Summary
Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.
Abstract
La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è un metodo chiave nella ricerca pre-clinica sul morbo di Parkinson. Attualmente, il conteggio stereologico imparziale è lo standard per la quantificazione di queste cellule, ma rimane un processo laborioso e dispendioso in termini di tempo, che potrebbe non essere fattibile per tutti i progetti. Qui descriviamo l'uso di una piattaforma di analisi delle immagini, in grado di stimare con precisione la quantità di celle etichettate in una regione di interesse predefinita. Descriviamo un protocollo passo-passo per questo metodo di analisi nel cervello del ratto e dimostriamo che può identificare una significativa riduzione dei neuroni positivi tirosina idrossilasi a causa dell'espressione della α-sinuleina mutante nella substantia nigra. Abbiamo convalidato questa metodologia confrontando i risultati ottenuti da stereologia imparziale. Nel complesso, questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici, ed è quindi adatto per una determinazione efficiente dell'effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.
Introduction
Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo del movimento neurodegenerativo prevalente caratterizzato dalla presenza di aggregati proteici contenenti α-sinuleina (α-syn) e dalla perdita preferenziale di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantificazione del numero di neuroni dopaminergici è una parte vitale della ricerca PD in quanto consente la valutazione dell'integrità del sistema nigrostriatale, fornendo così un endpoint importante per valutare l'efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Attualmente, lo standard per la quantificazione del numero di cellule è il conteggio stereologico imparziale, che utilizza sezioni trasversali bidimensionali (2D) del tessuto per stimare le caratteristiche volumetriche nelle strutture tridimensionali (3D)2,3,4. I moderni metodi stereologici basati sulla progettazione utilizzano procedure di campionamento casuali complete e applicano protocolli di conteggio (noti come sonde) per evitare potenziali artefatti ed errori sistematici, consentendo un rilevamento affidabile delle differenze solo leggermente superiore alla variazione tra animali5. Mentre la stereologia fornisce un potente strumento analitico per studi istologici in vivo, richiede molto tempo, presuppone una preparazione uniforme del campione e richiede la convalida in diversi passaggi, il che può influire sull'efficienza sempre più richiesta per l'indagine traslazionale preclinale.
I recenti progressi tecnologici nella scienza digitale rendono possibile l'adozione di nuove applicazioni per valutazioni più efficienti della patologia senza stereomicroscopio, pur riempiendo un'esigenza di surrogato di stereologia imparziale. Questi metodi aumentano la velocità, riducono l'errore umano e migliorano la riproducibilità delle tecnichestereologiche 6,7. HALO è una di queste piattaforme di analisi delle immagini per l'analisi quantitativa dei tessuti nella patologia digitale. Comprende una varietà di moduli diversi e riporta dati di espressione morfologici e multiplexati su base cellulare per cella su intere sezioni tissutali utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli. Il modulo FL citonucleare misura la positività immunofluorescente dei marcatori fluorescenti nel nucleo o nel citoplasma. Ciò consente di segnalare il numero di celle positive per ogni marcatore e il punteggio di intensità per ogni cella. Il modulo può essere adattato per fornire le singole dimensioni cellulari e le misurazioni dell'intensità, anche se questa caratteristica non è necessaria per la quantificazione dei neuroni dopaminergici.
Lo scopo di questo studio è quello di verificare questo metodo con un modello di ratto α-syn basato su vettori virali precedentemente convalidato di neurodegenerazione nigrale8,9,10. In questo modello, il mutante umano A53T α-syn è espresso nell'SNpc per iniezione stereotassitica del sierotipo ibrido virus adeno-associato 1/2 (AAV1/2), con conseguente significativa neurodegenerazione per un periodo di 6 settimane. L'SNpc non iniettato contralaterale può, in alcuni studi, servire da controllo interno per il lato iniettato. Più comunemente, l'iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) in una coorte di controllo degli animali viene utilizzata come controllo negativo. Presentiamo una guida dettagliata per stimare la densità dei neuroni dopaminergici che rimangono nell'SNpc iniettato dopo 6 settimane utilizzando un software automatizzato di analisi delle immagini(Figura 1).
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali della rete sanitaria universitaria ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti stabiliti dal Canadian Council on Animal Care.
1. Iniezione stereotassia
- Coppia femmina adulta Ratti Sprague-Dawley (250-280 g) in gabbie con biancheria da letto in legno e accesso ad lib a cibo e acqua. Mantenere la colonia animale in un ciclo normale di luce/buio di 12 ore (luci accese alle 06:30) con temperatura e umidità costanti.
- Eseguire l'iniezione stereotassiva unilaterale di AAV direttamente all'SNpc sul lato destro del cervello (lato destro o sinistro, secondo le preferenze di ogni laboratorio) comedescritto in precedenza 8,10. Iniettare 2 μL di AAV1/2 ad un formicolio finale di 3,4 x 1012 particelle genomiche/mL.
2. Sezione cerebrale e immunoistochimica (IHC)
- Anestetizzare il ratto con il 5% di isoflurane mettendolo in una camera anestetizzante per 3 min. Altri metodi approvati possono essere utilizzati per questo passaggio dopo un'adeguata revisione istituzionale.
- Una volta che il ratto ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia profonda, trasferirlo in un cono nasale saldamente apposto su un tavolo necroscopia. Fissare le zampe anteriori del topo usando il nastro adesivo e utilizzare il metodo di risposta delle dita dei piedi per determinare la profondità dell'anestesia. L'animale deve non rispondere prima di continuare.
- Fare un'incisione laterale sotto lo sterno e tagliare attraverso il diaframma lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Sollevare e bloccare lo sterno con un emostato e posizionarsi sopra la testa.
- Bloccare il cuore utilizzando le pinze e inserire un ago a farfalla collegato a una pompa perfusione nell'estremità posteriore del ventricolo sinistro. Perfondere il ratto transcardialmente con 150 mL di soluzione salina eparinata o fino a quando gli occhi e la pelle non sono chiari. La perfusione con paraformaldeide al 4% (PFA), invece della soluzione salina, può essere preferita per facilitare l'immunosottenimento con determinati anticorpi o sessatura cerebrale più sottile.
- Una volta completata la perfusione, decapitare con una ghigliottina ed estrarre il cervello in una matrice cerebrale, superficie ventrale rivolta verso l'alto.
- Utilizzando una lama di rasoio fresca, fai un taglio nel piano coronale 2 mm rostrale al chiasmo ottico. Far scorrere la lama da un lato all'altro per evitare di dedire il cervello durante l'affettamento.
- Immergere la porzione posteriore del cervello in una fiala pre-etichettata contenente circa 20 mL di PFA al 4% per 48 ore di post-fissazione a temperatura ambiente. La porzione anteriore del cervello può essere congelata in 2-metilbutano raffreddato a -42 °C prima della conservazione a -80 °C.
- Dopo 48 ore, trasferire il cervello fisso su una fiala etichettata contenente il 30% di saccarosio in salina tamponata dal fosfato (PBS) e conservare a 4 °C fino ad affondare (48-72 h).
- Preparare un microtomo posizionando ghiaccio secco nel trogolo dello stadio del campione, seguito da etanolo al 100%. Una volta raffreddato lo stadio, spremere il composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) sullo stadio fino a 30 30 cm di diametro e 0,5 cm di spessore. Una volta parzialmente congelato, abbassare accuratamente il cervello sul tumulo di OCT, assicurando che la superficie di taglio striata rimanga parallela allo stadio.
- Aggiungi più ghiaccio secco sul palco per aiutare il cervello a congelare. Una volta che il cervello ha trasformato un colore crema, sgombra lo stadio del ghiaccio secco.
- Infilare un buco nel lato destro del cervello con un ago 25G per distinguere l'emisfero destro e sinistro. Fare attenzione a non passare l'ago attraverso strutture anatomiche di interesse.
- Tagliare in serie sezioni da 40 μm nel piano coronale a partire da bregma -3,8 e terminando a bregma -6,8.
- Conservare sei serie in tubi etichettati con soluzione antigelo (40% PBS, 30% 2-etossietanolo, 30% glicerolo). Ogni serie dovrebbe contenere 12 sezioni cerebrali.
- Selezionare una serie di sezioni per la colorazione immunoistochimica e lavare via la soluzione antigelo con lavaggi 3 x 10 minuti nello 0,2% di PBS-T.
- Blocco per 1 h a RT con nutazione delicata in soluzione di blocco (10% siero di capra normale (NGS), 2% albumina di siero bovino (BSA) nello 0,2% PBS-T). Seguire questo con incubazione con anticorpo anti-tirosina del coniglio (TH) anticorpo (1:500) e anticorpo anti-α-syn del topo (1:500) nel 2% NGS nello 0,2% PBS-T durante la notte a temperatura ambiente.
- Lavare via l'anticorpo primario con lavaggi 3 x 5 minuti nello 0,2% di PBS-T, seguito da 1 h di incubazione con anticorpo secondario Alexa Fluor 488 (1:500) e anti-topo di capra Alexa Fluor 555 nell'anticorpo secondario 2% NGS nello 0,2% PBS-T. Assicurarsi che le sezioni siano protette dalla luce e dalla nutazione delicatamente.
- Lavare l'anticorpo secondario con lavaggi da 3 x 5 minuti nello 0,2% di PBS-T e montare l'insieme completo di sezioni su diapositive protette da luce e polvere utilizzando un pennello stretto. Copriscivolo con mezzo di montaggio a fluorescenza e guarnizione con vernice chiara per unghie.
3. Microscopia confocale e acquisizione di immagini
- Cattura le immagini IHC utilizzando un software accoppiato a un microscopio confocale con ingrandimento 10x. Apri il foro stenopeico a 1,5 UA per catturare un piano largo per un totale di ~ 1,5 μm e impostare l'attenzione sul lato iniettato del cervello.
- Nella scheda Acquisizione selezionare l'opzione di imaging Scansione riquadro e impostare le dimensioni su 10 x 4.
- Nel pannello Modalità acquisizione, impostate lo zoom su 1.1. Questo aiuta a evitare evidenti segni di cucitura tra le immagini di scansione dei riquadri.
- Impostate la dimensione del fotogramma su 1024 x 1024 pixel e la media su 2 per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità.
- Nel pannello Canali, traccia 1 su Alexa488 e traccia 2 per Alexa555.
- Caricare la diapositiva sul palco e scegliere una sezione con una forte colorazione TH. Clicca su Live sul pannello Acquisizione.
- Nel pannello Canali, impostate la forza e il guadagno laser su livelli che massimizzano il segnale e limitano il rumore dallo sfondo. Utilizzare l'indicatore di intervallo per assicurarsi che i segnali non siano sovraesposti (come indicato da una sovrapposizione rosso scuro).
- Ripetere il passaggio precedente con più diapositive per assicurarsi che la colorazione sia coerente tra le diapositive in quanto la resistenza/guadagno del laser non può essere regolata tra le diapositive.
- Nella scheda Acquisizione selezionare la casella Posizioni.
- A questo punto, sei pronto per iniziare l'imaging. Utilizzando l'oculare, scegliete la prima sezione che mostra la colorazione TH positiva, impostate la messa a fuoco nel punto di interesse (cioè SNpc) e quindi spostate lo stadio sulla linea mediana della sezione. In questo modo viene salvata la posizione negli assi x, y e z e verrà etata una scansione del riquadro che cattura l'intera sezione.
- Ripetere il passaggio precedente per tutte le sezioni dell'SNpc fornendo un set completo di immagini dell'SNpc. Se è necessaria un'analisi dettagliata del lato non iniettato, i passaggi da 3.10 a 3.11 devono essere ripetuti impostando l'attenzione sul lato non iniettato.
4. Analisi e quantificazione delle immagini
- Separare i file di immagine utilizzando il software appropriato e importare file di immagine in un software di analisi automatica delle immagini.
- Definite un'area di interesse selezionando lo strumento di annotazione Penna per disegnare un'annotazione attorno all'SNpc.
NOTA: Nelle sezioni che hanno una grande quantità di perdita di neuroni dopaminergici, aumentare temporaneamente l'emettitore / assorbimento può aiutare a definire chiaramente l'SNpc (Figura 2). - Passare alla scheda Analisi e scegliere Ottimizzazione in tempo reale dal menu a discesa Analizza. In questo modo viene aperta una finestra separata sull'immagine della sezione che consente la modifica in tempo reale dei parametri di analisi (Figura 3).
- Nella sezione Ingrandimento analisi selezionare lo zoom dell'immagine appropriato.
- Nella sezione Rilevamento celle, selezionare il colorante nucleare come colorante utilizzato per la colorazione TH (Alexa Fluor 488).
- Regolare le impostazioni Soglia di contrasto nucleare, Intensità nucleare minima, Aggressività di segmentazionenucleare e Dimensioni nucleari, osservando attentamente la finestra Sintonizzazione in tempo reale.
NOTA: una rappresentazione accurata di ogni singola cella come singola cella nella finestra Sintonizzazione in tempo reale è vitale per l'accuratezza. Queste impostazioni sono su scala arbitraria a seconda del software utilizzato, ma è necessaria una corretta regolazione per consentire al software di distinguere accuratamente tra le singole celle e tra le celle e lo sfondo (Figura 3). - Ripetere questo processo con un minimo di 10 campioni separati per garantire un accordo uniforme su ciò che costituisce una cella in diverse sezioni.
NOTA: ulteriori marcatori di cella (come α-syn o NeuN) possono essere identificati all'interno della stessa piattaforma di analisi utilizzando le sezioni Marcatore 1 o Marcatore 2 nella scheda analisi. - Dopo aver campionato un numero appropriato di immagini e aver regolato di conseguenza l'ottimizzazione in tempo reale, salvare le impostazioni di analisi nel menu a discesa Azioni impostazioni.
- Selezionare tutte le immagini da analizzare e fare clic su Analizza.
- Scegliete l'impostazione di analisi appena salvata e nella finestra Regione di analisi selezionare la casella Livelli di annotazione. Quindi, selezionare Livello 1 e fare clic su Analizza.
NOTA: Per un singolo cervello, l'analisi richiede in genere circa 5 minuti. Il risultato completato mostrerà chiaramente ogni elemento che è stato conteggiato come cella (Figura 4). - Una volta completato, esportare i dati di analisi di riepilogo per tutte le sezioni. È disponibile un'opzione per esportare Object Analysis Data, che fornirà dati dettagliati, incluse le dimensioni delle celle di ogni singola cella rilevata. Questo set di dati potrebbe essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule in risposta a una tossina /terapeutica.
- Aggiungere le celle totali di ogni sezione analizzata per animale e l'area totale analizzata (mm2). Dividere il numero totale di celle per l'area totale analizzata per calcolare il numero di celle/mm2 nell'SNpc per ogni ratto
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Representative Results
Applicando i metodi di cui sopra al tessuto cerebrale raccolti 6 settimane dopo le iniezioni di AAV, abbiamo dimostrato che l'iniezione stereotassica di AAV che esprime mutante A53T α-syn (AAV-A53T) nell'SNpc del cervello del ratto si traduce in una significativa riduzione della densità dei neuroni dopaminergici rispetto all'iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) come controllo(Figura 5A, B). Il numero medio di neuroni TH-positivi/mm2 nell'SNpc dei ratti iniettati con AAV-EV era di 276,2 ± 34,7, e nell'SNpc dei ratti iniettati con AAV-A53T era 41,2 ± 17 (P = 0,0003). La quantificazione del numero di neuroni dopaminergici/mm2 nell'SNpc è simile ai rapportiprecedentemente pubblicati 10,11. Per i metodi qui descritti, sono state analizzate 4 sezioni sequenziali per animale. Studi precedenti hanno mostrato differenze significative con appena 3 sezioni, ma l'analisi può essere ulteriormente aumentata fino a 12 sezioni per comprendere l'intero SNpc a seconda del modello e dell'intervento studiato dallo sperimentatore.
La stereologia imparziale è stata eseguita anche come descritto in precedenza12 su un'altra serie di sezioni cerebrali degli stessi animali. Utilizzando questo metodo, abbiamo anche dimostrato che l'iniezione stereotassica di mutante A53T α-syn nell'SNpc del cervello del ratto si traduce in una significativa riduzione del numero totale stimato di neuroni TH-positivi nell'SNpc, rispetto all'iniezione di EV-AAV (Figura 5C). È importante sottolineare che c'era una forte correlazione tra la densità dei neuroni dopaminergici stimata utilizzando software di analisi automatica delle immagini e il numero di neuroni dopaminergici stimato utilizzando stereologia imparziale (r = 0,8819, P=0,0007) (Figura 5D).
Abbiamo anche applicato i nostri metodi utilizzando un software di analisi automatica delle immagini per determinare il numero di neuroni TH-positivi / mm2 sul lato non iniettato dei ratti iniettati con AAV-A53T o AAV-EV. Il numero medio di neuroni TH-positivi/mm2 nell'SNpc non iniettato dei ratti iniettati con AAV-A53T è stato di 123,2 ± 26,4, che era significativamente maggiore rispetto all'SNpc iniettato, che era 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331) (Figura supplementare 1A). Il numero medio di neuroni TH-positivi/mm2 nell'SNpc non iniettato dei ratti iniettati con AAV-EV (215,6 ± 35,5) non era significativamente diverso dall'SNpc iniettato (276,2 ± 34,7), confermando che non c'era degenerazione dovuta all'iniezione con AAV-EV (Figura supplementare 1B). La Corte ha calcolato questi risultati come percentuale di animali iniettati/non iniettati e ha riscontrato che gli animali iniettati con AAV-A53T avevano una riduzione del 69% rispetto agli animali AAV-EV(figura complementare 1C).
Figura 1: Flusso di lavoro del metodo. Flusso di lavoro che dimostra i passaggi necessari per iniettare AAV, sezione e tessuto di macchia, definire una regione di interesse e ottimizzare il software per il conteggio delle cellule. Immagini rappresentative della scansione confocale delle piastrelle, della definizione del ROI e della quantificazione delle celle. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Definizione della regione di interesse. (A) Sezione cerebrale coronale, compresa l'immunosomossa SNpc per TH (verde) da un ratto iniettato con AAV-A53T α-syn. Nei ratti con una grave neurodegenerazione (come mostrato qui), può essere difficile identificare l'SNpc. ( B )Aumentandotemporaneamente l'assorbimento dell'immagine può identificare la struttura e consentire un'accurata identificazione della regione di interesse. Barra di scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ottimizzazione del rilevamento delle cellule mediante il metodo citonucleare nell'HALO. La messa a punto in tempo reale del modulo citonucleare consente all'utente di vedere i cambiamenti nel rilevamento delle cellule in tempo reale alterando la soglia di contrasto nucleare, l'intensità nucleare minima, l'aggressività della segmentazione nucleare e le dimensioni nucleari. (A) Immagine rappresentativa con la regione di interesse visualizzata. (B) Sintonizzazione in tempo reale che mostra il sotto-campionamento in cui il software non rileva tutte le celle nella finestra di sintonizzazione. (C) Sovrasenalisi in cui il software rileva più cellule di quelle evidenti nella finestra di sintonizzazione. (D) Ottimizzazione in cui viene conteggiato il numero corretto di celle. Barra di scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Impostazioni ottimizzate halo all'interno di una regione di interesse definita. Immagini rappresentative dell'analisi completata utilizzando impostazioni ottimizzate per il rilevamento citonucleare in HALO. Barra di scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione del mutante umano A53T α-syn in SNpc provoca una grave neurodegenerazione a 6 settimane come quantificato da HALO e stereologia imparziale. (A) Immagini rappresentative che mostrano la degenerazione dei neuroni TH-positivi nell'SNpc 6 settimane dopo l'iniezione stereotassiva di AAV-A53T α-syn a un formicolio di 3,4 x 1012 particelle virali/mL. Colorazione immunofluorescente con anticorpi anti-TH (verde) e anti-α-syn (rosso). Barra di scala = 200 μm. (B) Quantificazione del numero di neuroni TH-positivi nell'SNpc dei ratti iniettati con AAV-A53T α-syn o AAV-EV dimostra che l'espressione di mutante α-syn si traduce in una significativa perdita di neuroni dopaminergici. Test t nonaccoppiato; n = 5 ratti/gruppo. Il grafico mostra ± SEM, ***P < 0,001. (C) Immagini rappresentative della colorazione colorimetrica dei neuroni dopaminergici nell'SNpc dei ratti iniettati AAV-A53T (a sinistra) o AAV-EV (a destra) utilizzati per eseguire stereologia imparziale. Barra di scala = 200 μm. (D) Una correlazione significativa tra il conteggio HALO dei neuroni TH-positivi/mm2 (asse y) e i numeri delle cellule stereologiche imparziali (asse x). Correlazione di Pearson (r = 0,8819, P = 0,0007). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Una significativa neurodegenerazione unilaterale è osservata nell'SNpc dei ratti che hanno ricevuto l'iniezione di AAV-A53T. (A) La quantificazione del numero di neuroni TH-positivi nell'SNpc iniettato o non iniettato di ratti che hanno ricevuto un'iniezione stereotattica unilaterale AAV-A53T mostra una significativa diminuzione sul lato iniettato. (B) La quantificazione del numero di neuroni TH-positivi nell'SNpc iniettato o non iniettato di ratti che hanno ricevuto un'iniezione stereotattica unilaterale AAV-EV non mostra cambiamenti significativi. (C) La normalizzazione al lato contralaterale non iniettato dimostra una diminuzione del >50% al momento dell'iniezione con AAV-A53T α-syn rispetto all'AAV-EV. Test t nonaccoppiato; n = 5 ratti/gruppo. I grafici mostrano la ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Clicca qui per scaricare questa figura supplementare.
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Discussion
La valutazione affidabile dell'integrità del sistema dopaminergico nei modelli preclinali di PD è fondamentale per determinare l'efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Pertanto, è importante controllare e ridurre al minimo le potenziali confusioni che possono ridurre l'affidabilità e la riproducibilità dei dati istopatologici. Risultati quantitativi accurati possono fornire più informazioni rispetto alle sole descrizioni qualitative o semi-quantitative. Allo stesso tempo, dobbiamo riconoscere che i vincoli nel tempo e nelle risorse possono rendere difficile eseguire conteggi stereologici imparziali per quantificare i cambiamenti patologici o la perdita di cellule. Tuttavia, con i recenti progressi, molti di questi criteri possono essere soddisfatti utilizzando piattaforme di imaging computerizzate e automatizzate6.
Questo protocollo descrive una serie di passaggi importanti nel determinare la stima stereologica dei neuroni dopaminergici / mm2 nel cervello dei roditori. Va notato che abbiamo usato l'iniezione stereotassiva per fornire AAV all'SNpc, che attribuisce importanza alla consegna accurata di questi virus al fine di determinare l'effetto di qualsiasi trattamento. Le coordinate utilizzate per il nostro studio sono bregma -5,2 mm (anteriore-posteriore), -2 mm (mediale-laterale a destra) e -7,5 mm (ventrale dorsale dal cranio) su ratti femmine adulti del peso di ~ 275 g. La corretta consegna del virus utilizzando queste coordinate garantirà la consegna degli AAV all'SNpc.
Inoltre, è necessario prestare attenzione quando si preparano i tessuti per la colorazione. In primo luogo, occorre fare attenzione a contrassegnare quale lato è quello destro/sinistro. Nelle nostre mani, il più semplice e più
modo riproducibile per farlo era usare un ago 25G per colpire periodicamente un buco nel midbrain dorsale sinistro mentre identificava il lato non iniettato. Una conoscenza approfondita delle regioni neuroanatomiche del cervello dei roditori è importante per differenziare quando iniziare a tagliare e in seguito identificare l'SNpc quando si disegna una regione di interesse. È importante notare che la colorazione TH non macchia esclusivamente i neuroni dell'SNpc, e si dovrebbe essere in grado di distinguere tra neuroni TH-positivi nell'area tegmentale ventrale e campo retrorubale. Un atlante cerebrale del ratto è una guida utile per coloro che non hanno esperienza nella neuroanatomia dei roditori. I tempi di incubazione degli anticorpi sono uniformi in tutto il protocollo e la messa a fuoco è impostata nel tempo minimo possibile per evitare il fotobleaching.
C'è una bassa variabilità tra i campioni una volta che le caratteristiche neuroanatomiche coerenti sono utilizzate per distinguere tra le sezioni. Avere un osservatore esperto e accecato disegnare la regione di interesse è importante per mantenere la coerenza tra le sezioni da analizzare. L'analisi del lato non iniettato, come mostrato nella figura complementare 1, dimostra che esiste una coerenza nel metodo. Tuttavia, occorre prestare attenzione quando si interpretano i dati in questo modo. Il cervello affettato si basa costantemente sul confronto della presenza di caratteristiche neuroanatomiche note su ciascun lato del cervello. Sottili differenze possono significare che il lato non iniettato su una data sezione può essere più posteriore / anteriore del lato iniettato, e quindi non un confronto diretto accurato. Un'ulteriore analisi dei dati presentati evidenzia una limitazione di questo metodo. C'è un grande grado di variabilità nel numero di neuroni dopaminergici nel lato non iniettato (123,2 nel gruppo AAV-A53T vs 215,6 nell'AAV-EV), che non ci si aspetterebbe tra animali di età simile. Ci sono una serie di possibili ragioni per questa discrepanza, tra cui le piccole dimensioni del campione utilizzate in questo studio e le differenze anatomiche sopra menzionate da un lato all'altro. Inoltre, la messa a fuoco per il segnale fluorescente è impostata sul lato iniettato, il che significa che un leggero spostamento nel piano Z può lasciare il lato non iniettato fuori fuoco, e quindi alcune celle non saranno rilevabili dal software di conteggio delle celle. Per questo motivo, si consiglia di confrontare il numero di neuroni dopaminergici / mm2 da un lato usando caratteristiche neuroanatomiche note e dove è stata messa a fuoco il microscopio specificamente per questa regione. Se è necessario un confronto con il lato non iniettato, l'imaging deve essere ripetuto con lo stato attivo impostato su questo lato.
Presentiamo i dati ottenuti e analizzati con uno dei numerosi pacchetti software che forniscono analisi quantitativa delle immagini con una formazione minima degli utenti13. Altri programmi sono disponibili e sono sempre più adottati per studiare la neuropatologia, compresa la quantificazione della perdita di neuroni dopaminergici nei modelli sperimentali di PD6. Mentre alcuni offrono algoritmi integrati per eseguire funzioni specifiche (ad esempio, il conteggio della placca amiloide), molti dei pacchetti software condividono diverse funzionalità comuni che li rendono particolarmente utili per i laboratori che eseguono analisi ripetitive. Oltre all'identificazione della regione di interesse, i passaggi di pre-elaborazione che interferiscono con il segnale (pieghe dei tessuti, artefatti dei bordi, segni di inchiostro, macchie, ecc.) possono essere rimossi dalla regione di interesse con strumenti manuali e di riconoscimento dei modelli. Inoltre, le letture fornite possono essere utilizzate in combinazione con valori quantitativi ottenuti da studi proteici, cellulari o comportamentali per esplorare relazioni e potenziali correlazioni tra variabili.
Il metodo sopra descritto fornisce una procedura accurata, semi-quantitativa e relativamente economica per stimare i numeri dei neuroni nelle sezioni cerebrali immunoistochimicamente macchiate. La funzione di sintonizzazione in tempo reale consente l'adattamento del metodo per tutte le sezioni e garantisce coerenza anche con lievi variazioni nei metodi di affezione. Avere un osservatore accecato identificare le regioni di interesse nell'SNpc mitiga i pregiudizi di conferma o selezione e il software fornisce una semplice lettura che consente il calcolo dei neuroni / mm2. Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per fornire conteggi accurati dei neuroni in diverse regioni cerebrali, mantenendo al contempo efficienza e vantaggi in termini di costi rispetto ai protocolli stereologici più stabiliti. L'avanzamento della tecnologia di scansione delle diapositive per sezioni più spesse consentirebbe anche tempi di elaborazione più efficienti per il metodo sopra descritto.
Limitazioni
Il metodo descritto ha una serie di vantaggi distinti nella sua velocità e capacità di rilevare grandi cambiamenti nella densità dei neuroni, ma pone anche le proprie sfide. A differenza della stereologia, il metodo non può fornire una stima dei numeri di cella assoluti, ma calcola invece la densità cellulare all'interno dell'SNpc. Le stime della densità cellulare sono altamente, ma non perfettamente, correlate con i numeri di cellulare ottenuti usando una stereologia imparziale. Inoltre, il metodo si basa sull'ottimizzazione delle dimensioni e della forma delle celle da parte dell'utente prima di iniziare l'analisi. Ciò non può garantire che le celle non vengano perse a causa della loro parziale posizione nel piano focale o che le celle di dimensioni e/o forme insolite vengano perse dal software. Nell'esperienza degli autori, il metodo è particolarmente utile per esaminare l'efficacia di potenziali terapie che modificano la malattia nei modelli preclinali dei roditori. In conclusione, mentre i metodi stereologici per quantificare il numero di cellule rimangono ampiamente utilizzati nelle neuroscienze, la rapida accelerazione della digitalizzazione suggerisce che saranno sempre più adottate piattaforme automatizzate di analisi delle immagini per studiare la neuropatologia, in particolare mentre continuano a migliorare. È importante che lo sperimentatore comprenda i limiti tecnici di questo approccio e applichi questa metodologia dopo un'attenta considerazione.
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Disclosures
Gli autori non segnalano interessi contrastanti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano tutto lo staff dell'Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) di University Health Network per il loro tempo e la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
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