Summary
Здесь представлен автоматизированный метод полу количественного определения числа дофаминергических нейронов в крысиной субстанции nigra pars compacta.
Abstract
Оценка количества дофаминергических нейронов в чернии субстанции является ключевым методом в доклинических исследованиях болезни Паркинсона. В настоящее время непредвзятый стереологический подсчет является стандартом для количественной оценки этих клеток, но он остается трудоемким и трудоемким процессом, который может быть неосуществим для всех проектов. Здесь мы описываем использование платформы анализа изображений, которая может точно оценить количество меченых клеток в заранее определенной области интереса. Мы описываем пошаговый протокол для этого метода анализа в мозге крыс и демонстрируем, что он может идентифицировать значительное снижение положительных нейронов тирозингидроксилазы из-за экспрессии мутантного α-синуклеина в черную субстанцию. Мы проверили эту методологию, сравнив с результатами, полученными с помощью непредвзятой стереологии. Взятый вместе, этот метод обеспечивает эффективный по времени и точный процесс обнаружения изменений в количестве дофаминергических нейронов и, таким образом, подходит для эффективного определения влияния вмешательств на выживание клеток.
Introduction
Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным расстройством движения, характеризующимся наличием белковых агрегатов, содержащих α-синуклеин (α-син) и предпочтительной потерей дофаминергических нейронов в субстанции nigra pars compacta (SNpc)1. Количественная оценка числа дофаминергических нейронов является жизненно важной частью исследования БП, поскольку она позволяет оценить целостность нигростриатальной системы, обеспечивая тем самым важную конечную точку для оценки эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. В настоящее время стандартом количественной оценки числа клеток является непредвзятый стереологический подсчет, который использует двумерные (2D) поперечные сечения ткани для оценки объемных особенностей в трехмерных (3D) структурах2,3,4. Современные стереологические методы, основанные на проектировании, используют комплексные процедуры случайной выборки и применяют протоколы подсчета (известные как зонды), чтобы избежать потенциальных артефактов и систематических ошибок, что позволяет надежно обнаруживать различия, лишь немного большие, чем вариации между животными5. Хотя стереология обеспечивает мощный аналитический инструмент для гистологических исследований in vivo, она занимает много времени, предполагает равномерную подготовку образца и требует валидации на нескольких этапах, что может повлиять на эффективность, все более необходимую для доклинического трансляционного исследования.
Последние технологические достижения в цифровой науке позволяют принимать новые приложения для более эффективной оценки патологии без стереомикроскопа, одновременно удовлетворяя потребность в качестве суррогата непредвзятой стереологии. Эти методы увеличивают скорость, уменьшают человеческую ошибку и улучшают воспроизводимость стереологических методов6,7. HALO является одной из таких платформ анализа изображений для количественного анализа тканей в цифровой патологии. Он включает в себя множество различных модулей и сообщает морфологические и мультиплексированные данные экспрессии на клеточной основе по целым участкам ткани с использованием алгоритмов распознавания образов. Модуль cytonuclear FL измеряет иммунофлуоресцентную позитивность флуоресцентных маркеров в ядре или цитоплазме. Это позволяет сообщать о количестве клеток, положительных для каждого маркера, и оценке интенсивности для каждой ячейки. Модуль может быть адаптирован для обеспечения индивидуальных размеров клеток и измерений интенсивности, хотя эта функция не требуется для количественной оценки дофаминергических нейронов.
Целью данного исследования является проверка этого метода с помощью ранее проверенной вирусной векторной модели α-син крыс нигральной нейродегенерации8,9,10. В этой модели человеческий мутант A53T α-syn экспрессируется в SNpc путем стереотаксической инъекции аденоассоциированного вируса гибридного серотипа 1/2 (AAV1/2), что приводит к значительной нейродегенерации в течение 6 недель. Контралатеральный неинъекционный SNpc может, в некоторых исследованиях, служить внутренним контролем для вводимой стороны. Чаще всего инъекция AAV-пустого вектора (AAV-EV) в контрольную когорту животных используется в качестве отрицательного контроля. Мы представляем пошаговое руководство по оценке плотности дофаминергических нейронов, оставшихся в введенном SNpc через 6 недель с использованием автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений(рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными Университетской сети здравоохранения и выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Канадским советом по уходу за животными.
1. Стереотаксическая инъекция
- Парная взрослая самка крыс Sprague-Dawley (250-280 г) в клетках с древесной подстилкой и доступом к пище и воде. Поддерживайте колонию животных в регулярном 12-часовом цикле света / темноты (свет на 06:30) с постоянной температурой и влажностью.
- Выполняют одностороннюю стереотаксическую инъекцию AAV непосредственно в SNpc на правой стороне мозга (правой или левой стороне, согласно предпочтениям каждой лаборатории), как описаноранее 8,10. Вводят 2 мкл AAV1/2 при конечном титре 3,4 х 1012 геномных частиц/мл.
2. Сечение мозга и иммуногистохимия (IHC)
- Обезболивают крыс 5% изофлураном, помещая в обезболивающую камеру на 3 мин. Другие утвержденные методы могут быть использованы для этого этапа после соответствующего институционального обзора.
- Как только крыса достигнет хирургической плоскости глубокой анестезии, перенесите ее на носовой конус, прочно прикрепленный к столу для некропсии. Закрепите перепалки крысы с помощью ленты и используйте метод щипа-ответа на щипания, чтобы определить глубину анестезии. Животное должно не реагировать, прежде чем продолжить.
- Сделайте боковой разрез ниже грудины и прорежьте диафрагму по всей длине грудной клетки, чтобы обнажить плевральную полость. Поднимите и зажмите грудину гемостатом и поместите над головой.
- Зажмите сердце с помощью щипцов и вставьте иглу бабочки, соединенную с перфузионной накачкой, в задний конец левого желудочка. Перфьюируют крысу транскардиально 150 мл гепаринизированного физиологического раствора или до тех пор, пока глаза и кожа не будут чистыми. Перфузия с 4% параформальдегидом (PFA), вместо физиологического раствора, может быть предпочтительной для облегчения иммуноокрашивания определенными антителами или более тонкого сечения мозга.
- Как только перфузия будет завершена, обезглавить с помощью гильотины и извлечь мозг в мозговой матрикс, вентральную поверхность, обращенную вверх.
- Используя свежее лезвие бритвы, сделайте разрез в корональной плоскости 2 мм ростраля к зрительной хиазме. Скользите лезвием из стороны в сторону, чтобы избежать деформации мозга во время нарезки.
- Погрузите заднюю часть мозга в предварительно меченый флакон, содержащий примерно 20 мл 4% PFA в течение 48 ч постфиксации при комнатной температуре. Передняя часть мозга может быть заморожена в 2-метилбутане, охлажденным до -42 °C перед хранением при -80 °C.
- Через 48 ч переложите неподвижный мозг в меченый флакон, содержащий 30% сахарозы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), и храните при 4 °C до тех пор, пока они не утонут (48-72 ч).
- Подготовьте микротом, поместив сухой лед в желоб стадии образца, а затем 100% этанол. После того, как сцена остынет, выдавите на сцену компаунд оптимальной температуры резки (OCT), пока он не образует круг диаметром 2 см и толщиной 0,5 см. Как только он частично замерзнет, осторожно опустите мозг на насыпь OCT, гарантируя, что поверхность режущей стриатальной области остается параллельной стадии.
- Добавьте больше сухого льда на сцену, чтобы помочь мозгу замерзнуть. Как только мозг окрасится в кремовый цвет, очистите стадию от сухого льда.
- Проделайте отверстие в правой части мозга иглой 25G, чтобы различать правое и левое полушария. Следите за тем, чтобы не пропустить иглу через анатомические структуры, представляющие интерес.
- Последовательно разрезанные 40 мкм участки в корональной плоскости, начинающиеся при брегме -3,8 и заканчивающиеся на брегме -6,8.
- Хранить шесть серий в меченых тубах с антифризным раствором (40% PBS, 30% 2-этоксиэтанол, 30% глицерин). Каждая серия должна содержать 12 секций мозга.
- Выберите один набор секций для иммуногистохимического окрашивания и смойте антифризный раствор 3 х 10 мин промывками в 0,2% PBS-T.
- Блокируют в течение 1 ч при РТ с щадящим нутированием в блокирующем растворе (10% нормальная козья сыворотка (NGS), 2% бычоковый сывороточный альбумин (BSA) в 0,2% PBS-T). Затем следует инкубация с антителом против тирозингидроксилазы кролика (TH) (1:500) и антителом против α-син у мыши (1:500) в 2% NGS в 0,2% PBS-T в течение ночи при комнатной температуре.
- Смывайте первичное антитело 3 х 5 мин промывками в 0,2% PBS-T, затем 1 ч инкубации с козьим анти-кроликом Alexa Fluor 488 вторичным антителом (1:500) и козьим антимышиным Alexa Fluor 555 вторичным антителом в 2% NGS в 0,2% PBS-T. Убедитесь, что секции защищены от света и мягкой нутации.
- Смойте вторичные антитела 3 х 5 мин промывками в 0,2% PBS-T и установите полный набор секций на слайды, защищенные от света и пыли, с помощью узкой кисти. Обшивка с флуоресцентной монтажной средой и уплотнением прозрачным лаком для ногтей.
3. Конфокальная микроскопия и получение изображений
- Захват изображений IHC с помощью программного обеспечения, подключенного к конфокальному микроскопу с 10-кратным увеличением. Откройте точечное отверстие до 1,5 а.е., чтобы захватить широкую плоскость общей суммой ~ 1,5 мкм и установить фокус на введенной стороне мозга.
- На вкладке Приобретение установите флажок Изображение сканирования плитки и установите размеры 10 x 4.
- На панели «Режим получения» установите для кнопки «Масштаб» значение 1,1. Это помогает избежать каких-либо очевидных следов сшивания между изображениями сканирования плиток.
- Установите размер кадра 1024 x 1024 пикселя, а значение Усреднение — 2, чтобы обеспечить высокое качество получения изображения.
- На панели «Каналы» задайте для трека 1 значение Alexa488 и для трека 2 — Alexa555.
- Загрузите слайд на сцену и выберите участок с сильным окрашиванием TH. Нажмите «В реальном времени» на панели «Приобретение».
- На панели «Каналы» установите для параметров «Сила и усиление лазера» уровни, которые максимизируют сигнал и ограничивают шум от фона. Используйте индикатор диапазона, чтобы убедиться, что сигналы не переэкспонированы (как указано в темно-красном наложении).
- Повторите приведенный выше шаг с несколькими слайдами, чтобы убедиться, что окрашивание происходит между слайдами, так как сила / усиление лазера не может быть отрегулировано между слайдами.
- На вкладке Приобретение установите флажок Позиции.
- На этом этапе вы готовы приступить к визуализации. Используя окуляр, выберите первую секцию, показывающую положительное окрашивание TH, установите фокус в интересующей точке (т. Е. SNpc), а затем переместите сцену в среднюю линию секции. Это сохранит положение в осях x, y и z и создаст изображение сканирования плитки, захватывая весь раздел.
- Повторите приведенный выше шаг для всех разделов SNpc, предоставляя полный набор изображений SNpc. Если требуется подробный анализ неинъекированной стороны, шаги 3.10-3.11 следует повторить, установив фокус на неинжекторную сторону.
4. Анализ и количественное оценка изображений
- Разделяйте файлы изображений с помощью соответствующего программного обеспечения и импортируйте файлы изображений в автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений.
- Определите интересующую область, выбрав инструмент «Заметка пером», чтобы нарисовать аннотацию вокруг SNpc.
ПРИМЕЧАНИЕ: В участках, которые имеют большое количество потерь дофаминергических нейронов, временное увеличение эмиттанса/абсорбции может помочь четко определить SNpc(рисунок 2). - Перейдите на вкладку Анализ и в раскрывающемся меню Анализ выберите Настройка в реальном времени. Откроется отдельное окно на изображении раздела, позволяющее в режиме реального времени изменять параметры анализа(рисунок 3).
- В разделе Увеличение анализа выберите соответствующий масштаб изображения.
- В разделе «Обнаружение клеток» выберите ядерный краситель в качестве красителя, используемого для окрашивания TH (Alexa Fluor 488).
- Отрегулируйте настройки «Порог ядерной контрастности», «Минимальная ядерная интенсивность», «Агрессивность ядерной сегментации»и «Ядерный размер», внимательно следя за окном настройки в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точное представление каждой отдельной ячейки как одной ячейки в окне настройки в реальном времени имеет жизненно важное значение для точности. Эти настройки находятся в произвольном масштабе в зависимости от используемого программного обеспечения, но необходима правильная настройка, чтобы позволить программному обеспечению точно различать отдельные ячейки, а также между ячейками и фоном(рисунок 3). - Повторите этот процесс с минимум 10 отдельными образцами, чтобы обеспечить единообразное согласование того, что представляет собой ячейка в разных секциях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные маркеры ячеек (такие как α-syn или NeuN) могут быть идентифицированы в рамках той же аналитической платформы с помощью разделов Маркер 1 или Маркер 2 на вкладке анализа. - После выборки соответствующего количества изображений и соответствующей настройки в режиме реального времени сохраните параметры анализа в раскрывающемся меню Действия параметров.
- Выберите все изображения для анализа и нажмите «Анализировать».
- Выберите параметр анализа, который вы только что сохранили, и в окне Область анализа установите флажок Слои аннотаций. Затем проверьте уровень 1 и нажмите «Анализировать».
ПРИМЕЧАНИЕ: Для одного мозга анализ обычно занимает около 5 минут. Завершенный результат будет четко показывать каждый элемент, который был засчитан как ячейка(рисунок 4). - После завершения экспортируйте сводные данные анализа для всех разделов. Существует возможность экспорта данных анализа объектов,которые дадут подробные данные, включая размер ячейки каждой обнаруженной отдельной ячейки. Этот набор данных может быть использован для изучения изменений размера клеток в ответ на токсин / терапевтическое средство.
- Добавьте общее количество клеток из каждого раздела, проанализированного на животное, и общую анализируемую площадь (мм2). Разделите общее количество клеток на общую площадь, проанализированную для расчета количества клеток/мм2 в SNpc для каждой крысы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Применяя вышеуказанные методы к ткани мозга, собранной через 6 недель после инъекций AAV, мы продемонстрировали, что стереотаксическая инъекция AAV, экспрессирующую мутант A53T α-syn (AAV-A53T) в SNpc мозга крысы, приводит к значительному снижению плотности дофаминергических нейронов по сравнению с инъекцией пустого вектора AAV (AAV-EV) в качестве контроля(Рисунок 5A,B). Среднее число TH-положительных нейронов/мм2 в SNpc крыс, вводимых AAV-EV, составляло 276,2 ± 34,7, а в SNpc крыс, вводимых AAV-A53T, составляло 41,2 ± 17(P = 0,0003). Количественная оценка числа дофаминергических нейронов/мм2 в SNpc аналогична ранее опубликованным отчетам10,11. Для методов, описанных здесь, были проанализированы 4 последовательных участка на животное. Предыдущие исследования показали значительные различия всего с 3 разделами, но анализ может быть дополнительно увеличен до 12 разделов, чтобы охватить весь SNpc в зависимости от модели и вмешательства, изучаемого исследователем.
Непредвзятая стереология также была выполнена, какописано ранее 12 на другом наборе участков мозга от тех же животных. Используя этот метод, мы также продемонстрировали, что стереотаксическая инъекция мутантного A53T α-syn в SNpc мозга крыс приводит к значительному снижению предполагаемого общего числа TH-положительных нейронов в SNpc по сравнению с инъекцией EV-AAV(рисунок 5C). Важно отметить, что была выявлена сильная корреляция между плотностью дофаминергических нейронов, оцененной с помощью автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений, и числом дофаминергических нейронов, оцененным с использованием непредвзятой стереологии (r = 0,8819, P = 0,0007)(рисунок 5D).
Мы также применили наши методы с использованием автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений для определения количества TH-положительных нейронов /мм2 на неинъекированной стороне крыс, вводимых AAV-A53T или AAV-EV. Среднее число TH-положительных нейронов/мм2 в неинъецированном SNpc крыс, которым вводили AAV-A53T, составило 123,2 ± 26,4, что было значительно больше, чем в введенном SNpc, который составлял 44,0 ± 15,8(P = 0,0331)(дополнительный рисунок 1A). Среднее число TH-положительных нейронов/мм2 в неинъецированном SNpc крыс, вводимых AAV-EV (215,6 ± 35,5), существенно не отличалось от введенного SNpc (276,2 ± 34,7), подтверждая, что не было дегенерации из-за инъекции AAV-EV(дополнительный рисунок 1B). Мы рассчитали эти результаты в процентах от введенных / неинъекционных и обнаружили, что животные, которым вводили AAV-A53T, имели снижение на 69% по сравнению с животными AAV-EV(дополнительный рисунок 1C).
Рисунок 1:Рабочий процесс метода. Рабочий процесс, демонстрирующий шаги, необходимые для введения AAV, сечения и окрашивания ткани, определения интересующей области и оптимизации программного обеспечения для подсчета клеток. Репрезентативные изображения конфокального сканирования плиток, определения ROI и количественного определения клеток. Шкала бара = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Определение области интереса. (A)Корональный участок мозга, включая SNpc, иммуноокрашенный для TH (зеленый) от крысы, введенной AAV-A53T α-syn. У крыс с тяжелой нейродегенерацией (например, показанной здесь) может быть трудно идентифицировать SNpc.(B)Временно увеличивающее поглощение изображения может идентифицировать структуру и позволить точно идентифицировать интересующую область. Шкала = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Оптимизация обнаружения клеток с помощью метода Cytonuclear в HALO. Настройка в реальном времени цитонуклеарного модуля позволяет пользователю видеть изменения в обнаружении клеток в режиме реального времени, изменяя порог ядерного контраста, минимальную ядерную интенсивность, агрессивность ядерной сегментации и ядерный размер. (A) Репрезентативное изображение с отображением интересуемой области. (B)Настройка в режиме реального времени, показывающая недовыборку, при которой программное обеспечение не обнаруживает все ячейки в окне настройки. (C)Чрезмерная выборка, при которой программное обеспечение обнаруживает больше ячеек, чем видно в окне настройки. (D) Оптимизированная настройка, в которой подсчитывается правильное количество ячеек. Шкала бара = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Настройки, оптимизированные для HALO, в пределах определенной области интереса. Репрезентативные изображения завершенного анализа с использованием оптимизированных настроек для цитонуклеарного обнаружения в HALO. Шкала бара = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Экспрессия человеческого мутанта A53T α-syn в SNpc приводит к тяжелой нейродегенерации через 6 недель, что количественно определяется HALO и непредвзятой стереологией. (A) Репрезентативные изображения, показывающие дегенерацию TH-положительных нейронов в SNpc через 6 недель после стереотаксической инъекции AAV-A53T α-syn при титре 3,4 x 1012 вирусных частиц / мл. Иммунофлуоресцентное окрашивание анти-TH (зеленый) и анти-α-син (красный) антителами. Масштабная планка = 200 мкм. (B) Количественная оценка числа TH-положительных нейронов в SNpc крыс, которым вводили AAV-A53T α-syn или AAV-EV, показывает, что экспрессия мутантных α-syn приводит к значительной потере дофаминергических нейронов. Непарное т-тест; n = 5 крыс на группу. На графике показано среднее ± SEM, ***P < 0,001. (C)Репрезентативные изображения колориметрического окрашивания дофаминергических нейронов в SNpc AAV-A53T (слева) или AAV-EV (справа) введенных крыс, используемых для выполнения непредвзятой стереологии. Шкала = 200 мкм. (D) Значительная корреляция между HALO подсчетом TH-положительных нейронов/мм2 (ось y) и непредвзятыми стереологическими числами клеток (ось x). Корреляция Пирсона (r = 0,8819, P = 0,0007). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Значительная односторонняя нейродегенерация наблюдается в SNpc крыс, получавших инъекцию AAV-A53T. Количественноеобозначение количества TH-положительных нейронов в введенном или неинжелированном SNpc крыс, получающих одностороннюю стереотаксическую инъекцию AAV-A53T, показывает значительное снижение на вводимой стороне. (B)Количественная оценка количества TH-положительных нейронов в введенном или неинъекционном SNpc крыс, получающих одностороннюю стереотаксическую инъекцию AAV-EV, не показывает существенных изменений. (C)Нормализация на неинжелированную контралатеральную сторону демонстрирует снижение >50% при инъекции AAV-A53T α-syn по сравнению с AAV-EV. Непарное т-тест; n = 5 крыс на группу. Графики показывают среднее ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот дополнительный рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Достоверная оценка целостности дофаминергической системы в доклинических моделях БП имеет решающее значение для определения эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. Поэтому важно контролировать и минимизировать потенциальные путаницы, которые могут снизить надежность и воспроизводимость гистопатологических данных. Тщательные количественные результаты могут предоставить больше информации, чем качественные или полу количественные описания. В то же время мы должны признать, что ограниченность во времени и ресурсах может затруднить выполнение непредвзятого стереологического подсчета для количественной оценки патологических изменений или потери клеток. Однако с недавними достижениями многие из этих критериев могут быть выполнены с использованием компьютеризированных и автоматизированных платформ визуализации6.
Этот протокол описывает ряд важных шагов в определении стереологической оценки дофаминергических нейронов /мм2 в мозге грызунов. Следует отметить, что мы использовали стереотаксические инъекции для доставки AAV в SNpc, что придает большое значение точной доставке этих вирусов, чтобы определить эффект любого лечения. Координаты, используемые для нашего исследования: брегма -5,2 мм (передняя-задняя), -2 мм (медиалально-латеральная справа) и -7,5 мм (дорсальная вентральная от черепа) на взрослых самках крыс весом ~275 г. Правильная доставка вируса с использованием этих координат обеспечит доставку AAV в SNpc.
В дополнение к этому необходимо соблюдать осторожность при подготовке тканей к окрашиванию. Прежде всего, следует позаботиться о том, чтобы отметить, какая сторона является правой / левой. В наших руках самое легкое и самое
Воспроизводимым способом сделать это было использование иглы 25G, чтобы периодически протыкать отверстие в левом дорсальном среднем мозге, одновременно идентифицируя неинжекторную сторону. Глубокое знание нейроанатомических областей мозга грызунов важно различать, когда начинать резку, а затем идентифицировать SNpc при рисовании интересующего региона. Важно отметить, что окрашивание TH не окрашивает исключительно нейроны SNpc, и следует уметь различать TH-положительные нейроны в вентральной тегментальной области и ретрорубальном поле. Атлас мозга крыс является полезным руководством для тех, кому не хватает опыта в нейроанатомии грызунов. Время инкубации антител одинаково на протяжении всего протокола, и фокус устанавливается в минимально возможное время, чтобы избежать фотоотбеливания.
Существует низкая изменчивость между образцами, когда последовательные нейроанатомические особенности используются для различения участков. Наличие опытного, слепого наблюдателя, рисующего интересующую область, важно для поддержания согласованности между анализируемыми разделами. Анализ неинъекционной стороны, как показано на дополнительном рисунке 1, показывает, что метод является последовательным. Однако следует проявлять осторожность при интерпретации данных таким образом. Нарезка мозга последовательно опирается на сравнение наличия известных нейроанатомических особенностей на каждой стороне мозга. Тонкие различия могут означать, что неинжекированная сторона на данном участке может быть более задней/передней, чем вводимая сторона, и, следовательно, не является точным прямым сравнением. Дальнейший анализ представленных данных высвечивает ограниченность данного метода. Существует большая степень изменчивости количества дофаминергических нейронов в неинъективной стороне (123,2 в группе AAV-A53T против 215,6 в AAV-EV), чего нельзя было бы ожидать между животными аналогичного возраста. Существует ряд возможных причин этого несоответствия, включая небольшой размер выборки, использованный в этом исследовании, и вышеупомянутые анатомические различия из стороны в сторону. В дополнение к этому, фокус для флуоресцентного сигнала устанавливается на вводимой стороне, что означает, что небольшой сдвиг в z-плоскости может оставить неинжелированную сторону вне фокуса, и, таким образом, некоторые ячейки не будут обнаружены программным обеспечением для подсчета клеток. По этой причине рекомендуется сравнивать количество дофаминергических нейронов /мм2 с одной стороны, используя известные нейроанатомические особенности, и где фокус был установлен на микроскопе специально для этойобласти. Если требуется сравнение с неинъекированной стороной, изображение должно быть повторено с фокусом, установленным на этой стороне.
Представлены данные, полученные и проанализированные с помощью одного из нескольких программных пакетов, обеспечивающих количественный анализ изображений с минимальным обучением пользователей13. Другие программы доступны и все чаще принимаются для изучения невропатологии, включая количественную оценку потери дофаминергических нейронов в экспериментальных моделях PD6. В то время как некоторые предлагают встроенные алгоритмы для выполнения определенных функций (например, подсчет амилоидных бляшек), многие из пакетов программного обеспечения имеют несколько общих особенностей, которые делают их особенно полезными для лабораторий, выполняющих повторяющийся анализ. В дополнение к идентификации интересующей области, этапы предварительной обработки, которые мешают сигналу (складки тканей, артефакты краев, следы чернил, пятна и т. Д.), Могут быть удалены из области интереса с помощью ручных инструментов и инструментов распознавания образов. Кроме того, предоставленные показания могут быть использованы в сочетании с количественными значениями, полученными из белковых, клеточных или поведенческих исследований, для изучения отношений и потенциальных корреляций между переменными.
Метод, описанный выше, обеспечивает точную, полу количественную и относительно недорогую процедуру оценки числа нейронов в иммуногистохимически окрашенных участках мозга. Функция настройки в режиме реального времени позволяет адаптировать метод для всех секций и обеспечивает согласованность даже при небольших отклонениях в методах нарезки. Наличие слепого наблюдателя, идентифицирующего области, представляющие интерес в SNpc, смягчает смещения подтверждения или выбора, а программное обеспечение обеспечивает простое считывание, позволяющее рассчитывать нейроны /мм2. Этот метод может быть легко адаптирован для обеспечения точного подсчета нейронов в различных областях мозга, сохраняя при этом эффективность и преимущества в стоимости по сравнению с более установленными стереологическими протоколами. Развитие технологии сканирования слайдов для более толстых участков также позволит обеспечить более эффективное время обработки для вышеописанного метода.
Ограничения
Описанный метод имеет ряд явных преимуществ в своей скорости и способности обнаруживать большие изменения плотности нейронов, но также создает свои собственные проблемы. В отличие от стереологии, метод не может обеспечить оценку абсолютного числа клеток, а вместо этого вычисляет плотность клеток в пределах SNpc. Оценки плотности клеток высоко, но не идеально, коррелируют с числами клеток, полученными с использованием непредвзятой стереологии. Кроме того, метод основан на настройке размера и формы ячейки пользователем до начала анализа. Это не может гарантировать, что клетки не будут пропущены из-за того, что они частично находятся в фокальной плоскости, или что клетки необычного размера и / или формы будут пропущены программным обеспечением. По опыту авторов, метод особенно полезен для изучения эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств в доклинических моделях грызунов. В заключение, в то время как стереологические методы количественной оценки количества клеток по-прежнему широко используются в нейробиологии, быстрое ускорение цифровизации предполагает, что автоматизированные платформы анализа изображений будут все чаще использоваться для изучения невропатологии, особенно по мере их дальнейшего совершенствования. Важно, чтобы исследователь понимал технические ограничения этого подхода и применяет эту методологию после тщательного рассмотрения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех сотрудников Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) в University Health Network за их время и помощь в разработке этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
