Summary
Aquí presentamos un método automatizado para la determinación semicuantita cuantitativa del número de neuronas dopaminérgicas en el compacta de las igualdades del nigra del substantia de la rata.
Abstract
La estimación del número de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia es un método dominante en la investigación preclínica de la enfermedad de Parkinson. Actualmente, el conteo estereológico imparcial es el estándar para la cuantificación de estas células, pero sigue siendo un proceso laborioso y lento, que puede no ser factible para todos los proyectos. Aquí, describimos el uso de una plataforma de análisis de imágenes, que puede estimar con precisión la cantidad de celdas etiquetadas en una región predefinida de interés. Se describe un protocolo paso a paso para este método de análisis en el cerebro de rata y demostrar que puede identificar una reducción significativa en las neuronas positivas de la tirosina hidroxilasa debido a la expresión de mutante α-sinucleína en el nigra substantia. Se validó esta metodología mediante la comparación con los resultados obtenidos por estereología imparcial. En conjunto, este método proporciona un proceso eficiente en el tiempo y preciso para detectar cambios en el número de neuronas dopaminérgicas, y por lo tanto es adecuado para la determinación eficiente del efecto de las intervenciones en la supervivencia celular.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno del movimiento neurodegenerativo prevalente caracterizado por la presencia de agregados proteicos que contienen α-sinucleína (α-syn) y la pérdida preferencial de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra pars compacta (SNpc)1. La cuantificación del número de neuronas dopaminérgicas es una parte vital de la investigación de la EP, ya que permite la evaluación de la integridad del sistema nigroestriatal, lo que proporciona un criterio de valoración importante para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial modificadora de la enfermedad. Actualmente, el estándar para la cuantificación del número celular es el conteo estereológico imparcial, que utiliza secciones transversales bidimensionales (2D) de tejido para estimar las características volumétricas en estructuras tridimensionales (3D)2,3,4. Los métodos estereológicos modernos basados en el diseño emplean procedimientos integrales de muestreo aleatorio y aplican protocolos de conteo (conocidos como sondas) para evitar artefactos potenciales y errores sistemáticos, lo que permite la detección confiable de diferencias sólo ligeramente mayores que la variación entre animales5. Si bien la estereología proporciona una poderosa herramienta analítica para los estudios histológicos in vivo, requiere mucho tiempo, asume una preparación uniforme de la muestra y requiere validación en varios pasos, lo que puede afectar la eficiencia cada vez más requerida para la investigación traslacional preclínica.
Los recientes avances tecnológicos en la ciencia digital permiten adoptar nuevas aplicaciones para evaluaciones más eficientes de la patología sin un estereomicroscopio, al tiempo que se llena una necesidad como sustituto de la estereología imparcial. Estos métodos aumentan la velocidad, reducen el error humano y mejoran la reproducibilidad de las técnicas estereológicas6,7. HALO es una de esas plataformas de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo de tejidos en patología digital. Comprende una variedad de diferentes módulos e informes de expresión morfológica y multiplexada datos sobre una base de célula por célula a través de secciones de tejido entero utilizando algoritmos de reconocimiento de patrones. El módulo citonuclear FL mide la positividad inmunofluorescente de los marcadores fluorescentes en el núcleo o citoplasma. Esto permite informar del número de celdas positivas para cada marcador y la puntuación de intensidad para cada celda. El módulo se puede adaptar para proporcionar tamaños de célula individuales y mediciones de intensidad, aunque esta característica no es necesaria para la cuantificación de las neuronas dopaminérgicas.
El objetivo de este estudio es verificar este método con un modelo de neurodegeneración nigral previamente validado basado en vectores α-syn de neurodegeneraciónnigral 8,9,10. En este modelo, el mutante humano A53T α-syn se expresa en el SNpc por inyección estereotáctica del serotipo híbrido de virus adenoasociado 1/2 (AAV1/2), lo que resulta en una neurodegeneración significativa durante un período de 6 semanas. El SNpc no inyectado contralateral puede, en algunos estudios, servir como un control interno para el lado inyectado. Más comúnmente, la inyección de AAV-Empty Vector (AAV-EV) en una cohorte de control de animales se utiliza como un control negativo. Presentamos una guía paso a paso para estimar la densidad de neuronas dopaminérgicas que permanecen en el SNpc inyectado después de 6 semanas utilizando un software de análisis de imágenes automatizado(Figura 1).
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Red de Salud de la Universidad y se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.
1. Inyección estereotáctica
- Ratas Sprague-Dawley hembras adultas de casas de pareja (250-280 g) en jaulas con ropa de cama de madera y acceso ad lib a alimentos y agua. Mantener la colonia de animales en un ciclo regular de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 06:30) con temperatura y humedad constantes.
- Realizar la inyección estereotáctica unilateral de AAV directamente al SNpc en el lado derecho del cerebro (lado derecho o izquierdo, según las preferencias de cada laboratorio) como se describió anteriormente8,10. Inyecte 2 μL de AAV1/2 a un título final de 3,4 x 1012 partículas genómicas/mL.
2. Seccionamiento cerebral e inmunohistoquímica (IHC)
- Anestesiar a la rata con isoflurano al 5% colocándola en una cámara anestesizante durante 3 min. Otros métodos aprobados pueden ser utilizados para este paso después de la revisión institucional apropiada.
- Una vez que la rata ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia profunda, transfiéranlo a un cono de nariz firmemente fijado a una mesa de necropsia. Asegure las patas de la parte anterior de la rata usando cinta adhesiva y use el método de respuesta de pellizco del dedo del perro para determinar la profundidad de la anestesia. El animal debe no responder antes de continuar.
- Haga una incisión lateral debajo del esternón y corte el diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. Levante y sujete el esternón con un hemóstato y colótelo encima de la cabeza.
- Sujete el corazón con pinzas e inserte una aguja de mariposa conectada a una bomba de perfusión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo. Perfundir rata transcardialmente con 150 mL de solución salina heparinizada, o hasta que los ojos y la piel estén claros. La perfusión con el paraformaaldehído del 4% (PFA), en vez de salino, se puede preferir para facilitar immunostaining con ciertos anticuerpos o el seccionamiento más fino del cerebro.
- Una vez completada la perfusión, decapitar con una guillotina y extraer el cerebro a una matriz cerebral, superficie ventral hacia arriba.
- Usando una cuchilla de afeitar fresca, hacer un corte en el plano coronal 2 mm rostral al quiasma óptico. Deslice la cuchilla de lado a lado para evitar deformar el cerebro mientras se corta.
- Sumergir la porción posterior del cerebro en un vial pre-etiquetado que contenga aproximadamente 20 mL de PFA al 4% durante 48 h de post-fijación a temperatura ambiente. La porción anterior del cerebro puede congelarse en 2-metilbutano refrigerado a -42 °C antes de su almacenamiento a -80 °C.
- Después de 48 h, transferir los cerebros fijos a un vial marcado que contiene sacarosa al 30% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y almacenarlos a 4 °C hasta que se hundan (48-72 h).
- Prepare un microtoma colocando hielo seco en el canal de la etapa de la muestra, seguido de etanol al 100%. Una vez que la etapa se ha enfriado, apriete el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en la etapa hasta que forme un círculo de 2 cm de diámetro y 0,5 cm de espesor. Una vez que se ha congelado parcialmente, baje cuidadosamente el cerebro sobre el montículo de OCT, asegurando que la superficie de corte estriatal permanezca paralela a la etapa.
- Agregue más hielo seco al escenario para ayudar al cerebro a congelarse. Una vez que el cerebro se ha vuelto de un color crema, despeje la etapa de hielo seco.
- Haga un agujero en el lado derecho del cerebro con una aguja 25G para distinguir los hemisferios derecho e izquierdo. Tenga cuidado de no pasar la aguja a través de estructuras anatómicas de interés.
- Cortar en serie secciones de 40 μm en el plano coronal comenzando en bregma -3.8 y terminando en bregma -6.8.
- Guarde seis series en tubos etiquetados con solución anticongelante (40% PBS, 30% 2-etoxietanol, 30% glicerol). Cada serie debe contener 12 secciones cerebrales.
- Seleccione un conjunto de secciones para la tinción inmunohistoquímica y lave la solución anticongelante con lavados de 3 x 10 min en PBS-T al 0,2%.
- Bloque para 1 h en el RT con la nutación suave en la solución de bloqueo (suero normal de la cabra del 10% (NGS), albúmina de suero bovino del 2% (BSA) en 0,2% PBS-T). Siga esto con la incubación con el anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa del conejo (TH) (1:500) y el anticuerpo anti-α-syn del ratón (1:500) en ngs del 2% en pbs-t del 0,2% durante la noche en la temperatura ambiente.
- Lave el anticuerpo primario con lavados de 3 x 5 min en PBS-T al 0,2%, seguido de una incubación de 1 h con anticuerpo secundario Anti-conejo Alexa Fluor 488 de cabra (1:500) y anticuerpo secundario Anti-ratón Alexa Fluor 555 de cabra en NGS al 2% en PBS-T al 0,2%. Asegúrese de que las secciones estén protegidas de la luz y de la nuez suavemente.
- Lave los anticuerpos secundarios con lavados de 3 x 5 min en PBS-T al 0,2% y monte el conjunto completo de secciones en portaobjetos protegidos de la luz y el polvo con un pincel estrecho. Cubrebocas con medio de montaje de fluorescencia y sello con barniz de uñas transparente.
3. Microscopía confocal y adquisición de imágenes
- Capture imágenes IHC utilizando un software acoplado a un microscopio confocal a un aumento de 10x. Abra el agujero de alfiler a 1.5 UA para capturar un plano ancho que totalizara ~ 1.5 μm y establezca el enfoque en el lado inyectado del cerebro.
- En la pestaña Adquisición, active la opción Imágenes de escaneo de teselas y establezca las dimensiones en 10 x 4.
- En el panel Modo de adquisición, establezca el Zoom en 1.1. Esto ayuda a evitar cualquier marca de costura obvia entre las imágenes de escaneo de mosaicos.
- Establezca el Tamaño de fotograma en 1024 x 1024 píxeles y el Promedio en 2 para garantizar la adquisición de imágenes de alta calidad.
- En el panel Canales, establezca la pista 1 en Alexa488 y la pista 2 en Alexa555.
- Cargue la diapositiva en el escenario y elija una sección con una fuerte tinción de TH. Haga clic en En vivo en el panel Adquisición.
- En el panel Canales, establezca la Fuerza y ganancia del láser en niveles que maximicen la señal y limiten el ruido del fondo. Utilice el indicador de rango para asegurarse de que las señales no están sobreexpuestas (como lo indica una superposición de color rojo oscuro).
- Repita el paso anterior con varias diapositivas para asegurarse de que la tinción sea consistente entre las diapositivas, ya que la fuerza/ganancia del láser no se puede ajustar entre las diapositivas.
- En la pestaña Adquisición, active la casilla Posiciones.
- En este punto, usted está listo para comenzar la toma de imágenes. Usando el ocular, elija la primera sección que muestra una tinción de TH positiva, establezca el enfoque en el punto de interés (es decir, SNpc) y luego mueva el escenario a la línea media de la sección. Esto guarda la posición en los ejes x, y y z y creará una imagen de un escaneo de mosaico que captura toda la sección.
- Repita el paso anterior para todas las secciones a lo largo del SNpc dando un conjunto completo de imágenes del SNpc. Si se requiere un análisis detallado del lado no inyectado, los pasos 3.10 a 3.11 deben repetirse estableciendo el enfoque en el lado no inyectado.
4. Análisis de imágenes y cuantificación
- Separe los archivos de imagen utilizando el software adecuado e importe los archivos de imagen al software de análisis de imágenes automatizado.
- Defina una región de interés seleccionando la herramienta De anotación Pluma para dibujar una anotación alrededor del SNpc.
NOTA: En las secciones que tienen una gran cantidad de pérdida de neuronas dopaminérgicas, el aumento temporal de la emisión / absorción puede ayudar a definir claramente el SNpc (Figura 2). - Desplácese hasta la pestaña Análisis y, en el menú desplegable Analizar, seleccione Ajuste en tiempo real. Esto abre una ventana separada en la imagen de la sección que permite la modificación en tiempo real de los parámetros de análisis (Figura 3).
- En la sección Ampliación de análisis, seleccione el zoom de imagen adecuado.
- En la sección Detección celular, seleccione el tinte nuclear como el tinte utilizado para la tinción de TH (Alexa Fluor 488).
- Ajuste los ajustes de Umbral de contraste nuclear, Intensidad nuclear mínima, Agresividadde segmentación nuclear y Tamaño nuclear mientras observa cuidadosamente la ventana Ajuste en tiempo real.
Nota: La representación precisa de cada celda individual como una sola celda en la ventana de ajuste en tiempo real es vital para la precisión. Estos ajustes son a una escala arbitraria dependiendo del software utilizado, pero se necesita un ajuste correcto para permitir que el software diferencie con precisión entre celdas individuales, y entre celdas y el fondo (Figura 3). - Repita este proceso con un mínimo de 10 muestras separadas para garantizar una concordancia uniforme de lo que constituye una célula en diferentes secciones.
NOTA: Los marcadores de celda adicionales (como α-syn o NeuN) se pueden identificar dentro de la misma plataforma de análisis mediante las secciones Marcador 1 o Marcador 2 de la ficha análisis. - Una vez que se haya muestreado un número adecuado de imágenes y se haya ajustado en tiempo real en consecuencia, guarde la configuración de análisis en el menú desplegable Acciones de configuración.
- Seleccione todas las imágenes que se analizarán y haga clic en Analizar.
- Elija la configuración de análisis que acaba de guardar y, en la ventana Región de análisis, marque la casilla Capas de anotación. Luego, marque la Capa 1 y haga clic en Analizar.
NOTA: Para un solo cerebro, el análisis suele tardar unos 5 minutos. El resultado completado mostrará claramente cada elemento que se ha contado como una celda (Figura 4). - Una vez completado, exporte los datos de análisis de resumen para todas las secciones. Hay una opción para exportar datos de análisis de objetos,que proporcionará datos detallados, incluido el tamaño de celda de cada celda individual detectada. Este conjunto de datos podría utilizarse para examinar los cambios en el tamaño celular en respuesta a una toxina/terapéutica.
- Agregue las Celdas Totales de cada sección analizada por animal y el Área Total Analizada (mm2). Divida el número total de células por el área total analizada para calcular el número de células/mm2 en el SNpc para cada rata
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Representative Results
Mediante la aplicación de los métodos anteriores al tejido cerebral recogido 6 semanas después de las inyecciones de AAV, hemos demostrado que la inyección estereotáctica de AAV que expresa el mutante A53T α-syn (AAV-A53T) en el SNpc del cerebro de rata resulta en una reducción significativa en la densidad de las neuronas dopaminérgicas en comparación con la inyección del vector vacío AAV (AAV-EV) como un control(Figura 5A,B). El número malo de neuronas TH-positivas/mm2 en el SNpc de ratas inyectadas con AAV-EV era 276,2 ± 34,7, y en el SNpc de ratas inyectadas con AAV-A53T era 41,2 ± 17(P = 0,0003). La cuantificación del número de neuronas dopaminérgicas/mm2 en el SNpc es similar a los informes publicados anteriormente10,11. Para los métodos aquí descritos, se analizaron 4 secciones secuenciales por animal. Estudios anteriores han mostrado diferencias significativas con tan solo 3 secciones, pero el análisis se puede aumentar aún más hasta 12 secciones para abarcar todo el SNpc dependiendo del modelo y la intervención que esté estudiando el investigador.
La estereología imparcial también fue realizada según lo descritopreviamente 12 en otro sistema de secciones del cerebro de los mismos animales. Utilizando este método, también demostramos que la inyección estereotáctica del mutante A53T α-syn en el SNpc del cerebro de rata resulta en una reducción significativa en el número total estimado de neuronas TH-positivas en el SNpc, en comparación con la inyección de EV-AAV(Figura 5C). Es importante destacar que hubo una fuerte correlación entre la densidad de neuronas dopaminérgicas estimada mediante el software de análisis automatizado de imágenes y el número de neuronas dopaminérgicas estimada mediante estereología imparcial (r = 0,8819, P = 0,0007)(Figura 5D).
También aplicamos nuestros métodos utilizando software automatizado de análisis de imágenes para determinar el número de neuronas TH-positivas / mm2 en el lado no inyectado de ratas inyectadas con AAV-A53T o AAV-EV. El número medio de neuronas TH-positivas/mm2 en el SNpc no inyectado de ratas inyectadas con AAV-A53T fue de 123,2 ± 26,4, que fue significativamente mayor que en el SNpc inyectado, que fue de 44,0 ± 15,8(P = 0,0331) (Figura suplementaria 1A). El número medio de neuronas TH-positivas/mm2 en el SNpc no inyectado de ratas inyectadas con AAV-EV (215,6 ± 35,5) no fue significativamente diferente del SNpc inyectado (276,2 ± 34,7), confirmando que no hubo degeneración debido a la inyección con AAV-EV (Figura suplementaria 1B). Se calcularon estos resultados como un porcentaje de inyectados/no inyectados y se encontró que los animales inyectados con AAV-A53T tuvieron una reducción del 69% en comparación con los animales con AAV-EV(Figura suplementaria 1C).
Figura 1:Flujo de trabajo del método. Flujo de trabajo que demuestra los pasos necesarios para inyectar AAVs, seccionar y teñir tejido, definir una región de interés y optimizar el software para el conteo de células. Imágenes representativas del escaneo de teselas confocales, la definición de ROI y la cuantificación de celdas. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Definición de la región de interés. (A)Sección cerebral coronal, incluyendo el SNpc inmunotenido para TH (verde) de una rata inyectada con AAV-A53T α-syn. En ratas con neurodegeneración severa (como se muestra aquí), puede ser difícil identificar el SNpc. (B) Aumentar temporalmente la absorción de la imagen puede identificar la estructura y permitir una identificación precisa de la región de interés. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Optimización de la detección celular utilizando el método citonuclear en HALO. El ajuste en tiempo real del módulo citonuclear permite al usuario ver los cambios en la detección celular en tiempo real mediante la alteración del umbral de contraste nuclear, la intensidad nuclear mínima, la agresividad de segmentación nuclear y el tamaño nuclear. (A) Imagen representativa con la región de interés mostrada. (B) Ajuste en tiempo real que muestra el submuestreo en el que el software no detecta todas las celdas de la ventana de ajuste. (C)Sobremuestreo en el que el software detecta más células de las que son evidentes en la ventana de ajuste. (D) Ajuste optimizado en el que se cuenta el número correcto de celdas. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Configuración optimizada de HALO dentro de una región de interés definida. Imágenes representativas del análisis completado utilizando ajustes optimizados para la detección citonuclear en HALO. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5:La expresión del mutante humano A53T α-syn en SNpc resulta en neurodegeneración severa a las 6 semanas según lo cuantificado por HALO y estereología imparcial. (A) Imágenes representativas que muestran la degeneración de las neuronas TH-positivas en el SNpc 6 semanas después de la inyección estereotáctica de AAV-A53T α-syn a un título de 3,4 x 1012 partículas virales / mL. Tinción inmunofluorescente con anticuerpos anti-TH (verde) y anti-α-syn (rojos). Barra de escala = 200 μm.(B)La cuantificación del número de neuronas TH-positivas en el SNpc de ratas inyectadas con AAV-A53T α-syn o AAV-EV demuestra que la expresión de mutantes α-syn resulta en una pérdida significativa de neuronas dopaminérgicas. Prueba tno emparejada; n = 5 ratas/grupo. El gráfico muestra la media ± SEM, ***P < 0,001. (C)Imágenes representativas de tinción colorimétrica de neuronas dopaminérgicas en el SNpc de ratas inyectadas AAV-A53T (izquierda) o AAV-EV (derecha) utilizadas para realizar estereología imparcial. Barra de escala = 200 μm. (D) Una correlación significativa entre el recuento de HALO de neuronas TH-positivas/mm2 (eje y) y los números de celda de estereología imparcial (eje x). Correlación de Pearson (r = 0,8819, P = 0,0007). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura suplementaria 1: Se observa neurodegeneración unilateral significativa en el SNpc de ratas que recibieron la inyección de AAV-A53T. (A)La cuantificación del número de neuronas TH-positivas en el SNpc inyectado o no inyectado de ratas que recibieron una inyección estereotáctica unilateral de AAV-A53T muestra una disminución significativa en el lado inyectado. (B)La cuantificación del número de neuronas TH-positivas en el SNpc inyectado o no inyectado de ratas que recibieron inyección estereotáctica unilateral de AAV-EV no muestra cambios significativos. (C)La normalización al lado contralateral no inyectado demuestra una disminución del >50% tras la inyección con AAV-A53T α-syn en comparación con AAV-EV. Prueba tno emparejada; n = 5 ratas/grupo. Los gráficos muestran la media ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Haga clic aquí para descargar esta cifra suplementaria.
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Discussion
La evaluación confiable de la integridad del sistema dopaminérgico en modelos preclínicos del paladio es crítica determinar la eficacia de la terapéutica enfermedad-que modifica potencial. Por lo tanto, es importante controlar y minimizar las posibles confundciones que pueden reducir la fiabilidad y reproducibilidad de los datos histopatológicos. Los resultados cuantitativos cuidadosos pueden proporcionar más información que las descripciones cualitativas o semicuantitaticas por sí solas. Al mismo tiempo, debemos reconocer que las limitaciones de tiempo y recursos pueden dificultar la realización de un recuento estereológico imparcial para cuantificar los cambios patológicos o la pérdida de células. Sin embargo, con los avances recientes, muchos de estos criterios pueden cumplirse utilizando plataformas de imágenes computarizadas y automatizadas6.
Este protocolo describe varios pasos importantes en la determinación de la estimación estereológica de neurons/mm2 dopaminérgicos en cerebro del roedor. Cabe señalar que utilizamos la inyección estereotáctica para administrar AAV al SNpc, lo que da importancia a la entrega precisa de estos virus para determinar el efecto de cualquier tratamiento. Las coordenadas utilizadas para nuestro estudio son bregma -5,2 mm (anterior-posterior), -2 mm (medial-lateral a la derecha) y -7,5 mm (dorsal ventral del cráneo) en ratas hembra adultas que pesan ~275 g. La correcta entrega del virus utilizando estas coordenadas garantizará la entrega de los AAV al SNpc.
Además de esto, se debe tener cuidado al preparar los tejidos para la tinción. Ante todo, se debe tener cuidado de marcar qué lado es el derecho / izquierdo. En nuestras manos, lo más fácil y lo más fácil
La manera reproducible de hacer esto era utilizar una aguja 25G para meter un agujero periódicamente en el mesencéfalo dorsal izquierdo mientras que identificaba el lado sin inyectar. Un conocimiento profundo de las regiones neuroanatómicas del cerebro del roedor es importante para diferenciar cuándo comenzar a cortar, y más tarde para identificar el SNpc al dibujar una región de interés. Es importante tener en cuenta que la tinción de TH no mancha exclusivamente las neuronas del SNpc, y uno debe ser capaz de diferenciar entre las neuronas TH-positivas en el área tegmental ventral y el campo retrorubal. Un atlas del cerebro de la rata es una guía útil para ésos que carecen de experiencia en neuroanatomy del roedor. Los tiempos de incubación de anticuerpos son uniformes en todo el protocolo y el enfoque se establece en el mínimo tiempo posible para evitar el fotoblanqueo.
Hay una baja variabilidad entre las muestras una vez que se utilizan características neuroanatómicas consistentes para distinguir entre secciones. Hacer que un observador experimentado y ciego dibuje la región de interés es importante para mantener la coherencia entre las secciones que se analizarán. El análisis del lado no inyectado como se muestra en la Figura suplementaria 1 demuestra que hay una consistencia en el método. Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar los datos de esta manera. Cortar cerebros consistentemente se basa en la comparación de la presencia de características neuroanatómicas conocidas en cada lado del cerebro. Las diferencias sutiles pueden significar que el lado no inyectado en una sección dada puede ser más posterior/anterior que el lado inyectado, y por lo tanto no una comparación directa exacta. El análisis adicional de los datos presentados destaca una limitación de este método. Hay un grado grande de variabilidad en las cuentas dopaminérgicas de la neurona en el lado no inyectado (123,2 en el grupo de AAV-A53T contra 215,6 en el AAV-EV), que uno no esperaría entre los animales semejantemente envejecidos. Hay una serie de posibles razones para esta discrepancia, incluyendo el pequeño tamaño de la muestra utilizado en este estudio y las diferencias anatómicas antes mencionadas de lado a lado. Además de esto, el enfoque de la señal fluorescente se establece en el lado inyectado, lo que significa que un ligero cambio en el plano z puede dejar el lado no inyectado fuera de foco, y por lo tanto algunas células no serán detectables por el software de conteo celular. Por esta razón, se recomienda comparar el número de neuronas dopaminérgicas/mm2 en un lado usando características neuroanatómicas sabadas, y donde el foco se ha fijado en el microscopio específicamente para esta región. Si se necesita una comparación con el lado no inyectado, las imágenes deben repetirse con el enfoque establecido en este lado.
Presentamos los datos obtenidos y analizados con uno de los diversos paquetes de software que proporcionan análisis cuantitativo de imágenes con un mínimo entrenamiento del usuario13. Otros programas están disponibles y se están adoptando cada vez más para estudiar la neuropatología, incluyendo la cuantificación de la pérdida dopaminérgica de la neurona en modelos experimentales delpaladio 6. Mientras que algunos ofrecen algoritmos incorporados para realizar funciones específicas (por ejemplo, recuento de placas amiloides), muchos de los paquetes de software comparten varias características comunes que los hacen particularmente útiles para los laboratorios que realizan análisis repetitivos. Además de la identificación de la región de interés, los pasos de preprocesamiento que interfieren con la señal (pliegues de tejido, artefactos de borde, marcas de tinta, manchas, etc.) se pueden eliminar de la región de interés mediante herramientas manuales y de reconocimiento de patrones. Además, las lecturas proporcionadas se pueden utilizar junto con valores cuantitativos obtenidos de estudios de proteínas, celulares o de comportamiento para explorar las relaciones y las correlaciones potenciales entre las variables.
El método descrito arriba proporciona un procedimiento exacto, semicuantitato, y relativamente barato para estimar números de la neurona en secciones immunohistochemically manchadas del cerebro. La función de ajuste en tiempo real permite la adaptación del método para todas las secciones y garantiza la coherencia incluso con ligeras variaciones en los métodos de corte. Tener un observador ciego identificar las regiones de interés en el SNpc mitiga los sesgos de confirmación o selección y el software proporciona una lectura simple que permite el cálculo de neuronas / mm2. Este método podría adaptarse fácilmente para proporcionar recuentos precisos de neuronas en diferentes regiones del cerebro, manteniendo al mismo tiempo la eficiencia y las ventajas de costos sobre los protocolos estereológicos más establecidos. El avance de la tecnología de escaneo portaobjetos para secciones más gruesas también permitiría un tiempo de procesamiento más eficiente para el método descrito anteriormente.
Limitaciones
El método descrito tiene una serie de ventajas distintas en su velocidad y capacidad para detectar grandes cambios en la densidad de las neuronas, pero también plantea sus propios desafíos. A diferencia de la estereología, el método no puede proporcionar una estimación de los números absolutos de celda, sino que calcula la densidad celular dentro del SNpc. Las estimaciones de la densidad celular están altamente, pero no perfectamente, correlacionadas con los números de células obtenidos mediante estereología imparcial. Además, el método se basa en el ajuste del tamaño y la forma de la celda por parte del usuario antes de comenzar el análisis. Esto no puede garantizar que las células no se pierdan debido a estar parcialmente en el plano focal, o que las células de un tamaño y / o forma inusual se pierdan por el software. En la experiencia de los autores, el método es particularmente útil para examinar la eficacia de la terapéutica de enfermedad-modificación potencial en modelos preclínicos del roedor. En conclusión, si bien los métodos estereológicos para cuantificar el número de células siguen siendo ampliamente utilizados en la neurociencia, la rápida aceleración de la digitalización sugiere que las plataformas automatizadas de análisis de imágenes se adoptarán cada vez más para estudiar la neuropatología, particularmente a medida que continúan mejorando. Es importante que el investigador entienda las limitaciones técnicas de este acercamiento y aplique esta metodología después de la consideración cuidadosa.
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Disclosures
Los autores no divulgan n° intereses que compiten.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a todo el personal del Centro de Microscopía Óptica Avanzada (AOMF) de university health network por su tiempo y asistencia en el desarrollo de este protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
