Summary
여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.
Abstract
nigra의 도파민성 뉴런의 수를 추정하는 것은 임상 전 파킨슨 병 연구의 핵심 방법입니다. 현재, 편견 입체 계수는 이러한 세포의 정량화를위한 표준이지만, 모든 프로젝트에 대해 가능하지 않을 수 있습니다 힘들고 시간이 많이 소요되는 과정남아있다. 여기서는 미리 정의된 관심 영역에서 표지된 셀의 양을 정확하게 추정할 수 있는 이미지 분석 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 쥐 두뇌에 있는 분석의 이 방법에 대한 단계별 프로토콜을 설명하고 지하 니그라에서 돌연변이 α-synuclein의 발현때문에 티로신 하이드록실라제 양성 뉴런의 현저한 감소를 확인할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 편견없는 입체학에 의해 얻은 결과와 비교하여이 방법론을 검증했습니다. 종합하면, 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하므로 세포 생존에 대한 내정간섭의 효과를 효율적으로 판단하는 데 적합합니다.
Introduction
파킨슨병(PD)은 α-시뉴클레인(α-syn)을 함유한 단백질 골재의 존재와 실산니그라 파스 콤카(SNpc)1에서도파민성 뉴런의 우대손실을 특징으로 하는 만연한 신경퇴행성 운동 장애이다. 도파민성 뉴런 수의 정량화는 PD 연구의 중요한 부분으로, 이는 nigrostriatal 시스템의 무결성의 평가를 허용하므로, 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 평가하는 중요한 종점을 제공한다. 현재, 세포 수의 정량화에 대한 표준은 조직의 2차원(2D) 단면을 활용하여 3차원(3D) 구조2,3,4에서체적 특징을 추정하는 편견없는 입체 적 계수이다. 현대설계 기반 입체적 방법은 포괄적인 무작위 샘플링 절차를 채택하고 잠재적인 아티팩트및 체계적인 오류를 피하기 위해 계수 프로토콜(프로브라고 함)을 적용하여 동물 간 변형5보다약간 더 큰 차이를 안정적으로 감지할 수 있도록 합니다. 입체학은 생체 내 조직학 연구를 위한 강력한 분석 도구를 제공하지만, 시간 집약적이며 균일한 표본 준비를 가정하며, 임상 전 번역 조사에 점점 더 필요한 효율성에 영향을 미칠 수 있는 여러 단계에서 검증이 필요합니다.
디지털 과학의 최근 기술 발전은 입체 현미경없이 병리학의 보다 효율적인 평가를위한 새로운 응용 프로그램을 채택 할 수 있게, 편견 입체학의 대리로 필요성을 채우는 동안. 이러한 방법은 속도를 높이고, 사람의 실수를 줄이며, 입체 기술의 재현성을 향상6,7. HALO는 디지털 병리학에서 정량적 조직 분석을 위한 이러한 이미지 분석 플랫폼 중 하나입니다. 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 전체 조직 섹션에 걸쳐 세포별 기초에 대한 다양한 다양한 모듈 및 보고서 형태학적 및 멀티플렉스 식 데이터를 포함한다. 세포핵 FL 모듈은 핵 또는 세포질에서 형광 마커의 면역 형광 성 양성을 측정합니다. 이를 통해 각 마커에 대해 양성 셀 수와 각 셀에 대한 강도 점수를 보고할 수 있습니다. 이 기능은 도파민성 뉴런의 정량화에는 필요하지 않지만 모듈은 개별 세포 크기와 강도 측정을 제공하도록 조정할 수 있습니다.
이 연구의 목적은 이전에 검증된 바이러스 벡터 기반 α-syn 쥐 모델인 nigral neurodegeneration8,9,10을사용하여 이 방법을 확인하는 것이다. 본 모델에서, 인간 돌연변이 A53T α-syn은 아데노 관련 바이러스 하이브리드 혈청형 1/2(AAV1/2)의 스테레오테테 주사에 의해 SNpc에서 발현되어 6주 동안 상당한 신경 변성을 초래한다. 반대로 주입되지 않은 SNpc는 일부 연구에서 주입 된 측에 대한 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 더 일반적으로, 동물의 대조군에서 AAV-빈 벡터(AAV-EV)를 주입하는 것은 음의 대조군으로 사용된다. 자동 이미지 분석소프트웨어(도 1)를이용하여 6주 후 주입된 SNpc에 남아 있는 도파민성 뉴런의 밀도를 추정하는 단계별 가이드를 제시한다.
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Protocol
모든 절차는 대학 건강 네트워크 동물 관리위원회에 의해 승인되고 동물 관리에 캐나다 위원회에 의해 설정 된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
1. 스테레오전술 주입
- 나무 침구와 음식과 물에 대한 광고 리브 액세스 케이지에 쌍 하우스 성인 여성 스프라그 - Dawley 쥐 (250-280 g). 일정한 온도와 습도가 있는 일반 12h 빛/암흑 주기(06:30의 조명)에서 동물 서식지를 유지합니다.
- 이전에 설명된 바와 같이 뇌의 오른쪽에 있는 SNpc(오른쪽 또는 왼쪽, 각 실험실의 선호도에 따라)에 AAV를 직접 일방적으로 스테레오전술 주사를수행한다. 3.4 x 1012 게놈 입자/mL의 최종 티터에 AAV1/2의 2 μL을 주입하십시오.
2. 뇌 단면 및 면역 작용화학 (IHC)
- 3 분 동안 마취 챔버에 배치하여 5 %의 이소플루란으로 쥐를 마취. 다른 승인된 방법은 적절한 제도적 검토 후 이 단계에 사용될 수 있다.
- 쥐가 깊은 마취의 수술 비행기에 도달하면, 단단히 부검 테이블에 부착 코 콘으로 전송합니다. 테이프를 사용하여 쥐의 앞발을 확보하고 발가락 핀치 응답 방법을 사용하여 마취의 깊이를 결정합니다. 동물은 계속하기 전에 응답하지 않아야합니다.
- 흉골 아래 측면 절개를 하고 흉막 의 전체 길이를 따라 다이어프램을 잘라 흉막 구멍을 노출합니다. 머리 위에 있는 헤스테트로 흉골을 들어 올리고 고정합니다.
- 집게를 사용하여 심장을 고정하고 좌심실의 후면 끝에 관류 펌프에 연결된 나비 바늘을 삽입합니다. 150mL의 헤파린화식 식염수또는 눈과 피부가 맑을 때까지 쥐를 분리합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 가진 관류는 식염수 대신, 특정 항체 또는 얇은 뇌 절면을 통해 면역염색을 용이하게 하는 것이 바람직할 수 있다.
- 일단 관류가 완료되면, 기요틴으로 참수하고 뇌 매트릭스에 뇌를 추출, 복부 표면을 향하고.
- 신선한 면도날을 사용하여 관상 비행기에서 2mm 로스트랄을 광학 치아솜으로 자릅니다. 슬라이스하는 동안 뇌가 뒤틀리는 것을 피하기 위해 블레이드를 좌우로 밀어 내십시오.
- 실온에서 48h의 후고에 대한 4% PFA의 약 20mL를 포함하는 사전 표지된 유리병에 뇌의 후방 부분을 침수하십시오. 뇌의 전방 부분은 -80°C에서 저장하기 전에 -42°C로 냉각된 2-메틸부탄에서 얼어 붙일 수 있다.
- 48h 후, 고정 된 뇌를 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 30 % 자당을 포함하는 표지 된 유리병에 옮기고 4 ° C에서 가라 앉을 때까지 저장합니다 (48-72 h).
- 시편 단계의 트로프에 드라이 아이스를 배치하고 100% 에탄올을 넣음으로써 마이크로토메를 준비합니다. 스테이지가 냉각되면 직경 2cm, 두께 0.5cm의 원을 형성할 때까지 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물을 스테이지에 짜냅니다. 일단 부분적으로 동결되면, 조심스럽게 10 월의 마운드에 뇌를 낮추고, 줄무늬 절단 표면이 무대와 평행하게 유지되도록.
- 뇌가 얼릴 수 있도록 무대에 드라이 아이스를 더 넣습니다. 뇌가 크림색으로 변하면 드라이 아이스의 무대를 치웁울 수 있습니다.
- 오른쪽반구와 왼쪽 반구를 구별하기 위해 25G 바늘로 뇌의 오른쪽에 구멍을 찌른다. 관심있는 해부학 구조를 통해 바늘을 통과하지 않도록주의하십시오.
- 브레그마 -3.8에서 시작하여 bregma -6.8에서 끝나는 관상 비행기의 40 μm 섹션을 연속적으로 절단합니다.
- 동결 방지 용액(PBS 40%, 2-에톡시에탄올 30%, 글리세롤 30%)을 장착한 라벨이 부착된 튜브에 6시리즈를 저장합니다. 각 시리즈에는 12개의 뇌 섹션이 포함되어야 합니다.
- 면역히스토케미칼 염색을 위한 섹션 1세트를 선택하고 0.2% PBS-T에서 3 x 10분 세척으로 동결 방지 용액을 씻어냅니다.
- 블로킹 용액(일반 염소 세럼 10%, 소세럼 알부민(BSA)이 0.2% PBS-T로 부드러운 투두처리로 RT에서 1h를 차단합니다. 토끼 안티 티로신 하이드록실라제(TH) 항체(1:500) 및 마우스 항-α-syn 항체(1:500)를 실온에서 하룻밤 0.2% PBS-T로 배양하여 이에 따라보세요.
- 0.2% PBS-T에서 3 x 5 분 세척으로 1 차 항체를 씻어 내고, 염소 안티 래빗 알렉사 플루어 488 이차 항체 (1:500)와 염소 항 마우스 알렉사 플루어 555 이차 항체를 0.2 % PBS-T로 씻어. 섹션이 빛과 견과류로부터 부드럽게 보호되는지 확인합니다.
- 0.2% PBS-T로 3 x 5분 세척으로 이차 항체를 씻어내고 좁은 페인트 브러시를 사용하여 빛과 먼지로부터 보호되는 슬라이드에 전체 섹션 세트를 장착합니다. 투명 네일 바니시장착 매체와 씰이 있는 커버슬립.
3. 공초점 현미경 검사법과 이미지 수집
- 10배 배율로 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용하여 IHC 이미지를 캡처합니다. 핀홀을 1.5 AU로 열어 ~1.5 μm의 넓은 평면을 포착하고 뇌의 주입측에 초점을 맞춥니다.
- 수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10 x 4로 설정합니다.
- 수집 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정합니다. 이렇게 하면 타일 스캔 이미지 사이에 명백한 스티치 표시가 없습니다.
- 프레임 크기를 1024 x 1024 픽셀로 설정하고 평균을 2로 설정하여 고품질 의 이미지 수집을 보장합니다.
- 채널 패널에서 트랙 1을 Alexa488로 설정하고 2트랙을 Alexa555로 추적합니다.
- 슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.
- 채널 패널에서 레이저 강도와 게인을 신호를 최대화하고 배경에서 노이즈를 제한하는 수준으로 설정합니다. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과다 노출되지 않았는지 확인합니다(어두운 빨간색 오버레이로 표시됨).
- 레이저 강도 /게인슬라이드 사이에 조정할 수 없기 때문에 슬라이드 사이에 염색이 일관되도록 여러 슬라이드로 위의 단계를 반복하십시오.
- 획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다.
- 이 시점에서 이미징을 시작할 준비가 되었습니다. 접안렌즈를 사용하여, 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하고 관심 지점 (즉, SNpc)에 초점을 설정한 다음 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다. 이렇게 하면 x, y 및 z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다.
- SNpc의 전체 이미지 집합을 제공하는 SNpc 전체의 모든 섹션에 대해 위의 단계를 반복합니다. 주입되지 않은 측의 상세한 분석이 필요한 경우, 단계 3.10 에서 3.11 단계는 주입되지 않은 측에 초점을 설정하여 반복되어야한다.
4. 이미지 분석 및 수량
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 이미지 파일을 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
- SNpc 주위에 음부작성을 그릴 펜 어음 도구를 선택하여 관심 영역을 정의합니다.
참고: 다량의 도파민성 뉴런 손실이 있는 섹션에서, 일시적으로 발광/흡수를 증가시켜 SNpc(도2)를명확하게 정의하는 데 도움이 될 수 있다. - 분석 탭으로 이동하고 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수있습니다(그림 3).
- 분석 확대 섹션에서 적절한 이미지 확대/축소를 선택합니다.
- 세포 검출 섹션에서, TH 염색에 사용되는 염료로 핵염을 선택한다(Alexa Fluor 488).
- 실시간 튜닝 창을 주의 깊게 보면서 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성및 핵 크기 설정을 조정합니다.
참고: 실시간 튜닝 창에서 각 개별 셀을 단일 셀로 정확하게 표현하는 것은 정확성에 매우 중요합니다. 이러한 설정은 사용되는 소프트웨어에 따라 임의적인 척도에 있지만 소프트웨어가 개별 셀과 셀 과 배경 간에 정확하게 분화할 수 있도록 올바른 조정이필요합니다(그림 3). - 이 프로세스를 최소 10개의 개별 샘플로 반복하여 다른 섹션에 걸쳐 셀을 구성하는 것에 대한 균일한 동의를 보장합니다.
참고: 추가 셀 마커(예: α-syn 또는 NeuN)는 분석 탭의 마커 1 또는 마커 2 섹션을 사용하여 동일한 분석 플랫폼 내에서 식별할 수 있습니다. - 적절한 수의 이미지를 샘플링하고 그에 따라 실시간 튜닝이 조정되면 설정 작업 드롭다운 메뉴에서 분석 설정을 저장합니다.
- 분석할 모든 이미지를 선택하고 분석할 이미지를 클릭합니다.
- 방금 저장한 분석 설정을 선택하고 분석 영역에서 는 별표 레이어 상자를 선택합니다. 그런 다음 레이어 1을 확인하고 분석을클릭합니다.
참고: 단일 뇌의 경우 분석은 일반적으로 약 5분이 소요됩니다. 완료된 결과에셀로 계산된 각 항목(그림4)이명확하게 표시됩니다. - 완료되면 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 감지된각 셀의 셀 크기를 포함하여 자세한 데이터를 제공하는 개체 분석 데이터를 내보낼 수 있는 옵션이 있습니다. 이 데이터 집합은 독소/치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있습니다.
- 동물별로 분석된 각 섹션과 총 분석 영역(mm2)의총 셀을 추가합니다. 각 쥐에 대한 SNpc의 셀/mm2 수를 계산하기 위해 분석된 총 영역으로 총 셀 수를 나눕니다.
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Representative Results
AAV 주사 후 6주 후에 수집된 뇌 조직에 위의 방법을 적용함으로써, 쥐 뇌의 SNpc에서 돌연변이 A53T α-syn(AAV-A53T)을 발현하는 AAV의 스테레오테테 주사는 빈 벡터 AAV(AAV-EV)의 주입에비해 도파미네릭 뉴런의 밀도가 현저한 감소임을 입증하였다(AAV-EV). AAV-EV로 주입된 쥐의 SNpc에서 TH 양성 뉴런/mm2의 평균 수는 276.2 ± 34.7, AAV-A53T로 주입된 쥐의 SNpc에서 41.2 ± 17(P= 0.0003)이었다. SNpc에서 도파민성 뉴런/mm2의 수의 정량화는 이전에 발표된보고서(10,11)와유사하다. 여기에 설명된 방법에 대해 동물당 4개의 순차적 단면을 분석했다. 이전 연구는 3 섹션만큼 작은와 상당한 차이를 보여 주었다, 하지만 분석은 더 증가 할 수있다 12 조사자가 연구되는 모델과 개입에 따라 전체 SNpc를 포괄하는 섹션.
편견 없는 입체학은 또한 동일 동물에서 두뇌 단면도의 또 다른 세트에 이전에 기술된12로 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 쥐 뇌의 SNpc에서 돌연변이 A53T α-syn의 입체 적 주입이 EV-AAV(도 5C)의주입에 비해 SNpc에서 TH 양성 뉴런의 추정 총 수의 상당한 감소를 초래한다는 것을 입증했다. 중요한 것은, 무편견 입체학을 이용한 자동화된 이미지 분석 소프트웨어와 도파민성 뉴런 수를 이용한 추정도파민성 뉴런 밀도(r=0.8819, P=0.0007)(도 5D)를이용한 강한 상관관계가 있었다.
또한 자동화된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 AAV-A53T 또는 AAV-EV로 주입된 쥐의 주입되지 않은 측에 TH 양성 뉴런/mm2의 수를 결정하는 방법을 적용했습니다. AAV-A53T로 주입된 쥐의 미주입 SNpc에서 TH 양성 뉴런/mm2의 평균 수는 123.2 ± 26.4로, 주입된 SNpc보다 현저히 컸으며, 이는 44.0 ± 15.8(P = 0.0331) (보충 도1A)이었다. AAV-EV(215.6± 35.5)로 주입된 쥐의 미주입 SNpc에서 TH 양성 뉴런/mm2의 평균 수는 주입된 SNpc(276.2 ± 34.7)와 크게 다르지 않았으며, AAV-EV(보충도 1B)로주사로 인한 퇴행성이 없음을 확인하였다. 우리는 이러한 결과를 주입/미주입의 백분율로 계산하고 AAV-A53T로 주입된 동물이 AAV-EV 동물(보충 도1C)에비해 69% 감소한 것으로 나타났습니다.
그림 1: 메서드워크를 참조하십시오. AAV, 단면 및 얼룩 조직을 주입하고 관심 영역을 정의하고 셀 계산을 위해 소프트웨어를 최적화하는 데 필요한 단계를 보여 주는 워크플로우입니다. 공초점 타일 스캔, ROI 정의 및 셀 수량의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 관심 영역을 정의합니다. (A)관론 뇌 섹션은 AAV-A53T α-syn로 주입된 쥐로부터 TH(녹색)에 대한 SNpc 면역스테인드를 포함한다. 심한 신경변성을 가진 쥐(예: 여기에 도시된 것과 같이)에서는 SNpc를 식별하기 어려울 수 있습니다.(B)일시적으로 이미지의 흡수를 증가시켜 구조를 식별하고 관심 영역의 정확한 식별을 허용할 수 있다. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HALO에서 세포핵 방법을 사용하여 세포 검출을 최적화합니다. 사이토핵 모듈의 실시간 튜닝을 통해 사용자는 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성 및 핵 크기를 변경하여 실시간으로 세포 검출의 변화를 볼 수 있습니다. (A)관심 영역이 표시된 대표적인 이미지. (B)소프트웨어가 튜닝 창의 모든 세포를 감지하지 못하는 언더 샘플링을 보여주는 실시간 튜닝. (C)소프트웨어가 튜닝 창에서 분명하게 드러난 것보다 더 많은 세포를 감지하는 오버 샘플링. (D)정확한 셀 수가 계산되는 최적화된 튜닝. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HALO는 정의된 관심 영역 내에서 설정을 최적화했습니다. HALO에서 세포 핵 검출을 위한 최적화된 설정을 사용하여 완성된 분석의 대표적인 이미지입니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: SNpc에서 인간 돌연변이 A53T α-syn의 발현은 HALO 및 편견 없는 입체학에 의해 정량화된 6주에서 심한 신경변성을 초래합니다. (A)SNpc에서 TH 양성 뉴런의 변성을 보여주는 대표적인 이미지는 3.4 x10/10 12 의 titer에서 AAV-A53T α-syn의 스테레오테 삽입 후 6주 후에 SNpc에서 TH 양성 뉴런의 변성을 보여주는 대표적인 이미지입니다. 항TH (녹색) 및 항 α 신 (빨간색) 항체를 가진 면역 형광 염색. 스케일 바 = 200 μm.(B)AAV-A53T α-syn 또는 AAV-EV로 주입된 쥐의 SNpc에서 TH 양성 뉴런의 수를 정량화하면 돌연변이 α-syn의 발현이 상당한 도파민뉴 손실을 초래한다는 것을 보여준다. 페어링되지 않은 t-test; n = 5 쥐 / 그룹. 그래프는 sEM, *P < 0.001을 ± 의미합니다. (C)AAV-A53T의 SNpc(왼쪽) 또는 AAV-EV(오른쪽)의 주사쥐에서 도파민성 뉴런의 착색 염색의 대표적인 이미지(오른쪽) 편향된 입체학을 수행하는 데 사용되는 쥐. 스케일 바 = 200 μm.(D)TH 양성 뉴런/mm 2(y축) 및 편견없는 입체 세포 수(x 축)의 HALO 계수 사이의 유의한 상관관계. Pearson 상관 관계(r = 0.8819, P = 0.0007). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: AAV-A53T 주사를 받은 쥐의 SNpc에서 상당한 일방적 신경 변성 관찰. (A)일방적인 AAV-A53T 스테레오테테 주사를 받은 쥐의 주입 또는 미주입 SNpc에서 TH 양성 뉴런의 수를 정량화하면 주입측에 상당한 감소를 나타낸다. (B)일방적인 AAV-EV 스테레오테테 주사를 받은 쥐의 주입 또는 미주입 SNpc에서 TH 양성 뉴런의 수를 정량화하는 것은 큰 변화를 나타내지 않는다. (C)주입되지 않은 단량측으로의 정상화는 AAV-EV에 비해 AAV-A53T α-syn을 사용하여 주입시 >50% 감소를 나타낸다. 페어링되지 않은 t-test; n = 5 쥐 / 그룹. 그래프는 ± SEM, *P < 0.05, *P < 0.001을 의미합니다. 이 보충 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PD의 전임상 모델에서 도파민 시스템의 무결성에 대한 신뢰할 수 있는 평가는 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 결정하는 데 매우 중요합니다. 따라서 조직 병리학 데이터의 신뢰성과 재현성을 감소시킬 수 있는 잠재적인 혼동을 제어하고 최소화하는 것이 중요합니다. 신중한 정량적 결과는 정성적 또는 반정성 설명보다 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 동시에, 우리는 시간과 자원의 제약 조건이 병리학적 변화 또는 세포의 손실을 양화하기 위해 편견없는 입체 계수를 수행하기 어렵게 만들 수 있음을 인식해야합니다. 그러나, 최근 의 진보와 함께, 이러한 기준의 대부분은 전산화 및 자동화 된 이미징 플랫폼을 사용하여 충족 될 수있다6.
이 프로토콜은 설치류 뇌에서 도파민뉴런/mm2의 입체적 추정을 결정하는 데 중요한 여러 단계를 설명합니다. 그것은 우리가 SNpc에 AAV를 제공하기 위해 입체 주입을 사용 주의해야한다, 어떤 치료의 효과를 결정하기 위해 이러한 바이러스의 정확한 전달에 중요성을 배치. 우리의 연구 결과에 사용된 좌표는 -5.2 mm (전방 후방), -2 mm (오른쪽 내측 측면) 및 -7.5 mm (두개골에서 등쪽 복부) 무게 성인 여성 쥐에 ~275 g. 이러한 좌표를 사용하여 바이러스를 올바르게 전달하면 SNpc에 대한 AAV를 전달할 수 있습니다.
이 외에도 염색을 위해 조직을 준비할 때주의를 기울여야 합니다. 무엇보다도 오른쪽/왼쪽에 있는 쪽을 표시하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 우리의 손에, 가장 쉽고 가장
이를 수행하는 재현 가능한 방법은 25G 바늘을 사용하여 왼쪽 등쪽 중뇌에서 주기적으로 구멍을 찌르고 주입되지 않은 측면을 식별하는 것이었습니다. 설치류 뇌의 신경 해부학 적 영역에 대한 심층적인 지식은 절단을 시작할 때 를 구별하고 나중에 관심 영역을 그릴 때 SNpc를 식별하는 것이 중요합니다. TH 염색은 SNpc의 뉴런만 얼룩이 아니며, 복부 테지멘탈 영역과 레트로루블 필드에서 TH 양성 뉴런을 구별할 수 있어야 합니다. 쥐 두뇌 아틀라스는 설치류 신경 해부학에 경험이 부족한 사람들을 위한 유용한 가이드입니다. 항체 잠복기는 프로토콜 전체에 걸쳐 균일하며, 초점은 광표백을 피하기 위해 가능한 최소 시간에 설정된다.
일관된 신경 해부학 적 특징이 섹션을 구별하는 데 사용되는 경우 샘플 사이에 낮은 가변성이 있다. 경험이 풍부하고 눈이 멀었던 관찰자가 관심 영역을 그리는 것은 분석할 섹션 전반에 걸쳐 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 보충도 1에 도시된 바와 같이 미주입측의 분석은 방법에 일관성이 있음을 보여준다. 그러나 이러한 방식으로 데이터를 해석할 때주의를 기울여야 합니다. 뇌를 슬라이스하는 것은 지속적으로 뇌의 각 측면에 알려진 신경 해부학 적 기능의 존재를 비교에 의존. 미묘한 차이는 주어진 단면도에 주입되지 않은 측이 주입된 측보다 더 후방/전방일 수 있고, 따라서 정확한 직접 비교가 아님을 의미할 수 있다. 제시된 데이터의 추가 분석은 이 방법의 한계를 강조합니다. 주입되지 않은 측에서 도파민성 뉴런 카운트(AAV-A53T 그룹에서 123.2 대 AAV-EV의 215.6)에는 큰 정도의 가변성이 있으며, 이는 유사하게 노화된 동물 들 사이에서는 기대하지 않을 것이다. 이 연구에서 사용되는 작은 샘플 크기와 위에서 언급한 해부학적 차이를 포함하여 이러한 불일치에 대한 여러 가지 가능한 이유가 있습니다. 이 외에도, 형광 신호에 대한 초점은 주입된 측에 설정되어, z-평면의 약간의 변화가 주입되지 않은 측면을 초점에서 벗어날 수 있으며, 따라서 일부 세포는 세포 계수 소프트웨어에 의해 검출되지 않을 것이다. 이러한 이유로, 알려진 신경 해부학 기능을 사용 하 여 한쪽에 도파민형 뉴런/mm2의 수를 비교 하는 것이 좋습니다., 어디 초점은 이 지역에 대 한 특별히 현미경에 설정 되었습니다. 주입되지 않은 측에 대한 비교가 필요한 경우 이 쪽에 초점을 맞추어 이미징을 반복해야 합니다.
우리는 최소한의 사용자 교육(13)으로정량적 이미지 분석을 제공하는 여러 소프트웨어 패키지 중 하나로 얻은 데이터를 제시한다. 다른 프로그램은 사용할 수 있으며 PD6의실험 모델에서 도파민성 뉴런 손실의 정량화를 포함하여 신경 병리학을 연구하기 위해 점점 더 채택되고 있다. 일부 소프트웨어 패키지는 특정 기능(예: 아밀로이드 플라크 계산)을 수행하기 위한 기본 제공 알고리즘을 제공하지만, 많은 소프트웨어 패키지는 반복분석을 수행하는 실험실에 특히 유용하게 만드는 몇 가지 일반적인 기능을 공유합니다. 관심 영역 식별 영역 외에도 신호(조직 접기, 에지 아티팩트, 잉크 마크, 얼룩 등)를 방해하는 전처리 단계는 수동 및 패턴 인식 도구에 의해 관심 영역에서 제거될 수 있습니다. 더욱이, 제공된 판독값은 단백질, 세포 또는 행동 연구에서 얻은 정량적 가치와 함께 변수 간의 관계 및 잠재적 상관 관계를 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.
위에서 설명한 방법은 면역 조직화학적으로 얼룩진 뇌 섹션에서 뉴런 수를 추정하기 위한 정확하고 반정적이며 비교적 저렴한 절차를 제공합니다. 실시간 튜닝 기능은 모든 섹션에 대한 메서드를 조정할 수 있으며 슬라이싱 메서드에서 약간의 분산으로도 일관성을 보장합니다. 시각 장애인 관찰자가 SNpc에 대한 관심 영역을 식별하면 확인 또는 선택 편향이 완화되고 소프트웨어는 뉴런/mm2의계산을 허용하는 간단한 판독을 제공합니다. 이 방법은 보다 확립된 입체 프로토콜에 비해 효율성과 비용 이점을 유지하면서 다른 뇌 영역에서 뉴런의 정확한 수를 제공하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 두꺼운 섹션에 대한 슬라이드 스캐닝 기술의 발전은 또한 위에서 설명한 방법에 대한 보다 효율적인 처리 시간을 허용할 것입니다.
제한
설명된 방법은 그것의 속도와 신경 밀도에 있는 큰 변경을 검출하는 기능에 있는 명백한 이점의 다수를 가지고 있습니다, 그러나 또한 그것의 자신의 도전을 제기합니다. 입체학과와 달리 이 방법은 절대 세포 수의 추정을 제공할 수 없지만 대신 SNpc 내의 세포 밀도를 계산합니다. 세포 밀도의 추정은 높게, 그러나 완벽하게, 편견없는 입체학을 사용하여 얻은 세포 수와 상관관계가 있습니다. 또한, 상기 방법은 분석을 시작하기 전에 사용자가 셀 크기와 형상의 튜닝에 의존한다. 이것은 초점이 있는 평면에 부분적으로 있기 때문에 세포가 놓치지 않을 것이라는 점을 보장할 수 없습니다, 또는 특이한 크기 및/또는 모양의 세포는 소프트웨어에 의해 놓칠 것입니다. 저자의 경험에서, 방법은 전임상 설치류 모형에 있는 잠재적인 질병 수정 치료의 효험을 검토하기 위하여 특히 유용합니다. 결론적으로, 세포 수를 정량화하는 입체적 방법은 신경 과학에서 널리 사용되는 반면, 디지털화의 급속한 가속은 자동화 된 이미지 분석 플랫폼이 점점 더 신경 병리학을 연구하기 위해 채택 될 것을 시사, 특히 그들은 개선을 계속으로. 조사관은 이 방법의 기술적 한계를 이해하고 신중하게 고려한 후 이 방법론을 적용하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 관심사를 보고 하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 이 프로토콜 개발에 있는 그들의 시간 및 지원에 대한 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 검사기 시설 (AOMF)에 있는 모든 직원에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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