Summary
Burada sıçan substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron sayısının yarı nicel belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Substantia nigradaki dopaminerjik nöronların sayısının tahmin edilmesi klinik öncesi Parkinson hastalığı araştırmalarında önemli bir yöntemdir. Şu anda, tarafsız stereolojik sayım bu hücrelerin ölçülmesi için standarttır, ancak tüm projeler için mümkün olmayabilecek zahmetli ve zaman alıcı bir süreç olmaya devam etmektedir. Burada, önceden tanımlanmış bir ilgi alanında etiketli hücrelerin miktarını doğru bir şekilde tahmin edebilen bir görüntü analizi platformunun kullanımını açıklıyoruz. Sıçan beyninde bu analiz yöntemi için adım adım bir protokol açıklıyoruz ve substantia nigradaki mutant α-sinüklein ekspresyumu nedeniyle tirozin hidroksilaz pozitif nöronlarında önemli bir azalma tanımlayabileceğini gösteriyoruz. Bu metodolojiyi tarafsız stereoloji ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırarak doğruladık. Birlikte ele alındığında, bu yöntem dopaminerjik nöron sayısındaki değişiklikleri tespit etmek için zaman verimli ve doğru bir süreç sağlar ve bu nedenle müdahalelerin hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin verimli bir şekilde belirlenmesi için uygundur.
Introduction
Parkinson hastalığı (PD), α-sinüklein (α-syn) içeren protein agregalarının varlığı ve substantia nigra pars compacta (SNpc)1'dedopaminerjik nöronların tercihli kaybı ile karakterize yaygın bir nörodejeneratif hareket bozukluğudur. Dopaminerjik nöron sayısının ölçülmesi, nigrostriatal sistemin bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verdiği için PD araştırmasının hayati bir parçasıdır, bu nedenle potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için önemli bir uç nokta sağlar. Şu anda, hücre sayısının ölçülmesi için standart, üç boyutlu (3D) yapılarda hacimsel özellikleri tahmin etmek için dokunun iki boyutlu (2D) kesitlerini kullanan tarafsız stereolojiksayımdır 2,3,4. Modern tasarım tabanlı stereolojik yöntemler, kapsamlı rastgele örnekleme prosedürleri uygular ve potansiyel yapıtları ve sistematik hataları önlemek için sayım protokolleri (problar olarak bilinir) uygular ve farklılıkların hayvanlar arası varyasyondan sadece biraz daha büyük güvenilir bir şekilde tespit edilmesine izin verir5. Stereology in vivo histolojik çalışmalar için güçlü bir analitik araç sağlarken, zaman yoğundur, tek tip numune hazırlamayı varsayar ve klinik öncesi çevirisel araştırma için giderek daha fazla gerekli olan verimliliği etkileyebilecek birkaç adımda doğrulama gerektirir.
Dijital bilimdeki son teknolojik gelişmeler, bir yandan stereomikroskop olmadan patolojinin daha verimli değerlendirilmesi için yeni uygulamaların benimsenmesini mümkün getirirken, bir yandan da tarafsız stereolojinin bir vekili olarak bir ihtiyacı dolduruyor. Bu yöntemler hızı arttırır, insan hatasını azaltır vesterolojik tekniklerin tekrarlanabilirliğini artırır6,7. HALO, dijital patolojide nicel doku analizi için böyle bir görüntü analizi platformudur. Çeşitli modüllerden oluşur ve örüntü tanıma algoritmalarını kullanarak tüm doku bölümlerinde hücre bazında morfolojik ve çoklanmış ifade verilerini raporlar. Cytonükleer FL modülü, çekirdek veya sitoplazmadaki floresan belirteçlerin immünofluoresan pozitifliğini ölçer. Bu, her işaretleyici için pozitif hücre sayısının ve her hücrenin yoğunluk puanının bildirilmesini sağlar. Modül, dopaminerjik nöronların ölçülmesi için gerekli olmasa da, bireysel hücre boyutları ve yoğunluk ölçümleri sağlamak için uyarlanabilir.
Bu çalışmanın amacı, nigral nörodejenerasyon 8 ,9,10'undahaönce doğrulanmış viral vektör bazlı α-syn sıçan modeli ile bu yöntemi doğrulamaktır. Bu modelde, insan mutant A53T α-syn, SNpc'de adeno ilişkili virüs hibrid serotip 1/2'nin (AAV1/2) stereotaktik enjeksiyonu ile ifade edilir ve 6 haftalık bir süre boyunca önemli nörodejenerasyon ile sonuçlanır. Kontrallateral uninjected SNpc, bazı çalışmalarda, enjekte edilen taraf için bir iç kontrol görevi görebilir. Daha yaygın olarak, hayvanların bir kontrol kohortuna AAV-Boş Vektör (AAV-EV) enjeksiyonu negatif kontrol olarak kullanılır. Otomatik bir görüntü analiz yazılımı kullanarak 6 hafta sonra enjekte edilen SNpc'de kalan dopaminerjik nöronların yoğunluğunu tahmin etmek için adım adım bir kılavuz sunuyoruz (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Üniversite Sağlık Ağı Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi tarafından belirlenen kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Stereotaktik enjeksiyon
- Çift ev yetişkin dişi Sprague-Dawley sıçanları (250-280 g) ahşap yatak ve yiyecek ve suya ad lib erişimi ile kafeslerde. Hayvan kolonisini sabit sıcaklık ve nem ile düzenli 12 saat açık / karanlık döngüde (06:30'da ışıklar) koruyun.
- AAV'nin tek taraflı stereotaktik enjeksiyonunun doğrudan beynin sağ tarafındaki SNpc'ye (her laboratuvarın tercihlerine göre sağ veya sol taraf) daha önce açıklandığı gibi8,10. 3,4 x 10 12 genomik parçacık/mL'lik son titreye2 μL AAV1/2 enjekte edin.
2. Beyin kesit ve immünostokimya (IHC)
- 3 dakika boyunca bir anestezi odasına yerleştirerek sıçanı% 5 izofluran ile uyuşturun. Uygun kurumsal incelemeden sonra bu adım için onaylanan diğer yöntemler kullanılabilir.
- Sıçan derin anestezinin cerrahi bir düzlemine ulaştığında, nekropsi masasına sıkıca yapıştırılmış bir burun konisine aktarın. Farenin fore-paws bant kullanarak sabitleyin ve anestezinin derinliğini belirlemek için parmak sıkışma tepki yöntemini kullanın. Hayvan devam etmeden önce tepkisiz olmalıdır.
- Sternumun altında yanal bir kesi yapın ve plevral boşluğu açığa çıkarmak için göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframı kesin. Sternumu bir hemostatla kaldırın ve kelepçeleyin ve başın üzerine yerleştirin.
- Kalbi tokalar kullanarak sıkıştırın ve perfüzyon pompasına bağlı bir kelebek iğnesini sol ventrikülün arka ucuna yerleştirin. Sıçanı transkardiyöz olarak 150 mL heparinize salin ile veya gözler ve cilt temizlenene kadar perfuse. Bazı antikorlar veya daha ince beyin kesileri ile immün yetinmeyi kolaylaştırmak için salin yerine %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüzyon tercih edilebilir.
- Perfüzyon tamamlandıktan sonra, bir giyotinle kafalarını koparın ve beyni bir beyin matrisine, ventral yüzeye bakacak şekilde çıkarın.
- Taze bir jilet kullanarak, koronal düzlemde optik chiasm'a 2 mm rostral bir kesim yapın. Dilimleme yaparken beynin çarpıtılmasını önlemek için bıçağı bir yandan diğer yana kaydırın.
- Beynin arka kısmını, oda sıcaklığında 48 saat sonra sabitleme için yaklaşık 20 mL% 4 PFA içeren önceden etiketlenmiş bir şişeye batırın. Beynin ön kısmı -80 °C'de depolanmadan önce -42 °C'ye soğutulmuş 2-metilbütan içinde donmuş olabilir.
- 48 saat sonra, sabit beyinleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 30 sakkaroz içeren etiketli bir şişeye aktarın ve batana kadar (48-72 saat) 4 °C'de saklayın.
- Numune aşamasının oluğuna kuru buz ve ardından% 100 etanol yerleştirerek bir mikrotom hazırlayın. Sahne soğuduktan sonra, 2 cm çapında ve 0,5 cm kalınlığında bir daire oluşturana kadar optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği sahnenin üzerine sıkın. Kısmen donduktan sonra, beyni OCT höyüğüne dikkatlice dirakle ve striatal kesme yüzeyinin aşamaya paralel kalmasını sağlayın.
- Beynin donmasına yardımcı olmak için sahneye daha fazla kuru buz ekleyin. Beyin krem rengine döndükten sonra, kuru buzun aşamasını temizleyin.
- Sağ ve sol yarımküreleri ayırt etmek için 25G iğne ile beynin sağ tarafına bir delik açın. İğneyi ilgi çekici anatomik yapılardan geçirmemeye özen göster.
- Bregma -3.8'den başlayıp bregma -6.8'de biten koronal düzlemde seri olarak 40 μm kesitler kesin.
- Altı seriyi anti-freeze çözeltili etiketli tüplerde saklayın (%40 PBS, %30 2-etoksiyethanol, %30 gliserol). Her seri 12 beyin bölümü içermelidir.
- İmmünohistokimyasal boyama için bir bölüm kümesi seçin ve %0,2 PBS-T'de 3 x 10 dakikalık yıkamalarla donma önleyici çözeltiyi yıkayın.
- Blokaj çözeltisinde (%10 normal keçi serumu (NGS), %0,2 PBS-T'de %2 sığır serumu albümin (BSA) ile RT'de 1 saat boyunca blok. Bunu, oda sıcaklığında gece boyunca %0,2 PBS-T'de % 2 NGS'de tavşan anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikor (1:500) ve fare anti-α-syn antikor (1:500) ile inkübasyon ile takip edin.
- Birincil antikoru % 0.2 PBS-T'de 3 x 5 dakikalık yıkamalarla yıkayın, ardından keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:500) ve keçi anti-fare Alexa Fluor 555 ikincil antikor ile% 2 NGS'de% 0.2 PBS-T'de 1 saat inkübasyon. Bölümlerin ışıktan ve hafifçe fındıklamadan korunduğundan emin olun.
- İkincil antikoru %0,2 PBS-T'de 3 x 5 dakikalık yıkamalarla yıkayın ve dar bir boya fırçası kullanarak ışık ve tozdan korunan slaytlara tüm bölüm setini monte edin. Floresan montajlı kapakçık ve berrak tırnak verniği ile mühürleyin.
3. Konfokal mikroskopi ve görüntü alımı
- 10x büyütmede konfokal mikroskopla birleştirilmiş yazılımı kullanarak IHC görüntülerini yakalayın. Toplam ~1,5 μm'lik geniş bir düzlemi yakalamak için iğne deliğini 1,5 AU'ya açın ve odağı beynin enjekte edilen tarafına ayarlayın.
- Edinme sekmesinde Döşeme Taraması görüntüleme seçeneğini işaretleyin ve boyutları 10 x 4 olarak ayarlayın.
- Edinme Modu panelinin altında Yakınlaştırma'yı 1.1 olarak ayarlayın. Bu, döşeme tarama görüntüleri arasında belirgin dikiş izlerini önlemeye yardımcı olur.
- Yüksek kaliteli görüntü alımını sağlamak için Çerçeve Boyutunu 1024 x 1024 piksel ve Ortalamayı 2 olarak ayarlayın.
- Kanallar panelinde, parça 1'i Alexa488'e ve 2.
- Slaydı sahne alanına yükleyin ve güçlü TH boyamaya sahip bir bölüm seçin. Edinme panelinde Canlı'ya tıklayın.
- Kanallar panelinde, Lazer Gücü ve Kazancı'nı sinyali en üst düzeye çıkaran ve arka plandan gelen gürültüyü sınırlayan seviyelere ayarlayın. Sinyallerin aşırı pozlanmadığından emin olmak için aralık göstergesini kullanın (koyu kırmızı kaplamada belirtildiği gibi).
- Lazer gücü/kazancı slaytlar arasında ayarlanamadığından, lekelemenin slaytlar arasında tutarlı olduğundan emin olmak için yukarıdaki adımı birden fazla slaytla tekrarlayın.
- Edinme sekmesinde Pozisyonlar kutusunu işaretleyin.
- Bu noktada, görüntülemeye başlamaya hazırsınız. Göz merceği kullanarak, pozitif TH boyama gösteren ilk bölümü seçin, odağı ilgi çekici noktaya (yani SNpc) ayarlayın ve ardından sahneyi bölümün orta çizgisine taşıyın. Bu, x, y ve z eksenlerindeki konumu kaydeder ve tüm bölümü yakalayan bir döşeme taraması görüntüler.
- SNpc boyunca tüm bölümler için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve SNpc'nin tam bir görüntü kümesini verin. İstenmeyen tarafın ayrıntılı analizi gerekiyorsa, odağın seçilmemiş tarafa ayarlanmasıyla 3.10 ile 3.11 adımları tekrarlanmalıdır.
4. Görüntü analizi ve nicelik
- Uygun yazılımı kullanarak görüntü dosyalarını ayır ve görüntü dosyalarını otomatik görüntü analizi yazılımına içe aktarın.
- SNpc'nin etrafına ek açıklama çizmek için Kalem ek açıklama aracını seçerek ilgi çekici bir bölge tanımlayın.
NOT: Çok miktarda dopaminerjik nöron kaybı olan bölümlerde, yayılmayı / emilimi geçici olarak artırmak SNpc'yi net bir şekilde tanımlamaya yardımcı olabilir (Şekil 2). - Çözümleme sekmesine gidin ve açılır Çözümle menüsünden Gerçek Zamanlı Ayarlama 'yıseçin. Bu, bölüm görüntüsünde analiz parametrelerinin gerçek zamanlı olarak değiştirilmesine izin verilen ayrı bir pencere açar (Şekil 3).
- Analiz Büyütme bölümünün altında uygun görüntü yakınlaştırmasını seçin.
- Hücre Algılama bölümünde, TH boyama için kullanılan boya olarak nükleer boyayı seçin (Alexa Fluor 488).
- Gerçek Zamanlı Ayarlama penceresini dikkatle izlerken Nükleer Kontrast Eşiği, Minimum Nükleer Yoğunluk, Nükleer Segmentasyon Agresifliğive Nükleer Boyut ayarlarını yapın.
NOT: Her bir hücrenin Gerçek Zamanlı Ayarlama penceresinde tek bir hücre olarak doğru bir şekilde temsil edilmesi doğruluk açısından hayati önem taşır. Bu ayarlar kullanılan yazılıma bağlı olarak rasgele bir ölçektedir, ancak yazılımın tek tek hücreler arasında ve hücreler ile arka plan arasında doğru bir şekilde ayırt etmesine izin vermek için doğru ayarlama gereklidir (Şekil 3). - Farklı bölümlerde bir hücreyi oluşturan şeyin tekdüze bir şekilde kabul etmesini sağlamak için bu işlemi en az 10 ayrı örnekle tekrarlayın.
NOT: Ek hücre işaretleyicileri (α-syn veya NeuN gibi) analiz sekmesindeki İşaretçi 1 veya İşaretçi 2 bölümleri kullanılarak aynı analiz platformunda tanımlanabilir. - Uygun sayıda görüntü örneklendikten ve Gerçek Zamanlı Ayarlama buna göre ayarlandıktan sonra, analiz ayarlarını Ayarlar Eylemleri açılır menüsüne kaydedin.
- Analiz edilecek tüm görüntüleri seçin ve Analiz Et 'itıklatın.
- Yeni kaydettiğiniz analiz ayarını seçin ve Analiz Bölgesi penceresinde Ek Açıklama Katmanları kutusunu işaretleyin. Ardından Katman 1'i kontrol edin ve Çözümle 'yitıklatın.
NOT: Tek bir beyin için analiz genellikle yaklaşık 5 dakika sürer. Tamamlanan sonuç, hücre olarak sayılan her öğeyi açıkça gösterecektir (Şekil 4). - Tamamlandıktan sonra, tüm bölümler için özet analiz verilerini dışa aktarabilirsiniz. Nesne Çözümleme Verileriniverme seçeneği , algılanan her bir hücrenin hücre boyutu da dahil olmak üzere ayrıntılı veriler verecektir. Bu veri kümesi, bir toksin/terapötik yanıt olarak hücre boyutundaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.
- Hayvan başına analiz edilen her bölümden Toplam Hücreleri ve Toplam Analiz Edilen Alanı (mm2)ekleyin. Her sıçan için SNpc'deki hücre/mm2 sayısını hesaplamak için toplam hücre sayısını analiz edilen toplam alana bölün
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki yöntemleri AAV enjeksiyonlarından 6 hafta sonra toplanan beyin dokusuna uygulayarak, sıçan beyninin SNpc'sinde mutant A53T α-syn (AAV-A53T) ifade eden AAV'nin stereotaktik enjeksiyonunun, kontrol olarak boş vektör AAV (AAV-EV) enjeksiyonuna kıyasla dopaminerjik nöronların yoğunluğunda önemli bir azalmaya neden olduğunu gösterdik (Şekil 5A,B). AAV-EV enjekte edilen sıçanların SNpc'sinde ortalama TH pozitif nöron/mm2 sayısı 276.2 ± 34.7, AAV-A53T enjekte edilen sıçanların SNpc'sinde ise 41.2 ± 17 idi(P = 0.0003). SNpc'deki dopaminerjik nöron/mm2 sayısının ölçülmesi daha önce yayınlanan raporlara benzer10,11. Burada açıklanan yöntemler için hayvan başına 4 sıralı bölüm analiz edildi. Önceki çalışmalar 3 bölüm kadar az bir süre ile önemli farklılıklar göstermiştir, ancak analiz, araştırmacı tarafından incelenen modele ve müdahaleye bağlı olarak tüm SNpc'yi kapsayacak şekilde 12 bölüme kadar artırılabilir.
Tarafsız stereology de daha önce aynı hayvanlardan başka bir beyin bölümü kümesinde12 olarak tanımlandığı gibi gerçekleştirildi. Bu yöntemi kullanarak, sıçan beyninin SNpc'sinde mutant A53T α-syn'nin stereotaktik enjeksiyonunun, EV-AAV enjeksiyonuna kıyasla SNpc'deki tahmini toplam TH pozitif nöron sayısında önemli bir azalmaya neden olduğunu da gösterdik (Şekil 5C). Daha da önemlisi, otomatik görüntü analiz yazılımı kullanılarak tahmin edilen dopaminerjik nöron yoğunluğu ile tarafsız stereoloji (r = 0.8819, P=0.0007) kullanılarak tahmin edilen dopaminerjik nöron sayısı arasında güçlü bir korelasyon vardı (Şekil 5D).
Ayrıca, AAV-A53T veya AAV-EV enjekte edilen sıçanların seçilmemiş tarafında TH pozitif nöron/mm2 sayısını belirlemek için otomatik görüntü analizi yazılımı kullanarak yöntemlerimizi uyguladık. AAV-A53T enjekte edilen sıçanların snpc'sinde ortalama TH pozitif nöron/mm2 sayısı 123.2 ± 26.4 idi. enjekte edilen SNpc'den önemli ölçüde daha büyüktü, bu da 44.0 ± 15.8 (P = 0.0331) (Ek Şekil 1A). AAV-EV(215.6 ± 35.5) enjekte edilen sıçanların snpc'sinde ortalama TH-pozitif nöron/mm 2 sayısı enjekte edilen SNpc'den (276.2 ± 34.7) önemli ölçüde farklı değildi ve AAV-EV(Ek Şekil 1B)ile enjeksiyon nedeniyle dejenerasyon olmadığını doğruladı. Bu sonuçları enjekte edilen/tedavi edilmeyenlerin bir yüzdesi olarak hesapladık ve AAV-A53T enjekte edilen hayvanların AAV-EV hayvanlarına kıyasla% 69 azalma olduğunu gördük (Ek Şekil 1C).
Şekil 1: Yöntemin iş akışı. AAV'leri, kesitleri ve leke dokusunu enjekte etmek, ilgi çekici bir bölge tanımlamak ve hücrelerin sayımı için yazılımı optimize etmek için gereken adımları gösteren iş akışı. Konfokal karo taramasının, yatırım getirisi tanımının ve hücrelerin niceliğinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İlgi çekici bölgeyi tanımlama. ( A )AAV-A53Tα-syn enjekte edilen bir sıçandan TH (yeşil) için immünositlenmiş SNpc dahil olmak üzere koronal beyin bölümü. Şiddetli nörodejenerasyona sahip sıçanlarda (burada gösterildiği gibi), SNpc'yi tanımlamak zor olabilir. (B) Görüntünün emilimini geçici olarak artırmak yapıyı tanımlayabilir ve ilgi çekici bölgenin doğru bir şekilde tanımlanmasına izin verebilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HALO'da Cytonuclear yöntemi kullanılarak hücre algılamanın optimize edilmesi. Sitükleer modülün gerçek zamanlı olarak ayarlanması, kullanıcının Nükleer Kontrast Eşiği, Minimum Nükleer Yoğunluk, Nükleer Segmentasyon Agresifliği ve Nükleer Boyut'u değiştirerek hücre algılamadaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak görmesini sağlar. (A) İlgi alanı görüntülenen temsili görüntü. (B) Yazılımın ayarlama penceresindeki tüm hücreleri algılamadığı eksik örneklemesi gösteren gerçek zamanlı ayarlama. (C) Yazılımın ayarlama penceresinde belirgin olandan daha fazla hücre algıladığı aşırı örnekleme. (D) Doğru sayıda hücrenin sayılmış olduğu en iyi duruma getirilmiş ayarlama. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: HALO, tanımlanmış bir ilgi alanı içinde ayarları optimize etti. HALO'da sitokleer algılama için optimize edilmiş ayarlar kullanılarak tamamlanan analizin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SNpc'de insan mutant A53T α-syn ekspresyonu, HALO ve tarafsız stereology ile ölçülen 6 haftada şiddetli nörodejenerasyonla sonuçlanır. (A) AAV-A53T α-syn'nin stereotaktik enjeksiyonundan 6 hafta sonra SNpc'de TH pozitif nöronların dejenerasyonunu gösteren temsili görüntüler 3.4 x 1012 viral parçacık / mL titrede. Anti-TH (yeşil) ve anti-α-syn (kırmızı) antikorları ile immünofluoresan lekeleme. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) AAV-A53T α-syn veya AAV-EV enjekte edilen sıçanların SNpc'sinde TH pozitif nöron sayısının ölçülmesi, mutant α-syn ekspresyonunun önemli dopaminerjik nöron kaybına neden olduğunu göstermektedir. Eşleşmeyen t-test; n = 5 sıçan/grup. Grafik ortalama ± SEM, ***P < 0.001 gösterir. (C)AAV-A53T (solda) veya AAV-EV (sağda) enjekte edilen sıçanların SNpc'sinde dopaminerjik nöronların kolorimetrik lekelenmelerinin temsili görüntüleri tarafsız stereology yapmak için kullanılır. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D) TH pozitif nöronların/mm2'nin (y ekseni) HALO sayımı ile tarafsız stereoloji hücre sayıları (x ekseni) arasında anlamlı bir korelasyon. Pearson korelasyonu (r = 0.8819, P = 0.0007). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: AAV-A53T enjeksiyonu yapılan sıçanların SNpc'sinde önemli tek taraflı nörodejenerasyon gözlenir. (A) Tek taraflı AAV-A53T stereotaktik enjeksiyon alan sıçanların enjekte edilen veya seçilmemiş SNpc'lerindeki TH pozitif nöron sayısının nicelleştirilmesi, enjekte edilen tarafta önemli bir azalma olduğunu göstermektedir. (B) Tek taraflı AAV-EV stereotaktik enjeksiyonu alan sıçanların enjekte edilen veya seçilmemiş SNpc'lerindeki TH pozitif nöron sayısının nicelleştirilmesi önemli bir değişiklik göstermiyor. (C) Uninjected kontralteral tarafa normalleşme, AAV-EV'ye kıyasla AAV-A53T α-syn ile enjeksiyonda % >50'lik bir azalma göstermektedir. Eşleşmeyen t-test; n = 5 sıçan/grup. Grafikler ortalama ± SEM, *P < 0.05, ***P < 0.001 gösterir. Bu Ek Rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PD'nin klinik öncesi modellerinde dopaminerjik sistemin bütünlüğünün güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, histopatolojik verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini azaltabilecek potansiyel kafa karıştırıcıları kontrol etmek ve en aza indirmek önemlidir. Dikkatli nicel sonuçlar, tek başına nitel veya yarı nicel açıklamalardan daha fazla bilgi sağlayabilir. Aynı zamanda, zaman ve kaynaklardaki kısıtlamaların patolojik değişiklikleri veya hücre kaybını nicel hale getirmek için tarafsız stereolojik sayım yapmayı zorlaştırabileceğini kabul etmeliyiz. Ancak, son gelişmelerle, bu kriterlerin çoğu bilgisayarlı ve otomatik görüntüleme platformları kullanılarak yerine getirilebilir6.
Bu protokol, kemirgen beyninde dopaminerjik nöronların/mm2'ninstereolojik tahminini belirlemede bir dizi önemli adımı açıklar. Herhangi bir tedavinin etkisini belirlemek için bu virüslerin doğru teslimatına önem veren SNpc'ye AAV'leri teslim etmek için stereotaktik enjeksiyon kullandığımız belirtilmelidir. Çalışmamız için kullanılan koordinatlar, ~275 g ağırlığındaki yetişkin dişi sıçanlarda bregma -5.2 mm (ön-posterior), -2 mm (sağda medial-lateral) ve -7.5 mm (kafatasından dorsal ventral) olarak görevlendirilmiştir. Bu koordinatları kullanarak virüsün doğru teslimatı, AAV'lerin SNpc'ye teslimini sağlayacaktır.
Buna ek olarak, dokuları lekelenme için hazırlarken dikkatli olunmalıdır. Her şeyden önce, hangi tarafın sağ/sol olduğunu işaretlemeye özen edilmelidir. Bizim elimizde, en kolay ve en
bunu yapmanın tekrarlanabilir yolu, 25G iğne kullanarak sol sırt orta beyinde periyodik olarak bir delik açmak ve tanımlanmamış tarafı tanımlamaktı. Kemirgen beyninin nöroanatomik bölgeleri hakkında derinlemesine bir bilgi, kesmeye ne zaman başlanacaklarını ayırt etmek ve daha sonra ilgi çekici bir bölge çizerken SNpc'yi tanımlamak için önemlidir. TH lekelemenin sadece SNpc'nin nöronlarını lekelemediğini ve ventral tegmental bölgedeki ve retrorubal alandaki TH pozitif nöronları ayırt edebilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir. Sıçan beyin atlası, kemirgen nöroanatomi deneyimi olmayanlar için yararlı bir rehberdir. Antikor inkübasyon süreleri protokol boyunca tekdüzedir ve odak fotobleaching önlemek için mümkün olan en az sürede ayarlanır.
Bölümler arasında ayrım yapmak için tutarlı nöroanatomik özellikler kullanıldığında örnekler arasında düşük bir değişkenlik vardır. Deneyimli, kör bir gözlemcinin ilgi çekici bölgeyi çizmesi, analiz edilecek bölümlerde tutarlılığı korumak için önemlidir. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, incelenmemiş tarafın analizi, yöntemin bir tutarlılığı olduğunu göstermektedir. Ancak verileri bu şekilde yorumlarken dikkatli olunmalıdır. Beyinleri dilimleme, beynin her iki tarafında bilinen nöroanatomik özelliklerin varlığını karşılaştırmaya dayanır. İnce farklılıklar, belirli bir bölümdeki seçilmemiş tarafın enjekte edilen taraftan daha arka/ ön olabileceği ve bu nedenle doğru bir doğrudan karşılaştırma olmadığı anlamına gelebilir. Sunulan verilerin daha fazla analizi, bu yöntemin bir sınırlamasını vurgulamaktadır. Dopaminerjik nöron sayılarında, benzer yaşlı hayvanlar arasında beklenmeyecek büyük ölçüde değişkenlik vardır (AAV-A53T grubunda 123.2 ve AAV-EV'de 215.6). Bu çalışmada kullanılan küçük örneklem büyüklüğü ve yukarıda belirtilen anatomik farklılıklar da dahil olmak üzere bu tutarsızlığın bir dizi olası nedeni vardır. Buna ek olarak, floresan sinyali için odak enjekte edilen tarafta ayarlanır, yani z düzleminde hafif bir kayma, davetsiz tarafı odak dışında bırakabilir ve bu nedenle bazı hücreler hücre sayma yazılımı tarafından tespit edilemez. Bu nedenle, bilinen nöroanatomik özellikler kullanılarak ve özellikle bu bölge için mikroskopta odaklanıldığı bir tarafta dopaminerjik nöron/mm2 sayısının karşılaştırılması önerilir. Düzeltilmemiş tarafla karşılaştırma yapılması gerekiyorsa, görüntüleme bu tarafta odak kümesiyle tekrarlanmalıdır.
Elde edilen ve analiz edilen verileri, minimum kullanıcı eğitimi ile nicel görüntü analizi sağlayan çeşitli yazılım paketlerinden biriyle sunuyoruz13. Diğer programlar mevcuttur ve PD6'nındeneysel modellerinde dopaminerjik nöron kaybının nicelleştirilmesi de dahil olmak üzere nöropatolojiyi incelemek için giderek daha fazla benimsenmektedir. Bazıları belirli işlevleri (örneğin, amiloid plak sayımı) gerçekleştirmek için yerleşik algoritmalar sunarken, yazılım paketlerinin çoğu, bunları tekrarlayan analiz yapan laboratuvarlar için özellikle yararlı kılan çeşitli ortak özellikleri paylaşır. İlgi alanı tanımlamasına ek olarak, sinyale müdahale eden ön işleme adımları (doku kıvrımları, kenar eserleri, mürekkep izleri, lekeler vb.) manuel ve desen tanıma araçları ile ilgi çekici bölgeden çıkarılabilir. Ayrıca, sağlanan okumalar, değişkenler arasındaki ilişkileri ve potansiyel korelasyonları araştırmak için protein, hücresel veya davranışsal çalışmalardan elde edilen nicel değerlerle birlikte kullanılabilir.
Yukarıda açıklanan yöntem, immünoistokimyasal olarak lekeli beyin bölümlerinde nöron sayılarını tahmin etmek için doğru, yarı nicel ve nispeten ucuz bir prosedür sağlar. Gerçek zamanlı ayarlama özelliği, yöntemin tüm bölümler için uyarlanmasına izin verir ve dilimleme yöntemlerindeki küçük farklılıklarla bile tutarlılık sağlar. Kör bir gözlemcinin SNpc'ye ilgi alanlarını tanımlaması onay veya seçim önyargılarını azaltır ve yazılım nöronların / mm2'ninhesaplanmasına izin veren basit bir okuma sağlar. Bu yöntem, daha köklü stereolojik protokollere göre verimlilik ve maliyet avantajlarını korurken, farklı beyin bölgelerindeki nöronların doğru sayılarını sağlamak için kolayca uyarlanabilir. Daha kalın bölümler için slayt tarama teknolojisinin ilerlemesi, yukarıda açıklanan yöntem için daha verimli işlem süresi de sağlayacaktır.
Sınırlama
Açıklanan yöntem, nöron yoğunluğundaki büyük değişiklikleri tespit etme hızı ve yeteneğinde bir dizi farklı avantaja sahiptir, ancak aynı zamanda kendi zorluklarını da ortaya çıkarır. Stereolojinin aksine, yöntem mutlak hücre numaralarının tahminini sağlayamaz, bunun yerine SNpc içindeki hücre yoğunluğunu hesaplar. Hücre yoğunluğu tahminleri, tarafsız stereology kullanılarak elde edilen hücre sayılarıyla yüksek, ancak mükemmel değil. Buna ek olarak, yöntem analize başlamadan önce kullanıcı tarafından hücre boyutunun ve şeklinin ayarını dayanır. Bu, hücrelerin kısmen odak düzleminde olması nedeniyle kaçırılmayacağını veya olağandışı boyutta ve/veya şekildeki hücrelerin yazılım tarafından kaçırılacağını garanti edemez. Yazarların deneyimlerine göre, yöntem özellikle klinik öncesi kemirgen modellerinde potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini incelemek için yararlıdır. Sonuç olarak, hücre sayılarını ölçmek için stereolojik yöntemler nörobilimde yaygın olarak kullanılmaya devam ederken, dijitalleşmenin hızlı ivmelenmesi, özellikle gelişmeye devam ettikçe, nöropatolojiyi incelemek için otomatik görüntü analizi platformlarının giderek daha fazla benimseneceğini göstermektedir. Araştırmacının bu yaklaşımın teknik sınırlamalarını anlaması ve dikkatli bir değerlendirmeden sonra bu metodolojiyi uygulanması önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar bildirmiyor.
Acknowledgments
Yazarlar, Üniversite Sağlık Ağı'ndaki İleri Optik Mikroskopi Tesisi'ndeki (AOMF) tüm personele bu protokolün geliştirilmesinde zamanları ve yardımları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
