Summary
Her præsenterer vi en automatiseret metode til semi-kvantitativ bestemmelse af dopaminergisk neuron nummer i rotte substantia nigra pars compacta.
Abstract
Estimering af antallet af dopaminergiske neuroner i substantia nigra er en nøglemetode i præklinisk Parkinsons sygdomsforskning. I øjeblikket er uvildig stereologisk optælling standarden for kvantificering af disse celler, men det er stadig en besværlig og tidskrævende proces, som måske ikke er mulig for alle projekter. Her beskriver vi brugen af en billedanalyseplatform, som præcist kan estimere mængden af mærkede celler i et foruddefineret interesseområde. Vi beskriver en trin-for-trin protokol for denne analysemetode i rottehjerne og demonstrerer, at den kan identificere en signifikant reduktion i tyrosinhydroxylase positive neuroner på grund af udtryk for mutant α-synuclein i substantia nigra. Vi validerede denne metode ved at sammenligne med resultater opnået ved upartisk stereologi. Samlet set giver denne metode en tidseffektiv og præcis proces til påvisning af ændringer i dopaminergisk neuronnummer og er derfor egnet til effektiv bestemmelse af virkningen af interventioner på celleoverlevelse.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en udbredt neurodegenerativ bevægelsesforstyrrelse karakteriseret ved tilstedeværelsen af proteinaggregater, der indeholder α-synuclein (α-syn) og præferencetabet af dopaminergiske neuroner i substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kvantificering af dopaminergisk neuronnummer er en vigtig del af PD-forskningen, da den gør det muligt at evaluere nigrostriatalsystemets integritet, hvilket giver et vigtigt slutpunkt for at vurdere effektiviteten af potentielle sygdomsmodificerende behandlinger. I øjeblikket er standarden for kvantificering af cellenummer fordomsfri stereologisk optælling, som bruger todimensionelle (2D) tværsnit af væv til at estimere volumetriske funktioner i tredimensionelle (3D) strukturer2,3,4. Moderne designbaserede stereologiske metoder anvender omfattende stikprøveprocedurer og anvender tælleprotokoller (kendt som sonder) for at undgå potentielle artefakter og systematiske fejl, hvilket giver mulighed for pålidelig påvisning af forskelle, der kun er lidt større end variation mellem dyr5. Mens stereologi er et kraftfuldt analyseværktøj til in vivo histologiske undersøgelser, er det tidskrævende, antager ensartet prøveforberedelse og kræver validering på flere trin, hvilket kan påvirke den effektivitet, der i stigende grad kræves til præklinisk translationel undersøgelse.
De seneste teknologiske fremskridt inden for digital videnskab gør det muligt at vedtage nye applikationer til mere effektive vurderinger af patologi uden et stereomikroskop, samtidig med at man udfylder et behov som surrogat for upartisk stereologi. Disse metoder øger hastigheden, reducerer menneskelige fejl og forbedrer reproducerbarheden af stereologiske teknikker6,7. HALO er en sådan billedanalyseplatform for kvantitativ vævsanalyse i digital patologi. Det består af en række forskellige moduler og rapporter morfologiske og multiplekserede udtryksdata på celle-for-celle basis på tværs af hele vævssektioner ved hjælp af mønstergenkendelsesalgoritmer. Det cytonuclear FL-modul måler immunfluorescerende positivitet af fluorescerende markører i kernen eller cytoplasmaet. Dette gør det muligt at rapportere antallet af celler, der er positive for hver markør, og intensitetsscoren for hver celle. Modulet kan tilpasses til at give individuelle cellestørrelser og intensitetsmålinger, selvom denne funktion ikke er nødvendig for kvantificering af dopaminergiske neuroner.
Formålet med denne undersøgelse er at verificere denne metode med en tidligere valideret viral vektorbaseret α-syn rottemodel af nigral neurodegeneration8,9,10. I denne model udtrykkes human mutant A53T α-syn i SNpc ved stereotaktisk injektion af adeno-associeret virushybrid serotype 1/2 (AAV1/2), hvilket resulterer i betydelig neurodegeneration over en periode på 6 uger. Den kontralaterale uindsprøjtede SNpc kan i nogle undersøgelser tjene som en intern kontrol for den injicerede side. Mere almindeligt anvendes injektion af AAV-Tom Vector (AAV-EV) i en kontrolkohorte af dyr som en negativ kontrol. Vi præsenterer en trinvis vejledning til at estimere tætheden af dopaminergiske neuroner, der forbliver i den injicerede SNpc efter 6 uger ved hjælp af en automatiseret billedanalysesoftware (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af University Health Network Animal Care Committee og udført i overensstemmelse med retningslinjer og forskrifter fastsat af det canadiske råd for dyrepleje.
1. Stereotaktisk injektion
- Pair-house voksne kvindelige Sprague-Dawley rotter (250-280 g) i bure med træ sengetøj og ad lib adgang til mad og vand. Hold dyrekolonien i en almindelig 12 timers lys/mørk cyklus (lys på 06:30) med konstant temperatur og fugtighed.
- Udfør ensidig stereotaktisk injektion af AAV direkte til SNpc på højre side af hjernen (højre eller venstre side, i henhold til præferencerne for hvert laboratorium) som tidligere beskrevet8,10. Der injiceres 2 μL AAV1/2 ved en endelig titer på 3,4 x 1012 genomiske partikler/mL.
2. Hjernedesektion og immunohistochemi (IHC)
- Bedøve rotten med 5% isofluran ved at placere i et bedøvende kammer i 3 min. Andre godkendte metoder kan anvendes til dette trin efter passende institutionel revision.
- Når rotten har nået et kirurgisk plan af dyb anæstesi, overføre det til en næse kegle fast fastgjort til en obduktion bord. Fastgør rottens forpote ved hjælp af tape og brug tå pinch-response metode til at bestemme dybden af anæstesi. Dyret skal ikke reagere, før det fortsætter.
- Lav et lateralt snit under brystbenet og skær gennem mellemgulvet langs hele længden af brystkassen for at udsætte pleural hulrummet. Løft og klem brystbenet med en hæmostat og læg over hovedet.
- Klem hjertet ved hjælp af pincet og indsæt en sommerfugl nål forbundet til en perfusion pumpe ind i den bageste ende af venstre hjertekammer. Perfuse rotte transcardially med 150 mL hepariniseret saltvand, eller indtil øjne og hud er klare. Perfusion med 4% paraformaldehyd (PFA), i stedet for saltvand, kan foretrækkes for at lette immunostaining med visse antistoffer eller tyndere hjernesektion.
- Når perfusion er færdig, halshugge med en guillotine og udtrække hjernen til en hjerne matrix, ventral overflade vender op.
- Brug et frisk barberblad, lav et snit i koronaplanet 2 mm rostral til den optiske chiasm. Skub klingen fra side til side for at undgå at fordreje hjernen, mens du skærer.
- Fordyb den bageste del af hjernen i et formærket hætteglas, der indeholder ca. 20 mL på 4% PFA i 48 timers postfiksering ved stuetemperatur. Den forreste del af hjernen kan blinke frosset i 2-methylbutan kølet til -42 °C før opbevaring ved -80 °C.
- Efter 48 timer overføres de faste hjerner til et mærket hætteglas, der indeholder 30% saccharose i fosfatstødpudesal saltvand (PBS), og opbevares ved 4 °C, indtil de synker (48-72 timer).
- Forbered en mikrotome ved at placere tøris i prøvestadiet efterfulgt af 100% ethanol. Når scenen er afkølet, klemmes den optimale skæretemperatur (OCT) sammen på scenen, indtil den danner en cirkel 2 cm i diameter og 0,5 cm tyk. Når den er delvist frosset, skal du forsigtigt sænke hjernen ned på højen af OCT, hvilket sikrer, at den striatale skæreflade forbliver parallel med scenen.
- Tilsæt mere tøris til scenen for at hjælpe hjernen til at fryse. Når hjernen har vendt en cremefarve, skal du rydde scenen af tøris.
- Stik et hul i højre side af hjernen med en 25G nål for at skelne mellem højre og venstre hjernehalvdel. Pas på ikke at passere nålen gennem anatomiske strukturer af interesse.
- Serielt skåret 40 μm sektioner i koronar flyet begynder ved bregma -3,8 og slutter ved bregma -6,8.
- Opbevar seks serier i mærkede rør med frostvæske (40% PBS, 30% 2-ethoxyethanol, 30% glycerol). Hver serie skal indeholde 12 hjernesektioner.
- Vælg et sæt sektioner til immunokemisk farvning, og vask frostvæsken af med 3 x 10 min. vask i 0,2% PBS-T.
- Bloker i 1 time ved RT med skånsom dæmning i blokeringsopløsning (10% normalt gedeserum (NGS), 2% kvægserumalbumin (BSA) i 0,2% PBS-T). Følg dette med inkubation med kanin anti-tyrosin hydroxylase (TH) antistof (1:500) og mus anti-α-syn antistof (1:500) i 2% NGS i 0,2% PBS-T natten over ved stuetemperatur.
- Afvask primært antistof med 3 x 5 min vasker i 0,2% PBS-T, efterfulgt af 1 h inkubation med ged anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundære antistof (1:500) og ged anti-mus Alexa Fluor 555 sekundære antistof i 2% NGS i 0,2% PBS-T. Sørg for, at sektionerne er beskyttet mod lys og nutating forsigtigt.
- Afvask sekundært antistof med 3 x 5 min vasker i 0,2% PBS-T og montere det komplette sæt af sektioner på dias beskyttet mod lys og støv ved hjælp af en smal pensel. Coverslip med fluorescens montering medium og tætning med klar neglelak.
3. Confocal mikroskopi og billederhvervelse
- Tag IHC-billeder ved hjælp af software koblet til et konfokalt mikroskop ved 10x forstørrelse. Åbn pinhole til 1,5 AU for at fange et bredt plan i alt ~ 1,5 μm og sætte fokus på den injicerede side af hjernen.
- Markér indstillingen Feltscanningsbilled under fanen Anskaffelse, og angiv dimensionerne til 10 x 4.
- Angiv Zoom til 1,1 under panelet Anskaffelsestilstand. Dette hjælper med at undgå åbenlyse syningsmærker mellem flisescanningsbilleder.
- Indstil rammestørrelsen til 1024 x 1024 pixel og gennemsnit til 2 for at sikre billedopsamling i høj kvalitet.
- Indstil spor 1 til Alexa488 i panelet Kanaler, og spor 2 til Alexa555.
- Læg rutsjebanen på scenen, og vælg en sektion med stærk TH-farvning. Klik på Live på erhvervelse panelet.
- I panelet Kanaler skal du indstille laserstyrken og forstærkningen til niveauer, der maksimerer signalet og begrænser støj fra baggrunden. Brug områdeindikatoren til at sikre, at signalerne ikke overeksponeres (som angivet med et mørkerødt overlay).
- Gentag ovenstående trin med flere dias for at sikre, at farvningen er konsistent mellem dias, da laserstyrken/forstærkningen ikke kan justeres mellem dias.
- Markér afkrydsningsfeltet Stillinger under fanen Anskaffelse.
- På dette tidspunkt er du klar til at begynde at billedbehandling. Brug okularet til at vælge det første afsnit, der viser positiv TH-farvning, sæt fokus på interessepunktet (dvs. SNpc), og flyt derefter scenen til midterlinjen i sektionen. Dette gemmer positionen i x-, y- og z-akserne og afbilder en flisescanning, der henter hele sektionen.
- Gentag ovenstående trin for alle sektioner i hele SNpc giver et komplet sæt billeder af SNpc. Hvis der er behov for en detaljeret analyse af den ikke-injicerede side, gentages trin 3.10 til 3.11 ved at sætte fokus på den ikke-injicerede side.
4. Billedanalyse og kvantantitation
- Adskil billedfiler ved hjælp af passende software, og importer billedfiler til automatiseret billedanalysesoftware.
- Definer et område af interesse ved at vælge anmærkningsværktøjet Pen for at tegne en anmærkning omkring SNpc.
BEMÆRK: I sektioner, der har en stor mængde dopaminergisk neurontab, kan en midlertidig forøgelse af udstrålingen/absorptionen bidrage til klart at definere SNpc (Figur 2). - Gå til fanen Analyse , og vælg Justeringi realtid i rullemenuen Analyser . Dette åbner et separat vindue på sektionsbilledet, der giver mulighed for realtidsændring af analyseparametre (Figur 3).
- Vælg den relevante billedzoom i sektionen Analyseforstørrelse.
- Under afsnittet Celledetektering skal du vælge nukleart farvestof som farvestof, der anvendes til TH-farvning (Alexa Fluor 488).
- Juster indstillingerne for nuklear kontrast, minimum nuklear intensitet, nuklear segmentering aggressivitetog nuklear størrelse, mens du nøje holder øje med realtidsjusteringsvinduet.
BEMÆRK: Nøjagtig repræsentation af hver enkelt celle som en enkelt celle i realtidsjusteringsvinduet er afgørende for nøjagtigheden. Disse indstillinger er på en vilkårlig skala afhængigt af den anvendte software, men korrekt justering er nødvendig for at gøre det muligt for softwaren at skelne præcist mellem de enkelte celler og mellem celler og baggrunden (Figur 3). - Gentag denne proces med mindst 10 separate prøver for at sikre en ensartet aftale om, hvad der udgør en celle på tværs af forskellige sektioner.
BEMÆRK: Yderligere cellemærker (f.eks. α-syn eller NeuN) kan identificeres inden for den samme analyseplatform ved hjælp af afsnittene Markør 1 eller Markør 2 under analysefanen. - Når der er taget prøver af et passende antal billeder, og justeringen i realtid er blevet justeret i overensstemmelse hermed, skal du gemme analyseindstillingerne i rullemenuen Indstillinger.
- Vælg alle de billeder, der skal analyseres, og klik på Analyser.
- Vælg den analyseindstilling, du lige har gemt, og markér afkrydsningsfeltet Anmærkningslag(er) i vinduet Analyseområde. Markér derefter Lag 1, og klik på Analyser.
BEMÆRK: For en enkelt hjerne tager analysen typisk ca. 5 minutter. Det færdige resultat viser tydeligt hvert element, der er optalt som en celle (Figur 4). - Når de er fuldført, skal du eksportere de sammenfattende analysedata for alle sektioner. Der er en mulighed for at eksportere objektanalysedata, som giver detaljerede data, herunder cellestørrelsen på hver enkelt celle, der registreres. Dette datasæt kan bruges til at undersøge ændringer i cellestørrelsen som reaktion på et toksin/terapeutisk.
- Tilføj totalcellerne fra hvert analyseret afsnit pr. dyr og det samlede analyserede område (mm2). Divider det samlede antal celler med det analyserede samlede område for at beregne antallet af celler/mm2 i SNpc for hver rotte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at anvende ovenstående metoder på hjernevæv indsamlet 6 uger efter AAV-injektioner, viste vi, at stereotaktisk injektion af AAV, der udtrykker mutant A53T α-syn (AAV-A53T) i SNpc af rottehjernen, resulterer i en betydelig reduktion i tætheden af dopaminergiske neuroner sammenlignet med injektion af tom vektor AAV (AAV-EV) som en kontrol (Figur 5A, B). Det gennemsnitlige antal TH-positive neuroner/mm2 i SNpc af rotter injiceret med AAV-EV var 276,2 ± 34,7, og i SNpc af rotter injiceret med AAV-A53T var 41,2 ± 17 (P = 0,0003). Kvantificering af antallet af dopaminergiske neuroner/mm2 i SNpc svarer til tidligere offentliggjorte rapporter10,11. For de metoder, der er beskrevet her, blev 4 sekventielle sektioner pr. Dyr analyseret. Tidligere undersøgelser har vist betydelige forskelle med så lidt som 3 sektioner, men analysen kan øges yderligere op til 12 sektioner til at omfatte hele SNpc afhængigt af den model og intervention, der undersøges af investigator.
Fordomsfri stereologi blev også udført som tidligere beskrevet12 på et andet sæt hjernesektioner fra de samme dyr. Ved hjælp af denne metode viste vi også, at stereotaktisk injektion af mutant A53T α-syn i SNpc af rottehjerne resulterer i en betydelig reduktion i det anslåede samlede antal TH-positive neuroner i SNpc sammenlignet med injektion af EV-AAV (Figur 5C). Det er vigtigt, at der var en stærk sammenhæng mellem dopaminergisk neurontæthed anslået ved hjælp af automatiseret billedanalysesoftware og dopaminergisk neurontal anslået ved hjælp af upartisk stereologi (r = 0,8819, P = 0,0007) (Figur 5D).
Vi anvendte også vores metoder ved hjælp af automatiseret billedanalysesoftware til at bestemme antallet af TH-positive neuroner / mm2 på den ikke injicerede side af rotter injiceret med AAV-A53T eller AAV-EV. Det gennemsnitlige antal TH-positive neuroner/mm2 i den ikke-injicerede SNpc af rotter injiceret med AAV-A53T var 123,2 ± 26,4, hvilket var betydeligt større end i den injicerede SNpc, som var 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331)(supplerende figur 1A). Det gennemsnitlige antal TH-positive neuroner/mm2 i den ikke-injicerede SNpc af rotter injiceret med AAV-EV (215,6 ± 35,5) var ikke væsentligt forskelligt fra den injicerede SNpc (276,2 ± 34,7), hvilket bekræftede, at der ikke var nogen degeneration på grund af injektion med AAV-EV (Supplerende figur 1B). Vi beregnede disse resultater som en procentdel af injicerede/ikke injicerede og fandt, at dyr injiceret med AAV-A53T havde en 69% reduktion i forhold til AAV-EV dyr (Supplerende figur 1C).
Figur 1: Metodens arbejdsproces. Arbejdsgang, der demonstrerer de trin, der kræves for at injicere AAV'er, sektions- og pletvæv, definere en interesseregion og optimere softwaren til optælling af celler. Repræsentative billeder af confocal flisescanning, ROI definition, og kvantitet af celler. Skalastang = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Definition af interesseregionen. (A) Koronal hjernesektion, herunder SNpc immunostained for TH (grøn) fra en rotte injiceret med AAV-A53T α-syn. Hos rotter med svær neurodegeneration (som vist her) kan det være svært at identificere SNpc. (B) Midlertidigt at øge absorptionen af billedet kan identificere strukturen og muliggøre en nøjagtig identifikation af den region, der er af interesse. Skalalinje = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Optimering af celledetektering ved hjælp af Cytonuclear-metoden i HALO. Real-time tuning af cytonuclear modul giver brugeren mulighed for at se ændringer i celle detektion i realtid ved at ændre Nuclear Contrast Threshold, Minimum Nuclear Intensity, Nuclear Segmentation Aggressivitet, og Nuclear Size. (A) Repræsentativt billede med region af interesse vises. (B) Justering i realtid, der viser underudtagning, hvor softwaren ikke registrerer alle celler i tuningvinduet. (C) Over-prøveudtagning, hvor softwaren registrerer flere celler, end det er tydeligt i tuning vinduet. (D) Optimeret justering, hvor det korrekte antal celler tælles. Skalastang = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HALO-optimerede indstillinger inden for et defineret interesseområde. Repræsentative billeder af fuldført analyse ved hjælp af optimerede indstillinger til cytonuklear detektion i HALO. Skalastang = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Ekspression af human mutant A53T α-syn i SNpc resulterer i svær neurodegeneration efter 6 uger som kvantificeret af HALO og upartisk stereologi. (A) Repræsentative billeder, der viser degeneration af TH-positive neuroner i SNpc 6 uger efter stereotaktisk injektion af AAV-A53T α-syn ved en titer på 3,4 x 1012 virale partikler / mL. Immunfluorescerende farvning med anti-TH (grøn) og anti-α-syn (røde) antistoffer. Skala bar = 200 μm. (B) Kvantificering af antallet af TH-positive neuroner i SNpc af rotter injiceret med AAV-A53T α-syn eller AAV-EV viser, at udtryk for mutant α-syn resulterer i betydelige dopaminergiske neuron tab. Uparret t-test; n = 5 rotter/gruppe. Graf viser middelværdi ± SEM, ***P < 0,001. (C) Repræsentative billeder af kolorimetrisk farvning af dopaminergiske neuroner i SNpc af AAV-A53T (venstre) eller AAV-EV (højre) injicerede rotter, der anvendes til at udføre upartisk stereologi. Skalalinje = 200 μm. (D) En signifikant korrelation mellem HALO-optælling af TH-positive neuroner/mm2 (y-akse) og upartiske stereologicellenumre (x-akse). Pearson korrelation (r = 0,8819, P = 0,0007). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Signifikant ensidig neurodegeneration observeres i SNpc af rotter, der fik AAV-A53T-injektion. (A) Kvantificering af antallet af TH-positive neuroner i den injicerede eller uinjicerede SNpc af rotter, der fik en ensidig AAV-A53T stereotaktisk injektion, viser et betydeligt fald på den injicerede side. (B) Kvantificering af antallet af TH-positive neuroner i den injicerede eller ikke injicerede SNpc af rotter, der modtog ensidig AAV-EV stereotaktisk injektion, viser ingen signifikante ændringer. (C) Normalisering på den ikke-injicerede kontralaterale side viser et fald på >50% ved injektion med AAV-A53T α-syn sammenlignet med AAV-EV. Uparret t-test; n = 5 rotter/gruppe. Grafer viser gennemsnitlige ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Klik her for at downloade dette supplerende tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den pålidelige vurdering af dopaminergisk systems integritet i prækliniske modeller af PD er afgørende for at bestemme effektiviteten af potentielle sygdomsmodificerende behandlinger. Derfor er det vigtigt at kontrollere og minimere potentielle confounds, der kan reducere pålideligheden og reproducerbarheden af histopatologiske data. Omhyggelige kvantitative resultater kan give flere oplysninger end kvalitative eller halv kvantitative beskrivelser alene. Samtidig må vi erkende, at begrænsninger i tid og ressourcer kan gøre det vanskeligt at udføre upartisk stereologiske optælling for at kvantificere patologiske ændringer eller tab af celler. Men med de seneste fremskridt kan mange af disse kriterier opfyldes ved hjælp af edb og automatiserede billedbehandlingsplatforme6.
Denne protokol beskriver en række vigtige trin i fastsættelsen af det stereologiske skøn over dopaminergiske neuroner / mm2 i gnaverhjernen. Det skal bemærkes, at vi brugte stereotaktisk injektion til at levere AAV'er til SNpc, hvilket lægger vægt på nøjagtig levering af disse vira for at bestemme effekten af enhver behandling. De koordinater, der anvendes til vores undersøgelse, er bregma -5,2 mm (forreste-posterior), -2 mm (mediale-laterale til højre) og -7,5 mm (dorsal ventral fra kraniet) på voksne hunrotter, der vejer ~ 275 g. Korrekt levering af virussen ved hjælp af disse koordinater vil sikre levering af AAV'erne til SNpc.
Derudover skal man være forsigtig, når man forbereder væv til farvning. Først og fremmest skal man sørge for at markere, hvilken side der er højre / venstre. I vores hænder er den nemmeste og mest
reproducerbar måde at gøre dette på var at bruge en 25G-nål til at stikke et hul med jævne mellemrum i venstre dorsale midbrain, mens du identificerer den uindsprøjtede side. En dybdegående viden om de neuroanatomiske regioner i gnaverhjernen er vigtig for at differentiere, hvornår man skal begynde at skære, og senere at identificere SNpc, når man tegner en region af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at TH farvning ikke udelukkende pletter neuroner af SNpc, og man bør være i stand til at skelne mellem TH-positive neuroner i det ventrale tegmentale område og retrorubal felt. En rotte hjerne atlas er en nyttig guide til dem, der mangler erfaring i gnaver neuroanatomi. Antistof inkubationstider er ensartede i hele protokollen, og fokus er indstillet i den minimale tid muligt for at undgå fotobleaching.
Der er en lav variation mellem prøverne, når konsekvente neuroanatomiske træk bruges til at skelne mellem sektioner. At have en erfaren, blindet observatør trække interesseregionen er vigtigt at opretholde konsistens på tværs af de sektioner, der skal analyseres. En analyse af den ikke-injicerede side som vist i supplerende figur 1 viser, at metoden er konsekvent. Der bør dog udvises forsigtighed ved fortolkning af data på denne måde. Udskæring hjerner konsekvent er afhængig af at sammenligne tilstedeværelsen af kendte neuroanatomical funktioner på hver side af hjernen. Subtile forskelle kan betyde, at den uinjicerede side på et givet afsnit kan være mere bageste / forreste end den injicerede side, og dermed ikke en nøjagtig direkte sammenligning. Yderligere analyse af de præsenterede data fremhæver en begrænsning af denne metode. Der er en høj grad af variation i dopaminergiske neurontal i den ikke injicerede side (123,2 i AAV-A53T-gruppen vs. 215,6 i AAV-EV), som man ikke ville forvente mellem tilsvarende alderen dyr. Der er en række mulige årsager til denne forskel, herunder den lille stikprøvestørrelse, der anvendes i denne undersøgelse, og de ovennævnte anatomiske forskelle fra side til side. Derudover er fokus for lysstofrør indstillet på den injicerede side, hvilket betyder, at et lille skift i z-flyet kan efterlade den uindsprøjtede side ude af fokus, og dermed vil nogle celler ikke kunne påvises af celletællingssoftwaren. Af denne grund anbefales det at sammenligne antallet af dopaminergiske neuroner / mm2 på den ene side ved hjælp af kendte neuroanatomiske træk, og hvor der er sat fokus på mikroskopet specifikt for denne region. Hvis der er behov for en sammenligning med den ikke-injicerede side, skal billeddannelsen gentages med fokus indstillet på denne side.
Vi præsenterer data opnået og analyseret med en af de flere softwarepakker, der giver kvantitativ billedanalyse med minimal brugeruddannelse13. Andre programmer er tilgængelige og bliver i stigende grad vedtaget for at studere neuropatologi, herunder kvantificering af dopaminergisk neurontab i eksperimentelle modeller af PD6. Mens nogle tilbyder indbyggede algoritmer til at udføre specifikke funktioner (f.eks. amyloid plaquetælling), deler mange af softwarepakkerne flere almindelige funktioner, der gør dem særligt nyttige for laboratorier, der udfører gentagne analyser. Ud over region af interesse identifikation, forbehandling skridt, der forstyrrer signalet (væv folder, kant artefakter, blæk mærker, pletter, osv.) kan fjernes fra området af interesse ved manuel og mønster anerkendelse værktøjer. Desuden kan de leverede udlæsninger bruges sammen med kvantitative værdier opnået fra protein-, celle- eller adfærdsundersøgelser for at udforske relationer og potentielle korrelationer mellem variabler.
Den ovenfor beskrevne metode giver en nøjagtig, semi-kvantitativ og relativt billig procedure til vurdering af neurontal i immunokemisk farvede hjernesektioner. Justeringsfunktionen i realtid giver mulighed for tilpasning af metoden til alle sektioner og sikrer konsistens selv med små afvigelser i udskæringsmetoder. At have en blindet observatør identificere regioner af interesse i SNpc afbøder bekræftelse eller udvælgelse biases og softwaren giver en simpel udlæsning giver mulighed for beregning af neuroner / mm2. Denne metode kunne let tilpasses til at give nøjagtige optællinger af neuroner i forskellige hjerneregioner og samtidig opretholde effektivitet og omkostningsfordele i forhold til mere etablerede stereologiske protokoller. Fremme af slide-scanning teknologi til tykkere sektioner vil også give mulighed for mere effektiv behandlingstid for de ovenfor beskrevne metode.
Begrænsninger
Den beskrevne metode har en række forskellige fordele i sin hastighed og evne til at opdage store ændringer i neurontæthed, men udgør også sine egne udfordringer. I modsætning til stereologi kan metoden ikke give et skøn over absolutte celletal, men beregner i stedet celletætheden i SNpc. Estimaterne af celletætheden er meget, men ikke perfekt, korreleret med cellenumre opnået ved hjælp af upartisk stereologi. Derudover er metoden afhængig af, at brugeren indstiller cellestørrelse og -form, inden analysen påbegyndes. Dette kan ikke garantere, at celler ikke vil blive savnet på grund af at være delvist i brændplanet, eller at celler af en usædvanlig størrelse og / eller form vil blive savnet af softwaren. I forfatternes erfaring er metoden særlig nyttig til undersøgelse af effekten af potentielle sygdomsmodificerende behandlinger i prækliniske gnavermodeller. Afslutningsvis, mens stereologiske metoder til at kvantificere cellenumre fortsat er meget udbredt i neurovidenskab, tyder den hurtige acceleration af digitalisering på, at automatiserede billedanalyseplatforme i stigende grad vil blive vedtaget for at studere neuropatologi, især da de fortsætter med at forbedre sig. Det er vigtigt, at investigator forstår de tekniske begrænsninger ved denne tilgang og anvender denne metode efter nøje overvejelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle ansatte på Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) på University Health Network for deres tid og bistand til at udvikle denne protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
