Summary
Her presenterer vi en automatisert metode for semi-kvantitativ bestemmelse av dopaminerg nevron nummer i rotte substantia nigra pars compacta.
Abstract
Estimering av antall dopaminerge nevroner i substantia nigra er en nøkkelmetode i preklinisk Parkinsons sykdomsforskning. For tiden er objektiv stereologisk telling standarden for kvantifisering av disse cellene, men det forblir en arbeidskrevende og tidkrevende prosess, som kanskje ikke er mulig for alle prosjekter. Her beskriver vi bruken av en bildeanalyseplattform, som nøyaktig kan estimere mengden merkede celler i et forhåndsdefinert interesseområde. Vi beskriver en trinnvis protokoll for denne analysemetoden i rottehjernen og viser at den kan identifisere en betydelig reduksjon i tyrosinhydroksylase positive nevroner på grunn av uttrykk for mutant α-synuklein i substantia nigra. Vi validerte denne metodikken ved å sammenligne med resultater oppnådd ved objektiv stereologi. Samlet gir denne metoden en tidseffektiv og nøyaktig prosess for å oppdage endringer i dopaminerge nevrontall, og er dermed egnet for effektiv bestemmelse av effekten av intervensjoner på celleoverlevelse.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er en utbredt nevrodegenerativ bevegelsesforstyrrelse preget av tilstedeværelsen av proteinaggregater som inneholder α-synuklein (α-syn) og det foretrukne tapet av dopaminerge nevroner i substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kvantifisering av dopaminergt nevronnummer er en viktig del av PD-forskning, da det tillater evaluering av integriteten til nigrostriatalsystemet, og gir dermed et viktig endepunkt for å vurdere effektiviteten av potensielle sykdomsmodifiserende terapeutiske midler. For tiden er standarden for kvantifisering av cellenummer objektiv stereologisk telling, som benytter todimensjonale (2D) tverrsnitt av vev for å estimere volumetriske egenskaper i tredimensjonale (3D) strukturer2,3,4. Moderne designbaserte stereologiske metoder benytter omfattende tilfeldige prøvetakingsprosedyrer og bruker telleprotokoller (kjent som sonder) for å unngå potensielle artefakter og systematiske feil, noe som gir pålitelig deteksjon av forskjeller bare litt større enn variasjon mellom dyr5. Mens stereologi gir et kraftig analytisk verktøy for in vivo histologiske studier, er det tidkrevende, antar ensartet prøvepreparering, og krever validering på flere trinn, noe som kan påvirke effektiviteten som i økende grad kreves for preklinisk translasjonell undersøkelse.
Nylige teknologiske fremskritt innen digital vitenskap gjør det mulig å ta i bruk nye applikasjoner for mer effektive vurderinger av patologi uten stereomikroskop, samtidig som det fyller et behov som surrogat av objektiv stereologi. Disse metodene øker hastigheten, reduserer menneskelig feil og forbedrer reproduserbarheten av stereologiske teknikker6,7. HALO er en slik bildeanalyseplattform for kvantitativ vevsanalyse i digital patologi. Den består av en rekke forskjellige moduler og rapporterer morfologiske og multipleksede uttrykksdata på celle-for-celle-basis på tvers av hele vevsseksjoner ved hjelp av mønstergjenkjenningsalgoritmer. Cytonuclear FL-modulen måler immunfluorescerende positivitet av fluorescerende markører i kjernen eller cytoplasma. Dette gjør det mulig å rapportere antall celler som er positive for hver markør, og intensitetspoengsummen for hver celle. Modulen kan tilpasses for å gi individuelle cellestørrelser og intensitetsmålinger, selv om denne funksjonen ikke er nødvendig for kvantifisering av dopaminerge nevroner.
Målet med denne studien er å verifisere denne metoden med en tidligere validert viral vektorbasert α-syn rottemodell av nigral nevrodegenerasjon8,9,10. I denne modellen uttrykkes human mutant A53T α-syn i SNpc ved stereotaktisk injeksjon av adeno-assosiert virushybrid serotype 1/2 (AAV1/2), noe som resulterer i betydelig nevrodegenerasjon over en periode på 6 uker. Den kontralaterale uinjiserte SNpc kan i noen studier fungere som en intern kontroll for den injiserte siden. Oftere brukes injeksjon av AAV-Empty Vector (AAV-EV) i en kontrollkohort av dyr som en negativ kontroll. Vi presenterer en trinnvis guide for å estimere tettheten av dopaminerge nevroner som gjenstår i den injiserte SNpc etter 6 uker ved hjelp av en automatisert bildeanalyseprogramvare (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av University Health Network Animal Care Committee og utført i samsvar med retningslinjer og forskrifter fastsatt av Canadian Council on Animal Care.
1. Stereotaktisk injeksjon
- Parhus voksne kvinnelige Sprague-Dawley rotter (250-280 g) i bur med tre sengetøy og ad lib tilgang til mat og vann. Vedlikehold dyrekolonien i en vanlig 12 timers lys/mørk syklus (lys på 06:30) med konstant temperatur og fuktighet.
- Utfør ensidig stereotaktisk injeksjon av AAV direkte til SNpc på høyre side av hjernen (høyre eller venstre side, i henhold til preferansene til hvert laboratorium) som tidligere beskrevet8,10. Injiser 2 μL AAV1/2 ved en endelig titer på 3,4 x 1012 genomiske partikler/ml.
2. Hjerneseksjon og immunhiistokjemi (IHC)
- Bedøv rotten med 5% isofluran ved å plassere i et bedøvelseskammer i 3 min. Andre godkjente metoder kan brukes til dette trinnet etter passende institusjonell gjennomgang.
- Når rotten har nådd et kirurgisk plan med dyp anestesi, overfør den til en nesekegle fast festet til et nekropsibord. Sikre rottens forpoter ved hjelp av tape og bruk tåklemmeresponsmetode for å bestemme dybden på anestesi. Dyret må ikke svare før du fortsetter.
- Lag et lateralt snitt under brystbenet og kutt gjennom membranen langs hele lengden av ribbeburet for å eksponere pleuralhulen. Løft og klem brystbenet med en hemostat og plasser over hodet.
- Klem hjertet ved hjelp av tang og sett inn en sommerfuglnål koblet til en perfusjonspumpe i den bakre enden av venstre ventrikel. Perfuse rotte transkardielt med 150 ml heparinisert saltvann, eller til øynene og huden er klare. Perfusjon med 4% paraformaldehyd (PFA), i stedet for saltvann, kan foretrekkes for å lette immunisering med visse antistoffer eller tynnere hjerneseksjon.
- Når perfusjonen er fullført, halshugger du med en giljotin og trekker hjernen ut til en hjernematrise, ventral overflate vendt opp.
- Bruk et friskt barberblad, lag et kutt i koronalplanet 2 mm rostral til den optiske chiasmen. Skyv bladet fra side til side for å unngå å fordreier hjernen under kutting.
- Senk den bakre delen av hjernen ned i et forhåndsmerket hetteglass som inneholder ca. 20 ml 4 % PFA i 48 timer etter fiksering ved romtemperatur. Den fremre delen av hjernen kan blinke frosset i 2-metylbutan kjølt til -42 °C før lagring ved -80 °C.
- Etter 48 timer overfører du de faste hjernene til et merket hetteglass som inneholder 30% sukrose i fosfatbufret saltvann (PBS) og lagres ved 4 °C til de synker (48-72 timer).
- Forbered en mikrotom ved å plassere tørris i prøvestadiet, etterfulgt av 100% etanol. Når scenen er avkjølt, klem optimal skjæretemperatur (OCT) på scenen til den danner en sirkel 2 cm i diameter og 0,5 cm tykk. Når den har delvis frosset, senk hjernen forsiktig ned på haugen av OCT, og sørg for at striatal skjæreflaten forblir parallell med scenen.
- Tilsett mer tørris på scenen for å hjelpe hjernen til å fryse. Når hjernen har slått en kremfarge, fjern scenen med tørris.
- Stikk et hull inn i høyre side av hjernen med en 25G nål for å skille mellom høyre og venstre halvkule. Pass på at du ikke passerer nålen gjennom anatomiske strukturer av interesse.
- Klipp serielt 40 μm seksjoner i koronalplanet som begynner ved bregma -3,8 og slutter ved bregma -6,8.
- Oppbevar seks serier i merkede rør med frostvæskeoppløsning (40 % PBS, 30 % 2-ethoxyetanol, 30 % glyserol). Hver serie skal inneholde 12 hjerneseksjoner.
- Velg ett sett med seksjoner for immunhiistokjemisk farging, og vask av frostvæskeoppløsning med 3 x 10 min vasker i 0,2% PBS-T.
- Blokker i 1 time ved RT med skånsom muttering i blokkeringsløsning (10% normalt geiteserum (NGS), 2% bovint serumalbumin (BSA) i 0,2% PBS-T). Følg dette med inkubasjon med kanin anti-tyrosinhydroksylase (TH) antistoff (1:500) og mus anti-α-syn antistoff (1:500) i 2% NGS i 0,2% PBS-T over natten ved romtemperatur.
- Vask av primær antistoff med 3 x 5 min vasker i 0,2% PBS-T, etterfulgt av 1 t inkubasjon med geit anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundært antistoff (1:500) og geit antimus Alexa Fluor 555 sekundært antistoff i 2% NGS i 0,2% PBS-T. Sørg for at seksjonene er beskyttet mot lys og mutter forsiktig.
- Vask av sekundært antistoff med 3 x 5 min vasker i 0,2% PBS-T og monter hele settet med seksjoner på lysbilder beskyttet mot lys og støv ved hjelp av en smal pensel. Dekslerlip med fluorescens monteringsmedium og tetning med klar neglelakk.
3. Konfektmikroskopi og bildeanskaffelse
- Ta IHC-bilder ved hjelp av programvare koblet til et konfokalt mikroskop med 10x forstørrelse. Åpne hullhullet til 1,5 AU for å fange et bredt plan på totalt ~ 1,5 μm og sett fokus på den injiserte siden av hjernen.
- I kategorien Anskaffelse merker du av for Bildebehandling ved sideskanning og setter dimensjonene til 10 x 4.
- Sett Zoom til 1.1 under Panelet for anskaffelsesmodus. Dette bidrar til å unngå åpenbare sømmerker mellom flisskanningsbilder.
- Sett rammestørrelsen til 1024 x 1024 piksler og gjennomsnittet til 2 for å sikre bildeinnhenting av høy kvalitet.
- Sett spor 1 til Alexa488 i kanalpanelet, og spor 2 til Alexa555.
- Legg lysbildet på scenen og velg en seksjon med sterke TH-flekker. Klikk på Live på Acquisition-panelet.
- I kanalpanelet setter du laserstyrken og forsterkningen til nivåer som maksimerer signalet og begrenser støy fra bakgrunnen. Bruk områdeindikatoren til å sikre at signalene ikke er overeksponert (som angitt av et mørkrødt overlegg).
- Gjenta trinnet ovenfor med flere lysbilder for å sikre at fargingen er konsistent mellom lysbildene, da laserstyrken/forsterkningen ikke kan justeres mellom lysbildene.
- Merk av for Stillinger i kategorien Anskaffelse.
- På dette tidspunktet er du klar til å begynne å forestille deg. Bruk okularet til å velge den første delen som viser positiv TH-farging, sett fokus på interessepunktet (dvs. SNpc) og flytt deretter scenen til midtlinjen i delen. Dette sparer posisjonen i x-, y- og z-aksene, og vil avbilde en flisskanning som fanger hele delen.
- Gjenta trinnet ovenfor for alle seksjoner gjennom SNpc, noe som gir et komplett sett med bilder av SNpc. Hvis det er nødvendig med detaljert analyse av den uinnfelte siden, bør trinn 3.10 til 3.11 gjentas ved å sette fokus på den uinninnvidde siden.
4. Bildeanalyse og kvant mengder
- Skill bildefiler ved hjelp av riktig programvare og importer bildefiler til automatisert bildeanalyseprogramvare.
- Definer et interesseområde ved å velge pennemerknadsverktøyet for å tegne en merknad rundt SNpc.
MERK: I seksjoner som har en stor mengde dopaminerge nevrontap, kan midlertidig økning av emittance/absorpsjon bidra til å tydelig definere SNpc (figur 2). - Gå til kategorien Analyse , og velg Sanntidsjusteringpå Analyse -menyen. Dette åpner et eget vindu på seksjonsbildet som gjør det mulig å endre analyseparametere i sanntid (figur 3).
- Velg riktig bildezoom under Analyseforstørrelse.
- Under Celledeteksjon-delen velger du kjernefysisk fargestoff som fargestoffet som brukes til TH-farging (Alexa Fluor 488).
- Juster innstillingene for kjernefysisk kontrast, Minimum kjernefysisk intensitet, Aggressivitet for kjernefysisk segmenteringog Kjernefysisk størrelse mens du ser nøye på sanntidsjusteringsvinduet.
MERK: Nøyaktig representasjon av hver enkelt celle som en enkelt celle i sanntidsjusteringsvinduet er avgjørende for nøyaktigheten. Disse innstillingene er i vilkårlig skala avhengig av programvaren som brukes, men riktig justering er nødvendig for at programvaren skal kunne skille nøyaktig mellom enkeltceller og mellom celler og bakgrunnen (figur 3). - Gjenta denne prosessen med minst 10 separate prøver for å sikre en ensartet avtale om hva som utgjør en celle på tvers av forskjellige seksjoner.
MERK: Flere cellemarkører (for eksempel α-syn eller NeuN) kan identifiseres i samme analyseplattform ved hjelp av 1- eller 2-delene i analysefanen. - Når et passende antall bilder er samplet og sanntidsjustering er justert tilsvarende, lagrer du analyseinnstillingene i rullegardinmenyen Innstillingshandlinger.
- Velg alle bilder som skal analyseres, og klikk Analyser.
- Velg analyseinnstillingen du nettopp har lagret, og merk av for Merknadslag i Analyseområde-vinduet. Deretter merker du av for Lag 1 og klikker Analyser.
MERK: For en enkelt hjerne tar analysen vanligvis ca. 5 minutter. Det fullførte resultatet viser tydelig hvert element som er telt opp som en celle (Figur 4). - Når du er ferdig, eksporterer du sammendragsanalysedataene for alle seksjoner. Det finnes et alternativ for å eksportere objektanalysedata, som gir detaljerte data, inkludert cellestørrelsen til hver enkelt celle som oppdages. Dette datasettet kan brukes til å undersøke endringer i cellestørrelse som svar på et giftstoff/terapeutisk.
- Legg til totalcellene fra hver inndeling analysert per dyr og det totale analyserte området (mm2). Del det totale antallet celler etter det totale området som analyseres for å beregne antall celler/mm2 i SNpc for hver rotte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke metodene ovenfor på hjernevev samlet inn 6 uker etter AAV-injeksjoner, viste vi at stereotaktisk injeksjon av AAV som uttrykker mutant A53T α-syn (AAV-A53T) i SNpc av rottehjerne resulterer i en betydelig reduksjon i tettheten av dopaminerge nevroner sammenlignet med injeksjon av tom vektor AAV (AAV-EV) som en kontroll (Figur 5A, B). Gjennomsnittlig antall TH-positive nevroner/mm2 i SNpc av rotter injisert med AAV-EV var 276,2 ± 34,7, og i SNpc av rotter injisert med AAV-A53T var 41,2 ± 17 (P = 0,0003). Kvantifisering av antall dopaminerge nevroner/mm2 i SNpc ligner tidligere publiserte rapporter10,11. For metodene som er beskrevet her, ble 4 sekvensielle seksjoner per dyr analysert. Tidligere studier har vist signifikante forskjeller med så lite som 3 seksjoner, men analysen kan ytterligere økes opp til 12 seksjoner for å omfatte hele SNpc avhengig av modellen og intervensjonen som undersøkes av undersøkeren.
Objektiv stereologi ble også utført som tidligere beskrevet12 på et annet sett med hjerneseksjoner fra de samme dyrene. Ved hjelp av denne metoden viste vi også at stereotaktisk injeksjon av mutant A53T α-syn i SNpc av rottehjerne resulterer i en betydelig reduksjon i estimert totalt antall TH-positive nevroner i SNpc, sammenlignet med injeksjon av EV-AAV (Figur 5C). Det var viktig at det var en sterk sammenheng mellom den dopaminerge nevrontettheten som ble estimert ved hjelp av automatisert bildeanalyseprogramvare og dopaminerge nevrontall estimert ved hjelp av objektiv stereologi (r = 0,8819, P = 0,0007) (figur 5D).
Vi brukte også metodene våre ved hjelp av automatisert bildeanalyseprogramvare for å bestemme antall TH-positive nevroner / mm2 på den uinjiserte siden av rotter injisert med AAV-A53T eller AAV-EV. Gjennomsnittlig antall TH-positive nevroner/mm2 i den uinjiserte SNpc av rotter injisert med AAV-A53T var 123,2 ± 26,4, som var betydelig større enn i den injiserte SNpc, som var 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331) (Tilleggsfigur 1A). Gjennomsnittlig antall TH-positive nevroner/mm2 i den uinjiserte SNpc av rotter injisert med AAV-EV (215,6 ± 35,5) var ikke signifikant forskjellig fra den injiserte SNpc (276,2 ± 34,7), noe som bekreftet at det ikke var noen degenerasjon på grunn av injeksjon med AAV-EV (Supplementary Figure 1B). Vi beregnet disse resultatene som en prosentandel av injisert/uinjisert og fant at dyr injisert med AAV-A53T hadde en 69% reduksjon sammenlignet med AAV-EV dyr (Supplerende figur 1C).
Figur 1: Metodens arbeidsflyt. Arbeidsflyt som viser trinnene som kreves for å injisere AAVer, seksjon og flekkvev, definere en interesseregion og optimalisere programvaren for telling av celler. Representative bilder av konfikal flisskanning, avkastningsdefinisjon og mengde celler. Skalastang = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Definere interesseområdet. (A) Coronal hjerneseksjon, inkludert SNpc immunostained for TH (grønn) fra en rotte injisert med AAV-A53T α-syn. Hos rotter med alvorlig nevrodegenerasjon (som vist her), kan det være vanskelig å identifisere SNpc. (B) Midlertidig øke absorpsjonen av bildet kan identifisere strukturen og tillate en nøyaktig identifikasjon av interesseområdet. Skalastang = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optimalisere celledeteksjon ved hjelp av Cytonuclear-metoden i HALO. Sanntidsjustering av cytonuklearmodulen gjør det mulig for brukeren å se endringer i celledeteksjon i sanntid ved å endre kjernefysisk kontrastterskel, minimum kjernefysisk intensitet, kjernefysisk segmenterings aggressivitet og kjernefysisk størrelse. (A) Representativt bilde med interesseområde vist. (B) Sanntidsjustering som viser underprøvetaking der programvaren ikke oppdager alle cellene i innstillingsvinduet. (C) Overprøvetaking der programvaren oppdager flere celler enn det som er tydelig i innstillingsvinduet. (D) Optimalisert innstilling der riktig antall celler telles. Skalastang = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: HALO-optimaliserte innstillinger innenfor et definert interesseområde. Representative bilder av fullført analyse ved hjelp av optimaliserte innstillinger for cytonukleær deteksjon i HALO. Skalastang = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Uttrykk for human mutant A53T α-syn i SNpc resulterer i alvorlig nevrodegenerasjon ved 6 uker som kvantifisert av HALO og objektiv stereologi. (A) Representative bilder som viser degenerasjon av TH-positive nevroner i SNpc 6 uker etter stereotaktisk injeksjon av AAV-A53T α-syn ved en titer på 3,4 x 1012 virale partikler / ml. Immunfluorescerende farging med anti-TH (grønn) og anti-α-syn (røde) antistoffer. Skala bar = 200 μm. (B) Kvantifisering av antall TH-positive nevroner i SNpc av rotter injisert med AAV-A53T α-syn eller AAV-EV demonstrerer at uttrykk for mutant α-syn resulterer i betydelig dopaminerg nevron tap. Ubetalt t-test; n = 5 rotter/gruppe. Grafen viser gjennomsnittlig ± SEM, ***P < 0,001. (C) Representative bilder av kolorimetrisk farging av dopaminerge nevroner i SNpc av AAV-A53T (venstre) eller AAV-EV (høyre) injiserte rotter som brukes til å utføre objektiv stereologi. Skalastang = 200 μm. (D) En signifikant sammenheng mellom HALO-telling av TH-positive nevroner/mm2 (y-akse) og objektive stereologicellenumre (x-akse). Pearson korrelasjon (r = 0,8819, P = 0,0007). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Signifikant ensidig nevrodegenerasjon observeres i SNpc av rotter som fikk AAV-A53T injeksjon. (A) Kvantifisering av antall TH-positive nevroner i injisert eller uinjisert SNpc av rotter som fikk en ensidig AAV-A53T stereotaktisk injeksjon viser en betydelig reduksjon på den injiserte siden. (B) Kvantifisering av antall TH-positive nevroner i injisert eller uinjisert SNpc av rotter som fikk ensidig AAV-EV stereotaktisk injeksjon viser ingen signifikante endringer. (C) Normalisering til den uinjiserte kontralaterale siden viser en >50% reduksjon ved injeksjon med AAV-A53T α-syn sammenlignet med AAV-EV. Ubetalt t-test; n = 5 rotter/gruppe. Grafer viser gjennomsnittlig ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Klikk her for å laste ned denne tilleggsfiguren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den pålitelige vurderingen av integriteten til det dopaminerge systemet i prekliniske modeller av PD er avgjørende for å bestemme effektiviteten av potensielle sykdomsmodifiserende terapeutiske midler. Derfor er det viktig å kontrollere og minimere potensielle konfunderinger som kan redusere påliteligheten og reproduserbarheten av histopatologiske data. Forsiktige kvantitative resultater kan gi mer informasjon enn kvalitative eller semi-kvantitative beskrivelser alene. Samtidig må vi erkjenne at begrensninger i tid og ressurser kan gjøre det vanskelig å utføre objektivt stereologisk telling for å kvantisere patologiske endringer eller tap av celler. Men med nylige fremskritt kan mange av disse kriteriene oppfylles ved hjelp av datastyrte og automatiserte bildeplattformer6.
Denne protokollen beskriver en rekke viktige trinn for å bestemme den stereologiske beregningen av dopaminerge nevroner / mm2 i gnagerhjernen. Det skal bemerkes at vi brukte stereotaktisk injeksjon for å levere AAVs til SNpc, som legger vekt på nøyaktig levering av disse virusene for å bestemme effekten av enhver behandling. Koordinatorene som brukes til studien vår er bregma -5,2 mm (fremre-posterior), -2 mm (medial-lateral til høyre) og -7,5 mm (dorsal ventral fra skallen) på voksne kvinnelige rotter som veier ~ 275 g. Korrekt levering av viruset ved hjelp av disse koordinatene vil sikre levering av AAVene til SNpc.
I tillegg til dette må det tas hensyn til når du forbereder vev for farging. Først og fremst bør det tas hensyn til hvilken side som er høyre / venstre. I våre hender er den enkleste og mest
reproduserbar måte å gjøre dette på var å bruke en 25G nål til å stikke et hull med jevne mellomrom i venstre dorsal midbrain mens du identifiserer den uinjiserte siden. En inngående kunnskap om de nevroanatomiske områdene i gnagerhjernen er viktig for å skille når du skal begynne å kutte, og senere å identifisere SNpc når du tegner en region av interesse. Det er viktig å merke seg at TH-farging ikke utelukkende flekker nevroner av SNpc, og man skal kunne skille mellom TH-positive nevroner i det ventrale tegmentalområdet og retrorubalfeltet. Et rottehjerneatlas er en nyttig guide for de som mangler erfaring i gnager nevroanatomi. Antistoffinkubasjonstider er ensartede gjennom hele protokollen, og fokuset er satt på minimumstid for å unngå fotobleaching.
Det er lav variasjon mellom prøver når konsekvente nevroanatomiske egenskaper brukes til å skille mellom seksjoner. Å ha en erfaren, blindet observatør trekker interesseområdet er viktig for å opprettholde konsistens på tvers av seksjonene som skal analyseres. Analyse av den uinjiserte siden som vist i supplerende figur 1 viser at det er en konsistens i metoden. Det bør imidlertid utvises forsiktighet ved tolkning av data på denne måten. Kutting av hjerner er konsekvent avhengig av å sammenligne tilstedeværelsen av kjente nevroanatomiske egenskaper på hver side av hjernen. Subtile forskjeller kan bety at den uinjiserte siden på en gitt seksjon kan være mer bakre/fremre enn den injiserte siden, og dermed ikke en nøyaktig direkte sammenligning. Videre analyse av de presenterte dataene fremhever en begrensning av denne metoden. Det er en stor grad av variasjon i de dopaminerge nevrontallene i den uinjiserte siden (123,2 i AAV-A53T-gruppen vs. 215,6 i AAV-EV), som man ikke ville forvente mellom tilsvarende aldrende dyr. Det er en rekke mulige årsaker til dette avviket, inkludert den lille prøvestørrelsen som brukes i denne studien og de ovennevnte anatomiske forskjellene fra side til side. I tillegg til dette er fokus for fluorescerende signal satt på den injiserte siden, noe som betyr at et lite skifte i z-planet kan forlate den uinnintederte siden ute av fokus, og dermed vil noen celler ikke kunne påvises av celletellingsprogramvaren. Av denne grunn anbefales det å sammenligne antall dopaminerge nevroner / mm2 på den ene siden ved hjelp av kjente nevroanatomiske egenskaper, og hvor det er satt fokus på mikroskopet spesielt for denne regionen. Hvis det er behov for en sammenligning med den uinninnvidde siden, bør avbildning gjentas med fokus på denne siden.
Vi presenterer data innhentet og analysert med en av de flere programvarepakkene som gir kvantitativ bildeanalyse med minimal brukeropplæring13. Andre programmer er tilgjengelige og blir i økende grad vedtatt for å studere nevropatologi, inkludert kvantifisering av dopaminerg nevrontap i eksperimentelle modeller av PD6. Mens noen tilbyr innebygde algoritmer for å utføre spesifikke funksjoner (f.eks. antall amyloidplakk), deler mange av programvarepakkene flere vanlige funksjoner som gjør dem spesielt nyttige for laboratorier som utfører repeterende analyser. I tillegg til område av interesseidentifikasjon, kan forbehandlingstrinn som forstyrrer signalet (vevsfolder, kantartefakter, blekkmerker, flekker, etc.) fjernes fra interesseområdet ved hjelp av manuelle verktøy og mønstergjenkjenningsverktøy. Videre kan de oppgitte avlesningene brukes sammen med kvantitative verdier hentet fra protein-, cellulære eller atferdsstudier for å utforske sammenhenger og potensielle sammenhenger mellom variabler.
Metoden beskrevet ovenfor gir en nøyaktig, semi-kvantitativ og relativt billig prosedyre for å estimere nevrontall i immunhiistokjemisk fargede hjerneseksjoner. Sanntidsjusteringsfunksjonen gjør det mulig å tilpasse metoden for alle seksjoner og sikrer konsistens selv med små variasjoner i kuttemetoder. Å ha en blindet observatør identifiserer interesseområder i SNpc reduserer bekreftelses- eller utvalgsbias, og programvaren gir en enkel avlesning som tillater beregning av nevroner / mm2. Denne metoden kan enkelt tilpasses for å gi nøyaktige tellinger av nevroner i forskjellige hjerneregioner, samtidig som effektiviteten og kostnadsfordelene opprettholdes i forhold til mer etablerte stereologiske protokoller. Fremskritt av lysbildeskanningsteknologi for tykkere seksjoner vil også gi mer effektiv behandlingstid for den ovenfor beskrevne metoden.
Begrensninger
Metoden som er beskrevet har en rekke klare fordeler i sin hastighet og evne til å oppdage store endringer i nevrontetthet, men utgjør også sine egne utfordringer. I motsetning til stereologi kan ikke metoden gi en estimering av absolutte cellenumre, men beregner i stedet celletetthet i SNpc. Estimatene for celletetthet er svært, men ikke perfekt, korrelert med cellenumre oppnådd ved hjelp av objektiv stereologi. I tillegg er metoden avhengig av å justere cellestørrelse og form av brukeren før analysen begynner. Dette kan ikke garantere at celler ikke vil bli savnet på grunn av å være delvis i fokusplanet, eller at celler av uvanlig størrelse og / eller form vil bli savnet av programvaren. Etter forfatternes erfaring er metoden spesielt nyttig for å undersøke effekten av potensielle sykdomsmodifiserende terapeutiske behandlinger i prekliniske gnagermodeller. Til slutt, mens stereologiske metoder for å kvantifisere celletall forblir mye brukt i nevrovitenskap, antyder den raske akselerasjonen av digitalisering at automatiserte bildeanalyseplattformer i økende grad vil bli vedtatt for å studere nevropatologi, spesielt etter hvert som de fortsetter å forbedre seg. Det er viktig at undersøkeren forstår de tekniske begrensningene i denne tilnærmingen og bruker denne metoden etter nøye vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke alle ansatte ved Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) ved University Health Network for deres tid og hjelp til å utvikle denne protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
