Summary
هنا نقدم طريقة آلية لتحديد شبه كمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين في الجرذ substantia nigra pars compacta.
Abstract
تقدير عدد الخلايا العصبية الدوبامين في نيجرا substantia هو وسيلة رئيسية في أبحاث مرض باركنسون قبل السريرية. وفي الوقت الراهن، فإن العد غير المتحيز للخلايا هو المعيار للقياس الكمي لهذه الخلايا، ولكنه لا يزال عملية شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وقد لا تكون مجدية لجميع المشاريع. هنا، نقوم بوصف استخدام منصة تحليل الصور، والتي يمكنها تقدير كمية الخلايا المسماة بدقة في منطقة اهتمام محددة مسبقا. نحن نصف بروتوكول خطوة بخطوة لهذه الطريقة في التحليل في دماغ الفئران ونثبت أنه يمكن تحديد انخفاض كبير في الخلايا العصبية الإيجابية هيدروكسيلوز التيروزين بسبب التعبير عن متحولة α سينوكلين في نيجرا substantia. لقد صدقنا على هذه المنهجية من خلال المقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من خلال التجسم غير المتحيز. معا, هذه الطريقة توفر عملية فعالة من حيث الوقت ودقيقة للكشف عن التغيرات في عدد الخلايا العصبية الدوبامين, وبالتالي مناسبة لتحديد كفاءة تأثير التدخلات على بقاء الخلية.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو اضطراب الحركة العصبية السائدة التي تتميز بوجود مجاميع البروتين التي تحتوي على α-سينوكلين (α-syn) والخسارة التفضيلية للخلايا العصبية الدوبامين في substantia nigra pars compacta (SNpc)1. يعد التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين جزءا حيويا من أبحاث PD لأنه يسمح بتقييم سلامة النظام النيغروستريتال ، وبالتالي ، مما يوفر نقطة نهاية مهمة لتقييم فعالية العلاجات المحتملة لتعديل المرض. حاليا، معيار القياس الكمي لعدد الخلية هو عد غير متحيزة stereological، والذي يستخدم ثنائي الأبعاد (2D) المقاطع العرضية من الأنسجة لتقدير السمات الحجمية في الهياكل ثلاثية الأبعاد (3D)2،3،4. تستخدم الأساليب الحديثة القائمة على التصميم إجراءات أخذ عينات عشوائية شاملة وتطبق بروتوكولات العد (المعروفة باسم المسابير) لتجنب القطع الأثرية المحتملة والأخطاء المنهجية ، مما يسمح بالكشف الموثوق عن الاختلافات أكبر قليلا فقط من الاختلاف بينالحيوانات 5. في حين أن علم الجسم يوفر أداة تحليلية قوية للدراسات النسيجية الحية ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا ، ويفترض إعداد عينات موحدة ، ويتطلب التحقق من الصحة في عدة خطوات ، والتي يمكن أن تؤثر على الكفاءة المطلوبة بشكل متزايد للتحقيق قبل السريرية.
إن التقدم التكنولوجي الحديث في العلوم الرقمية يجعل من الممكن اعتماد تطبيقات جديدة لتقييمات أكثر كفاءة لعلم الأمراض دون منظار مجسم ، مع تلبية الحاجة كبديل للتجسيم غير المتحيز. هذه الأساليب تزيد من السرعة ، والحد من الخطأ البشري ، وتحسين استنساخ التقنيات stereological6،7. هالو هي واحدة من هذه منصة تحليل الصور لتحليل الأنسجة الكمية في علم الأمراض الرقمية. وهو يتألف من مجموعة متنوعة من وحدات مختلفة وتقارير بيانات التعبير المورفولوجية ومتعددة الخلايا على أساس كل خلية على حدة عبر أقسام الأنسجة بأكملها باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط. تقيس وحدة FL النووية النووية الإيجابية المناعية لعلامات الفلورسنت في النواة أو السيتوبلازم. وهذا يسمح للإبلاغ عن عدد الخلايا الموجبة لكل علامة، ودرجة كثافة لكل خلية. يمكن تكييف الوحدة لتوفير أحجام الخلايا الفردية وقياسات الكثافة ، على الرغم من أن هذه الميزة ليست مطلوبة للقياس الكمي للخلايا العصبية الدوبامين.
والهدف من هذه الدراسة هو التحقق من هذه الطريقة مع نموذج الفئران الفيروسية التي تم التحقق من صحتها سابقا على أساس ناقلات α سين من التنكس العصبي nigral8,9,10. في هذا النموذج, الإنسان متحولة A53T α-syn وأعرب في SNpc عن طريق الحقن المجسمة من الفيروس المرتبطة أدينو الهجين النمط المصلي 1/2 (AAV1/2), مما أدى إلى تنكس عصبي كبير على مدى فترة 6 أسابيع. قد تكون SNpc غير المنضروبة ، في بعض الدراسات ، بمثابة مراقبة داخلية للجانب المحقون. أكثر شيوعا، يتم استخدام حقن ناقلات AAV فارغة (AAV-EV) في مجموعة مراقبة من الحيوانات كتحكم سلبي. نقدم دليل خطوة بخطوة لتقدير كثافة الخلايا العصبية الدوبامين المتبقية في SNpc حقن بعد 6 أسابيع باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان التابعة للشبكة الصحية الجامعية على جميع الإجراءات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعها المجلس الكندي لرعاية الحيوان.
1. حقن مجسمة
- زوج منزل الكبار الإناث سبراغ دولي الفئران (250-280 غرام) في أقفاص مع الفراش الخشب والوصول إلى الإعلان ليب الغذاء والماء. الحفاظ على مستعمرة الحيوان في دورة العادية 12 ساعة ضوء / الظلام (أضواء على 06:30) مع درجة حرارة ثابتة والرطوبة.
- تنفيذ حقن مجسمة من جانب واحد من AAV مباشرة إلى SNPC على الجانب الأيمن من الدماغ (الجانب الأيمن أو الأيسر، وفقا لتفضيلات كل مختبر) كما هو موضح سابقا8،10. حقن 2 ميكرولتر من AAV1/2 في titer النهائي من 3.4 × 1012 الجسيمات الجينومية / مل.
2. تقزم الدماغ والكيمياء المناعية (IHC)
- تخدير الفئران مع 5٪ isoflurane عن طريق وضع في غرفة تخدير لمدة 3 دقائق. ويمكن استخدام أساليب أخرى معتمدة لهذه الخطوة بعد الاستعراض المؤسسي المناسب.
- بمجرد وصول الجرذ إلى مستوى جراحي من التخدير العميق ، قم بنقله إلى مخروط الأنف الملصق بقوة على طاولة التشريح. تأمين الجرذ الأمامية الكفوف باستخدام الشريط واستخدام إصبع القدم قرصة استجابة طريقة لتحديد عمق التخدير. يجب أن يكون الحيوان لا يستجيب قبل المتابعة.
- إجراء شق الجانبية تحت القص وقطع من خلال الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي. رفع ومشبك القص مع hemostat ومكان فوق الرأس.
- المشبك القلب باستخدام ملقط وإدراج إبرة فراشة متصلة مضخة التغلغل في النهاية الخلفية للبطين الأيسر. Perfuse الفئران عبر القلب مع 150 مل من المالحة الهيبارين، أو حتى العينين والجلد واضحة. قد يفضل التخثر مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، بدلا من المالحة، لتسهيل التثقيب المناعي مع أجسام مضادة معينة أو تقسيم الدماغ أرق.
- بمجرد اكتمال التشوه ، وقطع الرأس مع المقصلة واستخراج الدماغ إلى مصفوفة الدماغ ، والسطح البطني التي تواجه.
- باستخدام شفرة حلاقة جديدة، وجعل قطع في الطائرة التاجية 2 مم rostral إلى chiasm البصرية. الشريحة شفرة من جانب إلى آخر لتجنب تشويه الدماغ أثناء تشريح.
- تزج الجزء الخلفي من الدماغ في قارورة وصفت مسبقا تحتوي على ما يقرب من 20 مل من 4٪ PFA لمدة 48 ساعة من تثبيت ما بعد في درجة حرارة الغرفة. الجزء الأمامي من الدماغ قد يكون فلاش المجمدة في 2-ميثيلبوتان مبردة إلى -42 درجة مئوية قبل التخزين في -80 درجة مئوية.
- بعد 48 ساعة، نقل العقول الثابتة إلى قارورة المسمى تحتوي على 30٪ السكروز في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى تغرق (48-72 ساعة).
- إعداد microtome عن طريق وضع الجليد الجاف في الحوض الصغير من مرحلة العينة، تليها الإيثانول 100٪. مرة واحدة وقد بردت المرحلة، والضغط على درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مركب على خشبة المسرح حتى يشكل دائرة 2 سم في القطر و 0.5 سم سميكة. بمجرد أن تجمد جزئيا ، قم بخفض الدماغ بعناية على تلة OCT ، مما يضمن بقاء سطح القطع المخطط موازيا للمرحلة.
- إضافة المزيد من الجليد الجاف إلى المرحلة لمساعدة الدماغ على تجميد. بمجرد أن يتحول الدماغ إلى لون كريم ، قم بمسح مرحلة الجليد الجاف.
- كزة حفرة في الجانب الأيمن من الدماغ مع إبرة 25G للتمييز بين نصفي الكرة الأرضية الأيمن والأيسار. الحرص على عدم تمرير الإبرة من خلال الهياكل التشريحية ذات الأهمية.
- قطع تسلسلي 40 مقطع μm في الطائرة التاجية ابتداء من bregma -3.8 وتنتهي في bregma -6.8.
- تخزين ستة سلسلة في أنابيب المسمى مع حل مضاد للتجميد (40٪ برنامج تلفزيوني، 30٪ 2-ethoxyethanol، 30٪ الجلسرين). يجب أن تحتوي كل سلسلة على 12 مقطعا في الدماغ.
- حدد مجموعة واحدة من المقاطع لتلطيخ المناعية الكيميائية، وغسل قبالة المضادة للتجميد الحل مع يغسل 3 × 10 دقيقة في 0.2٪ PBS-T.
- كتلة لمدة 1 ساعة في RT مع الجوز لطيف في حل حجب (10٪ مصل الماعز العادي (NGS)، 2٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في 0.2٪ PBS-T). اتبع هذا مع الحضانة مع أرنب المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز (TH) الأجسام المضادة (1:500) والفأر المضادة α سين الأجسام المضادة (1:500) في 2٪ NGS في 0.2٪ PBS-T بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأجسام المضادة الأولية مع 3 × 5 دقيقة يغسل في 0.2٪ PBS-T، تليها 1 ح الحضانة مع الماعز المضادة للأرانب اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:500) والماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 555 الأجسام المضادة الثانوية في 2٪ NGS في 0.2٪ PBS-T. تأكد من حماية المقاطع من الضوء والجوز بلطف.
- غسل الأجسام المضادة الثانوية مع يغسل 3 × 5 دقائق في 0.2٪ PBS-T وجبل مجموعة كاملة من المقاطع على الشرائح المحمية من الضوء والغبار باستخدام فرشاة الطلاء الضيقة. Coverslip مع مضان تصاعد المتوسطة وختم مع الورنيش الأظافر واضحة.
3. كونفوجكال المجهر والحصول على صورة
- التقاط صور IHC باستخدام البرامج إلى جانب المجهر confocal في التكبير 10x. فتح الثقب إلى 1.5 الاتحاد الافريقي لالتقاط طائرة واسعة يبلغ مجموعها ~ 1.5 ميكرومتر وتعيين التركيز على الجانب حقن من الدماغ.
- في علامة التبويب اكتساب، تحقق من خيار التصوير "مسح الإطارات المتجانبة" ثم قم بتعيين الأبعاد إلى 10 × 4.
- ضمن لوحة وضع الامتلاك، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى 1.1. وهذا يساعد على تجنب أي علامات خياطة واضحة بين صور مسح البلاط.
- تعيين حجم الإطار إلى 1024 × 1024 بكسل ومتوسط إلى 2 لضمان الحصول على صورة عالية الجودة.
- في لوحة القنوات، حدد المسار 1 إلى Alexa488 وتتبع 2 إلى Alexa555.
- تحميل الشريحة على خشبة المسرح واختيار قسم مع تلطيخ TH قوية. انقر على لايف على لوحة الاستحواذ.
- في لوحة القنوات، قم بتعيين قوة الليزر وكسب إلى المستويات التي تزيد من الإشارة والحد من الضوضاء من الخلفية. استخدم مؤشر النطاق لضمان عدم تعريض الإشارات بشكل مفرط (كما هو مبين في تراكب أحمر داكن).
- كرر الخطوة أعلاه مع شرائح متعددة لضمان تلطيخ متناسقة بين الشرائح كما قوة الليزر / كسب لا يمكن تعديلها بين الشرائح.
- في علامة التبويب اكتساب، حدد المربع المواضع.
- عند هذه النقطة، كنت على استعداد لبدء التصوير. باستخدام العدسة، اختر القسم الأول الذي يظهر تلطيخ TH الإيجابي، وحدد التركيز عند نقطة الاهتمام (أي SNpc) ثم قم بنقل المرحلة إلى خط الوسط في القسم. وهذا يحفظ الموضع في محاور x و y و z وسيتم تصوير مسح التجانب التقاط المقطع بأكمله.
- كرر الخطوة المذكورة أعلاه لجميع الأقسام في جميع أنحاء SNpc إعطاء مجموعة كاملة من الصور من SNpc. إذا كان التحليل التفصيلي للجانب غير المصحح مطلوبا، يجب تكرار الخطوات من 3.10 إلى 3.11 عن طريق تعيين التركيز على الجانب غير المصحح.
4. تحليل الصورة والكمية
- ملفات صور منفصلة باستخدام البرامج المناسبة واستيراد ملفات الصور إلى برنامج تحليل الصور الآلي.
- حدد منطقة الاهتمام بتحديد أداة التعليق التوضيحي القلم لرسم تعليق توضيحي حول SNpc.
ملاحظة: في المقاطع التي لديها كمية كبيرة من فقدان الخلايا العصبية الدوبامين, زيادة مؤقتا انبعاث / امتصاص يمكن أن تساعد على تحديد واضح لSNpc (الشكل 2). - الانتقال إلى علامة التبويب تحليل ومن القائمة المنسدلة تحليل، حدد ضبط الوقت الحقيقي. يفتح هذا إطار منفصل على صورة المقطع يسمح بتعديل معلمات التحليل في الوقت الفعلي (الشكل 3).
- ضمن قسم تكبير التحليل، حدد تكبير الصورة المناسب.
- تحت قسم الكشف عن الخلايا، حدد الصبغة النووية كصبغة تستخدم لتلطيخ TH (اليكسا فلور 488).
- ضبط عتبة التباين النووي، الحد الأدنى من الكثافة النووية، العدوانية التقسيم النووي، وإعدادات الحجم النووي أثناء مراقبة بعناية نافذة ضبط الوقت الحقيقي.
ملاحظة: تمثيل دقيقة لكل خلية فردية كخلية واحدة في إطار ضبط الوقت الحقيقي أمر حيوي للدقة. هذه الإعدادات على نطاق تعسفي اعتمادا على البرمجيات المستخدمة، ولكن هناك حاجة إلى تعديل صحيح للسماح للبرنامج للتمييز بدقة بين الخلايا الفردية، وبين الخلايا والخلفية (الشكل 3). - كرر هذه العملية مع ما لا يقل عن 10 عينات منفصلة لضمان اتفاق موحد على ما يشكل خلية عبر أقسام مختلفة.
ملاحظة: يمكن تحديد علامات خلايا إضافية (مثل α-syn أو NeuN) داخل نفس منصة التحليل باستخدام مقاطع علامة 1 أو علامة 2 في علامة التبويب التحليل. - بمجرد أخذ عينات من عدد مناسب من الصور وتعديل الضبط في الوقت الفعلي وفقا لذلك، احفظ إعدادات التحليل في القائمة المنسدلة إجراءات الإعدادات.
- حدد جميع الصور التي سيتم تحليلها وانقر على تحليل.
- اختر إعداد التحليل الذي قمت بحفظه للتو، وفي إطار منطقة التحليل، حدد المربع طبقة(طبقات) التعليق التوضيحي. ثم، تحقق من الطبقة 1 وانقر على تحليل.
ملاحظة: بالنسبة لدماغ واحد، يستغرق التحليل عادة حوالي 5 دقائق. ستظهر النتيجة المكتملة بوضوح كل عنصر تم احتسابه كخلية(الشكل 4). - وبمجرد الانتهاء، قم بتصدير بيانات التحليل الموجز لجميع الأقسام. هناك خيار لتصدير بيانات تحليل الكائن، والتي ستعطي بيانات مفصلة ، بما في ذلك حجم الخلية لكل خلية على حدة تم اكتشافها. يمكن استخدام مجموعة البيانات هذه لفحص التغيرات في حجم الخلية استجابة للسموم / العلاجية.
- إضافة إجمالي الخلايا من كل قسم تحليل لكل والمنطقة تحليلها الكلي (مم2). تقسيم العدد الإجمالي للخلايا حسب المساحة الإجمالية التي تم تحليلها لحساب عدد الخلايا/مم2 في SNpc لكل فأر
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من خلال تطبيق الأساليب المذكورة أعلاه على أنسجة الدماغ التي تم جمعها بعد 6 أسابيع من حقن AAV ، أظهرنا أن الحقن المجسم ل AAV الذي يعبر عن متحولة A53T α-syn (AAV-A53T) في SNpc من دماغ الفئران يؤدي إلى انخفاض كبير في كثافة الخلايا العصبية الدوبامين مقارنة بحقن ناقلات فارغة AAV (AAV-EV) كعنصر تحكم(الشكل 5A، B). وكان متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH / مم2 في SNpc من الفئران حقنها مع AAV-EV 276.2 ± 34.7، وفي SNpc من الفئران حقنها مع AAV-A53T كان 41.2 ± 17 (P = 0.0003). القياس الكمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين / مم2 في SNPC يشبه التقارير المنشورة سابقا10،11. بالنسبة للطرق الموضحة هنا ، تم تحليل 4 أقسام متسلسلة لكل. وقد أظهرت الدراسات السابقة اختلافات كبيرة مع أقل من 3 أقسام، ولكن يمكن زيادة التحليل حتى 12 قسما لتشمل SNpc كله اعتمادا على النموذج والتدخل الذي يدرسه المحقق.
كما تم إجراء مجسمة غير متحيزة كما وصف سابقا12 على مجموعة أخرى من أقسام الدماغ من نفس الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة، أظهرنا أيضا أن الحقن المجسمة من متحولة A53T α-syn في SNpc من نتائج الدماغ الفئران في انخفاض كبير في العدد الإجمالي المقدر للخلايا العصبية الإيجابية TH في SNPC، بالمقارنة مع حقن EV-AAV (الشكل 5C). الأهم من ذلك، كان هناك ارتباط قوي بين كثافة الخلايا العصبية الدوبامين المقدرة باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي وعدد الخلايا العصبية الدوبامين المقدر باستخدام ستيريوولوجيا غير متحيزة (ص = 0.8819، P = 0.0007) (الشكل 5D).
كما قمنا بتطبيق أساليبنا باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي لتحديد عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH / مم2 على الجانب غير المحتقن من الفئران التي تم حقنها ب AAV-A53T أو AAV-EV. وكان متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH / مم2 في SNpc غير المحتقن من الفئران حقنها مع AAV-A53T 123.2 ± 26.4، والتي كانت أكبر بكثير مما كانت عليه في SNPC حقن، الذي كان 44.0 ± 15.8 (P = 0.0331) (الشكل التكميلي 1A). لم يكن متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH / mm2 في SNpc غير المحتقنة من الفئران التي تم حقنها ب AAV-EV (215.6 ± 35.5) مختلفا بشكل كبير عن SNpc المحقون (276.2 ± 34.7) ، مما يؤكد عدم وجود انحطاط بسبب الحقن مع AAV-EV (الشكل التكميلي 1B). قمنا بحساب هذه النتائج كنسبة مئوية من حقن / غير مشقوق ووجدنا أن الحيوانات التي حقنت مع AAV-A53T كان انخفاض 69٪ مقارنة مع الحيوانات AAV-EV(الشكل التكميلي 1C).
الشكل 1: سير العمل للطريقة. سير العمل الذي يوضح الخطوات المطلوبة لحقن AAVs والقسم والأنسجة البقعية ، وتحديد منطقة الاهتمام وتحسين البرنامج لعد الخلايا. صور تمثيلية لمسح البلاط confocal، تعريف العائد على الاستثمار، وكمية الخلايا. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد المنطقة ذات الاهتمام. (أ) قسم الدماغ التاجي، بما في ذلك SNpc المناعي الملون لTH (الأخضر) من الفئران حقنها مع AAV-A53T α سين. في الفئران مع تنكس عصبي شديد (كما هو موضح هنا)، يمكن أن يكون من الصعب تحديد SNpc. (ب) زيادة امتصاص الصورة مؤقتا يمكن تحديد الهيكل والسماح بتحديد دقيق للمنطقة ذات الاهتمام. مقياس الشريط = 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تحسين الكشف عن الخلايا باستخدام طريقة Cytonuclear في HALO. في الوقت الحقيقي ضبط وحدة نووية للخلايا يسمح للمستخدم أن يرى تغييرات في الكشف عن الخلايا في الوقت الحقيقي عن طريق تغيير عتبة التباين النووي، الحد الأدنى من الكثافة النووية، العدوانية التقسيم النووي، والحجم النووي. (أ) صورة تمثيلية مع عرض منطقة الاهتمام. (ب) ضبط الوقت الحقيقي تظهر تحت أخذ العينات التي البرنامج لا الكشف عن جميع الخلايا في إطار ضبط. (ج) الإفراط في أخذ العينات التي يكشف البرنامج خلايا أكثر مما هي واضحة في إطار ضبط. (D) ضبط الأمثل الذي يتم حساب العدد الصحيح من الخلايا. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إعدادات HALO المحسنة داخل منطقة محددة من الاهتمام. صور تمثيلية للتحليل المكتمل باستخدام إعدادات محسنة للكشف النووي الخلوي في HALO. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التعبير عن الإنسان متحولة A53T α سين في نتائج SNPC في تنكس عصبي شديد في 6 أسابيع كما تم قياسها كميا من قبل HALO و المجسمة غير متحيزة. (أ) صور تمثيلية تظهر انحطاط الخلايا العصبية الإيجابية TH في SNpc 6 أسابيع بعد الحقن المجسمة من AAV-A53T α-syn في تيتر من 3.4 × 1012 الجسيمات الفيروسية / مل. تلطيخ immunofluorescent مع المضادة للTH (الأخضر) ومكافحة α سين (الأحمر) الأجسام المضادة. مقياس شريط = 200 ميكرومتر. (ب) تحديد كمي لعدد الخلايا العصبية الإيجابية TH في SNpc من الفئران حقنها مع AAV-A53T α-syn أو AAV-EV يدل على أن التعبير عن متحولة α سين يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية الدوبامين كبيرة. غير مدفوع t-اختبار; ن = 5 فئران / مجموعة. الرسم البياني يظهر يعني ± SEM، ***P < 0.001. (ج) صور تمثيلية من تلطيخ colorimetric من الخلايا العصبية الدوبامين في SNpc من AAV-A53T (يسار) أو AAV-EV (يمين) حقن الفئران المستخدمة لأداء مجسمة غير متحيزة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (D) ارتباط كبير بين حساب HALO للخلايا العصبية الإيجابية TH / مم2 (محور ص) وأرقام الخلايا المجسمة غير المتحيزة (المحور س). بيرسون الارتباط (ص = 0.8819 ، ف = 0.0007). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: لوحظ تنكس عصبي أحادي الجانب كبير في SNpc من الفئران التي تلقت حقن AAV-A53T. (أ)تحديد كمي لعدد الخلايا العصبية الإيجابية TH في حقن أو غير مقننة SNPC من الفئران التي تلقت حقنة مجسمة AAV-A53T من جانب واحد يظهر انخفاضا كبيرا على الجانب المحقون. (ب)تحديد كمي لعدد الخلايا العصبية الإيجابية TH في حقن أو غير مقننة SNpc من الفئران التي تلقت حقن AAV-EV مجسمة من جانب واحد يظهر أي تغييرات كبيرة. (ج) التطبيع إلى الجانب غير المشقوق contralateral تثبت انخفاض بنسبة >50٪ عند الحقن مع AAV-A53T α-syn مقارنة مع AAV-EV. غير مدفوع t-اختبار; ن = 5 فئران / مجموعة. الرسوم البيانية تظهر يعني ± SEM ، *ف < 0.05 ، ***ف < 0.001. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم التكميلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التقييم الموثوق لسلامة النظام الدوبامين في نماذج ما قبل السريرية من PD أمر بالغ الأهمية لتحديد فعالية العلاجات المحتملة تعديل المرض. لذلك، من المهم السيطرة على الإرباكات المحتملة التي قد تقلل من موثوقية البيانات الهستوبولوجية وإعادة إنتاجها وتقليلها. ويمكن أن توفر النتائج الكمية الدقيقة معلومات أكثر من الأوصاف النوعية أو شبه الكمية وحدها. وفي الوقت نفسه، يجب أن ندرك أن القيود في الوقت والموارد يمكن أن تجعل من الصعب إجراء عد غير متحيز للأمراض لكمية التغيرات المرضية أو فقدان الخلايا. ومع ذلك ، مع التقدم الأخير ، يمكن استيفاء العديد من هذه المعايير باستخدام منصات التصوير المحوسبة والآلية6.
يصف هذا البروتوكول عددا من الخطوات الهامة في تحديد التقدير ال stereological من الخلايا العصبية الدوبامين / مم2 في الدماغ القوارض. وتجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا الحقن المجسم لتسليم AAVs إلى SNpc ، مما يضع أهمية على التسليم الدقيق لهذه الفيروسات من أجل تحديد تأثير أي علاج. الإحداثيات المستخدمة في دراستنا هي bregma -5.2 مم (الأمامي الخلفي) ، -2 مم (الوسيط الجانبي إلى اليمين) و -7.5 مم (البطن الظهري من الجمجمة) على الفئران الإناث البالغات التي تزن ~ 275 غرام. التسليم الصحيح للفيروس باستخدام هذه الإحداثيات سيضمن تسليم AAVs إلى SNpc.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر عند إعداد الأنسجة للتلطيخ. قبل كل شيء، ينبغي توخي الحذر لتحديد الجانب الذي هو اليمين / اليسار. في أيدينا، أسهل وأكثر
كانت الطريقة القابلة للاستنساخ للقيام بذلك هي استخدام إبرة 25G لكزة ثقب بشكل دوري في الدماغ الأوسط الظهري الأيسر مع تحديد الجانب غير المحتق. معرفة متعمقة للمناطق التشريحية العصبية من الدماغ القوارض من المهم التفريق بين متى تبدأ القطع، وبعد ذلك لتحديد SNPC عند رسم منطقة الاهتمام. من المهم أن نلاحظ أن TH تلطيخ لا وصمة عار حصرا الخلايا العصبية من SNPC، وينبغي للمرء أن يكون قادرا على التفريق بين الخلايا العصبية الإيجابية TH في منطقة tegmental البطني وحقل ريتروبال. أطلس دماغ الفئران هو دليل مفيد لأولئك الذين يفتقرون إلى الخبرة في استئصال الأعصاب القوارض. أوقات حضانة الأجسام المضادة موحدة في جميع أنحاء البروتوكول ويتم تعيين التركيز في الحد الأدنى من الوقت الممكن لتجنب photobleaching.
هناك تباين منخفض بين العينات بمجرد استخدام ميزات التشريح العصبي المتسقة للتمييز بين المقاطع. وجود مراقب من ذوي الخبرة والعمى رسم المنطقة ذات الاهتمام من المهم للحفاظ على الاتساق عبر الأقسام التي سيتم تحليلها. تحليل الجانب غير المنصف كما هو موضح في الشكل التكميلي 1 يوضح وجود اتساق في الأسلوب. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند تفسير البيانات بهذه الطريقة. تشريح العقول يعتمد باستمرار على مقارنة وجود ميزات التشريح العصبي المعروفة على كل جانب من الدماغ. قد تعني الاختلافات الدقيقة أن الجانب غير المحتق في مقطع معين قد يكون أكثر الخلفية / الأمامية من الجانب المحقون ، وبالتالي ليس مقارنة مباشرة دقيقة. ويبرز المزيد من التحليل للبيانات المقدمة وجود قيود على هذه الطريقة. هناك درجة كبيرة من التباين في عدد الخلايا العصبية الدوبامين في الجانب غير المشقوق (123.2 في مجموعة AAV-A53T مقابل 215.6 في AAV-EV) ، والتي لا يتوقعها المرء بين الحيوانات ذات العمر المماثل. هناك عدد من الأسباب المحتملة لهذا التباين، بما في ذلك حجم العينة الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة والاختلافات التشريحية المذكورة أعلاه من جانب إلى آخر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تعيين التركيز على إشارة الفلورسنت على الجانب المحقون ، مما يعني أن التحول الطفيف في الطائرة z يمكن أن يترك الجانب غير المحتقن بعيدا عن التركيز ، وبالتالي لن يتم اكتشاف بعض الخلايا من خلال برنامج عد الخلايا. لهذا السبب، فمن المستحسن لمقارنة عدد من الخلايا العصبية الدوبامين / مم2 على جانب واحد باستخدام ميزات التشريح العصبي المعروفة، وحيث تم تعيين التركيز على المجهر خصيصا لهذه المنطقة. إذا كانت هناك حاجة إلى مقارنة مع الجانب غير المصاغ، يجب تكرار التصوير مع التركيز على هذا الجانب.
نقدم البيانات التي تم الحصول عليها وتحليلها مع واحدة من عدة حزم البرامج التي توفر تحليل الصورة الكمية مع الحد الأدنى من تدريب المستخدم13. برامج أخرى متاحة ويجري اعتمادها على نحو متزايد لدراسة علم الأمراض العصبية, بما في ذلك تحديد كمي لفقدان الخلايا العصبية الدوبامين في نماذج تجريبية من PD6. في حين أن بعض الخوارزميات المدمج في تقديم لأداء وظائف محددة (على سبيل المثال، عد البلاك اميلويد)، العديد من حزم البرامج تشترك في العديد من الميزات المشتركة التي تجعلها مفيدة بشكل خاص للمختبرات التي تؤدي التحليل المتكرر. بالإضافة إلى تحديد المنطقة ذات الاهتمام، يمكن إزالة خطوات المعالجة المسبقة التي تتداخل مع الإشارة (طيات الأنسجة، القطع الأثرية الحافة، علامات الحبر، البقع، وما إلى ذلك) من المنطقة ذات الاهتمام بواسطة أدوات التعرف اليدوي والنمطي. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام القراءات المقدمة بالاقتران مع القيم الكمية التي تم الحصول عليها من البروتين، والدراسات الخلوية، أو السلوكية لاستكشاف العلاقات والارتباطات المحتملة بين المتغيرات.
توفر الطريقة المذكورة أعلاه إجراء دقيقا وشبه كمي وغير مكلف نسبيا لتقدير أعداد الخلايا العصبية في أقسام الدماغ الملطخة بالمناعة. تتيح ميزة الضبط في الوقت الفعلي إمكانية تكييف الأسلوب لجميع الأقسام وتضمن الاتساق حتى مع وجود تباينات طفيفة في طرق التقطيع. وجود مراقب أعمى تحديد المناطق ذات الاهتمام في SNPC يخفف من التحيزات تأكيد أو اختيار ويوفر البرنامج قراءات بسيطة تسمح حساب الخلايا العصبية / ملم2. ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لتوفير عدد دقيق من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة مع الحفاظ على الكفاءة ومزايا التكلفة على بروتوكولات أكثر رسوخا stereological. كما أن تقدم تكنولوجيا المسح الضوئي للشرائح للأقسام الأكثر سمكا من شأنه أن يتيح وقتا أكثر كفاءة للمعالجة للطريقة المذكورة أعلاه.
القيود
الطريقة الموصوفة لديها عدد من المزايا المتميزة في سرعتها وقدرتها على الكشف عن تغييرات كبيرة في كثافة الخلايا العصبية، ولكن أيضا يطرح تحدياته الخاصة. على عكس الستيريوولوجيا ، لا يمكن للطريقة توفير تقدير لأرقام الخلايا المطلقة ولكن بدلا من ذلك تحسب كثافة الخلية داخل SNpc. وترتبط تقديرات كثافة الخلايا ارتباطا وثيقا، ولكن ليس تماما، بأرقام الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام مجسمة غير متحيزة. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد الطريقة على ضبط حجم الخلية وشكلها بواسطة المستخدم قبل بدء التحليل. وهذا لا يمكن أن يضمن أن الخلايا لن تفوت بسبب كونها جزئيا في المستوى البؤري، أو أن الخلايا من حجم غير عادي و / أو شكل سوف تفوت من قبل البرنامج. في تجربة المؤلفين ، فإن الطريقة مفيدة بشكل خاص لفحص فعالية العلاجات المحتملة لتعديل الأمراض في نماذج القوارض قبل السريرية. في الختام، في حين أن الطرق التريولوجية لتحديد أعداد الخلايا لا تزال تستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب، فإن التسارع السريع للرقمنة يشير إلى أنه سيتم اعتماد منصات تحليل الصور الآلية بشكل متزايد لدراسة علم الأمراض العصبية، خاصة مع استمرار تحسنها. ومن المهم أن يفهم المحقق القيود التقنية لهذا النهج وأن يطبق هذه المنهجية بعد دراسة متأنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يبلغ المؤلفان عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع العاملين في مرفق الفحص المجهري البصري المتقدم في الشبكة الصحية الجامعية على وقتهم ومساعدتهم في وضع هذا البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
