Summary
Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.
Abstract
A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é um método-chave na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson. Atualmente, a contagem esqueológica imparcial é o padrão para quantificação dessas células, mas continua sendo um processo trabalhoso e demorado, que pode não ser viável para todos os projetos. Aqui, descrevemos o uso de uma plataforma de análise de imagens, que pode estimar com precisão a quantidade de células rotuladas em uma região de interesse pré-definida. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para este método de análise no cérebro de rato e demonstramos que ele pode identificar uma redução significativa nos neurônios positivos da hidroxilase de tyrosina devido à expressão de α-sinucleína mutante na substantia nigra. Validamos essa metodologia comparando-se com os resultados obtidos pela estereologia imparcial. Em conjunto, este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e, portanto, é adequado para uma determinação eficiente do efeito das intervenções na sobrevivência celular.
Introduction
A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)1. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções transversais bidimensionais (2D) do tecido para estimar características volutivas nas estruturas tridimensionais (3D)2,3,4. Os métodos eserológicos modernos baseados em design empregam procedimentos abrangentes de amostragem aleatória e aplicam protocolos de contagem (conhecidos como sondas) para evitar artefatos potenciais e erros sistemáticos, permitindo uma detecção confiável de diferenças apenas um pouco maior do que a variação inter-animal5. Embora a estereologia forneça uma poderosa ferramenta analítica para estudos histológicos in vivo, é tempo intensivo, assume a preparação uniforme de espécimes, e requer validação em várias etapas, o que pode impactar a eficiência cada vez mais necessária para a investigação translacional pré-clínica.
Os recentes avanços tecnológicos na ciência digital possibilitam a adoção de novas aplicações para avaliações mais eficientes da patologia sem um estereótipo, enquanto preenchem uma necessidade como substituto da estereologia imparcial. Esses métodos aumentam a velocidade, reduzem o erro humano e melhoram a reprodutibilidade das técnicas esteológicas6,7. HALO é uma dessas plataformas de análise de imagem para análise quantitativa de tecidos em patologia digital. Ele compreende uma variedade de diferentes módulos e relata dados de expressão morfológica e multiplexado em uma base celular por célula em seções inteiras de tecido usando algoritmos de reconhecimento de padrões. O módulo FL citonuclear mede a positividade imunofluorescente de marcadores fluorescentes no núcleo ou citoplasma. Isso permite relatar o número de células positivas para cada marcador, e o escore de intensidade para cada célula. O módulo pode ser adaptado para fornecer tamanhos celulares individuais e medidas de intensidade, embora este recurso não seja necessário para quantificação de neurônios dopaminérgicos.
O objetivo deste estudo é verificar este método com um modelo de rato α-syn baseado em vetor viral previamente validado de neurodegeneraçãonigral 8,9,10. Neste modelo, o mutante humano A53T α-syn é expresso no SNpc por injeção estereotática do sorotipo híbrido de vírus associado ao adeno 1/2 (AAV1/2), resultando em neurodegeneração significativa durante um período de 6 semanas. O SNpc não injetado contralateral pode, em alguns estudos, servir como um controle interno para o lado injetado. Mais comumente, a injeção de Vetor AAV-Empty (AAV-EV) em uma coorte de controle de animais é usada como um controle negativo. Apresentamos um guia passo-a-passo para estimar a densidade de neurônios dopaminérgicos remanescentes no SNpc injetado após 6 semanas usando um software automatizado de análise de imagem(Figura 1).
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Rede de Saúde universitária e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Injeção estereotática
- Ratos adultos de casa par-house Sprague-Dawley (250-280 g) em gaiolas com roupa de cama de madeira e acesso a anúncios lib a alimentos e água. Mantenha a colônia animal em um ciclo regular de 12h de luz/escuridão (luzes em 06:30) com temperatura e umidade constantes.
- Realize a injeção estereotática unilateral de AAV diretamente ao SNpc no lado direito do cérebro (lado direito ou esquerdo, de acordo com as preferências de cada laboratório) como descrito anteriormente8,10. Injete 2 μL de AAV1/2 em um título final de 3,4 x 1012 partículas genômicas/mL.
2. Secção cerebral e imunohistoquímica (IHC)
- Anestesiar o rato com 5% de isoflurane colocando em uma câmara de anestesia por 3 minutos. Outros métodos aprovados podem ser utilizados para esta etapa após a revisão institucional adequada.
- Uma vez que o rato tenha alcançado um plano cirúrgico de anestesia profunda, transfira-o para um cone de nariz firmemente afixado para uma tabela de necropsia. Fixar as patas dianteiras do rato usando fita adesiva e use o método de resposta ao dedo do dedo do dedo do dedo para determinar a profundidade da anestesia. O animal deve não responder antes de continuar.
- Faça uma incisão lateral abaixo do esterno e corte através do diafragma ao longo de toda a extensão da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Levante e aperte o esterno com um hemosta e coloque acima da cabeça.
- Aperte o coração usando fórceps e insira uma agulha de borboleta conectada a uma bomba de perfusão na extremidade posterior do ventrículo esquerdo. Perfuse rato transcardialmente com 150 mL de soro fisiológico heparinizado, ou até que os olhos e a pele estejam claros. A perfusão com 4% de paraformaldeído (PFA), em vez de soro fisiológico, pode ser preferida para facilitar a imunossão com certos anticorpos ou seção cerebral mais fina.
- Uma vez que a perfusão esteja completa, decapite com uma guilhotina e extraia o cérebro para uma matriz cerebral, superfície ventral voltada para cima.
- Usando uma lâmina de barbear fresca, faça um corte no plano coronal 2 mm rostral para o quiasmo óptico. Deslize a lâmina de um lado para o outro para evitar deformar o cérebro durante o corte.
- Mergulhe a porção posterior do cérebro em um frasco pré-rotulado contendo aproximadamente 20 mL de 4% de PFA para 48h de pós-fixação à temperatura ambiente. A porção anterior do cérebro pode ser congelada em 2-metilbutano refrigerado a -42 °C antes de armazenamento a -80 °C.
- Após 48 h, transfira os cérebros fixos para um frasco rotulado contendo 30% de sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e armazene a 4 °C até afundar (48-72 h).
- Prepare um microtoma colocando gelo seco no cocho da etapa da amostra, seguido de 100% de etanol. Uma vez que o estágio tenha esfriado, esprema o composto de temperatura de corte ideal (OCT) no palco até formar um círculo de 2 cm de diâmetro e 0,5 cm de espessura. Uma vez parcialmente congelado, abaixe cuidadosamente o cérebro sobre o monte de OCT, garantindo que a superfície de corte estriatal permaneça paralela com o estágio.
- Adicione mais gelo seco ao palco para ajudar o cérebro a congelar. Uma vez que o cérebro tenha virado uma cor creme, limpe o estágio de gelo seco.
- Faça um buraco no lado direito do cérebro com uma agulha 25G para distinguir os hemisférios direito e esquerdo. Tome cuidado para não passar a agulha através de estruturas anatômicas de interesse.
- Corte em série seções de 40 μm no plano coronal começando em bregma -3.8 e terminando em bregma -6.8.
- Armazene seis séries em tubos rotulados com solução anticongelante (40% PBS, 30% 2-ethoxyetanol, 30% glicerol). Cada série deve conter 12 seções cerebrais.
- Selecione um conjunto de seções para coloração imunohistoquímica e lave a solução anticongelante com lavagens de 3 x 10 min em 0,2% PBS-T.
- Bloqueie por 1 h em RT com porca suave na solução de bloqueio (soro de cabra 10% normal (NGS), 2% de albumina de soro bovino (BSA) em 0,2% PBS-T). Siga isso com incubação com anticorpo anti-tyrosina de coelho (TH) (1:500) e anticorpo anti-α-syn do rato (1:500) em 2% de NGS em 0,2% PBS-T durante a noite à temperatura ambiente.
- Lave o anticorpo primário com lavagens secundárias de 3 x 5 minutos em 0,2% PBS-T, seguido de incubação de 1 h com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (1:500) e anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 555 em 2% de NGS em 0,2% PBS-T. Certifique-se de que as seções estão protegidas da luz e da porca suavemente.
- Lave o anticorpo secundário com lavagens de 3 x 5 minutos em PBS-T de 0,2% e monte o conjunto completo de seções em lâminas protegidas de luz e poeira usando um pincel estreito. Tampar com fluorescência montagem média e vedação com verniz de unha claro.
3. Microscopia confocal e aquisição de imagens
- Capture imagens IHC usando software acoplado a um microscópio confocal a 10x de ampliação. Abra o orifício para 1,5 UA para capturar um plano largo totalizando ~1,5 μm e definir o foco no lado injetado do cérebro.
- Na guia Aquisição, verifique a opção de imagem Tile Scan e defina as dimensões para 10 x 4.
- No painel Modo aquisição, defina o Zoom para 1.1. Isso ajuda a evitar marcas óbvias de costura entre as imagens de varredura de ladrilhos.
- Defina o Tamanho do Quadro para 1024 x 1024 pixels e a Média para 2 para garantir a aquisição de imagem de alta qualidade.
- No painel Canais, defina a faixa 1 para alexa488 e faixa 2 até Alexa555.
- Carregue o slide no palco e escolha uma seção com forte coloração th. Clique em Live no painel Aquisição.
- No painel Canais, defina a força e o ganho do laser em níveis que maximizam o sinal e limitam o ruído a partir do plano de fundo. Use o indicador de intervalo para garantir que os sinais não sejam superexpostos (como indicado por uma sobreposição vermelha escura).
- Repita o passo acima com vários slides para garantir que a coloração seja consistente entre slides, pois a força/ganho do laser não pode ser ajustada entre slides.
- Na guia Aquisição, verifique a caixa Posições.
- Neste momento, você está pronto para começar a imagem. Usando a ocular, escolha a primeira seção mostrando coloração TH positiva, defina o foco no ponto de interesse (ou seja, SNpc) e, em seguida, mova o palco para a linha média da seção. Isso salva a posição nos eixos x, y e z e irá visualizar uma varredura de ladrilho capturando toda a seção.
- Repita o passo acima para todas as seções ao longo do SNpc dando um conjunto completo de imagens do SNpc. Se for necessária uma análise detalhada do lado não injetado, as etapas 3.10 a 3.11 devem ser repetidas definindo o foco no lado não injetado.
4. Análise e quantitação de imagens
- Arquivos de imagem separados usando software apropriado e importar arquivos de imagem para software automatizado de análise de imagem.
- Defina uma região de interesse selecionando a ferramenta de anotação caneta para desenhar uma anotação em torno do SNpc.
NOTA: Em seções que têm uma grande quantidade de perda de neurônio dopaminérgico, aumentar temporariamente a emiteção/absorção pode ajudar a definir claramente o SNpc (Figura 2). - Mova-se para a guia Análise e a partir do menu 'Analisar' suspenso, selecione Sintonia em Tempo Real. Isso abre uma janela separada na imagem da seção permitindo a modificação em tempo real dos parâmetros de análise(Figura 3).
- Na seção Desnificação de análise, selecione o zoom de imagem apropriado.
- Na seção Detecção celular, selecione o corante nuclear como o corante usado para coloração TH (Alexa Fluor 488).
- Ajuste o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nucleare as configurações de tamanho nuclear enquanto observa cuidadosamente a janela de sintonia em tempo real.
NOTA: A representação precisa de cada célula individual como uma única célula na janela de sintonia em tempo real é vital para a precisão. Essas configurações estão em escala arbitrária dependendo do software utilizado, mas o ajuste correto é necessário para permitir que o software diferencie com precisão entre células individuais e entre células e o fundo(Figura 3). - Repita este processo com um mínimo de 10 amostras separadas para garantir uma concordância uniforme do que constitui uma célula em diferentes seções.
NOTA: Marcadores celulares adicionais (como α-syn ou NeuN) podem ser identificados dentro da mesma plataforma de análise usando as seções Marcador 1 ou Marcador 2 na guia de análise. - Uma vez que um número apropriado de imagens tenha sido amostrado e o ajuste em tempo real tenha sido ajustado de acordo, salve as configurações de análise no menu suspenso Configurações Actions.
- Selecione todas as imagens a serem analisadas e clique em Analisar.
- Escolha a configuração de análise que acabou de salvar e na janela Região de Análise, verifique a caixa (s) camada de anotação. Em seguida, verifique a Camada 1 e clique em Analisar.
NOTA: Para um único cérebro, a análise normalmente leva cerca de 5 minutos. O resultado completo mostrará claramente cada item que foi contado como uma célula (Figura 4). - Uma vez concluída, exporte os dados de análise de resumo para todas as seções. Há uma opção para exportar dados de análise de objetos,que darão dados detalhados, incluindo o tamanho celular de cada célula individual detectada. Este conjunto de dados poderia ser usado para examinar alterações no tamanho da célula em resposta a uma toxina/terapêutica.
- Adicione as Células Totais de cada seção analisada por animal e a Área Total Analisada (mm2). Divida o número total de células pela área total analisada para calcular o número de células/mm2 no SNpc para cada rato
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Representative Results
Aplicando os métodos acima ao tecido cerebral coletados 6 semanas após as injeções de AAV, demonstramos que a injeção estereotática de AAV expressando o mutante A53T α-syn (AAV-A53T) no SNpc do cérebro de rato resulta em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos em comparação com a injeção de AAV (AAV-EV) vetorial vazio como controle (Figura 5A,B). O número médio de neurônios TH-positivo/mm2 no SNpc de ratos injetados com AAV-EV foi de 276,2 ± 34,7, e no SNpc de ratos injetados com AAV-A53T foi de 41,2 ± 17(P = 0,0003). A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos/mm2 no SNpc é semelhante aos relatórios publicados anteriormente10,11. Para os métodos aqui descritos, foram analisadas 4 seções sequenciais por animal. Estudos anteriores mostraram diferenças significativas com apenas 3 seções, mas a análise pode ser aumentada até 12 seções para abranger todo o SNpc dependendo do modelo e intervenção que está sendo estudado pelo pesquisador.
A estereologia imparcial também foi realizada como descrito anteriormente12 em outro conjunto de seções cerebrais dos mesmos animais. Usando este método, também demonstramos que a injeção estereotática do mutante A53T α-syn no SNpc do cérebro de rato resulta em uma redução significativa no número total estimado de neurônios TH-positivos no SNpc, em comparação com a injeção de EV-AAV(Figura 5C). É importante ressaltar que houve uma forte correlação entre a densidade do neurônio dopaminérgico estimada por meio de software automatizado de análise de imagem e o número de neurônios dopaminérgicos estimados por estereologia imparcial (r = 0,8819, P=0,0007)(Figura 5D).
Também aplicamos nossos métodos usando software automatizado de análise de imagens para determinar o número de neurônios TH-positivo/mm2 no lado não injetado de ratos injetados com AAV-A53T ou AAV-EV. O número médio de neurônios TH-positivo/mm2 no SNpc não injetado de ratos injetados com AAV-A53T foi de 123,2 ± 26,4, o que foi significativamente maior do que no SNpc injetado, que foi de 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331) (Figura Suplementar 1A). O número médio de neurônios TH-positivo/mm2 no SNpc não injetado de ratos injetados com AAV-EV (215,6 ± 35,5) não foi significativamente diferente do SNpc injetado (276,2 ± 34,7), confirmando que não houve degeneração devido à injeção com AAV-EV(Figura Suplementar 1B). Calculamos esses resultados como uma porcentagem de injetados/não injetados e constatamos que os animais injetados com AAV-A53T apresentaram uma redução de 69% em relação aos animais AAV-EV(Figura Suplementar 1C).
Figura 1: Fluxo de trabalho do método. Fluxo de trabalho demonstrando as etapas necessárias para injetar AAVs, seção e tecido de manchas, definir uma região de interesse e otimizar o software para contagem de células. Imagens representativas da varredura de telhas confocal, definição de ROI e quantitação de células. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Definindo a região de interesse. (A) Seção cerebral coronal, incluindo o SNpc imunostained for TH (verde) de um rato injetado com AAV-A53T α-syn. Em ratos com neurodegeneração grave (como mostrado aqui), pode ser difícil identificar o SNpc. (B) Aumentar temporariamente a absorção da imagem pode identificar a estrutura e permitir uma identificação precisa da região de interesse. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Otimização da detecção celular usando o método Citonuclear em HALO. A sintonia em tempo real do módulo citonuclear permite que o usuário veja alterações na detecção de células em tempo real alterando o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nuclear e tamanho nuclear. (A) Imagem representativa com região de interesse exibida. (B) Ajuste em tempo real mostrando a sub-amostragem na qual o software não detecta todas as células na janela de sintonia. (C) Super amostragem na qual o software detecta mais células do que são evidentes na janela de sintonia. (D) Ajuste otimizado no qual o número correto de células é contado. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Configurações otimizadas por HALO dentro de uma região de interesse definida. Imagens representativas da análise completa usando configurações otimizadas para detecção citonuclear em HALO. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão do mutante humano A53T α-syn em SNpc resulta em neurodegeneração grave às 6 semanas, quantificada por HALO e estereologia imparcial. (A) Imagens representativas mostrando a degeneração de neurônios TH positivos no SNpc 6 semanas após a injeção estereotática de AAV-A53T α-syn em um titer de 3,4 x 1012 partículas virais/mL. Manchas imunofluorescentes com anticorpos anti-TH (verde) e anti-α-syn (vermelho). Barra de escala = 200 μm. (B) Quantificação do número de neurônios TH positivos no SNpc de ratos injetados com AAV-A53T α-syn ou AAV-EV demonstra que a expressão de α-syn mutante resulta em perda significativa de neurônios dopaminérgicos. Teste tnão não pago; n = 5 ratos/grupo. Gráfico mostra ± médias SEM, ***P < 0,001. (C) Imagens representativas da coloração colorimétrica de neurônios dopaminérgicos no SNpc de AAV-A53T (esquerda) ou AAV-EV (direita) injetaram ratos usados para realizar estereologia imparcial. Barra de escala = 200 μm. (D) Uma correlação significativa entre a contagem de HALO de neurônios TH-positivos/mm2 (eixo y) e números de células estereologias imparcial (x-eixo). Correlação de pearson (r = 0,8819, P = 0,0007). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: A neurodegeneração unilateral significativa é observada no SNpc de ratos que receberam injeção AAV-A53T. (A) Quantificação do número de neurônios TH positivos no SNpc injetado ou não injetado de ratos que receberam uma injeção estereotática AAV-A53T unilateral mostra uma diminuição significativa no lado injetado. (B) Quantificação do número de neurônios TH positivos no SNpc injetado ou não injetado de ratos que receberam injeção estereotática AAV-EV unilateral não mostra alterações significativas. (C) A normalização para o lado contralateral não injetado demonstra uma redução de >50% após a injeção com AAV-A53T α-syn em comparação com a AAV-EV. Teste tnão não pago; n = 5 ratos/grupo. Gráficos mostram média ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Clique aqui para baixar esta Figura Suplementar.
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Discussion
A avaliação confiável da integridade do sistema dopaminérgico em modelos pré-clínicos de DP é fundamental para determinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Por isso, é importante controlar e minimizar potenciais confusões que possam reduzir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados histopatológicos. Resultados quantitativos cuidadosos podem fornecer mais informações do que descrições qualitativas ou semi-quantitativas. Ao mesmo tempo, devemos reconhecer que as restrições no tempo e nos recursos podem dificultar o desempenho da contagem estológica imparcial para quantificar alterações patológicas ou perda de células. No entanto, com os avanços recentes, muitos desses critérios podem ser cumpridos utilizando plataformas informatizadas e automatizadas de imagem6.
Este protocolo descreve uma série de passos importantes na determinação da estimativa esterológica dos neurônios dopaminérgicos/mm2 no cérebro de roedores. Deve-se notar que usamos injeção estereotática para entregar AAVs ao SNpc, o que coloca uma importância na entrega precisa desses vírus, a fim de determinar o efeito de qualquer tratamento. As coordenadas utilizadas para o nosso estudo são bregma -5,2 mm (anterior-posterior), -2 mm (medial-lateral à direita) e -7,5 mm (ventral dorsal do crânio) em ratos fêmeas adultas pesando ~275 g. A entrega correta do vírus usando essas coordenadas garantirá a entrega dos AAVs ao SNpc.
Além disso, deve-se tomar cuidado ao preparar tecidos para coloração. Acima de tudo, deve-se tomar cuidado para marcar qual lado é o direito/esquerdo. Em nossas mãos, o mais fácil e mais fácil
a maneira reprodutável de fazer isso foi usar uma agulha 25G para fazer um buraco periodicamente no cérebro dorsal esquerdo enquanto identificava o lado não injetado. Um conhecimento aprofundado das regiões neuroanatomicas do cérebro de roedores é importante para diferenciar quando começar a cortar, e depois identificar o SNpc ao desenhar uma região de interesse. É importante notar que a coloração de TH não mancha exclusivamente os neurônios do SNpc, e deve-se ser capaz de diferenciar entre neurônios TH positivos na área tegmental ventral e campo retrorubal. Um atlas cerebral de rato é um guia útil para aqueles que não têm experiência em neuronato de roedores. Os tempos de incubação de anticorpos são uniformes em todo o protocolo e o foco é definido no tempo mínimo possível para evitar fotobleaching.
Há uma baixa variabilidade entre as amostras uma vez que características neuroanatomômicas consistentes são usadas para distinguir entre seções. Ter um observador experiente e cego desenhar a região de interesse é importante para manter a consistência entre as seções a serem analisadas. A análise do lado não injetado, como mostrado na Figura Suplementar 1, demonstra que há uma consistência no método. No entanto, deve-se tomar cuidado ao interpretar os dados dessa forma. Cortar cérebros consistentemente depende de comparar a presença de características neuroanatómias conhecidas em cada lado do cérebro. Diferenças sutis podem significar que o lado não injetado em uma determinada seção pode ser mais posterior/anterior do que o lado injetado, e, portanto, não uma comparação direta precisa. Uma análise mais aprofundada dos dados apresentados evidencia uma limitação desse método. Há um grande grau de variabilidade na contagem de neurônios dopaminérgicos no lado não injetado (123,2 no grupo AAV-A53T vs 215,6 no AAV-EV), o que não se esperaria entre animais de idade semelhante. Há uma série de possíveis razões para essa discrepância, incluindo o pequeno tamanho amostral utilizado neste estudo e as diferenças anatômicas acima mencionadas de um lado para o outro. Além disso, o foco para o sinal fluorescente é definido no lado injetado, o que significa que uma ligeira mudança no z-plane pode deixar o lado não injetado fora de foco, e assim algumas células não serão detectáveis pelo software de contagem de células. Por essa razão, recomenda-se comparar o número de neurônios dopaminérgicos/mm2 de um lado usando características neuroanatomômicas conhecidas, e onde o foco foi definido no microscópio especificamente para esta região. Se for necessária uma comparação com o lado não injetado, a imagem deve ser repetida com o foco definido neste lado.
Apresentamos dados obtidos e analisados com um dos vários pacotes de software que fornecem análise quantitativa de imagens com treinamento mínimo do usuário13. Outros programas estão disponíveis e estão cada vez mais sendo adotados para estudar neuropatologia, incluindo a quantificação da perda de neurônios dopaminérgicos em modelos experimentais de PD6. Enquanto alguns oferecem algoritmos incorporados para executar funções específicas (por exemplo, contagem de placas amiloides), muitos dos pacotes de software compartilham vários recursos comuns que os tornam particularmente úteis para laboratórios que realizam análises repetitivas. Além da região de identificação de juros, as etapas de pré-processamento que interferem com o sinal (dobras teciduais, artefatos de borda, marcas de tinta, manchas, etc.) podem ser removidas da região de interesse por ferramentas de reconhecimento manual e padrão. Além disso, as leituras fornecidas podem ser utilizadas em conjunto com valores quantitativos obtidos a partir de estudos proteicos, celulares ou comportamentais para explorar relações e possíveis correlações entre variáveis.
O método descrito acima fornece um procedimento preciso, semi-quantitativo e relativamente barato para estimar números de neurônios em seções cerebrais imunohistoquesequeticamente manchadas. O recurso de ajuste em tempo real permite a adaptação do método para todas as seções e garante consistência mesmo com pequenas variâncias nos métodos de corte. Ter um observador cego identificar regiões de interesse no SNpc mitiga a confirmação ou os vieses de seleção e o software fornece uma leitura simples permitindo o cálculo de neurônios/mm2. Este método poderia ser facilmente adaptado para fornecer contagem precisa de neurônios em diferentes regiões cerebrais, mantendo a eficiência e as vantagens de custo sobre protocolos eserológicos mais estabelecidos. O avanço da tecnologia de varredura de slides para seções mais grossas também permitiria um tempo de processamento mais eficiente para o método acima descrito.
Limitações
O método descrito tem uma série de vantagens distintas em sua velocidade e capacidade de detectar grandes mudanças na densidade dos neurônios, mas também apresenta seus próprios desafios. Ao contrário da estereologia, o método não pode fornecer uma estimativa de números de células absolutas, mas sim calcular a densidade celular dentro do SNpc. As estimativas de densidade celular são altamente, mas não perfeitamente, correlacionadas com números de células obtidos usando estereologia imparcial. Além disso, o método conta com afinação do tamanho e forma do celular pelo usuário antes de iniciar a análise. Isso não pode garantir que as células não serão perdidas devido a estar parcialmente no plano focal, ou que células de um tamanho e/ou forma incomuns serão perdidas pelo software. Na experiência dos autores, o método é particularmente útil para examinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças em modelos pré-clínicos de roedores. Em conclusão, enquanto os métodos eseológicos para quantificar os números de células permanecem amplamente utilizados na neurociência, a aceleração rápida da digitalização sugere que plataformas automatizadas de análise de imagem serão cada vez mais adotadas para estudar neuropatologia, particularmente à medida que elas continuam a melhorar. É importante que o pesquisador entenda as limitações técnicas dessa abordagem e aplique essa metodologia após cuidadosa consideração.
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Disclosures
Os autores não relatam interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a todos os funcionários do Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) da University Health Network pelo tempo e assistência no desenvolvimento desse protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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