Summary
यहां हम चूहे सब्स्तानटिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन नंबर के अर्ध-मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक स्वचालित विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
सब्स्टानिया निग्रा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स की संख्या का आकलन प्री-क्लीनिकल पार्किंसंस डिजीज रिसर्च में एक महत्वपूर्ण तरीका है। वर्तमान में, निष्पक्ष स्टीरियोलॉजिकल गिनती इन कोशिकाओं के मात्राकरण के लिए मानक है, लेकिन यह एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रक्रिया बनी हुई है, जो सभी परियोजनाओं के लिए व्यवहार्य नहीं हो सकती है। यहां, हम एक छवि विश्लेषण मंच के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो ब्याज के पूर्व-परिभाषित क्षेत्र में लेबल कोशिकाओं की मात्रा का सटीक अनुमान लगा सकता है। हम चूहे के मस्तिष्क में विश्लेषण की इस विधि के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि यह सब्स्तानटिया निग्रा में उत्परिवर्ती α-सिन्यूक्लिन की अभिव्यक्ति के कारण टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज सकारात्मक न्यूरॉन्स में एक महत्वपूर्ण कमी की पहचान कर सकता है। हमने निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ तुलना करके इस पद्धति को मान्य किया। एक साथ लिया, यह विधि डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन संख्या में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक समय कुशल और सटीक प्रक्रिया प्रदान करती है, और इस प्रकार सेल अस्तित्व पर हस्तक्षेप के प्रभाव के कुशल निर्धारण के लिए उपयुक्त है।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक प्रचलित न्यूरोडीजेनेरेटिव मूवमेंट डिसऑर्डर है जो प्रोटीन समुच्चयिन (α α-सिन) और सब्सटेंटिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनपीसी)1में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के तरजीही नुकसान से युक्त प्रोटीन समुच्चय की उपस्थिति की विशेषता है। डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन संख्या का मात्राकरण पीडी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है क्योंकि यह निग्रोस्ट्रिटल सिस्टम की अखंडता के मूल्यांकन की अनुमति देता है, इस प्रकार, संभावित रोग-संशोधित चिकित्सीय की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण अंतिम बिंदु प्रदान करता है। वर्तमान में, सेल संख्या के मात्राकरण के लिए मानक निष्पक्ष स्टीरियोलॉजिकल गिनती है, जो तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं 2,3,4में वॉल्यूमेट्रिक सुविधाओं का अनुमान लगाने के लिए ऊतक के दो आयामी(2डी)क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करता है। आधुनिक डिजाइन-आधारित स्टीरियोलॉजिकल विधियां व्यापक यादृच्छिक नमूना प्रक्रियाओं को नियोजित करती हैं और संभावित कलाकृतियों और व्यवस्थित त्रुटियों से बचने के लिए गिनती प्रोटोकॉल (जांच के रूप में जाना जाता है) लागू करती हैं, जिससे अंतर-पशु भिन्नता5की तुलना में अंतर का विश्वसनीय पता लगाने की अनुमति होती है। जबकि स्टीरियोलॉजी वीवो हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों में एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करता है, यह समय गहन है, एक समान नमूना तैयारी मानता है, और कई चरणों पर सत्यापन की आवश्यकता होती है, जो पूर्व-नैदानिक ट्रांसलेशनल जांच के लिए आवश्यक दक्षता को प्रभावित कर सकती है।
डिजिटल विज्ञान में हाल ही में तकनीकी प्रगति निष्पक्ष स्टीरियोमाइप्रोस्कोप के बिना पैथोलॉजी के अधिक कुशल मूल्यांकन के लिए उपन्यास अनुप्रयोगों को अपनाना संभव बनाती है, जबकि निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी के किराए के रूप में आवश्यकता को भरना। ये विधियां गति बढ़ाती हैं, मानवीय त्रुटि को कम करते हैं, और स्टीरियोलॉजिकल तकनीकों की प्रजनन क्षमता में सुधार करते हैं6,7। हेलो डिजिटल पैथोलॉजी में मात्रात्मक ऊतक विश्लेषण के लिए ऐसा ही एक छवि विश्लेषण मंच है। इसमें विभिन्न मॉड्यूल शामिल हैं और पैटर्न मान्यता एल्गोरिदम का उपयोग करके पूरे ऊतक वर्गों में सेल-बाय-सेल आधार पर रूपात्मक और मल्टीप्लेक्स अभिव्यक्ति डेटा की रिपोर्ट करते हैं। साइटोन्यूक्लियर एफएल मॉड्यूल नाभिक या साइटोप्लाज्म में फ्लोरोसेंट मार्कर की इम्यूनोफ्लोर्सेंट सकारात्मकता को मापता है। यह प्रत्येक मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की रिपोर्टिंग के लिए अनुमति देता है, और प्रत्येक कोशिका के लिए तीव्रता स्कोर। मॉड्यूल को व्यक्तिगत सेल आकार और तीव्रता माप प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के मात्राकरण के लिए इस सुविधा की आवश्यकता नहीं है।
इस अध्ययन का उद्देश्य इस विधि को निग्रल न्यूरोडिजेनरेशन8,9,10के पहले मान्य वायरल वेक्टर आधारित α-सिन चूहा मॉडल के साथ सत्यापित करना है। इस मॉडल में, मानव उत्परिवर्ती A53T α-syn Adeno से जुड़े वायरस हाइब्रिड सेरोटाइप 1/2 (AAV1/2) के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन द्वारा SNpc में व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 6 सप्ताह की अवधि में महत्वपूर्ण न्यूरोडिजेनरेशन होता है । कॉन्ट्रालेट्रल यूनिजेनेक्टेड एसएनपीसी, कुछ अध्ययनों में, इंजेक्शन पक्ष के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है। अधिक सामान्यतः, जानवरों के नियंत्रण पलटन में एएवी-खाली वेक्टर (एएवी-ईवी) के इंजेक्शन का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। हम एक स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर(चित्रा 1)का उपयोग करके 6 सप्ताह के बाद इंजेक्शन एसएनपीसी में शेष डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के घनत्व का अनुमान लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रस्तुत करते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी प्रक्रियाओं विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और दिशा निर्देशों और पशु देखभाल पर कनाडा परिषद द्वारा निर्धारित नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया ।
1. स्टीरियोटाटिक इंजेक्शन
- लकड़ी के बिस्तर और भोजन और पानी के लिए विज्ञापन लिब पहुंच के साथ पिंजरों में जोड़ी-घर वयस्क मादा स्प्राग-डावले चूहों (250-280 ग्राम) । पशु कॉलोनी को निरंतर तापमान और आर्द्रता के साथ नियमित 12 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र (06:30 पर रोशनी) में बनाए रखें।
- मस्तिष्क के दाईं ओर सीधे एसएनपीसी (दाएं या बाएं पक्ष, प्रत्येक प्रयोगशाला की वरीयताओं के अनुसार) के लिए सीधे एएवी के एकतरफा स्टीरियोटायैक्टिक इंजेक्शन का प्रदर्शन करें, जैसा कि पहले8,10वर्णित है। 3.4 x 10 12 जीनोमिक कणों/एमएल के अंतिम टाइटर परAAV1/2 के 2 माइक्रोन इंजेक्ट करें ।
2. ब्रेन सेक्शनिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी)
- 3 मिनट के लिए एनेस्थेटाइजिंग चैंबर में रखकर 5% आइसोफ्लुन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें। उचित संस्थागत समीक्षा के बाद इस चरण के लिए अन्य अनुमोदित तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।
- एक बार चूहा गहरी संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान तक पहुंच गया है, यह एक नाक शंकु मजबूती से एक necropsy मेज से चिपका करने के लिए स्थानांतरण । टेप का उपयोग कर चूहे के सामने पंजे को सुरक्षित करें और संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करने के लिए अंगुली चुटकी-प्रतिक्रिया विधि का उपयोग करें। जारी रखने से पहले जानवर को अनुत्तरदायी होना चाहिए।
- उरोस्थि के नीचे एक पार्श्व चीरा बनाओ और पसली पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ डायाफ्राम के माध्यम से काटा प्ल्युरल गुहा का पर्दाफाश करने के लिए। एक हीमोस्टेट के साथ उरोस्थि को उठाएं और दबालें और सिर के ऊपर रखें।
- संदंश का उपयोग कर दिल क्लैंप और बाएं वेंट्रिकल के पीछे के अंत में एक पर्फ्यूजन पंप से जुड़े एक तितली सुई डालें। 150 एमएल हेपरिनाइज्ड खारा के साथ या जब तक आंखें और त्वचा स्पष्ट नहीं होती है, तब तक चूहे को ट्रांसकार्डी। खारे के बजाय 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ पर्फ्यूजन को कुछ एंटीबॉडी या पतले मस्तिष्क खंड के साथ इम्यूनोस्टेटिंग की सुविधा के लिए पसंद किया जा सकता है।
- एक बार परफ्यूजन पूरा हो जाने के बाद, गिलोटिन के साथ काटना और मस्तिष्क को मस्तिष्क मैट्रिक्स, वेंट्रल सतह का सामना करना पड़ रहा है।
- एक ताजा रेजर ब्लेड का उपयोग करना, ऑप्टिक चियाम के लिए कोरोनल प्लेन 2 एमएम रोस्ट्रल में कट बनाएं। स्लीकिंग करते समय मस्तिष्क को वार करने से बचने के लिए ब्लेड को साइड से स्लाइड करें।
- कमरे के तापमान पर निर्धारण के बाद के 48 एच के लिए 4% पीएफए के लगभग 20 एमएल युक्त एक पूर्व लेबल शीशी में मस्तिष्क के पीछे के हिस्से को विसर्जित करें। मस्तिष्क के पूर्वकाल के हिस्से को -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले -42 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा 2-मिथाइलबुटेन में फ्लैश फ्रीज किया जा सकता है।
- 48 घंटे के बाद, फिक्स्ड दिमाग को फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में 30% सुक्रोज युक्त लेबल वाली शीशी में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि वे सिंक (48-72 घंटे) न हो जाएं।
- नमूना चरण के गर्त में सूखी बर्फ रखकर एक माइक्रोटॉम तैयार करें, इसके बाद 100% इथेनॉल। एक बार जब चरण ठंडा हो जाता है, तो मंच पर इष्टतम काटने का तापमान (OCT) यौगिक निचोड़ें जब तक कि यह व्यास में एक सर्कल 2 सेमी और 0.5 सेमी मोटी न हो जाए। एक बार यह आंशिक रूप से जमे हुए है, ध्यान से अक्टूबर के टीले पर मस्तिष्क कम, स्ट्राइटल काटने की सतह सुनिश्चित करने के मंच के साथ समानांतर रहता है ।
- मस्तिष्क को फ्रीज करने में मदद करने के लिए मंच पर अधिक सूखी बर्फ जोड़ें। एक बार जब मस्तिष्क एक क्रीम रंग बदल गया है, सूखी बर्फ की अवस्था साफ।
- दाहिने और बाएं गोलार्द्धों को अलग करने के लिए 25G सुई के साथ मस्तिष्क के दाईं ओर एक छेद प्रहार करें। ध्यान रखें कि ब्याज की शारीरिक संरचनाओं के माध्यम से सुई पारित न करें।
- ब्रेग्मा -3.8 से शुरू होने वाले कोरोनल विमान में 40 माइक्रोन सेक्शन में क्रमिक रूप से कटौती की गई और ब्रेग्मा -6.8 पर समाप्त हो गई।
- एंटी-फ्रीज समाधान (40% पीबीएस, 30% 2-एथॉक्सीथेनॉल, 30% ग्लिसरोल) के साथ लेबल वाली ट्यूबों में छह श्रृंखला स्टोर करें। प्रत्येक श्रृंखला में 12 मस्तिष्क अनुभाग होने चाहिए।
- इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के लिए वर्गों के एक सेट का चयन करें, और 0.2% पीबीएस-टी में 3 x 10 मिनट वॉश के साथ एंटी-फ्रीज समाधान को धोएं।
- अवरुद्ध समाधान (10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस), 0.2% पीबीएस-टी में 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में कोमल अखरोट के साथ आरटी में 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें। खरगोश विरोधी टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (TH) एंटीबॉडी (1:500) और माउस एंटी-α-सिन एंटीबॉडी (1:500) के साथ इनक्यूबेशन के साथ इसका पालन करें 0.2% पीबीएस-टी रात भर कमरे के तापमान पर 0.2% पीबीएस-टी में।
- 0.2% पीबीएस-टी में 3 x 5 मिनट वॉश के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को धोएं, इसके बाद बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 488 माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) और बकरी विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 555 माध्यमिक एंटीबॉडी में 2% एनजीएस में 0.2% पीबीएस-टी में 1 एच इनक्यूबेशन के बाद। सुनिश्चित करें कि वर्गों को प्रकाश से संरक्षित किया जाता है और धीरे-धीरे अखरोट।
- 0.2% पीबीएस-टी में 3 x 5 मिनट धोता के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी को धोएं और एक संकीर्ण तूलिका का उपयोग करके प्रकाश और धूल से संरक्षित स्लाइड पर वर्गों का पूरा सेट माउंट करें। फ्लोरेसेंस बढ़ते मध्यम और स्पष्ट नाखून वार्निश के साथ सील के साथ कवरलिप।
3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि अधिग्रहण
- 10x आवर्धन पर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आईएचसी छवियों को कैप्चर करें। ~ 1.5 माइक्रोन कुल एक विस्तृत विमान पर कब्जा करने के लिए 1.5 AU के लिए पिनहोल खोलें और मस्तिष्क के इंजेक्शन पक्ष पर ध्यान केंद्रित सेट करें।
- एक्विजिशन टैब पर, टाइल स्कैन इमेजिंग विकल्प देखें और आयामों को 10 x 4 पर सेट करें।
- अधिग्रहण मोड पैनल के तहत, ज़ूम को 1.1 सेट करें। यह टाइल स्कैन छवियों के बीच किसी भी स्पष्ट सिलाई निशान से बचने में मदद करता है।
- उच्च गुणवत्ता वाले छवि अधिग्रहण को सुनिश्चित करने के लिए फ्रेम आकार को 1024 x 1024 पिक्सल और औसत से 2 सेट करें।
- चैनल पैनल में, एलेक्सा488 को ट्रैक 1 सेट करें और एलेक्सा 5555 को ट्रैक करें।
- मंच पर स्लाइड लोड और मजबूत TH धुंधला के साथ एक अनुभाग का चयन करें। अधिग्रहण पैनल पर लाइव पर क्लिक करें ।
- चैनल पैनल में, लेजर स्ट्रेंथ सेट करें और उस स्तर तक लाभ करें जो सिग्नल को अधिकतम करता है और पृष्ठभूमि से शोर को सीमित करता है। यह सुनिश्चित करने के लिए रेंज संकेतक का उपयोग करें कि सिग्नल अधिक उजागर न हों (जैसा कि गहरे लाल ओवरले द्वारा इंगित किया गया है)।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कई स्लाइड्स के साथ उपरोक्त चरण दोहराएं कि लेजर स्ट्रेंथ/गेन को स्लाइड्स के बीच समायोजित नहीं किया जा सकता है।
- अधिग्रहण टैब पर, पोजीशन बॉक्स की जांच करें।
- इस बिंदु पर, आप इमेजिंग शुरू करने के लिए तैयार हैं। आईपीस का उपयोग करके, सकारात्मक टीएच धुंधला दिखाते हुए पहला अनुभाग चुनें, ब्याज के बिंदु (यानी, SNpc) पर ध्यान केंद्रित करें और फिर चरण को अनुभाग के मिडलाइन पर ले जाएं। यह एक्स, वाई और जेड अक्षों में स्थिति को बचाता है और पूरे अनुभाग को कैप्चर करने वाले टाइल स्कैन की छवि करेगा।
- SNpc की छवियों का एक पूरा सेट दे SNpc भर में सभी वर्गों के लिए उपरोक्त कदम दोहराएं । यदि यूनिकेक्टेड पक्ष के विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता है, तो यूनिकेंजक्टेड पक्ष पर ध्यान केंद्रित करके चरण 3.10 से 3.11 को दोहराया जाना चाहिए।
4. छवि विश्लेषण और मात्रा
- उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अलग छवि फ़ाइलें और स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के लिए इमेज फ़ाइलों को आयात करें।
- एसएनपीसी के चारों ओर एनोटेशन आकर्षित करने के लिए पेन एनोटेशन टूल का चयन करके ब्याज के एक क्षेत्र को परिभाषित करें।
नोट: जिन वर्गों में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन हानि की एक बड़ी राशि है, अस्थायी रूप से उत्सर्जक/अवशोषण बढ़ाने के लिए स्पष्ट रूप से SNpc(चित्रा 2)को परिभाषित करने में मदद कर सकते हैं । - विश्लेषण टैब पर जाएं और ड्रॉप-डाउन से मेनू का विश्लेषण करें, वास्तविक समय ट्यूनिंग का चयन करें। यह विश्लेषण मापदंडों(चित्र 3)के वास्तविक समय संशोधन के लिए अनुमति अनुभाग छवि पर एक अलग खिड़की खोलता है ।
- विश्लेषण आवर्धन अनुभाग के तहत, उपयुक्त छवि ज़ूम का चयन करें।
- सेल डिटेक्शन सेक्शन के तहत, टीएच स्टेनिंग (एलेक्सा फ्लोर 488) के लिए उपयोग किए जाने वाले डाई के रूप में परमाणु डाई का चयन करें।
- वास्तविक समय ट्यूनिंग विंडो को ध्यान से देखते हुए परमाणु विपरीत सीमा, न्यूनतम परमाणु तीव्रता, परमाणु विभाजन आक्रामकताऔर परमाणु आकार सेटिंग्स को समायोजित करें।
नोट: वास्तविक समय ट्यूनिंग खिड़की में एक एकल सेल के रूप में प्रत्येक व्यक्तिगत सेल का सटीक प्रतिनिधित्व सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है। इन सेटिंग्स का इस्तेमाल सॉफ्टवेयर के आधार पर मनमाने पैमाने पर कर रहे हैं, लेकिन सही समायोजन के लिए सॉफ्टवेयर सही व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच अंतर करने की अनुमति की जरूरत है, और कोशिकाओं और पृष्ठभूमि के बीच(चित्रा 3)। - विभिन्न वर्गों में एक सेल का गठन सुनिश्चित करने के लिए न्यूनतम 10 अलग-अलग नमूनों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: अतिरिक्त सेल मार्कर (जैसे α-सिन या न्यून) को विश्लेषण टैब पर मार्कर 1 या मार्कर 2 अनुभागों का उपयोग करके एक ही विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म के भीतर पहचाना जा सकता है। - एक बार उचित संख्या में छवियों का नमूना लिया गया है और वास्तविक समय ट्यूनिंग को तदनुसार समायोजित किया गया है, सेटिंग क्रियाओं ड्रॉप-डाउन मेनू में विश्लेषण सेटिंग्स को सहेजें।
- विश्लेषण किए जाने वाले सभी चित्रों का चयन करें और विश्लेषण पर क्लिक करें।
- आपके द्वारा अभी सहेजी गई विश्लेषण सेटिंग चुनें और विश्लेषण विंडो के क्षेत्र में, एनोटेशन लेयर (एस) बॉक्स की जांच करें। फिर, लेयर 1 की जांच करें और विश्लेषण पर क्लिक करें।
नोट: एक ही मस्तिष्क के लिए, विश्लेषण आम तौर पर लगभग 5 मिनट लेता है । पूरा परिणाम स्पष्ट रूप से प्रत्येक आइटम है कि एक सेल(चित्रा 4)के रूप में गिना गया है दिखाएगा । - एक बार पूरा होने के बाद, सभी वर्गों के लिए सारांश विश्लेषण डेटा निर्यात करें। ऑब्जेक्ट एनालिसिस डेटाको निर्यात करने का विकल्प है, जो प्रत्येक व्यक्तिगत सेल के सेल आकार सहित विस्तृत डेटा देगा। इस डेटासेट का उपयोग विष/चिकित्सीय के प्रत्युत्तर में कोशिका आकार में परिवर्तन की जांच करने के लिए किया जा सकता है ।
- प्रति पशु विश्लेषण प्रत्येक खंड से कुल कोशिकाओं और कुल विश्लेषण क्षेत्र(मिमी 2)जोड़ें । प्रत्येक चूहे के लिए SNpcमें कोशिकाओं की संख्या/
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
मस्तिष्क के ऊतकों के लिए उपरोक्त तरीकों को लागू करके एएवी इंजेक्शन के 6 सप्ताह बाद एकत्र किया, हमने चूहे के मस्तिष्क के एसएनपीसी में उत्परिवर्ती A53T α-सिन (AAV-A53T) को व्यक्त करते हुए एएवी के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन को एकनियंत्रण (चित्रानियंत्रण) के रूप में खाली वेक्टर एव (AAV-EV,B)के इंजेक्शन की तुलना में डोपामिन न्यूरोनर्जिक्स के घनत्व में उल्लेखनीय कमी का परिणाम है। एएवी-ईवी के साथ इंजेक्शन चूहों के SNpc में TH-पॉजिटिव न्यूरॉन्स/एमएम2 की औसत संख्या २७६.२ ± ३४.७ थी, और AAV-A53T के साथ इंजेक्शन चूहों के SNpc में ४१.२ ± 17(P =0.0003) था । एसएनपीसी में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स/एमएम2 की संख्या का मात्राकरण पहले प्रकाशित रिपोर्ट10,11के समान है । यहां वर्णित तरीकों के लिए, प्रति पशु 4 अनुक्रमिक वर्गों का विश्लेषण किया गया। पिछले अध्ययनों के रूप में छोटे रूप में 3 वर्गों के साथ महत्वपूर्ण मतभेद दिखाया है, लेकिन विश्लेषण आगे 12 वर्गों तक बढ़ाया जा सकता है मॉडल और हस्तक्षेप के आधार पर पूरे SNpc शामिल अन्वेषक द्वारा अध्ययन किया जा रहा है ।
निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी भी किया गया था के रूप में पहले एक ही जानवरों से मस्तिष्क वर्गों के एक और सेट पर12 वर्णित है । इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने यह भी प्रदर्शित किया कि चूहे के मस्तिष्क के एसएनपीसी में उत्परिवर्ती A53T α-syn के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप एसएनपीसी में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की अनुमानित कुल संख्या में उल्लेखनीय कमी आती है, जबकि ईवी-एएवी(चित्रा 5 सी)के इंजेक्शन की तुलना में। महत्वपूर्ण बात यह है कि निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी (आर = 0.8819, पी= 0.0007)(चित्रा 5डी)का उपयोग करके अनुमानित डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन घनत्व के बीच एक मजबूत संबंध था।
हमने एएवी-ए 53टी या एएवी-ईवी के साथ इंजेक्शन चूहों के यूनिंजेक्टेड साइड पर टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स/एमएम2 की संख्या निर्धारित करने के लिए स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अपने तरीकों को भी लागू किया। एएवी-A53T के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों के यूनिंजेक्टेड एसएनपीसी में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स/एमएम2 की औसत संख्या १२३.२ ± २६.४ थी, जो इंजेक्शन एसएनपीसी की तुलना में काफी अधिक थी, जो ४४.० ± १५.८(पी = ०.०३३१)(अनुपूरक चित्रा 1)थी । एएवी-ईवी(215.6 ± 35.5) के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों के यूनिजेनेक्टेड एसएनपीसी में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स/एमएम 2 की औसत संख्या इंजेक्शन एसएनपीसी (276.2 ± 34.7) से काफी अलग नहीं थी, इस बात की पुष्टि करते हुए कि एएवी-ईवी(अनुपूरक चित्रा 1)के साथ इंजेक्शन के कारण कोई अध: पतन नहीं हुआ था। हम इंजेक्शन के एक प्रतिशत के रूप में इन परिणामों की गणना/anjected और पाया कि एएवी-A53T के साथ इंजेक्शन जानवरों AAV-EV जानवरों(अनुपूरक चित्रा 1C)की तुलना में एक ६९% की कमी थी ।
चित्रा 1:विधि का कार्यप्रवाह। AAVs, अनुभाग और दाग ऊतक इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक कदमों का प्रदर्शन कार्यप्रवाह, ब्याज के एक क्षेत्र को परिभाषित करने और कोशिकाओं की गिनती के लिए सॉफ्टवेयर का अनुकूलन । कॉन्फोकल टाइल स्कैन, आरओआई परिभाषा और कोशिकाओं के क्वांटिटेशन की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2-ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करना। (ए)कोरोनल ब्रेन सेक्शन, जिसमें एएवी-ए53टी α-सिन के साथ इंजेक्ट किए गए चूहे से टीएच (ग्रीन) के लिए एसएनपीसी इम्यूनोडांडित शामिल है । गंभीर न्यूरोडिजेनरेशन (जैसे कि यहां दिखाए गए) चूहों में, एसएनपीसी की पहचान करना मुश्किल हो सकता है।(बी)अस्थायी रूप से छवि के अवशोषण को बढ़ाने से संरचना की पहचान हो सकती है और ब्याज के क्षेत्र की सटीक पहचान की अनुमति मिल सकती है। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:हेलो में साइटोन्यूक्लियर विधि का उपयोग करके सेल डिटेक्शन का अनुकूलन। साइटोन्यूक्लियर मॉड्यूल की वास्तविक समय ट्यूनिंग उपयोगकर्ता को परमाणु विपरीत सीमा, न्यूनतम परमाणु तीव्रता, परमाणु विभाजन आक्रामकता और परमाणु आकार में फेरबदल करके वास्तविक समय में सेल का पता लगाने में परिवर्तन देखने की अनुमति देती है। (A)ब्याज के क्षेत्र के साथ प्रतिनिधि छवि प्रदर्शित की गई। (ख)रियल टाइम ट्यूनिंग जिसमें अंडर-सैंपलिंग दिखाई देती है जिसमें सॉफ्टवेयर ट्यूनिंग विंडो में सभी कोशिकाओं का पता नहीं लगाता है । (ग)ओवर-सैंपलिंग जिसमें सॉफ्टवेयर ट्यूनिंग विंडो में स्पष्ट होने की तुलना में अधिक कोशिकाओं का पता लगाता है। (घ)ऑप्टिमाइज्ड ट्यूनिंग जिसमें कोशिकाओं की सही संख्या गिनी जाती है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:ब्याज के एक परिभाषित क्षेत्र के भीतर हेलो अनुकूलित सेटिंग्स। हेलो में साइटोन्यूक्लियर डिटेक्शन के लिए अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग करके पूर्ण विश्लेषण की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5:एसएनपीसी में मानव उत्परिवर्ती A53T α-syn की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप 6 सप्ताह में गंभीर न्यूरोडिजेनरेशन होता है जैसा कि हेलो और निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी द्वारा निर्धारित किया जाता है। (A)प्रतिनिधि छवियां 3.4 x 1012 वायरल कणों/एमसीएल के एक टाइटर पर AAV-A53T α-syn के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के बाद 6 सप्ताह SNpc में TH-सकारात्मक न्यूरॉन्स के पतन दिखा । एंटी-टीएच (ग्रीन) और एंटी-α-सिन (लाल) एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला। स्केल बार = 200 माइक्रोन.(बी)एएवी-A53T α-syn या AAV-EV के साथ इंजेक्शन चूहों के SNpc में TH-सकारात्मक न्यूरॉन्स की संख्या का मात्राकरण दर्शाता है कि उत्परिवर्ती α की अभिव्यक्ति-महत्वपूर्ण dopaminergic न्यूरॉन हानि में syn परिणाम। अकर्षित टी-टेस्ट; द= 5 चूहे/समूह। ग्राफ शो का मतलब है ± SEM, ***पी < 0.001। (ग)एएवी-ए53टी (बाएं) या एएवी-ईवी (दाएं) के एसएनपीसी में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स के कोलोरिमेट्रिक स्टेनिंग की प्रतिनिधि छवियां निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले चूहों को इंजेक्शन देती हैं । स्केल बार = 200 माइक्रोन (डी)टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स/एमएम2 (वाई-एक्सिस) और निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी सेल नंबर (एक्स-एक्सिस) की हेलो गिनती के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध। पियर्सन सहसंबंध (आर = 0.8819, पी = 0.0007)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 1: एएवी-ए 53टी इंजेक्शन प्राप्त करने वाले चूहों के एसएनपीसी में महत्वपूर्ण एकतरफा न्यूरोडिजेनरेशन मनाई जाती है। (क)चूहों के इंजेक्शन या यूनिंजेक्टेड एसएनपीसी में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या का मात्राकरण जो एकतरफा एएवी-A53T स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन प्राप्त करता है, इंजेक्शन की ओर एक महत्वपूर्ण कमी दिखाता है। (ख)एकतरफा एवी-ईवी स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन प्राप्त करने वाले चूहों के इंजेक्शन या यूनिंजेक्टेड एसएनपीसी में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या का परिमाणीकरण कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाता है । (ग)यूनिजेनेक्टेड कॉन्ट्रालेटरल साइड को सामान्यीकरण एएवी-ईवी की तुलना में एएवी-ए53टी α-सिन के साथ इंजेक्शन पर >50% की कमी प्रदर्शित करता है । अकर्षित टी-टेस्ट; द= 5 चूहे/समूह। रेखांकन शो का मतलब है ± SEM, *पी < ०.०५, ***पी < ०.००१ । कृपया इस अनुपूरक चित्र को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
पीडी के पूर्व-नैदानिक मॉडलों में डोपामिनेर्गिक प्रणाली की अखंडता का विश्वसनीय मूल्यांकन संभावित रोग-संशोधित चिकित्सा की प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, संभावित कॉन्फाउंड को नियंत्रित करना और कम करना महत्वपूर्ण है जो हिस्टोपैथोलॉजिकल डेटा की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता को कम कर सकता है। सावधान मात्रात्मक परिणाम केवल गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक विवरणों की तुलना में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इसके साथ ही, हमें यह समझना चाहिए कि समय और संसाधनों में कमी से पैथोलॉजिकल परिवर्तनों या कोशिकाओं के नुकसान की मात्रा के लिए निष्पक्ष स्टीरियोलॉजिकल काउंटिंग करना मुश्किल हो सकता है । हालांकि, हाल की प्रगति के साथ, इनमें से कई मानदंडों को कंप्यूटरीकृत और स्वचालित इमेजिंगप्लेटफार्मों 6का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल कृंतक मस्तिष्क में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स/एमएम2 के स्टीरियोलॉजिकल अनुमान का निर्धारण करने में कई महत्वपूर्ण कदमों का वर्णन करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने एसएनपीसी को एएवी देने के लिए स्टीरियोटाैक्टिक इंजेक्शन का उपयोग किया, जो किसी भी उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इन वायरसों के सटीक वितरण पर महत्व रखता है। हमारे अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले सह-समन्वय ~275 ग्राम वजनी वयस्क मादा चूहों पर ब्रेग्मा -5.2 मिमी (पूर्वकाल-पीछे), -2 मिमी (मध्य-पार्श्व) और -7.5 मिमी (खोपड़ी से पृष्ठीय वेंट्रल) हैं। इन समन्वयों का उपयोग करके वायरस की सही डिलीवरी से एसएनपीसी को एएवी की डिलीवरी सुनिश्चित होगी ।
इसके अलावा, धुंधला करने के लिए ऊतकों को तैयार करते समय देखभाल की जानी चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि यह चिह्नित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि कौन सा पक्ष दाएं/बाएं है । हमारे हाथ में, सबसे आसान और सबसे
ऐसा करने का प्रजनन करने का तरीका एक 25G सुई का उपयोग करने के लिए बाएं पृष्ठीय मिडब्रेन में समय-समय पर एक छेद प्रहार करते हुए यूनिजेनेक्टेड पक्ष की पहचान करना था। कृंतक मस्तिष्क के न्यूरोएनाटॉमिकल क्षेत्रों का गहन ज्ञान यह अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कब काटना शुरू करना है, और बाद में ब्याज के क्षेत्र को आकर्षित करते समय एसएनपीसी की पहचान करना महत्वपूर्ण है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टीएच धुंधला विशेष रूप से एसएनपीसी के न्यूरॉन्स को दाग नहीं देता है, और किसी को वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र और रेट्रोरूल क्षेत्र में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के बीच अंतर करने में सक्षम होना चाहिए। एक चूहा मस्तिष्क एटलस कृंतक न्यूरोएनाटॉमी में अनुभव की कमी वाले लोगों के लिए एक उपयोगी गाइड है। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन बार प्रोटोकॉल के दौरान एक समान होते हैं और फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए ध्यान संभव न्यूनतम समय में सेट किया जाता है।
एक बार लगातार न्यूरोएनाटॉमिकल सुविधाओं का उपयोग वर्गों के बीच अंतर करने के लिए किए जाने के बाद नमूनों के बीच कम परिवर्तनशीलता होती है। एक अनुभवी, अंधा पर्यवेक्षक होने ब्याज के क्षेत्र आकर्षित करने के लिए वर्गों में निरंतरता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है विश्लेषण किया जाएगा । अनुपूरक चित्रा 1 में दिखाए गए यूनिजेनेक्टेड पक्ष का विश्लेषण दर्शाता है कि विधि में एक स्थिरता है। हालांकि, इस तरीके से डेटा की व्याख्या करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए। टुकड़ा करने की क्रिया दिमाग लगातार मस्तिष्क के प्रत्येक पक्ष पर ज्ञात न्यूरोएनाटॉमिकल सुविधाओं की उपस्थिति की तुलना पर निर्भर करता है। सूक्ष्म मतभेदों का मतलब यह हो सकता है कि किसी दिए गए खंड पर यूनिजेनेक्टेड पक्ष इंजेक्शन पक्ष की तुलना में अधिक पीछे/पूर्वकाल हो सकता है, और इस प्रकार सटीक प्रत्यक्ष तुलना नहीं हो सकती है । प्रस्तुत आंकड़ों का आगे विश्लेषण इस विधि की एक सीमा पर प्रकाश डाला गया । वहां dopaminergic न्यूरॉन में परिवर्तनशीलता की एक बड़ी डिग्री है uninjected पक्ष में मायने रखता है (AAV-A53T समूह बनाम AAV-EV में २१५.६ में १२३.२), जो एक इसी तरह वृद्ध जानवरों के बीच की उंमीद नहीं होगी । इस विसंगति के कई संभावित कारण हैं, जिनमें इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले छोटे नमूना आकार और ऊपर से उल्लिखित शारीरिक मतभेद शामिल हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए फोकस इंजेक्शन की ओर सेट किया जाता है, जिसका अर्थ है कि जेड-प्लेन में थोड़ी सी बदलाव यूनिजेनेक्टेड साइड को फोकस से बाहर छोड़ सकता है, और इस तरह कुछ कोशिकाओं को सेल काउंटिंग सॉफ्टवेयर द्वारा पता लगाने योग्य नहीं होगा। इस कारण से, ज्ञात न्यूरोएनाटॉमिकल सुविधाओं का उपयोग करके एक तरफ डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स/एमएम2 की संख्या की तुलना करने की सिफारिश की जाती है, और जहां विशेष रूप से इस क्षेत्र के लिए माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित किया गया है। यदि यूनिजेनेक्टेड पक्ष की तुलना की आवश्यकता है, तो इमेजिंग को इस तरफ निर्धारित ध्यान के साथ दोहराया जाना चाहिए।
हम प्राप्त डेटा पेश करते हैं और कई सॉफ्टवेयर पैकेजों में से एक के साथ विश्लेषण करते हैं जो न्यूनतम उपयोगकर्ता प्रशिक्षण13के साथ मात्रात्मक छवि विश्लेषण प्रदान करते हैं। अन्य कार्यक्रम उपलब्ध हैं और पीडी6के प्रयोगात्मक मॉडलों में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन हानि के मात्राकरण सहित न्यूरोपैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए तेजी से अपनाया जा रहा है। जबकि कुछ विशिष्ट कार्यों (जैसे, एमिलॉयड प्लेक काउंटिंग) करने के लिए अंतर्निहित एल्गोरिदम प्रदान करते हैं, कई सॉफ्टवेयर पैकेज कई सामान्य विशेषताओं को साझा करते हैं जो उन्हें दोहराए जाने वाली विश्लेषण करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाते हैं। ब्याज पहचान के क्षेत्र के अलावा, सिग्नल (ऊतक सिलवटों, किनारे कलाकृतियों, स्याही के निशान, दाग, आदि) के साथ हस्तक्षेप करने वाले पूर्वप्रसंस्करण कदमों को मैनुअल और पैटर्न मान्यता उपकरणों द्वारा ब्याज के क्षेत्र से हटाया जा सकता है। इसके अलावा, प्रदान किए गए रीडआउट का उपयोग प्रोटीन, सेलुलर या व्यवहार अध्ययनों से प्राप्त मात्रात्मक मूल्यों के साथ मिलकर किया जा सकता है ताकि वेरिएबल के बीच संबंधों और संभावित सहसंबंधों का पता लगाया जा सके।
ऊपर वर्णित विधि इम्यूनोहिस्टोकेमिक रूप से दाग वाले मस्तिष्क वर्गों में न्यूरॉन संख्या का आकलन करने के लिए एक सटीक, अर्ध-मात्रात्मक और अपेक्षाकृत सस्ती प्रक्रिया प्रदान करती है। वास्तविक समय ट्यूनिंग सुविधा सभी वर्गों के लिए विधि के अनुकूलन के लिए अनुमति देता है और टुकड़ा करने की क्रिया के तरीकों में मामूली विचरण के साथ भी स्थिरता सुनिश्चित करता है। एक अंधा पर्यवेक्षक होने SNpc में रुचि के क्षेत्रों की पहचान पुष्टि या चयन पूर्वाग्रहों को कम करता है और सॉफ्टवेयरन्यूरॉन्स/मिमी 2की गणना की अनुमति एक सरल readout प्रदान करता है । अधिक स्थापित स्टीरियोलॉजिकल प्रोटोकॉल पर दक्षता और लागत लाभ को बनाए रखते हुए विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की सटीक गिनती प्रदान करने के लिए इस विधि को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। मोटा वर्गों के लिए स्लाइड-स्कैनिंग तकनीक की उन्नति भी उपरोक्त वर्णित विधि के लिए अधिक कुशल प्रसंस्करण समय के लिए अनुमति देगी।
सीमाओं
वर्णित विधि अपनी गति और न्यूरॉन घनत्व में बड़े परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता में अलग लाभ के एक नंबर है, लेकिन यह भी अपनी चुनौतियों बन गया है । स्टीरियोलॉजी के विपरीत, विधि पूर्ण सेल संख्या का अनुमान प्रदान नहीं कर सकती है लेकिन इसके बजाय एसएनपीसी के भीतर सेल घनत्व की गणना करती है। सेल घनत्व के अनुमान अत्यधिक हैं, लेकिन पूरी तरह से नहीं, निष्पक्ष स्टीरियोलॉजी का उपयोग करके प्राप्त सेल नंबरों से सहसंबद्ध हैं। इसके अलावा, विधि विश्लेषण शुरू करने से पहले उपयोगकर्ता द्वारा सेल आकार और आकार की ट्यूनिंग पर निर्भर करती है। यह गारंटी नहीं दे सकता कि कोशिकाओं को आंशिक रूप से फोकल विमान में होने के कारण याद नहीं किया जाएगा, या कि एक असामान्य आकार और/या आकार की कोशिकाओं सॉफ्टवेयर द्वारा याद किया जाएगा । लेखकों के अनुभव में, विधि पूर्व-नैदानिक कृंतक मॉडलों में संभावित रोग-संशोधित चिकित्सीय की प्रभावकारिता की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। अंत में, जबकि कोशिका संख्याओं को निर्धारित करने के लिए स्टीरियोलॉजिकल तरीके व्यापक रूप से न्यूरोसाइंस में उपयोग किए जाते हैं, डिजिटलीकरण के तेजी से त्वरण से पता चलता है कि न्यूरोपैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए स्वचालित छवि विश्लेषण प्लेटफार्मों को तेजी से अपनाया जाएगा, खासकर के रूप में वे सुधार जारी रखते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि अन्वेषक इस दृष्टिकोण की तकनीकी सीमाओं को समझता है और सावधानीपूर्वक विचार करने के बाद इस पद्धति को लागू करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों की रिपोर्ट कोई प्रतिस्पर्धी हितों ।
Acknowledgments
लेखक इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में अपने समय और सहायता के लिए विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क में उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सुविधा (एओएमएफ) में सभी कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
