Summary
在这里，我们提出了一个自动方法，用于半定量确定大鼠亚坦蒂娅尼格拉解析压实数中的多巴明神经元数。
Abstract
估计亚坦蒂娅尼格拉多巴明神经元的数量是临床前帕金森病研究的关键方法。目前，不偏不倚的类固物计数是这些细胞的量化标准，但它仍然是一个费力和耗时的过程，这可能并非所有项目都可行。在这里，我们描述图像分析平台的使用，它可以准确估计预先定义的兴趣区域中标记的细胞的数量。我们描述了大鼠大脑中这种分析方法的分步协议，并证明它可以识别由于突变α核糖核素在亚种尼格拉中表达而显著减少酪氨酸羟基酶阳性神经元。我们通过与公正立体学获得的结果进行比较来验证这一方法。综合起来，该方法为检测多巴明神经元数的变化提供了一个时间高效、准确的过程，因此适合有效确定干预对细胞生存的影响。
Introduction
帕金森病 （PD） 是一种流行的神经退行性运动障碍，其特征是存在含有α-核素 （α-syn） 的蛋白质聚合物，以及亚坦蒂娅尼格拉解析 （SNpc）1中多巴明神经元的优先损失。多巴明神经元数的量化是PD研究的重要组成部分，因为它允许评估尼古菌系统的完整性，从而为评估潜在疾病改变疗法的有效性提供了一个重要的终点。目前，细胞编号的定量标准是公正的固态计数，它利用组织二维（2D）横截面来估计三维（3D）结构2、3、4的体积特征。现代基于设计的固态方法采用全面的随机采样程序，并应用计数协议（称为探针），以避免潜在的文物和系统错误，使可靠的检测差异只比动物间变异5略大。虽然立体学为体内组学研究提供了强大的分析工具，但它时间密集，承担统一的标本制备，需要分几个步骤进行验证，这可能会影响临床前转化调查日益需要的效率。
数字科学的最新技术进步使得在没有立体显微镜的情况下，能够采用新的应用来更有效地评估病理学，同时满足作为公正立体学代名词的需求。这些方法提高了速度，减少了人为错误，提高了固态技术6、7的可重复性。HALO是数字病理学中定量组织分析的图像分析平台之一。它包括各种不同的模块，并使用模式识别算法，逐细胞报告形态和多路复用表达数据。细胞核FL模块测量细胞核或细胞质中荧光标记的免疫荧光阳性。这允许报告每个标记的正细胞数量以及每个标记的强度分数。该模块可以调整，以提供单独的细胞大小和强度测量，虽然此功能不需要量化多巴明神经元。
这项研究的目的是验证这种方法与先前验证的病毒载体为基础的α合成大鼠模型的黑鬼神经退化8，9，10。在这个模型中，人类突变的A53T α合成通过定型注射腺相关病毒混合血清型1/2（AAV1+2）在SNpc中表达，导致在6周内显著的神经退化。在某些研究中，未弹出的对应性 SNpc 可能充当注射方的内部控制。更常见的情况是，在对照动物群中注射 AAV 空矢量 （AAV-EV） 用作负控制。我们使用自动图像分析软件（图 1）提供分步指南，以估计注射的 SNpc 中 6 周后剩余的多巴明神经元的密度。
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Protocol
所有程序均由大学健康网络动物护理委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会制定的准则和条例执行。
1. 立体定向注射
- 配对屋成年雌性斯普拉格-道利大鼠（250-280克）在笼子里用木床上用品和广告图书馆获得食物和水。保持动物群落在一个正常的12小时光/暗周期（灯在06：30）与恒定的温度和湿度。
- 按照先前描述的8、10，对大脑右侧的SNpc（根据每个实验室的偏好）进行单侧立体定向注射AAV。在 3.4 x 10 12 基因组粒子/mL 的最终滴定下注入 2μL 的AAV1/2。
2. 脑科和免疫化学 （IHC）
- 通过在麻醉室中放置3分钟，用5%的异氟兰麻醉大鼠。经适当机构审查后，可使用其他经核准的方法采取这一步骤。
- 一旦老鼠到达深麻醉的手术平面，将其转移到一个鼻锥牢固地贴在坏死表上。使用胶带固定大鼠的前爪，并使用脚趾捏响应方法确定麻醉的深度。动物在继续之前必须反应迟钝。
- 在胸骨下方做一个横向切口，沿着肋骨笼的整个长度切开隔膜，露出胸腔。用血压器抬起并夹住胸骨，放在头部上方。
- 用钳子夹住心脏，将连接到灌注泵的蝴蝶针插入左心室的后端。用150mL的肝盐水，或直到眼睛和皮肤清晰，用心肌发泄大鼠。与4%的甲醛（PFA）的灌注，而不是盐水，可能更倾向于促进免疫染色与某些抗体或更薄的大脑分割。
- 一旦灌注完成，用断头台斩首，并将大脑提取到大脑矩阵中，腹腔表面朝上。
- 使用新鲜的剃须刀刀片，在日冕平面上切开2毫米的旋转到光学气孔。将刀片从一侧滑到另一侧，以避免在切片时扭曲大脑。
- 将大脑的后部浸入预先标记的小瓶中，在室温下固定后48小时，含有约20mL的4%PFA。大脑的前部可能在-80°C储存前，在2-甲基丁烷中冻结至-42°C。
- 48小时后，将固定的大脑转移到含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）中含有30%蔗糖的标记小瓶中，并储存在4°C，直到它们下沉（48-72 h）。
- 通过在标本阶段的槽中放置干冰，然后100%乙醇来准备一个微原子。舞台冷却后，将最佳切割温度 （OCT） 化合物挤压到舞台上，直到形成直径 2 厘米、厚 0.5 厘米的圆圈。一旦部分冻结，小心地将大脑降低到 OCT 的土堆上，确保纹状切割表面与舞台保持平行。
- 在舞台上加入更多的干冰，以帮助大脑冻结。一旦大脑变成奶油色，清除干冰的阶段。
- 用25G针将一个洞插入大脑的右侧，以区分左右半球。小心不要通过感兴趣的解剖结构传递针头。
- 从布雷格马 -3.8 开始，到布雷格马 - 6.8 开始，连续切割日冕平面中的 40 μm 部分。
- 将六个系列的标签管中存储，配有防冻溶液（40% PBS、30% 2 乙氧乙醇、30% 甘油）。每个系列应包含12个大脑部分。
- 选择一组用于免疫化学染色的部分，并在 0.2% PBS-T 中用 3 x 10 分钟洗涤洗掉防冻溶液。
- 在 RT 阻塞溶液（10% 普通山羊血清 （NGS）， 2% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 0.2% PBS-T 中温和的坚果块 1 小时。遵循这一点与兔子抗酪氨酸羟基酶 （TH） 抗体 （1：500） 和小鼠抗α合成抗体 （1：500） 在 2% NGS 在 0.2% PBS-T 在室温下过夜。
- 用 3 x 5 分钟洗掉原抗体，在 0.2% PBS-T 中洗净，然后用山羊抗兔 Alexa Fluor 488 次抗体 （1：500） 和山羊抗鼠标 Alexa Fluor 555 在 2% NGS 中 1 小时孵育 0.2% PBS-T。确保这些部分免受光线的照射和轻轻的螺母。
- 用 3 x 5 分钟在 0.2% PBS-T 中清洗二次抗体，并在滑梯上安装完整的部分，使用狭窄的画笔保护免受光线和灰尘的干扰。盖上荧光安装介质，密封有清晰的指甲油。
3. 聚焦显微镜和图像采集
- 使用软件以 10 倍的倍数将 IHC 图像与对焦显微镜耦合捕获。将针孔打开至 1.5 AU，以捕获总金额为 1.5μm 的宽平面，并将焦点放在大脑的注射侧。
- 在 获取 选项卡上，检查 磁贴扫描 成像选项，并将尺寸设置为 10 x 4。
- 在 "获取模式" 面板下，将 缩放 设置为 1.1。这有助于避免瓷砖扫描图像之间出现任何明显的缝合痕迹。
- 将 帧大小 设置为 1024 x 1024 像素， 将平均值 设置为 2，以确保高质量的图像采集。
- 在 通道 面板中，设置 轨道 1 到 Alexa488， 将轨道 2 设置 为 Alexa555。
- 将幻灯片加载到舞台上，并选择具有强 TH 染色的部分。点击收购面板上的实时。
- 在 通道 面板中，将 激光强度 和 增益 设置为最大化信号和限制来自背景的噪音的水平。使用范围指示器以确保信号不会过度暴露（如深红色覆盖物所示）。
- 使用多个幻灯片重复上述步骤，以确保幻灯片之间的染色一致，因为激光强度/增益无法在幻灯片之间调整。
- 在 收购 选项卡上，检查 "位置 "框。
- 此时，您已准备好开始成像。使用目镜，选择显示正 TH 染色的第一节，将焦点设置在兴趣点（即 SNpc），然后将舞台移到该部分的中线。这样可以保存 x、y 和 z 轴中的位置，并将对捕获整个部分的瓷砖扫描进行成像。
- 在整个 SNpc 中重复上述步骤，提供一整套 SNpc 的图像。如果需要对未插入的一侧进行详细分析，则应通过将焦点设置在未弹出侧来重复步骤 3.10 到 3.11。
4. 图像分析和量化
- 使用适当的软件将图像文件单独输入到自动图像分析软件中。
- 通过选择 笔 注释工具在 SNpc 周围绘制注释来定义感兴趣的区域。
注意：在具有大量多巴明神经元损失的部分，暂时增加排放/吸收有助于明确定义 SNpc （图 2）。 - 移动到 分析 选项卡，从下拉 分析 菜单，选择 实时调整。这将打开部分图像上的单独窗口，以便实时修改分析参数（图 3）。
- 在 分析放大 部分下，选择适当的图像缩放。
- 在 细胞检测 部分下，选择核染料作为用于 TH 染色的染料（亚历克萨氟 488）。
- 调整核对比阈值、最低核强度、核分割攻击性和核大小设置，同时仔细观察实时调谐窗口。
注：在实时调谐窗口中，每个单元格作为单个单元的准确表示对于准确性至关重要。这些设置根据所使用的软件进行任意尺度，但需要进行正确的调整，以便软件能够准确区分单个单元格、单元格和背景（图 3）。 - 重复此过程，至少需要 10 个单独的样本，以确保在不同部分统一确定什么是单元格。
注：使用分析选项卡上的标记 1 或标记 2 部分，可在同一分析平台内识别其他细胞标记（如α合成或 NeuN）。 - 一旦采样了适当数量的图像，并相应地调整了实时调谐，请保存 "设置"操作 下拉菜单中的分析设置。
- 选择所有要分析的图像，然后单击 "分析"。
- 选择您刚刚保存的分析设置，并在分析窗口 区域 中检查 注释层（s） 框。然后，检查 第 1 层 并单击 "分析"。
注：对于单个大脑，分析通常需要大约 5 分钟。完成的结果将清楚地显示已计入单元格的每个项目（图 4）。 - 完成后，导出所有部分的汇总分析数据。有一个选项来导出 对象分析数据，这将提供详细的数据，包括每个检测到的单元格的细胞大小。此数据集可用于检查细胞大小的变化，以响应毒素/治疗。
- 添加每个动物分析的每个部分的总细胞和总分析区域（mm2）。将细胞总数除以分析的总面积，以计算每只大鼠 SNpc 中的细胞/mm2 数量
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Representative Results
通过将上述方法应用于AAV注射后6周收集的脑组织，我们证明，与注射空向量AV（AAV-EV）作为对照剂（图5A，B）相比，在大鼠大脑SNpc中对AAV表示突变A53T α-syn（AAV-A53T）的立体定向注射可显著降低多巴明神经元的密度。注射AAV-EV的SNpc中TH阳性神经元/mm2的平均数为276.2±34.7，注射AAV-A53T的大鼠SNpc为41.2±17（P = 0.0003）。 SNpc中多巴明神经元/mm2数量的量化与先前发表的报告10、11相似。对于此处描述的方法，分析了每种动物的 4 个顺序部分。先前的研究表明，只有3个部分存在显著差异，但分析可以进一步增加到12个部分，以涵盖整个SNpc，这取决于调查人员正在研究的模型和干预。
不偏不倚的立体学也像以前描述的那样，在来自同一动物的另一组大脑部分进行了12次。使用这种方法，我们还证明，与注射EV-AAV（图5C）相比，大鼠大脑SNpc中突变A53T的立体定向注射α合成导致SNpc中TH阳性神经元的估计总数显著减少。重要的是，使用自动图像分析软件估计的多巴明神经元密度与使用公正立体学估计的多巴明神经元数（r = 0.8819，P=0.0007）（图 5D）之间有很强的相关性。
我们还使用自动图像分析软件应用了我们的方法，以确定注射了 AAV-A53T 或 AAV-EV 的大鼠未弹出侧的 TH 阳性神经元/mm2的数量。注射AAV-A53T的未注入的SNpc中TH阳性神经元/mm2的平均数为123.2±26.4，明显高于注射的SNpc，即44.0±15.8（P = 0.0331）（补充图1A）。注射AAV-EV（215.6±35.5）的未注入的SNpc中TH阳性神经元/mm 2的平均数与注射的SNpc（276.2±34.7）没有显著差异，证实没有因注射AV-EV（补充图1B）而退化。我们计算了这些结果作为注射/未注射的百分比，发现注射AAV-A53T的动物与AV-EV动物相比减少了69%（补充图1C）。
图1：方法的工作流程。 工作流演示注射 AAV、节和污渍组织所需的步骤，定义感兴趣的区域并优化用于计算细胞的软件。共焦瓷砖扫描、投资回报率定义和细胞量度的代表性图像。比例栏 =100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：定义感兴趣的区域。 （A） 冠状脑部分，包括从注射AAV-A53T的老鼠中免疫TH（绿色）的SNpc α合成。在具有严重神经退化的老鼠（如图所示），很难识别 SNpc.（B） 暂时增加图像的吸收可以识别结构并允许准确识别感兴趣的区域。比例尺 = 1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：使用HALO中的细胞核方法优化细胞检测。 细胞核模块的实时调谐允许用户通过更改核对比阈值、最小核强度、核分割攻击性和核大小实时查看细胞检测的变化。（A） 显示感兴趣区域的代表形象。（B） 实时调整显示未采样，其中软件无法检测调谐窗口中的所有单元。（C） 过度采样，其中软件检测的细胞比调音窗口中明显的要多。（D） 优化调谐，计算正确细胞数。比例杆 =500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：HALO 在定义感兴趣的区域内优化设置。 使用优化设置完成分析的具有代表性的图像，用于 HALO 中的细胞核检测。比例杆 =500 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：人类突变A53T α合成在SNpc的表达导致严重的神经退化在6周，由HALO和公正的立体学量化。 （A） 在 AAV-A53T α 的立体定向注射后 6 周内，在 3.4 x 1012病毒颗粒/mL 的滴定下显示 SNpc 中 TH 阳性神经元的退化的代表性图像。免疫荧光染色与抗TH（绿色）和抗α合成（红色）抗体。比例杆 = 200μm. （B） 用 AAV-A53T α合成或 AAV-EV 注射的 SNpc 中 TH 阳性神经元数量的量化表明突变α合成的表达会导致显著的多巴明神经元损失。未修复的t测试;n = 5 只大鼠/组。图示表示平均± SEM，***P < 0.001。（C） AAV-A53T（左）或AV-EV（右）注射大鼠SNpc中多巴明神经元的彩色染色图像，用于执行公正的立体学。比例杆 = 200μm. （D） TH 阳性神经元/mm2 （y 轴） 的 HALO 计数与公正的立体学细胞数 （x 轴） 之间的显著相关性。皮尔逊相关性（r = 0.8819，P = 0.0007）。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：在接受AAV-A53T注射的老鼠的SNpc中观察到明显的单边神经退化。 （A） 接受单侧 AAV-A53T 立体定向注射的大鼠注射或未注射 SNpc 中的 TH 阳性神经元数量的量化表明注射方显著减少。（B） 接受单边AV-EV立体定向注射的大鼠注射或未注射的SNpc中TH阳性神经元数量的量化没有显著变化。（C） 与 AAV-EV 相比，未弹出的对角侧的规范化表明，AAV-A53T α合成注射后>50% 的降幅。未修复的 t测试;n = 5 只大鼠/组。图表显示平均值± SEM，*P < 0.05，***P < 0.001。 请单击此处下载此补充图。
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Discussion
PD 临床前模型中多巴明药物系统的完整性的可靠评估对于确定潜在疾病改变疗法的有效性至关重要。因此，控制和减少可能降低组织病理数据可靠性和可重复性的潜在混淆非常重要。仔细的定量结果可以提供比定性或半定量描述更多的信息。同时，我们必须认识到，时间和资源的限制可能使执行公正的固态计数难以量化病理变化或细胞损失。然而，随着最近的进步，许多这些标准可以使用计算机化和自动化成像平台6实现。
该协议描述了确定啮齿动物大脑中多巴明神经元/mm2 的固态估计的若干重要步骤。应当指出，我们使用立体定向注射将 AAV 传送到 SNpc，SNpc 重视准确传递这些病毒，以确定任何治疗的效果。用于我们研究的坐标是布雷格玛-5.2毫米（前后），-2毫米（中侧向右）和-7.5毫米（从头骨的多萨尔腹腔）对成年雌性大鼠重约275克。使用这些坐标正确传递病毒将确保将 AAV 交付给 SNpc。
除此之外，在准备染色组织时，必须小心。首先，应小心标记哪一边是右/左。在我们手中，最简单和最
可重复的方法是使用 25G 针定期戳左侧多塞尔中脑孔，同时识别未弹出的侧面。深入了解啮齿动物大脑的神经解剖区域对于区分何时开始切割以及以后在绘制感兴趣的区域时识别 SNpc 非常重要。需要注意的是，TH染色并不完全染色SNpc的神经元，人们应该能够区分心室牙周区域的TH阳性神经元和逆转录病毒学领域。老鼠脑图集是那些缺乏啮齿动物神经解剖经验的人的有用指南。在整个协议中，抗体潜伏时间是均匀的，并且将焦点设置在尽可能短的时间内，以避免光漂白。
一旦使用一致的神经解剖特征来区分各节，样本之间的变异性就很低。拥有经验丰富的盲人观察者会吸引感兴趣的区域，这对于保持要分析的各部分的一致性非常重要。 对补充图1 中显示的未弹出侧的分析表明，该方法具有一致性。但是，在以这种方式解释数据时应小心谨慎。切片大脑始终依赖于比较大脑两侧已知的神经解剖特征的存在。细微的差异可能意味着给定部分的未弹出侧可能比注射的侧面更后/后方，因此无法进行准确的直接比较。对所呈现数据的进一步分析突出了此方法的局限性。未弹出侧的多巴明神经元计数存在很大程度的变异性（AAV-A53T 组为 123.2，AAV-EV 为 215.6），人们不会期望在年龄相等的动物之间出现这种变化。造成这种差异的原因有很多，包括本研究中使用的样本量小，以及上述解剖学差异。除此之外，荧光信号的焦点设置在注入侧，这意味着z平面的轻微变化可能会使未弹出的一侧失去焦点，因此某些单元格不会被细胞计数软件检测到。因此，建议使用已知的神经解剖特征比较一侧的多巴明神经元/mm2 的数量，并专门针对这一区域设置显微镜。如果需要与未弹出的一侧进行比较，则应重复成像，并设置在该侧面的对焦。
我们提供获得和分析的数据与几个软件包之一，提供定量图像分析与最小的用户培训13。其他计划是可用的，并越来越多地被采用来研究神经病理学，包括在PD6的实验模型中多巴明神经元损失的量化。虽然有些软件提供内置算法来执行特定功能（例如淀粉样斑块计数），但许多软件包都具有几个共同功能，使得它们对于执行重复分析的实验室特别有用。除了兴趣识别区域外，还可以通过手动和模式识别工具从感兴趣的区域中删除干扰信号的预处理步骤（组织折叠、边缘文物、墨迹、污渍等）。此外，所提供的读数可以与从蛋白质、细胞或行为研究中获得的定量值结合使用，以探索变量之间的关系和潜在相关性。
上述方法为估计免疫化学染色大脑部分的神经元数量提供了一个准确、半定量和相对便宜的过程。实时调整功能允许对所有部分的方法进行调整，并确保一致性，即使切片方法略有差异。让失明的观察者识别 SNpc 感兴趣的区域可减轻确认或选择偏差，软件提供简单的读数，允许计算神经元/mm2。这种方法可以很容易地适应，以提供不同大脑区域神经元的准确计数，同时保持效率和成本优势比更成熟的固态协议。为较厚的部分推进幻灯片扫描技术，还可以为上述方法提供更高效的处理时间。
局限性
所述方法在检测神经元密度大变化的速度和能力方面具有许多明显的优势，但也提出了自己的挑战。与立体学不同，该方法不能提供绝对细胞数的估计，而是计算 SNpc 中的细胞密度。细胞密度的估计与使用公正立体学获得的细胞数量高度相关，但并不完美。此外，该方法还依赖于用户在开始分析之前对单元格大小和形状的调整。这不能保证细胞不会因为部分处于焦点平面而错过，或者软件会忽略大小和/或形状异常的单元格。根据作者的经验，该方法对于检查临床前啮齿动物模型中潜在的疾病改变疗法的疗效特别有用。总之，虽然量化细胞数量的固理方法在神经科学中仍然被广泛使用，但数字化的快速加速表明，自动图像分析平台将越来越多地用于研究神经病理学，尤其是在它们不断改进的时候。调查人员必须了解这种方法的技术局限性，并在认真考虑后应用这种方法。
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Disclosures
作者报告没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
作者要感谢大学健康网络高级光学显微镜设施（AOMF）的所有工作人员在制定此协议方面给予的时间和帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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