Summary
Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.
Abstract
L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra est une méthode clé dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson. Actuellement, le comptage stéréologique non biaisé est la norme pour la quantification de ces cellules, mais il reste un processus laborieux et long, qui peut ne pas être réalisable pour tous les projets. Ici, nous décrivons l’utilisation d’une plate-forme d’analyse d’image, qui peut estimer avec précision la quantité de cellules étiquetées dans une région d’intérêt prédéfinie. Nous décrivons un protocole étape par étape pour cette méthode d’analyse dans le cerveau de rat et démontrons qu’il peut identifier une réduction significative des neurones positifs d’hydroxylase de tyrosine dus à l’expression du mutant α-synuclein dans le nigra de substantia. Nous avons validé cette méthodologie en comparant avec les résultats obtenus par stéréologie impartiale. Prise ensemble, cette méthode fournit un processus rapide et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques, et convient donc à une détermination efficace de l’effet des interventions sur la survie cellulaire.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement neurodégénérative répandue caractérisée par la présence d’agrégats protéiques contenant de la α-synucléine (α-syn) et la perte préférentielle de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantification du nombre de neurones dopaminergiques est une partie essentielle de la recherche sur la MP, car elle permet d’évaluer l’intégrité du système nigrostriatal, fournissant ainsi un critère d’évaluation important pour évaluer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Actuellement, la norme pour la quantification du nombre de cellules est le comptage stéréologique non biaisé, qui utilise des sections transversales bidimensionnelles (2D) du tissu pour estimer les caractéristiques volumétriques dans les structures tridimensionnelles (3D)2,3,4. Les méthodes thétélogiques modernes basées sur la conception utilisent des procédures d’échantillonnage aléatoire complètes et appliquent des protocoles de comptage (connus sous le nom de sondes) pour éviter les artefacts potentiels et les erreurs systématiques, permettant une détection fiable des différences légèrement supérieures à la variation inter-animaux5. Tandis que la stéréologie fournit un outil analytique puissant pour des études histologiques in vivo, elle prend beaucoup de temps, suppose la préparation uniforme d’échantillon, et exige la validation à plusieurs étapes, qui peut avoir un impact de plus en plus l’efficacité de plus en plus exigée pour l’investigation translationnelle préclinique.
Les progrès technologiques récents de la science numérique permettent d’adopter de nouvelles applications pour des évaluations plus efficaces de la pathologie sans stéréomicroscope, tout en comblant un besoin de substitut de la stéréologie impartiale. Ces méthodes augmentent la vitesse, réduisent l’erreur humaine et améliorent la reproductibilité des techniques téréologiques6,7. HALO est l’une de ces plateformes d’analyse d’images pour l’analyse quantitative des tissus en pathologie numérique. Il comprend une variété de modules différents et rapporte des données d’expression morphologiques et multiplexées sur une base cellule par cellule à travers des sections entières de tissu utilisant des algorithmes de reconnaissance de formes. Le module FL cytonucléaire mesure la positivité immunofluorescente des marqueurs fluorescents dans le noyau ou le cytoplasme. Cela permet de signaler le nombre de cellules positives pour chaque marqueur et le score d’intensité pour chaque cellule. Le module peut être adapté pour fournir des mesures individuelles de la taille des cellules et de l’intensité, bien que cette fonctionnalité ne soit pas requise pour la quantification des neurones dopaminergiques.
Le but de cette étude est de vérifier cette méthode avec un modèle de rat α-syn à base de vecteur viral préalablement validé de neurodégénérescencenigrale 8,9,10. Dans ce modèle, le mutant humain A53T α-syn est exprimé dans le SNpc par injection stéréotaxique du sérotype hybride adéno-associé du virus 1/2 (AAV1/2), entraînant une neurodégénérescence significative sur une période de 6 semaines. Le SNpc non injecté contralatéral peut, dans certaines études, servir de contrôle interne pour le côté injecté. Plus communément, l’injection de vecteur vide AAV (AAV-EV) dans une cohorte témoin d’animaux est utilisée comme témoin négatif. Nous présentons un guide étape par étape pour estimer la densité des neurones dopaminergiques restant dans le SNpc injecté après 6 semaines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image automatisé (Figure 1).
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux du Réseau universitaire de santé et exécutées conformément aux lignes directrices et aux règlements établis par le Conseil canadien de protection des animaux.
1. Injection stéréotaxique
- Couples de rats Sprague-Dawley femelles adultes (250-280 g) dans des cages avec litière en bois et accès ad lib à la nourriture et à l’eau. Maintenir la colonie animale dans un cycle clair/sombre régulier de 12 h (lumières à 06h30) avec une température et une humidité constantes.
- Effectuer une injection stéréotaxique unilatérale d’AAV directement au SNpc sur le côté droit du cerveau (côté droit ou gauche, selon les préférences de chaque laboratoire) comme décrit précédemment8,10. Injecter 2 μL d’AAV1/2 à un titre final de 3,4 x 1012 particules génomiques/mL.
2. Sectionnement cérébral et immunohistochimie (CSI)
- Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane en le plaçant dans une chambre anesthésiante pendant 3 min. D’autres méthodes approuvées peuvent être utilisées pour cette étape après un examen institutionnel approprié.
- Une fois que le rat a atteint un plan chirurgical d’anesthésie profonde, transférez-le dans un cône de nez fermement fixé à une table d’autopsie. Fixez les pattes antérieures du rat à l’aide de ruban adhésif et utilisez la méthode de réponse au pincement des pincements pour déterminer la profondeur de l’anesthésie. L’animal doit ne pas répondre avant de continuer.
- Faites une incision latérale sous le sternum et coupez à travers le diaphragme sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale. Soulevez et serrez le sternum avec un hémostatique et placez-le au-dessus de la tête.
- Serrez le cœur à l’aide d’une pince et insérez une aiguille papillon reliée à une pompe de perfusion dans l’extrémité postérieure du ventricule gauche. Perfuser le rat transcardialement avec 150 ml de solution saline héparinisée, ou jusqu’à ce que les yeux et la peau soient clairs. La perfusion avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA), au lieu d’une solution saline, peut être préférée pour faciliter l’immunomarquage avec certains anticorps ou une section plus mince du cerveau.
- Une fois la perfusion terminée, décapiter avec une guillotine et extraire le cerveau vers une matrice cérébrale, surface ventrale tournée vers le haut.
- À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, faire une coupe dans le plan coronal 2 mm rostral au chiasme optique. Faites glisser la lame d’un côté à l’autre pour éviter de déformer le cerveau tout en tranchant.
- Immerger la partie postérieure du cerveau dans un flacon pré-marqué contenant environ 20 mL de PFA à 4% pendant 48 h de post-fixation à température ambiante. La partie antérieure du cerveau peut être congelée instantanément dans du 2-méthylbutane réfrigéré à -42 °C avant d’être entreposée à -80 °C.
- Après 48 h, transférer les cerveaux fixes dans un flacon marqué contenant 30% de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’ils coulent (48-72 h).
- Préparer un microtome en plaçant de la glace carbonique dans l’auge de l’échantillon, suivie d’éthanol à 100 %. Une fois l’étape refroidie, pressez le composé de température de coupe optimale (OCT) sur l’étape jusqu’à ce qu’il forme un cercle de 2 cm de diamètre et de 0,5 cm d’épaisseur. Une fois partiellement gelé, abaissez soigneusement le cerveau sur le monticule d’OCT, en veillant à ce que la surface de coupe striatale reste parallèle au stade.
- Ajoutez plus de glace carbonique à la scène pour aider le cerveau à geler. Une fois que le cerveau a pris une couleur crème, effacez le stade de la glace carbonique.
- Percez un trou dans le côté droit du cerveau avec une aiguille 25G pour distinguer les hémisphères droit et gauche. Veillez à ne pas passer l’aiguille à travers les structures anatomiques d’intérêt.
- Couper en série des sections de 40 μm dans le plan coronal commençant à bregma -3,8 et se terminant à bregma -6,8.
- Conservez six séries dans des tubes étiquetés avec une solution antigel (40% PBS, 30% 2-éthoxyéthanol, 30% glycérol). Chaque série doit contenir 12 sections du cerveau.
- Sélectionnez un ensemble de sections pour la coloration immunohistochimique et lavez la solution antigel avec 3 x 10 lavages de minute dans 0,2% PBS-T.
- Bloquer pendant 1 h à droite avec nutation douce en solution de blocage (10% sérum de chèvre normal (NGS), 2% d’albumine sérique bovine (BSA) dans 0,2% PBS-T). Suivez ceci avec l’incubation avec l’anticorps anti-tyrosine hydroxylase de lapin (TH) (1:500) et l’anticorps anti-α-syn de souris (1:500) dans 2% NGS dans 0.2% PBS-T pendant la nuit à température ambiante.
- Laver l’anticorps primaire avec 3 x 5 lavages de minute dans 0,2% PBS-T, suivi d’une incubation de 1 h avec l’anticorps secondaire alexa fluor 488 anti-lapin de chèvre (1:500) et l’anticorps secondaire alexa fluor 555 anti-souris de chèvre dans 2% NGS dans 0,2% PBS-T. Assurez-vous que les sections sont protégées de la lumière et des noisettes doucement.
- Lavez les anticorps secondaires avec des lavages de 3 x 5 minutes dans 0,2% PBS-T et montez l’ensemble complet des sections sur des lames protégées de la lumière et de la poussière à l’aide d’un pinceau étroit. Lamelle de couverture avec support de montage de fluorescence et joint avec vernis à ongles transparent.
3. Microscopie confocale et acquisition d’images
- Capturez des images IHC à l’aide d’un logiciel couplé à un microscope confocal à un grossissement 10x. Ouvrez le trou d’épingle à 1,5 UA pour capturer un plan large totalisant ~ 1,5 μm et ouvrez la mise au point sur le côté injecté du cerveau.
- Sous l’onglet Acquisition, cochez l’option d’imagerie Tile Scan (Analyse par vignettes) et définissez les dimensions sur 10 x 4.
- Sous le panneau Mode d’acquisition, définissez le zoom sur 1.1. Cela permet d’éviter les marques d’assemblage évidentes entre les images de numérisation de tuiles.
- Définissez la taille d’image sur 1024 x 1024 pixels et la moyenne sur 2 pour garantir l’acquisition d’images de haute qualité.
- Dans le panneau Canaux, définissez la piste 1 sur Alexa488 et la piste 2 sur Alexa555.
- Chargez la glissière sur la scène et choisissez une section avec une forte coloration TH. Cliquez sur Live dans le panneau Acquisition.
- Dans le panneau Canaux, définissez la force et le gain laser sur des niveaux qui maximisent le signal et limitent le bruit de l’arrière-plan. Utilisez l’indicateur de portée pour vous assurer que les signaux ne sont pas surexposés (comme indiqué par une superposition rouge foncé).
- Répétez l’étape ci-dessus avec plusieurs diapositives pour vous assurer que la coloration est cohérente entre les diapositives, car la force / le gain du laser ne peut pas être ajusté entre les diapositives.
- Sous l’onglet Acquisition, cochez la case Positions.
- À ce stade, vous êtes prêt à commencer l’imagerie. À l’aide de l’oculaire, choisissez la première section montrant une coloration TH positive, définissez la mise au point au point d’intérêt (c.-à-d. SNpc), puis déplacez la scène vers la ligne médiane de la section. Cela enregistre la position dans les axes x, y et z et image une analyse de tuiles capturant toute la section.
- Répétez l’étape ci-dessus pour toutes les sections du SNpc en donnant un ensemble complet d’images du SNpc. Si une analyse détaillée du côté non injecté est requise, les étapes 3.10 à 3.11 doivent être répétées en mettant l’accent sur le côté non injecté.
4. Analyse et quantification d’images
- Séparez les fichiers image à l’aide du logiciel approprié et importez les fichiers image dans un logiciel d’analyse d’image automatisé.
- Définissez une région d’intérêt en sélectionnant l’outil d’annotation Plume pour dessiner une annotation autour du SNpc.
REMARQUE: Dans les sections qui ont une grande quantité de perte de neurone dopaminergique, l’augmentation temporaire de l’émétence / absorption peut aider à définir clairement le SNpc (Figure 2). - Passez à l’onglet Analyse et dans le menu déroulant Analyser, sélectionnez Réglage en temps réel. Cela ouvre une fenêtre séparée sur l’image de la section permettant la modification en temps réel des paramètres d’analyse(Figure 3).
- Sous la section Agrandissement de l’analyse, sélectionnez le zoom d’image approprié.
- Dans la section Détection cellulaire, sélectionnez colorant nucléaire comme colorant utilisé pour la coloration TH (Alexa Fluor 488).
- Ajustez les paramètres Seuil de contraste nucléaire, Intensité nucléaire minimale, Agressivitéde la segmentation nucléaire et Taille nucléaire tout en regardant attentivement la fenêtre réglage en temps réel.
Remarque : représentation précise de chaque cellule individuelle comme une seule cellule dans la fenêtre de réglage en temps réel est essentielle pour la précision. Ces paramètres sont à une échelle arbitraire en fonction du logiciel utilisé, mais un ajustement correct est nécessaire pour permettre au logiciel de différencier avec précision les cellules individuelles et entre les cellules et l’arrière-plan (Figure 3). - Répétez ce processus avec un minimum de 10 échantillons distincts pour assurer un accord uniforme de ce qui constitue une cellule à travers différentes sections.
Remarque : marqueurs de cellule supplémentaires (tels que α-syn ou NeuN) peuvent être identifiés dans la même plate-forme d’analyse à l’aide des sections marqueur 1 ou marqueur 2 sous l’onglet analyse. - Une fois qu’un nombre approprié d’images a été échantillonné et que le réglage en temps réel a été ajusté en conséquence, enregistrez les paramètres d’analyse dans le menu déroulant Actions de paramètres.
- Sélectionnez toutes les images à analyser et cliquez sur Analyser.
- Choisissez le paramètre d’analyse que vous venez d’enregistrer et, dans la fenêtre Région d’analyse, cochez la case Couche(s) d’annotations. Ensuite, vérifiez la couche 1 et cliquez sur En fonction analyser.
REMARQUE: Pour un seul cerveau, l’analyse prend généralement environ 5 minutes. Le résultat obtenu affichera clairement chaque élément qui a été compté comme une cellule(Figure 4). - Une fois terminé, exportez les données d’analyse récapitulative pour toutes les sections. Il existe une option pour exporter des données d’analyse d’objet, qui donnera des données détaillées, y compris la taille de cellule de chaque cellule individuelle détectée. Cet ensemble de données pourrait être utilisé pour examiner les changements dans la taille des cellules en réponse à une toxine ou à un traitement.
- Ajoutez le nombre total de cellules de chaque section analysée par animal et la surface totale analysée (mm2). Divisez le nombre total de cellules par la surface totale analysée pour calculer le nombre de cellules/mm2 dans le SNpc pour chaque rat
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Representative Results
En appliquant les méthodes ci-dessus au tissu cérébral collecté 6 semaines après les injections d’AAV, nous avons démontré que l’injection stéréotaxique d’AAV exprimant le mutant A53T α-syn (AAV-A53T) dans le SNpc du cerveau de rat entraîne une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques par rapport à l’injection d’AAV vectoriel vide (AAV-EV) comme contrôle(Figure 5A,B). Le nombre moyen de neurones/mmTH-positifs 2 dans le SNpc des rats injectés avec AAV-EV était 276,2 ± 34,7, et dans le SNpc des rats injectés avec AAV-A53T était 41,2 ± 17(P = 0,0003). La quantification du nombre de neurones dopaminergiques/mm2 dans le SNpc est similaire aux rapports précédemment publiés10,11. Pour les méthodes décrites ici, 4 sections séquentielles par animal ont été analysées. Des études antérieures ont montré des différences significatives avec aussi peu que 3 sections, mais l’analyse peut être encore augmentée jusqu’à 12 sections pour englober l’ensemble du SNPC en fonction du modèle et de l’intervention étudiés par l’investigateur.
La stéréologie impartiale a également été exécutée comme précédemment décrit12 sur un autre ensemble de sections de cerveau des mêmes animaux. En utilisant cette méthode, nous avons également démontré que l’injection stéréotaxique du mutant A53T α-syn dans le SNpc du cerveau de rat entraîne une réduction significative du nombre total estimé de neurones TH-positifs dans le SNpc, par rapport à l’injection d’EV-AAV (Figure 5C). Il est important de faire une forte corrélation entre la densité des neurones dopaminergiques estimée à l’aide d’un logiciel automatisé d’analyse d’images et le nombre de neurones dopaminergiques estimé à l’aide d’une stéréologie non biaisée (r = 0,8819, P = 0,0007)(Figure 5D).
Nous avons également appliqué nos méthodes à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image automatisé pour déterminer le nombre de neurones/mm2 positifs TH du côté non injecté de rats injectés avec AAV-A53T ou AAV-EV. Le nombre moyen de neurones TH-positifs/mm2 dans le SNpc non injecté des rats injectés avec AAV-A53T était 123,2 ± 26,4, qui était sensiblement plus grand que dans le SNpc injecté, qui était 44,0 ± 15,8(P = 0,0331)(figure supplémentaire 1A). Le nombre moyen de neurones TH-positifs/mm2 dans le SNpc non injecté des rats injectés avec AAV-EV (215,6 ± 35,5) n’était pas significativement différent du SNpc injecté (276,2 ± 34,7), confirmant qu’il n’y avait pas de dégénérescence due à l’injection avec AAV-EV(figure supplémentaire 1B). Nous avons calculé ces résultats en pourcentage d’animaux injectés/non injectés et avons constaté que les animaux injectés avec AAV-A53T présentaient une réduction de 69 % par rapport aux animaux AAV-EV(figure supplémentaire 1C).
Figure 1: Flux de travail de la méthode. Flux de travail démontrant les étapes requises pour injecter des AAV, des sections et des tissus de coloration, définir une région d’intérêt et optimiser le logiciel pour le comptage des cellules. Images représentatives de l’analyse des tuiles confocales, de la définition du retour sur investissement et de la quantification des cellules. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Définition de la région d’intérêt. (A)Section cérébrale coronale, y compris le SNpc immunostained pour TH (vert) d’un rat injecté avec AAV-A53T α-syn. Chez les rats atteints de neurodégénérescence sévère (comme indiqué ici), il peut être difficile d’identifier le SNpc. (B) L’augmentation temporaire de l’absorption de l’image peut identifier la structure et permettre une identification précise de la région d’intérêt. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Optimisation de la détection cellulaire à l’aide de la méthode cytonucléaire dans HALO. Le réglage en temps réel du module cytonucléaire permet à l’utilisateur de voir les changements dans la détection cellulaire en temps réel en modifiant le seuil de contraste nucléaire, l’intensité nucléaire minimale, l’agressivité de segmentation nucléaire et la taille nucléaire. (A) Image représentative avec la région d’intérêt affichée. (B) Réglage en temps réel montrant un sous-échantillonnage dans lequel le logiciel ne détecte pas toutes les cellules de la fenêtre de réglage. (C) Suréchantillonnage dans lequel le logiciel détecte plus de cellules que ce qui est évident dans la fenêtre de réglage. (D) Réglage optimisé dans lequel le nombre correct de cellules sont comptées. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Paramètres optimisés halo dans une région d’intérêt définie. Images représentatives de l’analyse terminée en utilisant des paramètres optimisés pour la détection cytonucléaire dans HALO. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: L’expression du mutant humain A53T α-syn dans SNpc entraîne une neurodégénérescence sévère à 6 semaines quantifiée par HALO et une stéréologie impartiale. (A)Images représentatives montrant la dégénérescence des neurones TH-positifs dans le SNpc 6 semaines après l’injection stéréotaxique d’AAV-A53T α-syn à un titre de 3,4 x 1012 particules virales/mL. Coloration immunofluorescente avec des anticorps anti-TH (vert) et anti-α-syn (rouges). Barre d’échelle = 200 μm. (B) La quantification du nombre de neurones TH-positifs dans le SNpc des rats injectés avec AAV-A53T α-syn ou AAV-EV démontre que l’expression de mutants α-syn entraîne une perte significative de neurones dopaminergiques. T nonapparié -test; n = 5 rats/groupe. Le graphique montre la moyenne ± SEM, ***P < 0,001. (C) Images représentatives de la coloration colorimétrique des neurones dopaminergiques dans le SNpc de rats injectés AAV-A53T (gauche) ou AAV-EV (droite) utilisés pour effectuer une stéréologie impartiale. Barre d’échelle = 200 μm.(D)Corrélation significative entre le comptage HALO des neurones positifs à la TH/mm2 (axe des y) et les nombres de cellules stéréologées non biaisés (axe des x). Corrélation de Pearson (r = 0,8819, P = 0,0007). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Une neurodégénérescence unilatérale importante est observée chez le SNpc de rats qui ont reçu une injection d’AAV-A53T. (A) La quantification du nombre de neurones TH-positifs dans le SNpc injecté ou non injecté des rats qui ont reçu une injection stéréotaxique unilatérale d’AAV-A53T montre une diminution significative du côté injecté. (B) La quantification du nombre de neurones TH-positifs dans le SNpc injecté ou non injecté des rats qui ont reçu l’injection stereotactic unilatérale d’AAV-EV ne montre aucun changement significatif. (C) La normalisation au côté controlatéral non injecté démontre une diminution de >50% lors de l’injection avec AAV-A53T α-syn par rapport à AAV-EV. T nonapparié -test; n = 5 rats/groupe. Les graphiques montrent la moyenne ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure supplémentaire.
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Discussion
L’évaluation fiable de l’intégrité du système dopaminergique dans les modèles précliniques de palladium est essentielle pour déterminer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Par conséquent, il est important de contrôler et de réduire au minimum les confusions potentielles qui peuvent réduire la fiabilité et la reproductibilité des données histopathologiques. Des résultats quantitatifs prudents peuvent fournir plus d’informations que les descriptions qualitatives ou semi-quantitatives seules. En même temps, nous devons reconnaître que les contraintes de temps et de ressources peuvent rendre difficile l’exécution d’un comptage stéréologique impartial pour quantifier les changements pathologiques ou la perte de cellules. Cependant, avec les progrès récents, bon nombre de ces critères peuvent être remplis à l’aide de plates-formes d’imagerie informatisées et automatisées6.
Ce protocole décrit un certain nombre d’étapes importantes en déterminant l’estimation histologique des neurones dopaminergiques/mm2 dans le cerveau de rongeur. Il convient de noter que nous avons utilisé l’injection stéréotaxique pour administrer des AAV au SNPC, ce qui accorde une importance à l’administration précise de ces virus afin de déterminer l’effet de tout traitement. Les coordonnées utilisées pour notre étude sont bregma -5,2 mm (antérieur-postérieur), -2 mm (médial-latéral vers la droite) et -7,5 mm (ventrale dorsale du crâne) sur des rats femelles adultes pesant environ 275 g. La livraison correcte du virus à l’aide de ces coordonnées garantira la livraison des AAV au SNpc.
En plus de cela, des précautions doivent être prises lors de la préparation des tissus pour la coloration. Avant tout, il faut prendre soin de marquer quel côté est la droite/gauche. Entre nos mains, le plus facile et le plus
la façon reproductible de le faire était d’utiliser une aiguille 25G pour piquer un trou périodiquement dans le mécèbre dorsal gauche tout en identifiant le côté non injecté. Une connaissance approfondie des régions neuroanaatomiques du cerveau des rongeurs est importante pour différencier quand commencer la coupe, et plus tard pour identifier le SNpc lors du dessin d’une région d’intérêt. Il est important de noter que la coloration TH ne tache pas exclusivement les neurones du SNpc, et on devrait pouvoir différencier les neurones TH-positifs dans le secteur tegmental ventral et le champ rétrorubal. Un atlas du cerveau du rat est un guide utile pour ceux qui manquent d’expérience en neuroanatomie des rongeurs. Les temps d’incubation des anticorps sont uniformes dans tout le protocole et la mise au point est réglée dans le temps minimum possible pour éviter le photobleaching.
Il y a une faible variabilité entre les échantillons une fois que des caractéristiques neuroanaatomiques cohérentes sont utilisées pour distinguer les sections. Il est important qu’un observateur expérimenté et aveuglé dessine la région d’intérêt pour maintenir l’uniformité entre les sections à analyser. L’analyse du côté non injecté, comme le montre la figure supplémentaire 1, démontre qu’il existe une cohérence dans la méthode. Toutefois, il faut faire attention à interpréter les données de cette manière. Trancher les cerveaux repose constamment sur la comparaison de la présence de caractéristiques neuroanatomiques connues de chaque côté du cerveau. Les différences subtiles peuvent signifier que le côté non injecté sur une section donnée peut être plus postérieur/antérieur que le côté injecté, et donc pas une comparaison directe précise. Une analyse plus approfondie des données présentées met en évidence une limite de cette méthode. Il y a un grand degré de variabilité dans le nombre de neurones dopaminergiques dans le côté non injecté (123,2 dans le groupe AAV-A53T contre 215,6 dans l’AAV-EV), ce à quoi on ne s’attendrait pas entre les animaux d’âge similaire. Il y a un certain nombre de raisons possibles à cet écart, y compris la petite taille de l’échantillon utilisé dans cette étude et les différences anatomiques mentionnées ci-dessus d’un côté à l’autre. En plus de cela, la mise au point du signal fluorescent est définie sur le côté injecté, ce qui signifie qu’un léger décalage dans le plan z peut laisser le côté non injecté hors de la mise au point, et donc certaines cellules ne seront pas détectables par le logiciel de comptage de cellules. Pour cette raison, il est recommandé de comparer le nombre de neurones dopaminergiques/mm2 d’un côté en utilisant des caractéristiques neuroanaatomiques connues, et où l’accent a été mis sur le microscope spécifiquement pour cette région. Si une comparaison avec le côté non injecté est nécessaire, l’imagerie doit être répétée avec le focus défini de ce côté.
Nous présentons les données obtenues et analysées avec l’un des nombreux logiciels qui fournissent une analyse quantitative d’images avec une formation minimale desutilisateurs 13. D’autres programmes sont disponibles et sont de plus en plus adoptés pour étudier la neuropathologie, y compris la quantification de la perte de neurones dopaminergiques dans les modèles expérimentaux de6. Alors que certains offrent des algorithmes intégrés pour exécuter des fonctions spécifiques (par exemple, le comptage de la plaque amyloïde), de nombreux progiciels partagent plusieurs caractéristiques communes qui les rendent particulièrement utiles pour les laboratoires qui effectuent des analyses répétitives. En plus de l’identification de la région d’intérêt, les étapes de prétraitement qui interfèrent avec le signal (plis tissulaires, artefacts de bord, marques d’encre, taches, etc.) peuvent être retirées de la région d’intérêt par des outils manuels et de reconnaissance des formes. En outre, les lectures fournies peuvent être utilisées conjointement avec des valeurs quantitatives obtenues à partir d’études protéiques, cellulaires ou comportementales pour explorer les relations et les corrélations potentielles entre les variables.
La méthode décrite ci-dessus fournit une procédure précise, semi-quantitative et relativement peu coûteuse pour estimer le nombre de neurones dans les sections cérébrales immunohistochemically colorées. La fonction de réglage en temps réel permet d’adapter la méthode pour toutes les sections et assure la cohérence même avec de légères variations dans les méthodes de découpage. Le fait qu’un observateur aveuglé identifie les régions d’intérêt dans le SNpc atténue les biais de confirmation ou de sélection et le logiciel fournit une lecture simple permettant le calcul des neurones / mm2. Cette méthode pourrait être facilement adaptée pour fournir des comptages précis de neurones dans différentes régions du cerveau tout en maintenant l’efficacité et les avantages de coût par rapport aux protocoles téréologiques plus établis. L’avancement de la technologie de balayage des lames pour les sections plus épaisses permettrait également un temps de traitement plus efficace pour la méthode décrite ci-dessus.
Limitations
La méthode décrite présente un certain nombre d’avantages distincts dans sa vitesse et sa capacité à détecter de grands changements dans la densité des neurones, mais pose également ses propres défis. Contrairement à la stéréologie, la méthode ne peut pas fournir une estimation des nombres absolus de cellules, mais calcule plutôt la densité de cellules dans le SNpc. Les estimations de la densité cellulaire sont fortement, mais pas parfaitement, corrélées avec les nombres de cellules obtenus à l’aide d’une stéréologie impartiale. En outre, la méthode repose sur le réglage de la taille et de la forme de la cellule par l’utilisateur avant de commencer l’analyse. Cela ne peut pas garantir que les cellules ne seront pas manquées en raison d’être partiellement dans le plan focal, ou que les cellules d’une taille et / ou d’une forme inhabituelles seront manquées par le logiciel. Dans l’expérience des auteurs, la méthode est particulièrement utile pour examiner l’efficacité des traitements modificateurs potentiels de la maladie dans les modèles précliniques de rongeurs. En conclusion, alors que les méthodes thétéologiques pour quantifier le nombre de cellules restent largement utilisées en neurosciences, l’accélération rapide de la numérisation suggère que les plateformes d’analyse d’images automatisées seront de plus en plus adoptées pour étudier la neuropathologie, en particulier à mesure qu’elles continuent de s’améliorer. Il est important que l’investigateur comprenne les limites techniques de cette approche et applique cette méthodologie après mûre réflexion.
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Disclosures
Les auteurs ne font état d’aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier tout le personnel de l’Installation avancée de microscopie optique (AOMF) du Réseau universitaire de santé pour leur temps et leur aide dans l’élaboration de ce protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
