Summary
Här presenterar vi en automatiserad metod för semikvantitativ bestämning av dopaminerga neuronnummer i råtta substantia nigra pars compacta.
Abstract
Uppskattning av antalet dopaminerga nervceller i substantia nigra är en nyckelmetod i preklinisk Parkinsons sjukdom forskning. För närvarande är opartisk stereologisk räkning standarden för kvantifiering av dessa celler, men det är fortfarande en mödosam och tidskrävande process, vilket kanske inte är genomförbart för alla projekt. Här beskriver vi användningen av en bild analys plattform, som exakt kan uppskatta mängden märkta celler i en fördefinierad region av intresse. Vi beskriver en steg-för-steg protokoll för denna analysmetod i råtta hjärnan och visa det kan identifiera en betydande minskning av tyrosin hydroxylase positiva nervceller på grund av att uttryck för mutant α-synuklein i substantia nigra. Vi validerade denna metod genom att jämföra med resultat som erhållits av opartisk stereologi. Sammantaget ger denna metod en tidseffektiv och exakt process för att upptäcka förändringar i dopaminerga neuronnummer, och är därför lämplig för effektiv bestämning av effekten av interventioner på cellens överlevnad.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en utbredd neurodegenerativ rörelsestörning som kännetecknas av närvaron av proteinaggregat som innehåller α-synuklein (α-syn) och den förmånliga förlusten av dopaminerga nervceller i substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kvantifiering av dopaminerga neuronnummer är en viktig del av PD-forskning eftersom det tillåter utvärdering av integriteten hos nigrostriatalsystemet, vilket ger en viktig slutpunkt för att bedöma effektiviteten hos potentiella sjukdomsmodifierande terapier. För närvarande är standarden för kvantifiering av cellnummer opartisk stereologisk räkning, som använder tvådimensionella (2D) tvärsnitt av vävnad för att uppskatta volymetriska egenskaper i tredimensionella (3D)strukturer 2,3,4. Moderna designbaserade stereologiska metoder använder omfattande slumpmässiga provtagningsförfaranden och tillämpar räkneprotokoll (så kallade sonder) för att undvika potentiella artefakter och systematiska fel, vilket möjliggör tillförlitlig upptäckt av skillnader som endast är något större än variation mellan djur5. Medan stereologi ger ett kraftfullt analysverktyg för histologiska studier in vivo, är det tidsintensivt, antar enhetlig provberedning och kräver validering i flera steg, vilket kan påverka effektiviteten som alltmer krävs för preklinisk translationell undersökning.
Den senaste tidens tekniska framsteg inom digital vetenskap gör det möjligt att anta nya tillämpningar för effektivare bedömningar av patologi utan stereomikroskop, samtidigt som det fyller ett behov som surrogat av opartisk stereologi. Dessa metoder ökar hastigheten, minskar mänskliga fel och förbättrar reproducerbarheten av stereologiska tekniker6,7. HALO är en sådan bildanalysplattform för kvantitativ vävnadsanalys i digital patologi. Den består av en mängd olika moduler och rapporterar morfologiska och multiplexerade uttrycksdata cell för cell över hela vävnadsavsnitt med hjälp av mönsterigenkänningsalgoritmer. Den cytonukleära FL-modulen mäter den immunofluorescerande positiviteten hos fluorescerande markörer i kärnan eller cytoplasman. Detta gör det möjligt att rapportera antalet celler som är positiva för varje markör och intensitetspoängen för varje cell. Modulen kan anpassas för att ge individuella cellstorlekar och intensitetsmätningar, även om denna funktion inte krävs för kvantifiering av dopaminerga nervceller.
Syftet med denna studie är att verifiera denna metod med en tidigare validerad viral vektorbaserad α-syn råtta modell av nigral neurodegeneration8,9,10. I denna modell uttrycks human mutant A53T α-syn i SNpc genom stereotaktisk injektion av adeno-associerade virus hybrid serotyp 1/2 (AAV1/2), vilket resulterar i betydande neurodegeneration under en period av 6 veckor. Den kontralaterala oinjected SNpc kan i vissa studier fungera som en intern kontroll för den injicerade sidan. Vanligare är att injektion av AAV-Tom Vektor (AAV-EV) i en kontrollkohort av djur används som en negativ kontroll. Vi presenterar en steg-för-steg guide för att uppskatta densiteten av dopaminerga nervceller kvar i den injicerade SNpc efter 6 veckor med hjälp av en automatiserad bildanalys programvara (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes av University Health Network Animal Care Committee och utfördes i enlighet med riktlinjer och förordningar som fastställts av Canadian Council on Animal Care.
1. Stereotaktisk injektion
- Parhus vuxna kvinnliga Sprague-Dawley råttor (250-280 g) i burar med trä sängkläder och ad lib tillgång till mat och vatten. Håll djurkolonin i en vanlig 12 h ljus / mörk cykel (lampor på 06:30) med konstant temperatur och fuktighet.
- Utför ensidig stereotaktisk injektion av AAV direkt till SNpc på höger sida av hjärnan (höger eller vänster sida, enligt preferenserna för varje labb) som tidigarebeskrivits 8,10. Injicera 2 μL AAV1/2 vid en slutlig titer på 3,4 x 1012 genomiska partiklar/ml.
2. Hjärnsektionering och immunohistokemi (IHC)
- Söv råttan med 5% isofluran genom att placera i en bedövande kammare i 3 min. Andra godkända metoder får användas för detta steg efter lämplig institutionell översyn.
- När råttan har nått ett kirurgiskt plan med djupbedövning, överför den till en näskon fast fastsatt på ett obduktionsbord. Säkra råttans förpottar med tejp och använd tånypresponsmetoden för att bestämma anestesins djup. Djuret måste inte svara innan det fortsätter.
- Gör ett sidosnitt under bröstbenet och skär genom membranet längs hela revbensburens längd för att exponera pleurahålan. Lyft och kläm fast bröstbenet med en hemostat och placera ovanför huvudet.
- Kläm fast hjärtat med tång och sätt in en fjärilsnål ansluten till en perfusionspump i den bakre änden av vänster ventrikel. Granska råtta transcardially med 150 ml hepariniserad saltlösning, eller tills ögonen och huden är klara. Perfusion med 4% paraformaldehyd (PFA), istället för saltlösning, kan föredras för att underlätta immunstaining med vissa antikroppar eller tunnare hjärnsektionering.
- När perfusionen är klar, halshugg med en giljotin och extrahera hjärnan till en hjärnmatris, ventral yta vänd uppåt.
- Använd ett nytt rakblad, gör ett snitt i koronalplanet 2 mm rostral till den optiska chiasmen. Skjut bladet från sida till sida för att undvika att försåga hjärnan medan du skär.
- Fördjupa den bakre delen av hjärnan i en förmärkt injektionsflaska som innehåller cirka 20 ml 4% PFA för 48 h efter fixering vid rumstemperatur. Den främre delen av hjärnan kan blixtfrysas i 2-metylbutan kyld till -42 °C före förvaring vid -80 °C.
- Efter 48 timmar överför du de fasta hjärnorna till en märkt injektionsflaska som innehåller 30% sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvaras vid 4 °C tills de sjunker (48-72 h).
- Förbered en mikrotom genom att placera torr is i provsteget, följt av 100% etanol. När scenen har svalnat, pressa optimal skärtemperatur (OCT) förening på scenen tills den bildar en cirkel 2 cm i diameter och 0,5 cm tjock. När den delvis har frusit, sänk försiktigt hjärnan på högen av OCT, se till att den striatala skärytan förblir parallell med scenen.
- Tillsätt mer torr is på scenen för att hjälpa hjärnan att frysa. När hjärnan har vänt en gräddfärg, rensa scenen av torr is.
- Peta ett hål i höger sida av hjärnan med en 25G-nål för att skilja höger och vänster halvklot. Var försiktig så att du inte passerar nålen genom anatomiska strukturer av intresse.
- Serieskurna 40 μm sektioner i koronarplanet med början på bregma -3,8 och slutar på bregma -6,8.
- Förvara sex serier i märkta rör med frostskyddslösning (40% PBS, 30% 2-etoxietanol, 30% glycerol). Varje serie bör innehålla 12 hjärnsektioner.
- Välj en uppsättning sektioner för immunohistokemisk färgning och tvätta av frostskyddslösning med 3 x 10 min tvättar i 0,2% PBS-T.
- Blockera i 1 h vid RT med mild nötning i blockeringslösning (10% normalt getserum (NGS), 2% bovint serumalbumin (BSA) i 0,2% PBS-T). Följ detta med inkubation med kanin anti-tyrosinhydroxilas (TH) antikroppar (1:500) och mus anti-α-syn antikroppar (1:500) i 2% NGS i 0,2% PBS-T över natten vid rumstemperatur.
- Tvätta av primär antikropp med 3 x 5 min tvättar i 0,2% PBS-T, följt av 1 h inkubation med get antikanin Alexa Fluor 488 sekundär antikropp (1:500) och get antimus Alexa Fluor 555 sekundär antikropp i 2% NGS i 0,2% PB-T. Se till att sektionerna är skyddade mot ljus och nötning försiktigt.
- Tvätta av sekundär antikropp med 3 x 5 min tvättar i 0,2% PBS-T och montera hela uppsättningen sektioner på diabilder skyddade mot ljus och damm med en smal pensel. Täcklip med fluorescensmonteringsmedium och tätning med klar nagellack.
3. Konfokal mikroskopi och bildförvärv
- Fånga IHC-bilder med hjälp av programvara i kombination med ett konfokalt mikroskop vid 10x förstoring. Öppna pinhole till 1,5 AU för att fånga ett brett plan på totalt ~ 1,5 μm och ställ in fokus på den injicerade sidan av hjärnan.
- Kontrollera alternativet Tile Scan imaging på fliken Anskaffning och ställ in dimensionerna på 10 x 4.
- Ställ in zoomen på 1,1 under panelen Förvärvsläge. Detta hjälper till att undvika uppenbara sömmärken mellan kakelskanningsbilder.
- Ställ in bildstorleken på 1 024 x 1 024 pixlar och medelvärdet till 2 för att säkerställa högkvalitativ bildförvärv.
- På panelen Kanaler ställer du in spår 1 på Alexa488 och spår 2 till Alexa555.
- Ladda bilden på scenen och välj en sektion med stark TH-färgning. Klicka på Live på förvärvspanelen.
- På panelen Kanaler ställer du in laserstyrkan och förstärkningen på nivåer som maximerar signalen och begränsar bruset från bakgrunden. Använd intervallindikatorn för att säkerställa att signalerna inte är överexponerade (vilket indikeras av ett mörkrött överlägg).
- Upprepa ovanstående steg med flera bilder för att säkerställa att färgningen är konsekvent mellan bilderna eftersom laserstyrkan/förstärkningen inte kan justeras mellan bilderna.
- Markera kryssrutan Positioner på fliken Anskaffning.
- Just nu är du redo att börja avbildning. Använd okularet, välj det första avsnittet som visar positiv TH-färgning, ställ in fokus vid intressepunkten (dvs. SNpc) och flytta sedan scenen till mitten av avsnittet. Detta sparar positionen i x-, y- och z-axlarna och kommer att avbilda en panelskanning som fångar hela avsnittet.
- Upprepa ovanstående steg för alla avsnitt i hela SNpc som ger en komplett uppsättning bilder av SNpc. Om detaljerad analys av den oin injicerade sidan krävs, bör steg 3.10 till 3.11 upprepas genom att fokusera på den oin injicerade sidan.
4. Bildanalys och kvantifiering
- Separera bildfiler med lämplig programvara och importera bildfiler till automatiserad bildanalysprogramvara.
- Definiera en intresseregion genom att välja pennanteckningsverktyget för att rita en anteckning runt SNpc.
OBS: I avsnitt som har en stor mängd dopaminerg neuronförlust, tillfälligt öka avgivandet / absorptionen kan bidra till att tydligt definiera SNpc (Figur 2). - Gå till fliken Analys och välj Justering i realtid på den nedrullningsbara analysmenyn. Detta öppnar ett separat fönster på avsnittsbilden som möjliggör realtidsändring av analysparametrar (figur 3).
- Välj lämplig bildzoom under avsnittet Analysförstoring.
- Under avsnittet Celldetektering väljer du kärnfärg som färgämne som används för TH-färgning (Alexa Fluor 488).
- Justera inställningarna för kärnkontrasttröskel,minsta kärnintensitet, kärnsegmenteringsaggressivitet och kärnstorlek samtidigt som du noggrant tittar på fönstret För justering i realtid.
OBS: Korrekt representation av varje enskild cell som en enda cell i fönstret Justering i realtid är avgörande för noggrannheten. Dessa inställningar är på en godtycklig skala beroende på vilken programvara som används, men korrekt justering behövs för att programvaran korrekt ska kunna skilja mellan enskilda celler och mellan celler och bakgrunden (figur 3). - Upprepa denna process med minst 10 separata prover för att säkerställa en enhetlig överenskommelse om vad som utgör en cell över olika sektioner.
OBS: Ytterligare cellmarkörer (t.ex. α-syn eller NeuN) kan identifieras inom samma analysplattform med hjälp av avsnitten Marker 1 eller Marker 2 på analysfliken. - När ett lämpligt antal bilder har samplats och realtidsjusteringen har justerats i enlighet därmed sparar du analysinställningarna i listrutan Inställningsåtgärder.
- Välj alla bilder som ska analyseras och klicka på Analysera.
- Välj den analysinställning som du just har sparat och markera rutan Anteckningslager i fönstret Analysregion. Kontrollera sedan lager 1 och klicka på Analysera.
Obs: För en enda hjärna tar analysen vanligtvis cirka 5 minuter. Det slutförda resultatet visar tydligt varje objekt som har räknats som en cell (figur 4). - När du är klar exporterar du sammanfattningsanalysdata för alla avsnitt. Det finns ett alternativ för att exportera objektanalysdata, som ger detaljerade data, inklusive cellstorlek för varje enskild cell som identifieras. Denna datauppsättning kan användas för att undersöka förändringar i cellstorlek som svar på ett toxin/terapeutiskt.
- Lägg till de totala cellerna från varje avsnitt som analyseras per djur och det totala analyserade området (mm2). Dividera det totala antalet celler med den totala analyserade areaen för att beräkna antalet celler/mm2 i SNpc för varje råtta
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att tillämpa ovanstående metoder på hjärnvävnad som samlats in 6 veckor efter AAV injektioner, visade vi att stereotaktisk injektion av AAV uttrycker mutant A53T α-syn (AAV-A53T) i SNpc av råtta hjärnan resulterar i en betydande minskning av densiteten av dopaminerga nervceller jämfört med injektion av tom vektor AAV (AAV-EV) som en kontroll (Figur 5A,B). Det genomsnittliga antalet TH-positiva nervceller/mm2 i SNpc av råttor injiceras med AAV-EV var 276,2 ± 34,7, och i SNpc av råttor injiceras med AAV-A53T var 41,2 ± 17 (P = 0,0003). Kvantifiering av antalet dopaminerga nervceller/mm2 i SNpc liknar tidigare publicerade rapporter10,11. För de metoder som beskrivs här analyserades 4 sekventiella avsnitt per djur. Tidigare studier har visat signifikanta skillnader med så lite som 3 avsnitt, men analysen kan ökas ytterligare upp till 12 avsnitt för att omfatta hela SNpc beroende på vilken modell och intervention som studeras av prövaren.
Opartisk stereologi utfördes också som tidigarebeskrivits 12 på en annan uppsättning hjärnsektioner från samma djur. Med denna metod visade vi också att stereotaktisk injektion av mutant A53T α-syn i SNpc av råtta hjärnan resulterar i en betydande minskning av det uppskattade totala antalet TH-positiva nervceller i SNpc, jämfört med injektion av EV-AAV (Figur 5C). Viktigt, det fanns en stark korrelation mellan dopaminerg neuron densitet uppskattas med hjälp av automatiserad bild analys programvara och dopaminerg neuron nummer uppskattas med hjälp av opartisk stereologi (r = 0,8819, P=0,0007) (Figur 5D).
Vi tillämpade också våra metoder med hjälp av automatiserad bildanalys programvara för att bestämma antalet TH-positiva nervceller/mm2 på den oinjected sidan av råttor injiceras med AAV-A53T eller AAV-EV. Det genomsnittliga antalet TH-positiva nervceller/mm2 i den oinjected SNpc av råttor injiceras med AAV-A53T var 123,2 ± 26,4, vilket var betydligt större än i den injicerade SNpc, som var 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331) (Kompletterande figur 1A). Det genomsnittliga antalet TH-positiva nervceller/mm2 i den oinjicerade SNpc av råttor injicerade med AAV-EV (215,6 ± 35,5) var inte signifikant annorlunda än den injicerade SNpc (276,2 ± 34,7), vilket bekräftar att det inte fanns någon degeneration på grund av injektion med AAV-EV (Kompletterande figur 1B). Vi beräknade dessa resultat som en procentandel injicerade/oin injicerade och fann att djur som injicerats med AAV-A53T hade en minskning på 69% jämfört med AAV-EV djur (Kompletterande figur 1C).
Bild 1: Metodens arbetsflöde. Arbetsflöde som visar de steg som krävs för att injicera AAV, avsnitt och fläckvävnad, definiera en region av intresse och optimera programvaran för räkning av celler. Representativa bilder av konfokal kakel skanning, ROI definition och kvantifiering av celler. Skalstång = 100 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Definiera den region av intresse. (A) Coronal hjärnsektion, inklusive SNpc immunostained för TH (grön) från en råtta injiceras med AAV-A53T α-syn. Hos råttor med svår neurodegeneration (som visas här) kan det vara svårt att identifiera SNpc. (B) Tillfälligt öka absorptionen av bilden kan identifiera strukturen och möjliggöra en korrekt identifiering av intresseområdet. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3:Optimera celldetektering med cytonukleärmetoden i HALO. Realtidsjustering av cytonukleärmodulen gör det möjligt för användaren att se förändringar i celldetektering i realtid genom att ändra kärnkontrasttröskel, minsta kärnintensitet, kärnsegmenterings aggressivitet och nukleär storlek. (A) Representativ bild med intresseregion visad. B)Justering i realtid som visar underprovtagning där programvaran inte detekterar alla celler i inställningsfönstret. C)Överprovtagning där programvaran detekterar fler celler än vad som framgår av inställningsfönstret. (D) Optimerad justering där rätt antal celler räknas. Skalstång = 500 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:HALO-optimerade inställningar inom ett definierat intresseområde. Representativa bilder av slutförd analys med optimerade inställningar för cytonukleär detektion i HALO. Skalstång = 500 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Uttryck för human mutant A53T α-syn i SNpc resulterar i svår neurodegeneration vid 6 veckor som kvantifieras av HALO och opartisk stereologi. (A) Representativa bilder som visar degeneration av TH-positiva nervceller i SNpc 6 veckor efter stereotaktisk injektion av AAV-A53T α-syn vid en titer på 3,4 x 1012 virala partiklar/ml. Immunofluorescerande färgning med anti-TH (grön) och anti-α-syn (röda) antikroppar. Skala bar = 200 μm. (B) Kvantifiering av antalet TH-positiva nervceller i SNpc av råttor injiceras med AAV-A53T α-syn eller AAV-EV visar att uttryck för mutanta α-syn resulterar i betydande dopaminerg neuron förlust. Oparat t-test; n = 5 råttor/grupp. Diagrammet visar medelvärdet ± SEM, ***P < 0,001. (C) Representativa bilder av kolorimetrisk färgning av dopaminerga nervceller i SNpc av AAV-A53T (vänster) eller AAV-EV (höger) injicerade råttor som används för att utföra opartisk stereologi. Skalstång = 200 μm. (D) En signifikant korrelation mellan HALO-räkning av TH-positiva nervceller/mm2 (y-axel) och opartiska stereologicellnummer (x-axel). Pearson korrelation (r = 0,8819, P = 0,0007). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Signifikant ensidig neurodegeneration observeras hos SNpc hos råttor som fick AAV- A53T injektion. A) Kvantifiering av antalet TH-positiva nervceller i injicerade eller oinjicerade SNpc av råttor som fick en ensidig AAV-A53T stereotaktisk injektion visar en signifikant minskning på den injicerade sidan. B) Kvantifieringen av antalet TH-positiva nervceller i injicerade eller oinjektionerade SNpc av råttor som fick ensidig AAV-EV stereotaktisk injektion visar inga signifikanta förändringar. (C) Normalisering till den oinjektionerade kontralaterala sidan visar en >50% minskning vid injektion med AAV-A53T α-syn jämfört med AAV-EV. Oparat t-test; n = 5 råttor/grupp. Grafer visar medelvärdet ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Klicka här för att ladda ner denna kompletterande figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tillförlitliga bedömningen av integriteten i det dopaminerga systemet i prekliniska modeller av PD är avgörande för att bestämma effektiviteten av potentiella sjukdomsmodifierande terapier. Därför är det viktigt att kontrollera och minimera potentiella confounds som kan minska tillförlitligheten och reproducerbarheten av histopatologiska data. Noggranna kvantitativa resultat kan ge mer information än enbart kvalitativa eller semikvantitativa beskrivningar. Samtidigt måste vi inse att tids- och resursbegränsningar kan göra det svårt att utföra opartiska stereologiska räknare för att kvantifiera patologiska förändringar eller förlust av celler. Men med de senaste framstegen kan många av dessa kriterier uppfyllas med hjälp av datoriserade och automatiserade bildplattformar6.
Detta protokoll beskriver ett antal viktiga steg för att bestämma den stereologiska uppskattningen av dopaminerga nervceller/mm2 i gnagare hjärnan. Det bör noteras att vi använde stereotaktisk injektion för att leverera AAV till SNpc, vilket lägger en vikt vid korrekt leverans av dessa virus för att bestämma effekten av någon behandling. Koordinaterna som används för vår studie är bregma -5,2 mm (främre bakre), -2 mm (mediala-laterala till höger) och -7,5 mm (dorsala ventrala från skallen) på vuxna kvinnliga råttor som väger ~275 g. Korrekt leverans av viruset med hjälp av dessa koordinater kommer att säkerställa leverans av AAV till SNpc.
Utöver detta måste försiktighet vidtas vid beredning av vävnader för färgning. Framför allt bör man se till att markera vilken sida som är höger/vänster. I våra händer är de enklaste och mest
reproducerbart sätt att göra detta var att använda en 25G nål för att peta ett hål regelbundet i vänster dorsala midbrain medan identifiera den oin injicerade sidan. En djupgående kunskap om de neuroanatomiska regionerna i gnagarhjärnan är viktig för att skilja när man ska börja skära, och senare identifiera SNpc när man ritar en region av intresse. Det är viktigt att notera att TH färgning inte uteslutande färga nervceller av SNpc, och man bör kunna skilja mellan TH-positiva nervceller i ventrala tegmentalområdet och retrorubal fältet. En råtta hjärnatlas är en användbar guide för dem som saknar erfarenhet av gnagare neuroanatomi. Antikroppsinkubationstiderna är enhetliga i hela protokollet och fokus ställs in på minsta möjliga tid för att undvika fotoblekning.
Det finns en låg variation mellan prover när konsekventa neuroanatomiska funktioner används för att skilja mellan sektioner. Att ha en erfaren, förblindad observatör som drar den region av intresse är viktigt för att upprätthålla konsekvens över de avsnitt som ska analyseras. En analys av den oinjecteda sidan, som visas i kompletterande figur 1, visar att metoden är konsekvent. Försiktighet bör dock vidtas vid tolkning av uppgifter på detta sätt. Skivning hjärnor förlitar sig konsekvent på att jämföra förekomsten av kända neuroanatomical funktioner på varje sida av hjärnan. Subtila skillnader kan innebära att den oin injicerade sidan på ett visst avsnitt kan vara mer bakre/främre än den injicerade sidan, och därmed inte en korrekt direkt jämförelse. Ytterligare analys av de presenterade uppgifterna belyser en begränsning av denna metod. Det finns en stor grad av variation i dopaminerga neuronräkningar i den oinjected sidan (123,2 i AAV-A53T-gruppen vs 215,6 i AAV-EV), som man inte kan förvänta sig mellan lika åldrade djur. Det finns ett antal möjliga orsaker till denna diskrepans, inklusive den lilla provstorlek som används i denna studie och de ovan nämnda anatomiska skillnaderna från sida till sida. Utöver detta ställs fokus för fluorescerande signal in på den injicerade sidan, vilket innebär att en liten förskjutning i z-planet kan lämna den oinjected sidan ur fokus, och därför kommer vissa celler inte att upptäckas av cellräkningsprogramvaran. Av denna anledning rekommenderas att jämföra antalet dopaminerga nervceller/ mm2 på ena sidan med kända neuroanatomiska funktioner, och där fokus har ställts in på mikroskopet specifikt för denna region. Om en jämförelse med den oinjecteda sidan behövs, bör avbildningen upprepas med fokuset inställt på denna sida.
Vi presenterar data som erhållits och analyserats med ett av de flera mjukvarupaketen som ger kvantitativ bildanalys med minimal användarutbildning13. Andra program är tillgängliga och antas alltmer för att studera neuropatologi, inklusive kvantifiering av dopaminerg neuron förlust i experimentella modeller av PD6. Medan vissa erbjuder inbyggda algoritmer för att utföra specifika funktioner (t.ex. amyloid plackräkning), delar många av mjukvarupaketen flera vanliga funktioner som gör dem särskilt användbara för laboratorier som utför repetitiv analys. Förutom identifiering av intresseområde kan förbearbetningssteg som stör signalen (vävnadsveck, kantartefakter, bläckmärken, fläckar etc.) tas bort från intresseområdet med manuella verktyg och mönsterigenkänningsverktyg. Dessutom kan de avläsningar som tillhandahålls användas tillsammans med kvantitativa värden som erhållits från protein-, cellulära eller beteendestudier för att utforska relationer och potentiella korrelationer mellan variabler.
Metoden som beskrivs ovan ger en korrekt, semi-kvantitativ och relativt billig procedur för att uppskatta neuron nummer i immunohistochemically färgade hjärnavsnitt. Justeringsfunktionen i realtid möjliggör anpassning av metoden för alla sektioner och säkerställer konsekvens även med små variationer i skivningsmetoder. Att ha en blind observatör identifiera regioner av intresse i SNpc mildrar bekräftelse eller urvalsbias och programvaran ger en enkel avläsning som möjliggör beräkning av nervceller / mm2. Denna metod kan enkelt anpassas för att ge exakta räkningar av nervceller i olika hjärnregioner samtidigt som effektivitet och kostnadsfördelar bibehålls jämfört med mer etablerade stereologiska protokoll. Framsteg av bildskanningsteknik för tjockare sektioner skulle också möjliggöra effektivare bearbetningstid för den ovan beskrivna metoden.
Begränsningar
Den beskrivna metoden har ett antal tydliga fördelar i sin hastighet och förmåga att upptäcka stora förändringar i neurontätheten, men innebär också sina egna utmaningar. Till skillnad från stereologi kan metoden inte ge en uppskattning av absoluta cellnummer utan beräknar i stället celltätheten inom SNpc. Uppskattningarna av celltätheten är mycket, men inte perfekt, korrelerade med cellnummer som erhållits med hjälp av opartisk stereologi. Dessutom förlitar sig metoden på justering av cellstorlek och form av användaren innan analysen påbörjas. Detta kan inte garantera att celler inte kommer att missas på grund av att de delvis är i fokalplanet, eller att celler av ovanlig storlek och/eller form kommer att missas av programvaran. Enligt författarnas erfarenhet är metoden särskilt användbar för att undersöka effekten av potentiella sjukdomsmodifierande terapier i prekliniska gnagaremodeller. Sammanfattningsvis, medan stereologiska metoder för att kvantifiera cellantal fortfarande används i stor utsträckning inom neurovetenskap, tyder den snabba accelerationen av digitaliseringen på att automatiserade bildanalysplattformar i allt högre grad kommer att antas för att studera neuropatologi, särskilt när de fortsätter att förbättras. Det är viktigt att utredaren förstår de tekniska begränsningarna i detta tillvägagångssätt och tillämpar denna metod efter noggrant övervägande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka all personal vid Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) vid University Health Network för deras tid och hjälp med att utveckla detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
