकोज समाधान युक्त फॉस्फेट बफर के 5 एमएल को कम से कम इंजेक्ट करें, नाएचसीओ3 (1%) और जिलेटिन (14%) । यह बफर एक प्रयोग के दौरान कटनीस जहाजों द्वारा अवशोषित किया जाएगा और तरल पदार्थ संतुलन बनाए रखने में मदद करेगा।
- सर्जरी के दौरान, समय-समय पर पलटा कार्यों के लिए जानवर की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो संज्ञाहरण के पूरक (सोडियम पेंटोबार्बिटल के10मिलीग्राम -1 ·एच-1)।
2. सर्जरी
- बाएं हिंडलिब के पृष्ठीय भाग पर फर शेविंग करके शल्य चिकित्सा उपचार के लिए पशु तैयार करें, टखने से कूल्हे तक, पीठ, पूंछ से उच्च वक्ष खंडों तक, छाती के बाईं ओर, और उरोस्थि के ऊपर गर्दन क्षेत्र के वेंट्रल साइड
- नसों में लाइन का प्लेसमेंट
- चूहे को अपनी पीठ पर एक बंद-लूप हीटिंग पैड पर रखें (और इसे अंग निर्धारण के साथ सुरक्षित करें)।
- 21 ब्लेड का उपयोग करके, त्वचा के माध्यम से एक उरोस्थि से ठोड़ी तक एक देशांतर कट बनाएं।
- त्वचा को संदंश के साथ पकड़ें और इसे अंतर्निहित ऊतक से अलग करें।
- कुंद विच्छेदन तकनीकों का उपयोग सही जुगुलर नस का पर्दाफाश। ध्यान से आसपास के ऊतकों से नस विच्छेदन।
- बिना ब्रांचिंग पॉइंट्स के नस के हिस्से का पता लगाएं, इसके नीचे दो 4-0 लिगेचर ्स को स्लिप करें।
- नस के पहले पहचाने गए गैर-शाखाओं वाले खंड के समीपस्थ छोर पर एक ढीली गाँठ बनाएं और नस के इस खंड के डिस्टल एंड पर एक ढीली गाँठ बनाएं। नस को दिल के समीपस्थ पर दबाएं, और फिर नस के डिस्टल हिस्से को लिगेट करें।
- आईरिस कैंची का उपयोग करके, क्लैंप और दूर लिगेचर के बीच एक चीरा बनाएं। नस का एक पल्ला पकड़ो, और बिंदु है जहां यह क्लैंप द्वारा अवरुद्ध है करने के लिए एक पूर्व से भरा कैथेटर परिचय ।
- नस और कैथेटर को एक साथ संदंश के साथ पकड़ते समय क्लैंप को हटा दें और कैथेटर को कई मिलीमीटर नस में धकेल दें। नस में कैथेटर के दोनों सिरों को सुरक्षित करें, और त्वचा में एक अतिरिक्त निर्धारण बिंदु जोड़ें।
- श्वास नली का परिचय
- कुंद संदंश का उपयोग करने से स्टर्नोहाइड्र की मांसपेशियों को कवर करने वाली दो मंडीबुलर ग्रंथियां अलग होती हैं। श्वासनली को बेनकाब करने के लिए मिडलाइन पर अलग-अलग स्टर्नोहाइड्रॉयड मांसपेशियों को अलग करें।
- श्वासनली के नीचे तीन 4-0 लिगेचर स्लिप करें, फिर श्वास नली प्रविष्टि बिंदु के नीचे दो समुद्री मील और ऊपर एक गाँठ बनाएं।
- गला के क्रिकॉइड उपास्थि का पता लगाएं और तीसरे श्वासनली उपास्थि के नीचे एक चीरा बनाएं।
- श्वासनली के नीचे एक श्वास नली डालें और पहले से तैयार लिगेचर के साथ ट्यूब को सुरक्षित करें, फिर त्वचा में एक अतिरिक्त लिगेचर जोड़ें।
- अलग मांसपेशियों के ऊपर कपास ऊन का एक छोटा सा टुकड़ा रखें, और संचालित क्षेत्र पर त्वचा सीवन।
- हिंद अंग नसों का विच्छेदन
- 21 ब्लेड का उपयोग करना, दुखती कण्डरा से कूल्हे तक, बाएं हिंद अंग के पीछे की ओर एक देशांतर कट बनाओ।
- संदंश के साथ त्वचा को पकड़ो, और कुंद विच्छेदन तकनीकों का उपयोग चीरा के दोनों किनारों पर अंतर्निहित मांसपेशियों से त्वचा को अलग करता है।
- घुटने के जोड़ के पीछे पॉपलाइटल फोसा का पता लगाएं, जो बाइसेप्स फेमोरिस मांसपेशी द्वारा कवर किया जाता है, और कैंची का उपयोग करके इस मांसपेशियों के पूर्वकाल और पीछे के हिस्से के बीच कटौती करते हैं।
- ऊपर की ओर बढ़ते हुए बाइसेप्स फेमोरिस के दो सिर कूल्हे के लिए सभी तरह से काट के लिए sciatic तंत्रिका का पर्दाफाश । रक्तस्राव को रोकने के लिए आवश्यकतानुसार कॉटरिज़।
- सियाटिक तंत्रिका की सुराल, टिबियल और आम पेरोनियल शाखाओं की पहचान करें।
- कैंची का उपयोग करना, टिबियल तंत्रिका और इसकी शाखाओं को बेनकाब करने के लिए गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के मध्यकालीन सिर से पार्श्व को अलग करें।
- 55 संदंश का उपयोग करना सुराल तंत्रिका के डिस्टल अंत को पकड़ें, इसे अव्यवस्थित रूप से काटें और जहां तक संभव हो विच्छेदन करें।
- सामान्य पेरोनल तंत्रिका के साथ प्रक्रिया दोहराएं।
- एक कुंद कांच की छड़ का उपयोग आसपास के ऊतकों से टिबियल तंत्रिका को अलग करता है, रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचाने का ध्यान रखता है, और इसे अलग से काटता है।
- मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस (एमजी) और पार्श्व गैस्ट्रोकनेमियस और सोलियस (एलजीएस) नसों की पहचान करें।
- 55 संदंश का उपयोग करना, एमजी और एलजीएस नसों को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें, उन्हें आसपास के ऊतकों से डिस्कनेक्ट करें, लेकिन संबंधित मांसपेशियों से उनके कनेक्शन को बनाए रखें।
- उजागर नसों के नीचे कपास ऊन का एक खारा लथपथ टुकड़ा रखें।
- संचालित क्षेत्र पर त्वचा को बंद करें।
- लेमिनेक्टॉमी
- 21 ब्लेड का उपयोग करना सैक्रम से वक्ष कशेरुकी तक एक देशांतर चीरा बनाते हैं।
- त्वचा को अंतर्निहित मांसपेशियों से अलग करें।
- वक्ष और काठ की धुरी प्रक्रियाओं के दोनों किनारों पर लोंगसिमस मांसपेशी काटें।
- कुंद धार स्केलपेल का उपयोग प्रत्येक कशेरुका की ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं को बेनकाब करने के लिए रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से मांसपेशियों को वापस लेना।
- कुंद टिप कैंची का उपयोग उजागर रीढ़ की हड्डी स्तंभ के साथ ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं से जुड़े मांसपेशियों के टेंडन में कटौती। यदि आवश्यक हो तो हीमोस्टेटिक एजेंटों को लागू करें।
- Th13 कशेरुका को रिब प्रविष्टि के साथ सबसे कम वक्ष खंड के रूप में पहचानें और ठीक रोंगटेर का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी के काठ के खंडों का पर्दाफाश करने के लिए Th13 से L2 कशेरुकी तक स्पिनस प्रक्रियाओं और लैमिना को हटा दें। L3 स्पाइनस प्रक्रिया को नुकसान पहुंचाने के लिए याद न रखें जिसका उपयोग रीढ़ के स्थिरीकरण के लिए निर्धारण बिंदु के रूप में किया जाएगा।
- Th12 स्पाइनल प्रक्रिया को हटा दें और जितना संभव हो कशेरुका पृष्ठीय सतह को चिकना करें।
- कुंद विच्छेदन तकनीकों का उपयोग धारक प्रविष्टि अंक बनाने के लिए Th11 कशेरुका से मांसपेशियों को अलग करता है।
- उजागर रीढ़ की हड्डी के खंडों के ऊपर पतली खारा लथपथ कपास ऊन रखें।
- रीढ़ की हड्डी को समर्थन और स्थिर करने के लिए क्लैंप के साथ दो समानांतर सलाखों और दो समायोज्य हथियारों के साथ कस्टम मेड धातु फ्रेम करने के लिए चूहे को ले जाएं।
3. रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए तैयारी
- कशेरुकी कॉलम निर्धारण और तंत्रिका व्यवस्था
- 37 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर पशु शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए बंद लूप हीटिंग सिस्टम से जुड़े एक हीटिंग पैड पर कस्टम-निर्मित फ्रेम में चूहे को रखें।
- त्वचा के नीचे ईसीजी इलेक्ट्रोड डालें और हृदय गति की निगरानी के लिए एक एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
- त्वचा फ्लैप का उपयोग करके, उजागर रीढ़ की हड्डी पर एक गहरा पूल बनाएं।
- धातु क्लैंप का उपयोग करके, Th12 ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं के नीचे और एल 3 स्पिनस प्रक्रिया पर क्लैंप डालकर कशेरुका स्तंभ को ठीक करें।
- सुनिश्चित करें कि कशेरुकी स्तंभ सुरक्षित और क्षैतिज रूप से व्यवस्थित है, और फिर मांसपेशियों को वापस लेने के लिए कॉलम के दोनों किनारों पर डोरसो-वेंट्रल दबाव लागू करें।
- पूल को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) खनिज तेल से भरें और इस तापमान पर बनाए रखें।
- दुखती कण्डरा के माध्यम से एक 4-0 लिगामेंट थ्रेड करें, ऑपरेटिव लेफ्ट हिंद अंग को उठाएं और फैलाएं ताकि टखने को कूल्हे के साथ समतल किया जा सके।
- त्वचा फ्लैप का उपयोग उजागर टिबियल, एमजी और एलजीएस नसों पर एक गहरा पूल बनाते हैं।
- पूल को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) खनिज तेल से भरें।
- द्विध्रुवी चांदी के तार उत्तेजक इलेक्ट्रोड पर एमजी और एलजीएस नसों रखें और उन्हें एक वर्ग पल्स उत्तेजक से कनेक्ट करें। प्रत्येक तंत्रिका के लिए अलग उत्तेजना चैनलों का उपयोग करें।
- सरफेस इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट
- उजागर रीढ़ की हड्डी के बाएं कौडल पक्ष पर एक चांदी की गेंद इलेक्ट्रोड रखें, पीठ की मांसपेशियों में डाला एक संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ, और अंतर डीसी एम्पलीफायर के लिए दोनों इलेक्ट्रोड कनेक्ट । सतह गेंद इलेक्ट्रोड नसों से afferent वॉलियों रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
- एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक का उपयोग करना, 0.1 एमएस अवधि के वर्ग दालों के साथ एमजी और एलजीएस नसों को उत्तेजित करें, 3 हर्ट्ज की आवृत्ति पर दोहराया जाता है, और अफ़ेरेंट वॉलियों का निरीक्षण करें।
- तंत्रिका सक्रियण के लिए दहलीज (टी) निर्धारित करें, लगभग 3 पर प्रत्येक तंत्रिका को उत्तेजित करें · टी तीव्रता, और प्रत्येक तंत्रिका के लिए अफरेंट वॉली के रिकॉर्ड आयाम।
- सतह इलेक्ट्रोड रोस्ट्रल को स्थानांतरित करें और रीढ़ की हड्डी के खंडों की पहचान करने की प्रक्रिया दोहराएं जिस पर वॉलियों के आयाम प्रत्येक तंत्रिका के लिए सबसे अधिक हैं। अधिकतम वॉली स्थान निर्धारित करने के बाद, सतह इलेक्ट्रोड को रीढ़ की हड्डी से सुरक्षित दूरी पर ले जाएं।
- मांसपेशियों के पक्षाघात और श्वसन आंदोलनों को कम करने के लिए एक नियोमोटोराक्स बनाने
- चूहे को एक न्यूरोमस्कुलर अवरोधक के साथ नसों में लकवा मारें और श्वास नली को एक बाहरी वेंटिलेटर से कनेक्ट करें, जो कृंतक-संगत कैपनोमीटर (पनक्यूोनियम ब्रोमाइड, 0.4मिलीग्राम-1की प्रारंभिक खुराक पर) के अनुरूप है, जो 0.2 मिलीग्राम-1की खुराक में हर 30 मिनट में पूरक है)
- अंत ज्वारीय सीओ2 एकाग्रता की निगरानी करें और वेंटिलेशन मापदंडों (आवृत्ति, हवा के दबाव और प्रवाह की मात्रा) को समायोजित करके इसे लगभग 3\u20124% पर बनाए रखें।
- रिकॉर्डिंग के एक तरफ 5 वीं और 6 पसली के बीच त्वचा में एक देशांतर चीरा बनाओ।
- कुंद टिप कैंची का उपयोग पसलियों के बीच इंटरकोस्टल अंतरिक्ष की कल्पना करने के लिए ओवरलाइंग मांसपेशियों को काटता है।
- छोटी तेज कैंची का उपयोग करके, इंटरकोस्टल मांसपेशियों और प्लूरा में एक छोटा सा चीरा बनाएं, फिर फेफड़ों पर प्रेस न करने का ख्याल रखते हुए, खोलने में कुंद किनारे संदंश की नोक डालें।
- पूरे प्रयोग में वायोथोरैक्स को खुला रखने के लिए एक छोटी ट्यूब का विस्तार या डालने के लिए संदंश की अनुमति दें।
- न्यूरोमस्कुलर ब्लॉक के बाद, ईसीजी आवृत्ति की जांच करके संज्ञाहरण गहराई की निगरानी करें, और हृदय गति 400 बीपीएम से अधिक होने पर एनेस्थेटिक एजेंट को पूरक करें। मांसपेशियों के पक्षाघात और श्वसन आंदोलनों को कम करने के लिए एक नियोमोटोराक्स बनाने, जो रिकॉर्डिंग स्थिरता में सुधार होगा
- ड्यूरा और पिया मेटर खोलना
- #55 संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे ड्यूरा मेटर उठाएं, और इसे एल 5 सेगमेंट से कम करके काट दें, जो एल 4 सेगमेंट तक है।
- अल्ट्रा-थिन 5SF संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना पिया में एक छोटा सा पैच बनाते हैं जो रक्त वाहिकाओं के बीच, रक्त वाहिकाओं के बीच, एमजी या एलजीएस तंत्रिका से अधिकतम आफरेंट वॉली के स्तर पर, पृष्ठीय स्तंभ को कवर करते हैं।
- यदि आवश्यक हो तो रक्तस्राव को अवरुद्ध करने के लिए नमकीन से लथपथ और सूखे जेल फोम के छोटे टुकड़ों का उपयोग करें।
- टीएसडीसी इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट
- L4-L5 रीढ़ की हड्डी खंडों के स्थान के अनुरूप रोस्ट्रो-कौडल स्तर पर चूहे के पेट के वेंट्रल साइड पर त्वचा में एक छोटा सा चीरा बनाएं।
- एक धातु क्लिप जो एक संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में काम करेगा के साथ उजागर त्वचा पल्ला पकड़ो।
- Th12 कशेरुका के पृष्ठीय पक्ष पर एक खारा लथपथ स्पंज रखें। सुनिश्चित करें कि स्पंज का आकार एक सक्रिय टीएसडीसी इलेक्ट्रोड (व्यास में 5 मिमी की सर्कल के आकार का स्टेनलेस स्टील प्लेट) के बराबर है।
- एक ठीक जोड़तोड़ का उपयोग करके, एक सक्रिय टीएसडीसी इलेक्ट्रोड के साथ स्पंज को हड्डी पर दबाएं और सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड की पूरी सतह समान रूप से दबाई गई है।
- संदर्भ और सक्रिय टीएसडीसी दोनों इलेक्ट्रोड को निरंतर-वर्तमान उत्तेजक इकाई से कनेक्ट करें, जो प्रत्यक्ष वर्तमान के निरंतर प्रवाह को वितरित करने में सक्षम है।
- माइक्रोपिपेट्स की तैयारी
- माइक्रोइलेक्ट्रोड पुलर का उपयोग करके, माइक्रोइलेक्ट्रोड तैयार करें।
नोट: फिलामेंट और गैर-फिलामेंट इलेक्ट्रोड दोनों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि, याद रखें कि इलेक्ट्रोड की टांग वेंट्रल सींग तक पहुंचने के लिए काफी लंबी होनी चाहिए, जबकि उतरते समय रीढ़ की हड्डी को संकुचित करने के लिए पर्याप्त पतली नहीं होना चाहिए।- पुलर सेटिंग को समायोजित करें ताकि रीढ़ की हड्डी में प्रवेश करने वाली टांग लगभग 3 मिमी लंबी हो, जबकि इलेक्ट्रोड की नोक व्यास में 1\u20122 माइक्रोन से अधिक नहीं है और माइक्रोइलेक्ट्रोड प्रतिरोध 10 और 20 एम के बीच हैΩ।
- माइक्रोइलेक्ट्रोड्स को 2M पोटेशियम-साइट्रेट इलेक्ट्रोलाइट से भरें।
- 1\u20122 μm कदम आंदोलन और स्टीरियोटैक्सिक अंशांकन की अनुमति माइक्रोमैनीपुलेटर पर तैयार माइक्रोइलेक्ट्रोड माउंट।
- माइक्रोइलेक्ट्रोड को पीछे की मांसपेशियों में रखे संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ इंट्रासेल्युलर एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
- माइक्रोइलेक्ट्रोड पुलर का उपयोग करके, माइक्रोइलेक्ट्रोड तैयार करें।
- न्यूरोमस्कुलर ब्लॉक के बाद, ईसीजी आवृत्ति की जांच करके संज्ञाहरण गहराई की निगरानी करें, और एनेस्थेटिक एजेंट को पूरक करें ताकि चूहे की हृदय गति 400 बीपीएम से अधिक न हो।
4. Motoneuron ट्रैकिंग और प्रवेश
- एल6 सेगमेंट के स्तर पर, रिकॉर्डिंग साइट के स्थान पर, रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय सतह पर अफ़रीद वॉली रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड वापस रखें।
- एक चयनित तंत्रिका के भीतर अल्फा-motoneurons के सभी अक्षतंतु को सक्रिय करने के लिए, 3 हर्ट्ज, और 3T तीव्रता की आवृत्ति पर विद्युत 0.1 एमएस दालों के साथ एमजी और एलजीएस नसों को उत्तेजित करें।
- माइक्रोपिपेट को पिया में एक चयनित पैच में 15\u201220 ° के एक औसत-पार्श्व कोण के साथ ड्राइव करें (बाद में निर्देशित टिप के साथ)।
- सतह के नीचे उतरते हुए, माइक्रोइलेक्ट्रोड को कैलिब्रेट करें और इसकी क्षमता और वोल्टेज ऑफसेट की भरपाई करें, और सभी मापदंडों के स्थिर होने पर रीढ़ की हड्डी में प्रवेश जारी रखें। संबंधित तंत्रिका की उत्तेजना के दौरान एक समर्पित मोटर नाभिक के पास पहुंचते समय माइक्रोइलेक्ट्रोड वोल्टेज ट्रेस पर मोटोन्यूरॉन पूल की एक एंटीड्रोमिक क्षेत्र क्षमता दिखाई देगी।
- 1\u20122 माइक्रोन चरणों में माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ प्रवेश करें, और समय-समय पर किसी भी अवशेष से इलेक्ट्रोड टिप को साफ करने के लिए इंट्रासेलर एम्पलीफायर के चर्चा फ़ंक्शन का उपयोग करें।
- मोटोन्यूरॉन प्रवेश का निरीक्षण करें जो रिकॉर्ड किए गए वोल्टेज ट्रेस और एंटीड्रोमिक स्पाइक क्षमता की उपस्थिति के अचानक हाइपरपोलराइजेशन की विशेषता होगी।
5. रिकॉर्डिंग मोटोन्यूरॉन झिल्ली और फायरिंग गुण
- इंट्रासेलुलर एम्पलीफायर के एक पुल मोड में, संबंधित तंत्रिका शाखाओं को उत्तेजित करके एंटीड्रोमिक एक्शन क्षमता की "ऑल-या-कुछ नहीं" उपस्थिति के आधार पर मोटोन्यूरॉन की पहचान करें। बाद में औसत के लिए रिकॉर्ड 20 बाद के निशान ।
- उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए एक सख्त समावेशन मापदंड को लागू करें: आयाम में कम से कम -50 एमवी की झिल्ली क्षमता को आराम; एक सकारात्मक ओवरशूट के साथ, 50 मीटर से अधिक कार्य क्षमता आयाम; रिकॉर्डिंग से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए झिल्ली संभावित स्थिर।
- इंट्रासेल्युलर एम्पलीफायर के एक असतत वर्तमान क्लैंप मोड (वर्तमान स्विच रेट मोड 4-8 किलोहर्ट्ज) में, 0.5 एमएस इंट्रासेलुलर डीपोलराइजिंग वर्तमान दालों का उपयोग करके एक मोटोन्यूरॉन में ऑर्थोड्रोमिक एक्शन क्षमता पैदा करें। ऑफलाइन औसत के लिए कम से कम 20 बार दोहराएं।
- सेल इनपुट प्रतिरोध की गणना करने के लिए हाइपरपोलेराइजिंग करंट (1 एनए) के 40 छोटी दालों (100 एमएस) के साथ एक मोटोन्यूरॉन को उत्तेजित करें।
- एक स्पाइक को प्रकाश में लाने के लिए आवश्यक वर्तमान को डीपोलेराइज करने के न्यूनतम आयाम के रूप में रियोबेस मूल्य निर्धारित करने के लिए बढ़ते आयामों में 50 एमएस वर्ग-तरंग दालों के साथ एक मोटोन्यूरॉन को उत्तेजित करें।
- 0.1-2 एनए के चरणों में बढ़ते आयामों पर, 1-2 एनए के कदमों में बढ़ते आयामों पर, 500 एमएस वर्ग-तरंग दालों को इंजेक्ट करें ताकि मोटोन्यूरॉन्स के लयबद्ध निस्सरण को पैदा किया जा सके।
6. ट्रांस-स्पाइनल डायरेक्ट करंट उत्तेजना (टीएसडीसी)
- मोटोन्यूरॉन के स्थिर प्रवेश को बनाए रखते हुए, प्रत्यक्ष वर्तमान के ट्रांस-स्पाइनल एप्लिकेशन द्वारा ध्रुवीकरण प्रक्रिया शुरू करें। प्रयोग डिजाइन के लिए वर्तमान तीव्रता और आवेदन समय को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, 15 मिनट के लिए 0.1 एमए)।
- डीसी पर स्विच करने के तुरंत बाद, मोटोन्यूरॉन झिल्ली क्षमता का निरीक्षण करें। एक नोडल ध्रुवीकरण (एक एनोड के रूप में सक्रिय इलेक्ट्रोड) के परिणामस्वरूप झिल्ली की क्षमता का ध्रुवीकरण होना चाहिए, जबकि कैथोडल ध्रुवीकरण (कैथोड के रूप में सक्रिय इलेक्ट्रोड) को विपरीत प्रभाव पैदा करना चाहिए। निरीक्षण करें कि क्या डीसी उत्तेजना के जवाब में आराम झिल्ली क्षमता में परिवर्तन स्थिर है, जो यह सुनिश्चित करता है कि विद्युत क्षेत्र की तीव्रता प्रभावित न हो।
- निरंतर वर्तमान आवेदन के दौरान, 5 मिनट के अंतराल में 5.3\u20125.6 दोहराएं।
- डीसी बंद करें और 5 मिनट के अंतराल में चरण 5.3\u20125.6 दोहराने के लिए जारी रखें जब तक रिकॉर्डिंग अस्थिर हो जाती है या समावेशन मानदंडों से समझौता नहीं किया जाता है।
- प्रयोग समाप्त करें और पेंटोबार्बिटल सोडियम (180मिलीग्राम-1) की घातक खुराक के नसों में प्रशासन का उपयोग करके जानवर को इच्छामृत्यु दें।
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Representative Results
सेल प्रवेश की स्थिर स्थितियों को सुनिश्चित किए जाने पर कार्रवाई क्षमता और कई झिल्ली गुणों के मापदंडों की गणना इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग के आधार पर की जा सकती है। चित्रा 1A इंट्रासेलुलर उत्तेजना द्वारा पैदा की गई एक विशिष्ट ऑर्थोड्रोमिक कार्रवाई क्षमता प्रस्तुत करता है, जो डेटा समावेश के लिए सभी मानदंडों को पूरा करता है (कम से कम -50 एमवी की आराम झिल्ली क्षमता, और 50 एमवी से अधिक स्पाइक आयाम, एक सकारात्मक ओवरशूट के साथ)। कार्रवाई संभावित मापदंडों, जैसे स्पाइक आयाम, आशुलिपि ध्रुवीकरण आयाम या afterhyperpolarization आधा क्षय समय (AHP-HDT) मापा जा सकता है । चूहे के मोटोन्यूरॉन्स में उत्तरार्द्ध पैरामीटर का मूल्य तेज और धीमी गति से मोटोन्यूरॉन्स (एएचपी-एचडीटी और जीटी; 20 एमएस के बीच धीमी गति से, जबकि एएचपी-एचडीटी और एलटी;20 एमएस के लिए फास्ट मोटोन्यूरॉन्स)17के बीच भेद करने के लिए एक विश्वसनीय मापदंड के रूप में कार्य करता है । चित्रा 1B 1nA के एक 100 एमएस हाइपरपोलेशन वर्तमान पल्स के लिए एक सेल प्रतिक्रिया दिखाता है, जिसमें से एक मोटोन्यूरॉन के पीक और पठार इनपुट प्रतिरोध (आईआर) दोनों वोल्टेज विक्षेप से निर्धारित किए जा सकते हैं। चित्रा 1C स्पाइक की स्पष्ट रूप से चिह्नित वोल्टेज सीमा के साथ एक रियोबासिक स्पाइक का एक विस्तारित वोल्टेज ट्रेस दिखाता है, जो झिल्ली के स्तर को दर्शाता है जिस पर कार्रवाई क्षमता शुरू करने के लिए वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल सक्रिय होते हैं। इन सभी रिकॉर्डिंग के दौरान और tsDCS आवेदन के बाद कई बार दोहराया जा सकता है, जो हमें संबंधित मापदंडों की तुलना की अनुमति देता है जब तक आराम झिल्ली क्षमता स्थिर है और उत्तेजना और रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल के अंय मानदंडों को पूरा कर रहे हैं ।
कई अध्ययनों से अप्रत्यक्ष रूप से यह पता चला है कि टीएसडीसी मोटिवेबिलिटी और फायरिंग पैटर्न9,18को बदल देता है . चित्र 2 दो मोटिवेशन से इंट्रासेलुलर वोल्टेज निशान के उदाहरण दिखाता है, जो टीएसडीसी आवेदन के दौरान और बाद में वर्तमान को depolarizing के 500 एमएस वर्ग दालों के साथ प्रेरित किया जाता है। स्थिर परिस्थितियों में, रिकॉर्डिंग एक के बाद एक कई मिनट दोहराया जा सकता है, और motoneuron फायरिंग पैटर्न मज़बूती से तुलना में किया जा सकता है । एक नोडल (+) टीएसडीसी को लयबद्ध गोलीबारी(चित्रा 2 ए)की बढ़ी हुई मोटोन्यूरोन उत्तेजना और उच्च आवृत्तियों की दिशा में कार्य करने के लिए पाया गया, जबकि कैथोडल (-) टीएसडीसी ने फायरिंग अवरोध(चित्रा 2B)की दिशा में काम किया । इसके अलावा, दोनों प्रकार के टीएसडीसी के प्रभाव ने ध्रुवीकरण की अवधि को आगे बढा दिया। यह भी ध्यान देने योग्य है कि उत्तेजना और फायरिंग पैटर्न में देखे गए परिवर्तन केवल एक नोडल या कैथोडल टीएसडीसी द्वारा सेल झिल्ली depolarization या अतिध्रुवीकरण का परिणाम नहीं हैं, लेकिन झिल्ली क्षमता के परिवर्तन से संबंधित नहीं गहन परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं, क्योंकि वे इस तथ्य के बावजूद कायम रहे कि यह पैरामीटर ध्रुवीकरण के अंत के बाद एक आधार रेखा पर लौट आया।
अंत में, इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल से किसी भी विचलन की संभावना एक असफल प्रयोग में परिणाम होगा, तैयारी की गिरावट के कारण और/या डेटा विश्वसनीयता की एक गहरी गिरावट । चित्रा 3 रिकॉर्डिंग के उदाहरण दिखाता है जब डेटा समावेशन मानदंडों को या तो अपूर्ण कोशिका प्रवेश(चित्रा 3 ए),माइक्रोइलेक्ट्रोड प्रतिरोध और क्षमता(चित्रा 3B)या रीढ़ की हड्डी की अस्थिरता(चित्रा 3C)की भरपाई के लिए उपेक्षा के कारण समझौता किया गया था । यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ता ऐसी गैर-इष्टतम रिकॉर्डिंग की पहचान करें, और उचित सुधारात्मक कार्यों को लागू करें या डेटा सेट से ऐसे परिणामों की उपेक्षा करें।
चित्रा 1: कार्रवाई क्षमता और झिल्ली गुणों के पैरामीटर।
(क)इंट्रासेल्युलर उत्तेजना द्वारा प्राप्त एक आर्थोड्रोमिक क्रिया क्षमता, संकेतित बुनियादी मापदंडों के साथ, जिसकी गणना इस रिकॉर्ड से की जा सकती है । एपी आयाम = कार्रवाई संभावित आयाम; एएचपी एम्पल = आफ़ोहीपर्रक्षवीकरण आयाम; एएचपी-एचडीटी = आफरीपर्रक्षा आधा क्षय समय। (ख)1nA तीव्रता की वर्तमान नाड़ी को कम (100 एमएस) के लिए झिल्ली प्रतिक्रिया का वोल्टेज ट्रेस, जो हमें इनपुट प्रतिरोध (आईआर) की गणना करने में सक्षम बनाता है। एक संभावित विक्षेप (आईआर पीक) के शिखर पर ध्यान दें जिसके बाद एक छोटी सी कमी और झिल्ली क्षमता (आईआर पठार) के निम्नलिखित पठार चरण। (ग)स्पाइक वोल्टेज सीमा को इंगित करने वाली बिंदीदार क्षैतिज रेखा के साथ एक रियोबासिक स्पाइक का विस्तारित वोल्टेज ट्रेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: मोटोन्यूरॉन फायरिंग पर ध्रुवीकरण का प्रभाव।
(A)एक मोटोन्यूरॉन से इंट्रासेलुलर रिकॉर्ड ने ध्रुवीकरण (दाएं) की समाप्ति के बाद एक नोडल टीएसडीसी (0.1 एमए, मध्य) और 10 मिनट के दौरान 500 एमएस के लिए 7.5 एनएम के साथ इंट्रासेलुलर रूप से प्रेरित किया। एक ही उत्तेजना तीव्रता पर motoneuron उत्तेजना में क्रमिक वृद्धि पर ध्यान दें। (ख)एक अन्य मोटोन्यूरॉन से इंट्रासेलुलर रिकॉर्ड ने 500 एमएस के लिए 6 एनए के साथ इंट्रासेलुलर रूप से उत्तेजित किया, जो पहले (बाएं) बनाया गया था, कैथोडल टीएसडीसी (0.1 एमए, मध्य) के दौरान, और ध्रुवीकरण के अंत के बाद 10 मिनट (दाएं)। एक ही उत्तेजना तीव्रता पर मोटोन्यूरॉन फायरिंग फ्रीक्वेंसी के क्रमिक अवरोध पर ध्यान दें। रिकॉर्डिंग के नीचे, इंट्रासेलर उत्तेजना वर्तमान के निशान प्रदान किए जाते हैं। नीचे दाईं ओर अंशांकन सलाखों के सभी प्रस्तुत इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग पर लागू होते हैं। आराम झिल्ली क्षमता के मूल्यों को प्रत्येक रिकॉर्डिंग के बाईं ओर प्रदान किया जाता है। स्थिर राज्य गोलीबारी की आवृत्तियों, अंतिम तीन interspike अंतराल के साधनों से गणना, रिकॉर्ड से ऊपर दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: प्रायोगिक प्रोटोकॉल से विचलन के परिणामस्वरूप उप-प्रतिस्थापन रिकॉर्ड के उदाहरण।
(क)एक मोटोन्यूरॉन से दर्ज एंटीड्रोमिक स्पाइक अपर्याप्त रूप से प्रवेश करता है । आराम झिल्ली क्षमता अपर्याप्त है (-45 एमवी), और डीपोलराइजेशन, पुनर्ध्रुवीकरण और हाइपरपोलराइजेशन के लगातार सभी चरणों के साथ स्पाइक के उचित आकार के बावजूद, इसका आयाम बहुत कम (41 एमवी) और बिना ओवरशूट है। (ख)एक अवास्तविक वोल्टेज सीमा पर उत्पन्न एक रियोबासिक स्पाइक (झिल्ली +68 एमवी तक डीपोलराइज्ड)। इस तरह की त्रुटि आमतौर पर अवरुद्ध माइक्रोइलेक्ट्रोड के कारण होती है, जिसमें बिना मुआवजा प्रतिरोध और क्षमता होती है। एक भी देख सकते है कि इस रिकॉर्ड दृढ़ता से ५० हर्ट्ज बिजली के शोर से दूषित है । (ग)500 एमएस डीपोलराइजिंग करंट के जवाब में एक मोटोन्यूरॉन लयबद्ध फायरिंग, जिसमें झिल्ली की क्षमता के बड़े उतार-चढ़ाव होते हैं, मुख्य रूप से अस्थिर माइक्रोइलेक्ट्रोड प्रवेश के कारण, संभवतः अत्यधिक श्वसन आंदोलनों के कारण। सभी प्रस्तुत मामलों के लिए गणना झिल्ली या फायरिंग गुण अविश्वसनीय होंगे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यदि सही ढंग से किया जाता है, तो वर्णित प्रोटोकॉल का शल्य चिकित्सा हिस्सा लगभग तीन घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। सर्जरी के दौरान, विशेष रूप से शरीर के तापमान और संज्ञाहरण की गहराई में, एक जानवर की स्थिर शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने में विशेष रूप से ध्यान रखना चाहिए। स्पष्ट नैतिक विचारों के अलावा, उचित संज्ञाहरण की कमी तंत्रिका विच्छेदन या लेमिनेक्टॉमी के दौरान अत्यधिक अंग आंदोलनों में परिणाम दे सकती है और तैयारी या समय से पहले प्रयोग समाप्ति को नुकसान पहुंचा सकती है। माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ रीढ़ की हड्डी को भेदने से पहले एक जानवर को लकवा मारने पर, संज्ञाहरण और हृदय गति की गहराई की निगरानी करना और पशु वजन और फेफड़ों की क्षमता के आधार पर उचित वेंटिलेशन मापदंडों को लागू करना महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया की सफलता सुनिश्चित करने के लिए वांछित शारीरिक मापदंडों से किसी भी विचलन को तुरंत संशोधित करना होगा । सर्जरी के बाद, स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थिति को कम से कम चार घंटे तक बनाए रखना संभव होना चाहिए।
एक मोटोन्यूरॉन के प्रवेश के बाद, रिकॉर्डिंग स्थिरता उच्च महत्व की है। यह जरूरी है कि नियंत्रण रिकॉर्डिंग के दौरान एक झिल्ली क्षमता स्थिर बनी रहे, क्योंकि कोई भी उतार-चढ़ाव रियोबेस वर्तमान और लयबद्ध गोलीबारी की दहलीज को काफी प्रभावित करेगा। कशेरुका स्तंभ का उचित निर्धारण बुनियादी स्थिरता प्रदान करना चाहिए, जबकि एक वायोथोरैक्स का लक्ष्य श्वसन द्वारा पैदा की गई रीढ़ की हड्डी के आंदोलनों को कम करना है। इसके अलावा, किसी को यह सुनिश्चित करना होगा कि प्रवेश के प्रयास से पहले मांसपेशियों के संकुचन को पूरी तरह से समाप्त कर दिया जाता है और न्यूरोमस्कुलर अवरोधक को नियमित अंतराल पर प्रशासित किया जाता है।
रिकॉर्ड किए गए मोटोन्यूरॉन की एक सफल प्रवेश एंटीड्रोमिक पहचान के बाद एक संबंधित तंत्रिका शाखा की उत्तेजना द्वारा किया जा सकता है। यह वीवो तैयारी का एक वास्तविक लाभ है, जिसमें मोटोन्यूरॉन एक्सॉन को रीढ़ की हड्डी के स्लाइस पर किए गए इन विट्रो इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग के संदर्भ में इनरवेटेड मांसपेशियों के साथ निरंतरता में रखा जाता है, जो हाल ही में वयस्क जानवरों में संभव थे16,लेकिन रिकॉर्ड किए गए मोटोन्यूरॉन की पहचान की अनुमति नहीं देते हैं। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं को डेटा की गलत व्याख्या से बचने के लिए मोटोन्यूरॉन19 के एंटीड्रोमिक और ऑर्थोड्रोमिक एक्टिवेशन के बीच अंतर की स्पष्ट समझ हो । वर्तमान प्रसार के कारण अतिरिक्त नसों की सक्रियता को रोकने और एंटीड्रोमिक स्पाइक 19 की निरंतर और छोटी विलंबता पर ध्यान देने के लिए परिधीय तंत्रिका उत्तेजना को यथासंभव कम(0.5वी से कम) रखना महत्वपूर्ण है।
प्रस्तुत तकनीक का एक और लाभ यह है कि मोटोन्यूरॉन्स को अतिरिक्त रूप से उनके कार्य संभावित मापदंडों, अर्थात् एएचपी-एचडीटी अवधि17के आधार पर तेज या धीमी गति से प्रकारों के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। आंदोलनों के दौरान मांसपेशियों के प्रदर्शन में उनके विभिन्न योगदान के संबंध में तेजी से प्रकार और धीमी गति से प्रकार के मांसपेशियों के तंतुओं को अंतर्रवेट करने वाले मोटोन्यूरॉन्स के बीच भेदभाव महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, तेजी से और धीमी गति से motoneurons ध्रुवीकरण 9 के लिए अलगतरहसे प्रतिक्रिया कर सकते हैं ।
ध्रुवीकरण के विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए टीएसडीसी के उचित मापदंडों को निर्धारित करने पर ध्यान देना चाहिए। वर्तमान तीव्रता, एक तरफ, चयनित क्षेत्र में एक वांछित क्षेत्र घनत्व प्रदान करने के लिए न्यूरोनल नेटवर्क पर प्रभाव पैदा करना चाहिए, जबकि दूसरी ओर ऊतक क्षति20के लिए सुरक्षा सीमा के भीतर होना चाहिए । रिकॉर्डिंग की साइट के संबंध में सक्रिय और संदर्भ इलेक्ट्रोड का आकार और उनका प्लेसमेंट भी महत्वपूर्ण तत्व हैं , जिन पर विचार करने के लिए,4और टीएसडीसी अवधि आवेदन समय वांछित प्रभाव 16 ,17,,1622को पैदा करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । इस विधियों में, प्रतिनिधि परिणाम 100 μa कैथोडल या 15 मिनट के लिए एक नोडल ध्रुवीकरण के आवेदन द्वारा प्राप्त किए गए थे। इलेक्ट्रोड आकार और व्यास को ध्यान में रखते हुए, इलेक्ट्रोड के नीचे सीधे संबंधित विद्युत क्षेत्र की तीव्रता 39.25 μA.mm2थी। हालांकि, किसी को यह समझना चाहिए कि रिकॉर्ड किए गए मोटोन्यूरॉन साइट पर विद्युत क्षेत्र का सटीक मूल्य ध्रुवीकरण इलेक्ट्रोड के संबंध में मोटोन्यूरॉन स्थान के रूप में पूर्व-निर्धारित करना असंभव है, और ई-फील्ड घनत्व में वृद्धि की गहराई के साथ काफी गिरावट आती है और इलेक्ट्रोड आकार4,,24में कमी आई है। इसके अलावा, लागू इलेक्ट्रिक क्षेत्र के सापेक्ष मोटोन्यूरॉन डिब्बों का,अभिविन्यास कार्रवाई क्षमता22, 25, 26,25के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है, और यह व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है।26 इसके अलावा, यह समझना बेहद महत्वपूर्ण है कि टीएसडीसी प्रभाव ध्रुवीकरण की अवधि तक सीमित नहीं हैं, और लगातार, लंबे समय तक चलने वाले प्रभाव अच्छी तरह से प्रलेखित हैं22,,27। इसलिए, एक ही तैयारी में एक एकल, संक्षिप्त ध्रुवीकरण सत्र के बाद सभी क्रमिक रिकॉर्डिंग का पालन किया जाएगा, जो संभावित तीव्र ध्रुवीकरण रिकॉर्डिंग की संख्या को प्रति पशु एक तक सीमित करता है।
प्रस्तुत प्रक्रिया के अतिरिक्त संशोधन विशिष्ट अनुसंधान सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है । न्यूनतम संशोधनों वाले इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए एक मानक के रूप में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, लागू टीएसडीसी की विभिन्न अवधि और/या आयामों का परीक्षण करते समय या विभिन्न पूल मोटिव्स में टीएसडीसी के लघु या दीर्घकालिक प्रभावों की तुलना करते समय। कई आनुवंशिक रोग मॉडल का उपयोग (उदाहरण के लिए एएमयोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस का एसओडी1 जी93ए चूहा मॉडल) या एंटीड्रोमिक तंत्रिका सक्रियण (पेरोनल, टिबियल, सैफेनोस, आदि) के लिए विभिन्न तंत्रिकाएं स्वीकार्य हैं। हालांकि, किसी को प्रक्रिया सीमाओं के बारे में भी पता होना चाहिए। उदाहरण के लिए, संज्ञाहरण के लिए बार्बिटुरेट्स का उपयोग लगातार आवक धाराओं28की गतिविधि को रोकता है, जबकि आमतौर पर इन विट्रो तैयारी में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट ब्लॉकर्स की प्रणालीगत शुरूआत (उदाहरण के लिए, निकोटीनिक रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए स्ट्राइकनाइन) जानवर के लिए घातक साबित हो सकती है। शोधकर्ताओं के लिए उचित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का चयन करने से पहले इन सीमाओं पर विचार करने की सलाह दी जाती है।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र अनुदान संख्या 2017/25/B/NZ7/00373 द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक हैना ड्रज़ीमाला-सेलिचोवस्का और वलोड्ज़िमियर्ज़ एमरौज़िन्स्की के काम को पहचानना चाहते हैं, जिन्होंने इस पेपर में प्रस्तुत परिणामों के डेटा एकत्र करने और विश्लेषण में योगदान दिया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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