Summary
Denne protokollen beskriver in vivo intracellulær registrering av rotte lumbale motoneurons med samtidig trans-spinal direkte strømstimulering. Metoden gjør det mulig for oss å måle membranegenskaper og registrere rytmisk avfyring av motoneuroner før, under og etter anodal eller cathodal polarisering av ryggmargen.
Abstract
Intracellulær registrering av spinal motoneurons in vivo gir en "gullstandard" for å bestemme cellenes elektrofysiologiske egenskaper i det intakte spinalnettverket og har betydelige fordeler i forhold til klassisk in vitro eller ekstracellulære opptaksteknikker. En fordel med in vivo intracellulære opptak er at denne metoden kan utføres på voksne dyr med et fullt modent nervesystem, og derfor kan mange observerte fysiologiske mekanismer oversettes til praktiske applikasjoner. I dette metodiske papiret beskriver vi denne prosedyren kombinert med eksternt anvendt konstant strømstimulering, som etterligner polariseringsprosesser som forekommer i spinalneuronale nettverk. Trans-spinal direkte strøm stimulering (tsDCS) er en innovativ metode i økende grad brukt som en neuromodulerende intervensjon i rehabilitering etter ulike nevrologiske skader så vel som i sport. Påvirkningen av tsDCS på nervesystemet forblir dårlig forstått og de fysiologiske mekanismene bak sine handlinger er i stor grad ukjente. Anvendelsen av tsDCS samtidig med intracellulære opptak gjør det mulig for oss å direkte observere endringer av motoneuronmembranegenskaper og egenskaper ved rytmisk avfyring som svar på polariseringen av spinalneuronnettverket, noe som er avgjørende for forståelsen av tsDCS-handlinger. Videre, når den presenterte protokollen inkluderer identifisering av motoneuron med hensyn til en innervated muskel og dens funksjon (flexor versus extensor) samt fysiologisk type (rask versus langsom) det gir en mulighet til å selektivt undersøke påvirkning av tsDCS på identifiserte komponenter av spinal kretser, som synes å være annerledes påvirket av polarisering. Den presenterte prosedyren fokuserer på kirurgisk forberedelse for intracellulære opptak og stimulering med vekt på trinnene som er nødvendige for å oppnå forberedelsesstabilitet og reproduserbarhet av resultater. Detaljene i metodikken til anodal- eller cathodal tsDCS-søknaden diskuteres samtidig som man tar hensyn til praktiske og sikkerhetsmessige spørsmål.
Introduction
Trans-spinal direkte strøm stimulering (tsDCS) er å få anerkjennelse som en potent metode for å endre spinal krets spenning i helse og sykdom1,,2,,3. I denne teknikken overføres en konstant strøm mellom en aktiv elektrode som ligger over utvalgte spinalsegmenter, med en referanseelektrode plassert enten ventrikalt eller mer rostrally4. Flere studier har allerede bekreftet at tsDCS kan brukes til å håndtere visse patologiske forhold, for eksempel nevropatisksmerte 5,spasticitet6,ryggmargsskade7 eller for å lette rehabilitering8. Forskere foreslår at tsDCS fremkaller endringer i iionfordelingen mellom intracellulær og ekstracellulært rom over cellemembranen, og dette kan enten lette eller hemme nevronal aktivitet avhengig av gjeldendeorientering 9,10,11. Men inntil nylig manglet en direkte bekreftelse på denne påvirkningen på motoneuroner.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å gjennomføre intracellulær registrering av elektriske potensialer fra lumbale spinalmotoneuroner i den bedøvede rotten med samtidig bruk av tsDCS, for å observere endringer i motoneuronmembran og avfyringsegenskaper som svar på anodal eller katadal polarisering av spinalneuronalnettet. Intracellulære opptak åpner flere områder av undersøkelse av nevronegenskaper, utilgjengelig for tidligere brukte ekstracellulæreteknikker 9,12. For eksempel er det mulig å nøyaktig måle motoneuron membran spenning respons på direkte strøm strøm indusert av tsDCS, for å indikere spenningsterskel for pigggenerering, eller for å analysere handling potensielle parametere. Videre tillater denne teknikken oss å bestemme motoneuron passive membranegenskaper, for eksempel inngangsmotstand, og for å observere forholdet mellom intracellulær stimuleringsstrøm og hyppigheten av rytmisk avfyring av motoneuroner. Antidromisk identifisering av registrert motoneuron, basert på stimulering av funksjonelt identifiserte nerver (det vil si nerver som gir efferents til flexors eller extensors) tillater oss å i tillegg identifisere typer innervated motorenheter (rask versus sakte), noe som gir en mulighet til å teste om polarisering påvirker ulike elementer i det modne spinalneuronale systemet. På grunn av omfattende kirurgi før opptaket og høye krav til stabilitet og pålitelighet av opptak, er denne teknikken svært utfordrende, men tillater direkte og langsiktig vurdering av elektrofysiologiske egenskaper av en motoneuron: før, under og etter påføring av tsDCS, noe som er avgjørende for å bestemme både sine akutte handlinger ogvedvarende effekter 13. Som en motoneuron aktiverer direkte ekstradrivstoff muskelfibre14 og tar del i tilbakemeldingskontroll av en muskelsammentrekning og utviklet kraft15,16 enhver observert påvirkning av tsDCS på motorenheten eller muskelkontraktile egenskaper kan være knyttet til moduleringer av motoneuron spenning eller avfyring egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer knyttet til denne protokollen er akseptert av de aktuelle myndighetene (f.eks. lokal etikkkomité) og følger de nasjonale og internasjonale reglene for dyrevelferd og ledelse.
MERK: Hver deltaker som er involvert i prosedyren må være riktig opplært i grunnleggende kirurgiske prosedyrer og må ha en gyldig lisens for å utføre dyreforsøk.
1. Anestesi og overmedisinering
- Bedøve en rotte med intraperitoneale injeksjoner av natriumpentobarbital (en startdose på 60 mg·kg-1 for 6 måneder gamle hannrotter som veier 400\u2012550g).
MERK: Denne protokollen er ikke begrenset til den angitte belastningen, kjønnet eller alderen til rotter. Også, alternativ anestesi som ketamin-xylazine blanding, alfa-kloralose eller fentanyl + midazolam + medetomidin kan brukes hvis mer egnet for ulike forskningsmål eller når det kreves av etikkkomiteen. - Etter ca. 5 min, kontroller dybden av anestesi ved å klemme rottens baklem tå med stumpe tang. Fortsett med de neste trinnene i protokollen bare når ingen reflekshandling observeres.
- Injiser 0,05 ml atropin subkutant for å redusere slimproduksjonen etter intubasjon.
- Injiser subkutant 5 ml fosfatbuffer som inneholder 4 % glukoseoppløsning, NaHCO3 (1 %) og gelatin (14 %). Denne bufferen vil bli absorbert av de kutane fartøyene gjennom et eksperiment og vil bidra til å opprettholde væskebalansen.
- Gjennom hele operasjonen, regelmessig sjekke dyret for refleks handlinger og supplere anestesi om nødvendig (10 mg ·kg-1·h-1av natrium pentobarbital).
2. Kirurgi
- Forbered dyret for kirurgisk behandling ved å barbere pels over ryggdelen av venstre bakkulb, fra ankelen til hoften, baksiden, fra halen til de høye thoraxsegmentene, venstre side av brystet og ventral side av nakkeområdet over brystbenet
- Plassering av intravenøs linje
- Plasser rotten på ryggen på en lukket varmepute (og fest den med lemfikseringer).
- Bruk et 21 blad, gjør et langsgående kutt gjennom huden fra et brystben til en hake.
- Hold huden med tang og skill den fra det underliggende vevet.
- Ved hjelp av stumpe disseksjonsteknikker eksponerer du riktig halsvene. Disseker venen forsiktig fra omkringliggende vev.
- Finn den delen av venen uten forgreningspunkter, slipp to 4-0 ligaturer under den.
- Lag en løs knute på den proksimale enden av det tidligere identifiserte ikke-forgreningssegmentet av venen og en løs knute på den distale enden av dette segmentet av venen. Klem venen proksimal til hjertet, og deretter ligate den distale delen av venen.
- Ved hjelp av iris saks, gjør et snitt mellom klemmen og fjern ligatur. Hold en klaff i venen, og introdusere et ferdigfylt kateter til det punktet hvor den er blokkert av klemmen.
- Mens du holder venen og kateteret sammen med tang, fjern klemmen og skyv kateteret flere millimeter inn i venen. Fest begge endene av kateteret til venen, og legg til et ekstra fikseringspunkt til huden.
- Introduksjon av trakealrøret
- Ved hjelp av stumpe tang skille de to mandibulære kjertler som dekker sternohyoid muskler. Separer sternohyoid muskler i midtlinjen for å eksponere luftrøret.
- Sett tre 4-0 ligaturer under luftrøret, og lag deretter to knop under trakealrøret innsettingspunkt og en knute over.
- Finn cricoid brusk av strupehodet og gjøre et snitt under den tredje trakeal brusk.
- Sett inn et trakealrør ned i luftrøret og fest røret på plass med forhåndsforberedt ligaturer, og tilsett deretter en ekstra ligatur til huden.
- Legg et lite stykke bomullsull over de separerte musklene, og sutur huden over det opererte området.
- Disseksjon av baklem nerver
- Bruk 21 blad, gjør et langsgående kutt på den bakre siden av venstre bakben, fra akillessenen til hoften.
- Grip huden med tang, og ved hjelp av stump disseksjon teknikker skille huden fra underliggende muskler på begge sider av snittet.
- Finn popliteal fossa på baksiden av kneleddet, som er dekket av biceps femoris muskelen, og ved hjelp av saks gjør et kutt mellom den fremre og bakre delen av denne muskelen.
- Beveger seg oppover kutte to hoder av biceps femoris hele veien til hoften for å avsløre isjiasnerven. Cauterize etter behov for å hindre blødning.
- Identifiser sural, tibiale og vanlige peroneale grener av isjiasnerven.
- Ved hjelp av saks, skille lateral fra mediale hodet av gastrocnemius muskelen for å avsløre tibial nerve og dens grener.
- Ved hjelp av 55 tang ta den distale enden av sural nerve, kutt den distalt og dissekere så langt som mulig.
- Gjenta prosedyren med vanlig peroneal nerve.
- Ved hjelp av en stump glassstang skille tibial nerve fra omkringliggende vev, ta vare på ikke å skade blodårene, og kutte den distally.
- Identifiser mediale gastrocnemius (MG) og lateral gastrocnemius og soleus (LGS) nerver.
- Ved hjelp av 55 tang, nøye dissekere MG og LGS nerver, koble dem fra omkringliggende vev, men opprettholde sin forbindelse til de respektive musklene.
- Legg et saltvannsgjennomvåt stykke bomullsull under de eksponerte nervene.
- Lukk huden over det opererte området.
- Laminektomi
- Ved hjelp av 21 blad gjør et langsgående snitt fra sakrum opp til thorax ryggvirvler.
- Skill huden fra underliggende muskler.
- Skjær longissimus muskelen på begge sider av thorax og lumbale spinøse prosesser.
- Ved hjelp av stump kantet skalpell trekke musklene fra ryggraden for å avsløre tverrgående prosesser av hver vertebra.
- Ved hjelp av stump spiss saks kutte sener av muskler knyttet til tverrgående prosesser langs den eksponerte ryggraden. Påfør hemostatiske midler om nødvendig.
- Identifiser Th13 vertebra som det laveste thoraxsegmentet med ribbeinnsetting og bruk av fine rongeurs fjerne spinøse prosesser og laminae fra Th13 til L2 ryggvirvler for å avsløre lumbale segmenter av ryggmargen. Husk å ikke skade L3 spinøs prosess som vil bli brukt som et fikseringspunkt for ryggraden stabilisering.
- Fjern Th12 spinous prosessen og glatt vertebra ryggeoverflaten så mye som mulig.
- Ved hjelp av stump disseksjon teknikker skille musklene fra Th11 vertebra å skape holder innsettingspunkter.
- Legg tynn saltvannsgjennomvåt bomullsull over de eksponerte ryggmargssegmentene.
- Flytt rotten til den skreddersydde metallrammen med to parallelle stenger og to justerbare armer med klemmer for å støtte og stabilisere ryggraden.
3. Forberedelse til opptak og stimulering
- Fiksering av vertebrale kolonner og nervearrangement
- Plasser rotten i den skreddersydde rammen på en varmepute, koblet til det lukkede varmesystemet for å opprettholde dyrekroppstemperaturen ved 37 ± 1 °C.
- Sett EKG-elektroder under huden og koble til en forsterker for pulsovervåking.
- Ved hjelp av hudklaffene danner du et dypt basseng over den eksponerte ryggmargen.
- Ved hjelp av metallklemmer, fest vertebralkolonnen ved å sette klemmer under Th12 tverrgående prosesser og ved L3 spinøs prosess.
- Pass på at vertebralkolonnen er sikret og ordnet horisontalt, og bruk deretter dorso-ventralt trykk på begge sider av kolonnen for å trekke musklene tilbake.
- Fyll bassenget med varm mineralolje og vedlikehold det ved denne temperaturen.
- Tre en 4-0 ligatur gjennom akillessenen, løft og strekk den opererte venstre bakbenet slik at ankelen er jevnet med hoften.
- Ved hjelp av hudklaffene gjør et dypt basseng over de eksponerte tibiale, MG og LGS nerver.
- Fyll bassenget med varm mineralolje.
- Plasser MG- og LGS-nerver på bipolare sølvtrådstimulerende elektroder og koble dem til en firkantet pulsstimulator. Bruk separate stimuleringskanaler for hver nerve.
- Plassering av overflateelektrode
- Plasser en sølvkuleelektrode på venstre kaudal side av den eksponerte ryggmargen, med en referanseelektrode satt inn i ryggmuskulaturen, og koble begge elektrodene til differensial dc forsterker. Overflaten ball elektroden vil bli brukt til å registrere afferent volleys fra nerver.
- Ved hjelp av en konstant strømstimulator, stimulere MG og LGS nerver med firkantede pulser på 0,1 ms varighet, gjentatt med en frekvens på 3 Hz, og observere afferent volleys.
- Bestem terskelen (T) for nerveaktivering, stimulere hver nerve på ca. 3· T intensitet, og registrere amplitude av afferent volley for hver nerve.
- Flytt overflaten elektrode rostral og gjenta prosedyren for å identifisere spinal segmenter der amplituder av volleys er den høyeste for hver nerve. Etter å ha bestemt maksimal volley plassering, flytt overflaten elektroden til en trygg avstand fra ryggmargen.
- Muskellammelse og danner en pneumothorax for å redusere respiratoriske bevegelser
- Lammer rotten intravenøst med en nevromuskulær blokkering og koble trakealrøret til en ekstern ventilator i tråd med et gnagerkompatibelt kapnometer (Pankuroniumbromid, med en startdose på 0,4 mg·kg-1, supplert hver 30 min i doser på 0,2 mg·kg-1)
- Overvåk end-tidal CO2 konsentrasjonen og opprettholde den på ca 3 \\ u20124% ved å justere ventilasjonsparametere (frekvens, lufttrykk, og strømningsvolumer).
- Lag et langsgående snitt i huden mellom 5th og 6th ribben på en side av opptaket.
- Ved hjelp av stump spiss saks kutte overlying muskler for å visualisere interkostalrom mellom ribbeina.
- Ved hjelp av liten skarp saks, gjør et lite snitt i interkostalrommuskulaturen og i pleuraen, og sett deretter inn en spiss av en stump kantttpiss inn i åpningen, pass på å ikke trykke på lungene.
- La tang utvide eller sette inn et lite rør for å holde pneumothorax åpen gjennom hele eksperimentet.
- Etter den nevromuskulære blokken, overvåke anestesi dybde ved å sjekke EKG frekvens, og supplere bedøvelsesmiddel hvis hjertefrekvensen overstiger 400 bpm. Muskellammelse og danner en pneumothorax for å redusere respiratoriske bevegelser, noe som vil forbedre registreringsstabiliteten
- Åpner dura og pia mater
- Bruk #55, løft forsiktig duramateren og kutt den caudally fra L5-segmentet, rostrally opp til L4-segmentet.
- Ved hjelp av et par ultratynne 5SF-tang lage en liten i pia som dekker dorsalkolonnen, mellom blodkarene, akkurat på nivået av maksimal afferent volley fra MG eller LGS nerve.
- Bruk små biter av saltvann-gjennomvåt og tørket gel skum for å blokkere blødning om nødvendig.
- tsDCS elektrode plassering
- Lag et lite snitt i huden på ventral side av en rottemage på rostro-caudal nivå som tilsvarer plasseringen av L4-L5 spinal segmenter.
- Ta tak i den eksponerte hudklaffen med en metallklips som vil fungere som referanseelektrode.
- Plasser en saltvannsvåt svamp på ryggsiden av Th12 vertebra. Pass på at svampstørrelsen er lik den til en aktiv tsDCS elektrode (sirkelformet rustfritt stålplate på 5 mm i diameter).
- Bruk en fin manipulator til å trykke svampen med en aktiv tsDCS-elektrode til beinet og sørge for at hele overflaten av elektroden presses like mye.
- Koble både referanse- og aktive tsDCS-elektroder til en konstant strømstimulatorenhet, som kan levere en kontinuerlig strøm av direkte strøm.
- Fremstilling av mikropipetter
- Ved hjelp av en mikroelektrodtrekker, lag en mikroelektrod.
MERK: Både filament og ikke-filamentelektroder kan imidlertid brukes, men husk at elektrodens skaft må være lang nok til å nå ventralhornet mens du er tynn nok til ikke å komprimere ryggmargen mens du går ned.- Juster avtrekkerinnstillingen slik at skaftet som kommer inn i ryggmargen er ca. 3 mm lang, mens spissen av elektroden ikke er mer enn 1\u20122 μm i diameter og mikroelektrorodmotstanden er mellom 10 og 20 MΩ.
- Fyll mikroelektrodene med 2M kalium-citrat elektrolytt.
- Monter den tilberedte mikroelektrogen på mikromanipulatoren slik at 1\u20122 μm stepping bevegelse og stereotoksisk kalibrering.
- Koble mikroelektrogen til den intracellulære forsterkeren med referanseelektroden plassert i ryggmuskulaturen.
- Ved hjelp av en mikroelektrodtrekker, lag en mikroelektrod.
- Etter den nevromuskulære blokken, overvåk anestesidybden ved å kontrollere EKG-frekvensen, og supplere bedøvelsesmiddelet slik at rottepulsen ikke overstiger 400 bpm.
4. Motoneuron sporing og penetrasjon
- Plasser den afferent volley opptak elektroden tilbake på ryggmargens ryggmargens ryggmarg, caudally til plasseringen av opptaksstedet, på nivå med L6 segmentet.
- Stimulere MG og LGS nerver med elektriske 0,1 ms pulser med en frekvens på 3 Hz, og 3T intensitet, for å aktivere alle aksoner av alfa-motoneurons innenfor en valgt nerve.
- Kjør mikropipetten inn i en valgt i pia med en middelmådig sidevinkel på 15\u201220° (med et tips rettet sidealt).
- Etter å ha gått ned under overflaten, kalibrer mikroelektroden og kompensere kapasitansen og spenningsforskyvningen, og fortsett penetrasjonen av ryggmargen når alle parametrene er stabile. Et antidromisk feltpotensial av motoneuronbassenget vil være synlig ved mikroelektrogenspenningsspor mens du nærmer deg en dedikert motorkjerne under stimulering av den respektive nerven.
- Fortsett penetrasjon med mikroelektrogen ved 1\u20122 μm trinn, og bruk regelmessig buzz-funksjonen til den intracellulære forsterkeren til å fjerne elektrodespissen fra eventuelle rester.
- Observer motoneuron penetrasjon som vil bli preget av en plutselig hyperpolarisering av registrert spenning spor og utseende av en antidromisk pigg potensial.
5. Opptak motoneuron membran og avfyring egenskaper
- I en bromodus av den intracellulære forsterkeren, identifiser motoneuron på grunnlag av "alt-eller-ingenting" utseendet til det antidromiske virkningspotensialet ved å stimulere respektive nervegrener. Rekord 20 påfølgende spor for senere snitt.
- Implementer et strengt inkluderingskriterium for å sikre data av høy kvalitet: hvilemembranpotensial på minst -50 mV i amplitude; virkning potensielle amplituder større enn 50 mV, med en positiv overshoot; membranpotensialet stabilt i minst 5 minutter før opptak.
- I en diskontinuerlig strømklemmemodus (strømbryterhastighetsmodus 4–8 kHz) på den intracellulære forsterkeren fremkaller du et ortopomisk virkningspotensial i en motoneuron ved hjelp av 0,5 ms intracellulære depolariserende strømpulser. Gjenta minst 20 ganger for frakoblet snitt.
- Stimulere en motoneuron med 40 korte pulser (100 ms) av hyperpolariserende strøm (1 nA) for å beregne celleinngangsmotstand.
- Stimulere en motoneuron med 50 ms kvadratbølgepulser ved å øke amplitudene for å bestemme revobaseverdien som minimum amplitude av depolariserende strøm som kreves for å fremkalle en enkelt pigg.
- Injiser 500 ms kvadratbølgepulser av depolariserende strøm, ved økende amplituder i trinn på 0,1-2 nA for å fremkalle rytmiske utslipp av motoneuroner.
6. Trans-spinal direkte strøm stimulering (tsDCS)
- Samtidig opprettholde en stabil penetrasjon av motoneuron, start polariseringsprosedyren ved trans-spinal anvendelse av direkte strøm. Juster gjeldende intensitet og brukstid til eksperimentdesignen (f.eks. 0,1 mA i 15 min).
- Umiddelbart etter at du har slått på DC, må du observere motoneuronmembranpotensialet. Anodal polarisering (den aktive elektroden som en anode) bør resultere i depolarisering av membranpotensialet, mens katadal polarisering (den aktive elektroden som katode) bør fremkalle en motsatt effekt. Vær oppmerksom på om en endring i hvilemembranpotensialet som svar på dc-stimulering er konstant, noe som sikrer at elektrisk feltintensitet ikke påvirkes.
- Under kontinuerlig gjeldende program gjentar du trinn 5.3\u20125.6 i 5 min intervaller.
- Slå av DC og fortsett å gjenta trinn 5.3\u20125.6 i 5 min intervaller til opptakene blir ustabile eller inklusjonskriteriene er kompromittert.
- Avslutt forsøket og eutanisere dyret ved hjelp av intravenøs administrering av en dødelig dose pentobarbital natrium (180 mg·kg-1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parametere for handlingspotensialer og flere membranegenskaper kan beregnes på grunnlag av intracellulære opptak når stabile forhold for cellepenetrasjon sikres. Figur 1A presenterer et typisk ortokmisk virkningspotensial fremkalt av intracellulær stimulering, som oppfyller alle kriterier for datainkludering (hvilemembranpotensialet på minst -50 mV og spike amplitude høyere enn 50 mV, med en positiv overshoot). Handling potensielle parametere, for eksempel spike amplitude, etterhyperpolarisering amplitude eller etterhyperpolarisering halvforfall tid (AHP-HDT) kan måles. En verdi av sistnevnte parameter i rottemotoneuroner fungerer som et pålitelig kriterium for å skille mellom raske og langsomme motoneuroner (AHP-HDT > 20 ms for sakte, mens AHP-HDT <20 ms for raske motoneuroner)17. Figur 1B viser en cellerespons på en 100 ms hyperpolariserende strømpuls på 1nA, hvorfra både topp- og platåinngangsmotstand (IR) av en motoneuron kan bestemmes fra spenningsavbøyningen. Figur 1C viser et utvidet spenningsspor av en revbasisk pigg med en klart markert spenningsterskel på spissen, noe som indikerer nivået av membrandepolarisering der spenningsporterte natriumkanaler aktiveres for å initiere handlingspotensialet. Alle disse opptakene kan gjentas flere ganger under og etter tsDCS-applikasjon, noe som gjør at vi kan sammenligne respektive parametere så lenge hvilemembranpotensialet er stabilt og andre kriterier for stimulering og opptaksprotokoll er oppfylt.
Flere studier har indirekte vist at tsDCS endrer motoneuron spenning og avfyring mønster9,18. Figur 2 viser eksempler på intracellulære spenningsspor fra to motoneuroner stimulert intracellulært med 500 ms kvadratpulser av depolariserende strøm før, under og etter tsDCS-påføring. Under stabile forhold kan opptak gjentatt flere minutter etter hverandre utføres, og motoneuron avfyringsmønstre kan sammenlignes pålitelig. Anodal (+) tsDCS ble funnet å virke mot økt motoneuron spenning og høyere frekvenser av rytmisk avfyring (figur 2A), mens cathodal (-) tsDCS handlet mot avfyring hemming (figur 2B). Videre var effekten av begge typer tsDCS overvarte polariseringsperioden. Det er også verdt å legge til at de observerte endringene i spenning og avfyringsmønster ikke bare er et resultat av cellemembrandepolarisering eller hyperpolarisering av henholdsvis anodal eller katadal tsDCS, men viser dype endringer som ikke er relatert til endringen av et membranpotensial, da de vedvarte til tross for at denne parameteren kom tilbake til en grunnlinje etter polariseringens slutt.
Til slutt må det understrekes at eventuelle avvik fra den presenterte protokollen sannsynligvis vil resultere i et mislykket eksperiment, på grunn av forverring av forberedelse og / eller en dyp nedgang av datapålitelighet. Figur 3 viser eksempler på registreringer når datainkluderingskriterier ble kompromittert enten på grunn av ufullkommen cellepenetrasjon (figur 3A), forsømmelse for å kompensere mikroelektrodresistens og kapasitans (figur 3B) eller ustabilitet i ryggmargen (figur 3C). Det er viktig at forskerne identifiserer slike ikke-optimale opptak, og implementerer riktige korrigerende tiltak eller ser bort fra slike resultater fra datasettet.
Figur 1: Parametere for handlingspotensialer og membranegenskaper.
(A)Et ortodromisk virkningspotensial fremkalt ved intracellulær stimulering, med angitte grunnleggende parametere som kan beregnes fra denne posten. AP ampl = virkningspotensial amplitude; AHP ampl = etterhyperpolarisering amplitude; AHP-HDT = etterhyperpolarisering halvforfallstid. (B)Spenningsspor av en membranrespons på en kort (100 ms) depolariserende strømpuls på 1nA intensitet, noe som gjør oss i stand til å beregne inngangsmotstand (IR). Legg merke til toppen av en potensiell nedbøyning (IR Peak) etterfulgt av en liten reduksjon og følgende platåfase av membranpotensialet (IR-platået). (C) Den utvidede spenningsspor av en revbasisk pigg med en stiplet horisontal linje som indikerer piggspenningsterskelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av polarisering på motoneuron avfyring.
(A) Intracellulære poster fra en motoneuron stimulert intracellulært med 7,5 nA for 500 ms, laget før (venstre), under anodal tsDCS (0,1 mA, midten) og 10 min etter slutten av polariseringen (høyre). Legg merke til den gradvise økningen i motoneuron-spenningen ved samme stimulansintensitet. (B) Intracellulære poster fra en annen motoneuron stimulert intracellulært med 6 nA for 500 ms, laget før (venstre), under cathodal tsDCS (0,1 mA, midten) og 10 min etter slutten av polariseringen (høyre). Legg merke til en gradvis hemming av motoneuronavfyringsfrekvens med samme stimulansintensitet. Under opptak er spor av intracellulær stimuleringsstrøm gitt. Kalibreringslinjene nederst til høyre gjelder for alle presenterte intracellulære opptak. Verdiene av hvilemembranpotensialet er gitt til venstre for hvert opptak. Frekvenser av steady-state avfyring, beregnet ut fra de tre siste interspike intervallene, er gitt over poster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på suboptimale poster som følge av avvik fra eksperimentell protokoll.
(A)Den antidromiske spissen registrert fra en motoneuron utilstrekkelig penetrert. Hvilemembranpotensialet er utilstrekkelig (-45 mV), og til tross for en passende form på spissen med alle påfølgende faser av depolarisering, repolarisering og hyperpolarisering, er amplituden for lav (41 mV) og uten overshoot. (B)En revbasisk pigg generert ved en urealistisk spenningsterskel (membran depolarisert til +68 mV). Denne typen feil skyldes vanligvis en blokkert mikroelektrod, med ukompensert motstand og kapasitans. Man kan også se at denne posten er sterkt forurenset av 50 Hz elektrisk støy. (C) En motoneuron rytmisk avfyring som svar på 500 ms depolariserende strøm, med store svingninger i et membranpotensial, hovedsakelig forårsaket av ustabil mikroelektrorod penetrasjon, muligens på grunn av overdreven respiratoriske bevegelser. For alle de presenterte tilfellene vil de beregnede membran- eller avfyringsegenskapene være upålitelige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hvis den utføres riktig, bør den kirurgiske delen av den beskrevne protokollen fullføres innen ca. tre timer. Man bør være spesielt forsiktig med å opprettholde stabile fysiologiske forhold til et dyr under operasjonen, spesielt kroppstemperatur og dybde av anestesi. Bortsett fra åpenbare etiske hensyn, kan mangel på riktig anestesi føre til overdreven lembevegelser under nervedeksjon eller laminektomi og føre til skade på preparatet eller en tidlig eksperimentoppsigelse. Ved å lamme et dyr før du trenger inn i ryggmargen med en mikroelekrod, er det avgjørende å overvåke dybden av anestesi og hjertefrekvens og å bruke riktige ventilasjonsparametere basert på dyrevekt og lungekapasitet. Eventuelle avvik fra de ønskede fysiologiske parametrene må endres umiddelbart for å sikre prosedyresuksess. Etter operasjonen bør stabile opptaksforhold være mulig å opprettholde i minst fire timer.
Etter penetrasjon av en motoneuron er opptaksstabiliteten av stor betydning. Det er viktig at et membranpotensial forblir konstant under kontrollopptak, da eventuelle svingninger vil påvirke revobasestrømmen betydelig og en terskel for rytmisk avfyring. Riktig fiksering av vertebralkolonnen bør gi grunnleggende stabilitet, mens målet med en pneumothorax er å redusere ryggmargsbevegelsene fremkalt av åndedrett. Videre må man være sikker på at muskelsammentrekninger er fullstendig avskaffet før man forsøker penetrasjon og den nevromuskulære blokkeringen administreres med jevne mellomrom.
Etter en vellykket penetrasjon kan antidromisk identifikasjon av det registrerte motoneuron utføres ved stimulering av en respektive nervegren. Dette er en reell fordel med et in vivo-preparat, der motoneuronakson holdes i kontinuitet med de innervate musklene i referanse til in vitro intracellulære opptak utført på spinalskiver, som bare nylig var mulig hos voksnedyr 16, men tillater ikke identifisering av registrert motoneuron. Det er imidlertid viktig at forskerne har en klar forståelse av forskjellen mellom antidromisk og ortopom aktivering av motoneuron19 for å unngå feiltolkning av dataene. Det er viktig å holde perifer nervestimulering så lav som mulig (mindre enn 0,5 V) for å forhindre aktivering av ekstra nerver på grunn av den nåværende spredningen og å ta hensyn til en konstant og kort ventetid på den antidromiske spissen19.
En annen fordel med den presenterte teknikken er at motoneuroner i tillegg kan klassifiseres som raske eller langsomme typer på grunnlag av deres handling potensielle parametere, nemlig AHP-HDT varighet17. Differensiering mellom motoneurons innervating rask type og slow-type muskelfibre er avgjørende i forhold til deres ulike bidrag til muskelytelse under bevegelser. Videre kan raske og langsomme motoneuroner reagere annerledes på polariseringen9.
For å sikre pålitelige resultater av polarisering bør man være oppmerksom på å sette riktige parametere for tsDCS. Nåværende intensitet bør på den ene siden gi en ønsket felttetthet på det valgte området for å fremkalle effekter på nevronale nettverk, mens på den annen side bør være innenfor sikkerhetsgrenser for vevsskade20. Størrelsen på aktive og referanseelektroder og deres plassering med hensyn til et opptakssted er også viktige elementer åvurdere 4, og tsDCS varighet søknadstid bør være tilstrekkelig til å fremkalle de ønskedeeffektene 16,17,22. I denne metodepapiren ble de representative resultatene oppnådd ved påføring av 100 μA cathodal eller anodal polarisering i 15 min. Med hensyn til elektrodeformen og diameteren var den respektive elektriske feltintensiteten rett under elektroden 39,25 μA·mm2. Man bør imidlertid forstå at den nøyaktige verdien av det elektriske feltet på det registrerte motoneuronstedet er umulig å forhåndsbe bestemme som motoneuron plassering med hensyn til polarisering elektrode varierer, og e-feltet tetthet synker betydelig med økt dybde og redusert elektrodestørrelse 4,24. Videre er orienteringen av motoneuronrommene i forhold til det påførte elektriske feltet viktig for generering av handlingspotensialer22,,25,26, og dette kan ikke forutsies for individuelle celler. I tillegg er det svært viktig å forstå at tsDCS effekter ikke er begrenset til en periode med polarisering, og at vedvarende, langvarige effekter er godt dokumentert22,27. Derfor, etter enda en enkelt, kort polariseringsøkt, vil alle påfølgende opptak i samme preparat bli utført under postpolariseringsforhold, noe som begrenser antall mulige akutte polariseringsopptak til en per dyr.
Ytterligere endringer i den presenterte prosedyren kan gjøres for å svare på spesifikke forskningsspørsmål. Denne protokollen med minimale modifikasjoner kan brukes som standard for flere eksperimentelle design, for eksempel ved testing av ulike varigheter og/eller amplituder av anvendte tsDCS eller når man sammenligner kortsiktige eller langsiktige effekter av tsDCS i ulike bassengmotoneuroner. Bruk av flere genetiske sykdomsmodeller (for eksempel SOD1 G93A rottemodell av amyotrofisk lateral sklerose) eller forskjellige nerver for antidromisk nerveaktivering (peroneal, tibial, saphenous, etc.) er akseptabelt. Men man bør også være klar over prosedyrebegrensninger. For eksempel hemmer bruken av barbiturater for anestesi aktiviteten til vedvarende innover strømmer28, mens systemisk innføring av spesifikke blokkere som vanligvis brukes i in vitro preparater (f.eks. stryknin for å blokkere nikotinreseptorer) kan være dødelig for dyret. Det anbefales for forskere å vurdere disse begrensningene før de velger riktig eksperimentell protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Center grant No. 2017/25/B/NZ7/00373. Forfattere ønsker å gjenkjenne arbeidet til Hanna Drzymała-Celichowska og Włodzimierz Mrówczyński, som begge bidro til datainnsamling og analyse av resultatene som presenteres i denne artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
