Summary
Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.
Abstract
Die Abschätzung der Anzahl dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra ist eine Schlüsselmethode in der präklinischen Parkinson-Forschung. Derzeit ist die unvoreingenommene stereologische Zählung der Standard für die Quantifizierung dieser Zellen, aber es bleibt ein mühsamer und zeitaufwendiger Prozess, der möglicherweise nicht für alle Projekte durchführbar ist. Hier beschreiben wir den Einsatz einer Bildanalyseplattform, die die Menge der markierten Zellen in einem vordefinierten Interessenbereich genau abschätzen kann. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für diese Analysemethode im Rattengehirn und zeigen, dass es eine signifikante Reduktion der Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen aufgrund der Expression von mutiertem α-Synuclein in der Substantia nigra identifizieren kann. Wir validierten diese Methodik durch Vergleich mit Ergebnissen, die durch unvoreingenommene Stereologie erzielt wurden. Zusammengenommen bietet diese Methode einen zeiteffizienten und genauen Prozess zur Erkennung von Veränderungen der dopaminergen Neuronenzahl und eignet sich somit für die effiziente Bestimmung der Wirkung von Interventionen auf das Zellüberleben.
Introduction
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine weit verbreitete neurodegenerative Bewegungsstörung, die durch das Vorhandensein von Proteinaggregaten gekennzeichnet ist, die α-Synuclein (α-syn) enthalten, und den bevorzugten Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Die Quantifizierung der dopaminergen Neuronenzahl ist ein wesentlicher Bestandteil der PD-Forschung, da sie die Bewertung der Integrität des nigrostriatalen Systems ermöglicht und somit einen wichtigen Endpunkt zur Beurteilung der Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika darstellt. Derzeit ist der Standard für die Quantifizierung der Zellzahl die unvoreingenommene stereologische Zählung, die zweidimensionale (2D) Querschnitte von Gewebe verwendet, um volumetrische Merkmale in dreidimensionalen (3D) Strukturenabzuschätzen 2,3,4. Moderne designbasierte stereologische Methoden verwenden umfassende Stichprobenverfahren und wenden Zählprotokolle (sogenannte Sonden) an, um potenzielle Artefakte und systematische Fehler zu vermeiden, so dass Unterschiede, die nur geringfügig größer sind als die Variation zwischen den Tieren, zuverlässig erkannt werdenkönnen 5. Während die Sterologie ein leistungsfähiges Analysewerkzeug für histologische In-vivo-Studien darstellt, ist sie zeitintensiv, setzt eine einheitliche Probenvorbereitung voraus und erfordert eine Validierung in mehreren Schritten, was sich auf die Effizienz auswirken kann, die zunehmend für präklinische translationale Untersuchungen erforderlich ist.
Jüngste technologische Fortschritte in der digitalen Wissenschaft ermöglichen es, neuartige Anwendungen für effizientere Beurteilungen der Pathologie ohne Stereomikroskop zu übernehmen und gleichzeitig den Bedarf als Ersatz für unvoreingenommene Stereologie zu decken. Diese Methoden erhöhen die Geschwindigkeit, reduzieren menschliche Fehler und verbessern die Reproduzierbarkeit stereologischer Techniken6,7. HALO ist eine solche Bildanalyseplattform für die quantitative Gewebeanalyse in der digitalen Pathologie. Es besteht aus einer Vielzahl verschiedener Module und berichtet morphologische und multiplexte Expressionsdaten auf Zell-für-Zell-Basis über ganze Gewebeschnitte mit Hilfe von Mustererkennungsalgorithmen. Das zytonukleäre FL-Modul misst die immunfluoreszierende Positivität von fluoreszierenden Markern im Zellkern oder Zytoplasma. Dies ermöglicht die Meldung der Anzahl der positiven Zellen für jeden Marker und des Intensitätswerts für jede Zelle. Das Modul kann angepasst werden, um individuelle Zellgrößen und Intensitätsmessungen bereitzustellen, obwohl diese Funktion für die Quantifizierung dopaminerger Neuronen nicht erforderlich ist.
Ziel dieser Studie ist es, diese Methode mit einem zuvor validierten viralen Vektor-basierten α-Syn-Rattenmodell der nigralen Neurodegeneration8,9,10zu verifizieren. In diesem Modell wird die humane Mutante A53T α-syn im SNpc durch stereotaktische Injektion von Adeno-assoziiertem Virus-Hybrid-Serotyp 1/2 (AAV1/2) exprimiert, was zu einer signifikanten Neurodegeneration über einen Zeitraum von 6 Wochen führt. Das kontralaterale unausgestoßene SNpc kann in einigen Studien als interne Kontrolle für die injizierte Seite dienen. Häufiger wird die Injektion von AAV-Empty Vector (AAV-EV) in eine Kontrollkohorte von Tieren als Negativkontrolle verwendet. Wir präsentieren eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Abschätzung der Dichte dopaminerger Neuronen, die nach 6 Wochen im injizierten SNpc verbleiben, mit einer automatisierten Bildanalysesoftware (Abbildung 1).
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Animal Care Committee des University Health Network genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.
1. Stereotaktische Injektion
- Paarhaus erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten (250-280 g) in Käfigen mit Holzeinstreu und ad lib Zugang zu Nahrung und Wasser. Halten Sie die Tierkolonie in einem regelmäßigen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (Lichter an 06:30 Uhr) mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
- Führen Sie eine einseitige stereotaktische Injektion von AAV direkt in den SNpc auf der rechten Seite des Gehirns (rechte oder linke Seite, je nach den Präferenzen jedes Labors) durch, wie zuvor beschrieben8,10. Injizieren Sie 2 μL AAV1/2 bei einem Endtiter von 3,4 x 1012 genomischen Partikeln/ml.
2. Hirnschnitt und Immunhistochemie (IHC)
- Betäuben Sie die Ratte mit 5% Isofluran, indem Sie sie für 3 min in eine Betäubungskammer legen. Andere genehmigte Methoden können für diesen Schritt nach entsprechender institutioneller Überprüfung verwendet werden.
- Sobald die Ratte eine chirurgische Ebene der tiefen Anästhesie erreicht hat, übertragen Sie sie auf einen Nasenkegel, der fest an einem Nekropsietisch befestigt ist. Sichern Sie die Vorpfoten der Ratte mit Klebeband und verwenden Sie die Zehenquetschreaktionsmethode, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen. Das Tier muss nicht reagieren, bevor es weiterfährt.
- Machen Sie einen seitlichen Schnitt unterhalb des Brustbeins und schneiden Sie das Zwerchfell entlang der gesamten Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle freizulegen. Heben und klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat und legen Sie es über den Kopf.
- Klemmen Sie das Herz mit einer Zange und führen Sie eine Schmetterlingsnadel ein, die mit einer Perfusionspumpe verbunden ist, in das hintere Ende des linken Ventrikels. Perfusion ratte transkardial mit 150 ml heparinisierter Kochsalzlösung oder bis die Augen und die Haut klar sind. Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (PFA) anstelle von Kochsalzlösung kann bevorzugt werden, um die Immunfärbung mit bestimmten Antikörpern oder eine dünnere Hirnschnitte zu erleichtern.
- Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, enthaupten Sie mit einer Guillotine und extrahieren Sie das Gehirn zu einer Gehirnmatrix, die ventrale Oberfläche nach oben zeigt.
- Schneiden Sie mit einer frischen Rasierklinge in der koronalen Ebene 2 mm rostral zum optischen Chiasmus. Schieben Sie die Klinge von einer Seite zur anderen, um zu vermeiden, dass sich das Gehirn beim Schneiden verzog.
- Tauchen Sie den hinteren Teil des Gehirns in eine vormarkierte Durchstechflasche mit etwa 20 ml 4% PFA für 48 Stunden Postfixierung bei Raumtemperatur. Der vordere Teil des Gehirns kann in 2-Methylbutan, gekühlt auf -42 °C, vor der Lagerung bei -80 °C flashgefroren werden.
- Nach 48 h werden die fixierten Gehirne in eine markierte Durchstechflasche mit 30% Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) überführt und bei 4 °C gelagert, bis sie sinken (48-72 h).
- Bereiten Sie ein Mikrotom vor, indem Sie Trockeneis in den Trog der Probenstufe legen, gefolgt von 100% Ethanol. Sobald die Bühne abgekühlt ist, drücken Sie die Verbindung mit der optimalen Schnitttemperatur (OCT) auf die Bühne, bis sie einen Kreis von 2 cm Durchmesser und 0,5 cm Dicke bildet. Sobald es teilweise eingefroren ist, senken Sie das Gehirn vorsichtig auf den Hügel des OCT, um sicherzustellen, dass die striatale Schnittfläche parallel zur Stufe bleibt.
- Fügen Sie der Bühne mehr Trockeneis hinzu, um dem Gehirn zu helfen, einzufrieren. Sobald das Gehirn eine Cremefarbe verfärbt hat, klären Sie das Stadium des Trockeneis.
- Stechen Sie mit einer 25G-Nadel ein Loch in die rechte Seite des Gehirns, um die rechte und linke Hemisphäre zu unterscheiden. Achten Sie darauf, die Nadel nicht durch anatomische Strukturen von Interesse zu führen.
- Schneiden Sie seriell 40 μm-Abschnitte in der koronalen Ebene, beginnend bei Bregma -3,8 und endend bei Bregma -6,8.
- Lagern Sie sechs Serien in markierten Röhrchen mit Frostschutzlösung (40% PBS, 30% 2-Ethoxyethanol, 30% Glycerin). Jede Serie sollte 12 Gehirnabschnitte enthalten.
- Wählen Sie einen Satz Abschnitte für die immunhistochemische Färbung und waschen Sie die Frostschutzlösung mit 3 x 10 min Waschgang in 0,2% PBS-T ab.
- Block für 1 h bei RT mit sanfter Nutation in Blocklösung (10% normales Ziegenserum (NGS), 2% Rinderserumalbumin (BSA) in 0,2% PBS-T). Anschließend erfolgt die Inkubation mit Kaninchen-Antityrosinhydroxylase (TH)-Antikörper (1:500) und Maus-Anti-α-Syn-Antikörper (1:500) in 2% NGS in 0,2% PBS-T über Nacht bei Raumtemperatur.
- Primärantikörper mit 3 x 5 min Waschungen in 0,2% PBS-T abwaschen, gefolgt von 1 h Inkubation mit Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 sekundären Antikörper (1:500) und Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 555 sekundären Antikörper in 2% NGS in 0,2% PBS-T. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vor Licht und Sanftnähren geschützt sind.
- Sekundärantikörper mit 3 x 5 min Waschgang in 0,2% PBS-T abwaschen und den kompletten Satz Abschnitte mit einem schmalen Pinsel vor Licht und Staub geschützten Objektträgern montieren. Abdecklip mit Fluoreszenz-Montagemedium und Dichtung mit klarem Nagellack.
3. Konfokale Mikroskopie und Bildaufnahme
- Erfassen Sie IHC-Bilder mit einer Software, die mit einem konfokalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung gekoppelt ist. Öffnen Sie das Loch auf 1,5 AE, um eine breite Ebene von insgesamt ~ 1,5 μm zu erfassen, und legen Sie den Fokus auf die injizierte Seite des Gehirns.
- Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung die Option Kachelscan-Imaging, und legen Sie die Abmessungen auf 10 x 4 fest.
- Legen Sie im Bedienfeld "Aufnahmemodus" den Zoom auf 1.1 fest. Dies hilft, offensichtliche Stichmarken zwischen Kachelscanbildern zu vermeiden.
- Stellen Sie die Rahmengröße auf 1024 x 1024 Pixel und die Mittelwertbildung auf 2 ein, um eine qualitativ hochwertige Bildaufnahme zu gewährleisten.
- Legen Sie im Bedienfeld "Kanäle" Track 1 auf Alexa488 und Track 2 auf "Alexa555" fest.
- Laden Sie den Dia auf die Bühne und wählen Sie einen Abschnitt mit starker TH-Färbung. Klicken Sie im Bedienfeld "Akquisition" auf "Live".
- Stellen Sie im Bedienfeld "Kanäle" die Laserstärke und -verstärkung auf Werte ein, die das Signal maximieren und das Rauschen aus dem Hintergrund begrenzen. Verwenden Sie die Bereichsanzeige, um sicherzustellen, dass die Signale nicht überbelichtet werden (wie durch eine dunkelrote Überlagerung angezeigt).
- Wiederholen Sie den obigen Schritt mit mehreren Schlitten, um sicherzustellen, dass die Färbung zwischen den Schlitten konsistent ist, da die Laserstärke / -verstärkung zwischen den Objektträgern nicht angepasst werden kann.
- Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung das Kontrollkästchen Positionen.
- An diesem Punkt können Sie mit der Bildgebung beginnen. Wählen Sie mit dem Okular den ersten Abschnitt mit positiver TH-Färbung aus, setzen Sie den Fokus auf den Point of Interest (z. B. SNpc) und bewegen Sie dann die Bühne in die Mittellinie des Abschnitts. Dadurch wird die Position in den x-, y- und z-Achsen gespeichert und ein Kachelscan abgebildet, der den gesamten Abschnitt erfasst.
- Wiederholen Sie den obigen Schritt für alle Abschnitte im gesamten SNpc und erhalten Sie einen vollständigen Satz von Bildern des SNpc. Wenn eine detaillierte Analyse der nicht eingeworfenen Seite erforderlich ist, sollten die Schritte 3.10 bis 3.11 wiederholt werden, indem der Fokus auf die nicht eingeworfene Seite liegt.
4. Bildanalyse und Quantifizierung
- Trennen Sie Bilddateien mit geeigneter Software und importieren Sie Bilddateien in automatisierte Bildanalysesoftware.
- Definieren Sie einen bereich von Interesse, indem Sie das Zeichenstift-Anmerkungswerkzeug auswählen, um eine Anmerkung um den SNpc zu zeichnen.
HINWEIS: In Abschnitten, die einen großen Dopaminergen Neuronenverlust aufweisen, kann eine vorübergehende Erhöhung der Emittanz / Absorption dazu beitragen, den SNpc klar zu definieren (Abbildung 2). - Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse, und wählen Sie im Dropdown-Menü Analysieren die Option Echtzeitoptimierung aus. Dadurch wird ein separates Fenster auf dem Schnittbild geöffnet, das eine Echtzeitänderung der Analyseparameter ermöglicht (Abbildung 3).
- Wählen Sie im Abschnitt Analysevergrößerung den entsprechenden Bildzoom aus.
- Wählen Sie im Abschnitt Zellerkennung den Kernfarbstoff als Farbstoff für die TH-Färbung (Alexa Fluor 488) aus.
- Passen Sie die Einstellungen für den nuklearen Kontrast, die minimale Kernintensität,die Aggressivität der Kernsegmentierungund die Kerngröße an, während Sie das Fenster "Echtzeit-Optimierung" sorgfältig beobachten.
HINWEIS: Die genaue Darstellung jeder einzelnen Zelle als einzelne Zelle im Echtzeit-Tuning-Fenster ist für die Genauigkeit von entscheidender Bedeutung. Diese Einstellungen sind je nach verwendeter Software in einem beliebigen Maßstab, aber eine korrekte Anpassung ist erforderlich, damit die Software genau zwischen einzelnen Zellen sowie zwischen Zellen und dem Hintergrund unterscheiden kann (Abbildung 3). - Wiederholen Sie diesen Vorgang mit mindestens 10 separaten Proben, um eine einheitliche Übereinstimmung darüber sicherzustellen, was eine Zelle über verschiedene Abschnitte hinweg ausmacht.
HINWEIS: Zusätzliche Zellmarker (z. B. α-syn oder NeuN) können innerhalb derselben Analyseplattform mithilfe der Abschnitte Marker 1 oder Marker 2 auf der Registerkarte Analyse identifiziert werden. - Sobald eine entsprechende Anzahl von Bildern abgetastet und das Echtzeit-Tuning entsprechend angepasst wurde, speichern Sie die Analyseeinstellungen im Dropdown-Menü Einstellungsaktionen.
- Wählen Sie alle zu analysierenden Bilder aus und klicken Sie auf Analysieren.
- Wählen Sie die Analyseeinstellung aus, die Sie gerade gespeichert haben, und aktivieren Sie im Fenster Analysebereich das Kontrollkästchen Anmerkungs-Layer. Aktivieren Sie dann Layer 1 und klicken Sie auf Analysieren.
HINWEIS: Für ein einzelnes Gehirn dauert die Analyse in der Regel etwa 5 Minuten. Das abgeschlossene Ergebnis zeigt deutlich jedes Element, das als Zelle gezählt wurde (Abbildung 4). - Exportieren Sie nach Abschluss die zusammenfassenden Analysedaten für alle Abschnitte. Es gibt eine Option zum Exportieren von Objektanalysedaten, die detaillierte Daten, einschließlich der Zellgröße jeder einzelnen erkannten Zelle, erhalten. Dieser Datensatz könnte verwendet werden, um Veränderungen der Zellgröße als Reaktion auf ein Toxin / Therapeutikum zu untersuchen.
- Addieren Sie die Gesamtzellen aus jedem analysierten Abschnitt pro Tier und die analysierte Gesamtfläche (mm2). Dividieren Sie die Gesamtzahl der Zellen durch die analysierte Gesamtfläche, um die Anzahl der Zellen/mm2 im SNpc für jede Ratte zu berechnen
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Representative Results
Durch die Anwendung der oben genannten Methoden auf Hirngewebe, das 6 Wochen nach AAV-Injektionen gesammelt wurde, zeigten wir, dass die stereotaktische Injektion von AAV, die die Mutante A53T α-syn (AAV-A53T) im SNpc des Rattengehirns exprimiert, zu einer signifikanten Verringerung der Dichte dopaminerger Neuronen im Vergleich zur Injektion von leerem Vektor-AAV (AAV-EV) als Kontrolle führt (Abbildung 5A,B). Die mittlere Anzahl von TH-positiven Neuronen/mm2 im SNpc von Ratten, die mit AAV-EV injiziert wurden, betrug 276,2 ± 34,7 und im SNpc von Ratten, die mit AAV-A53T injiziert wurden, 41,2 ± 17(P = 0,0003). Die Quantifizierung der Anzahl der dopaminergen Neuronen/mm2 im SNpc ähnelt den zuvor veröffentlichten Berichten10,11. Für die hier beschriebenen Methoden wurden 4 sequentielle Schnitte pro Tier analysiert. Frühere Studien haben signifikante Unterschiede mit nur 3 Abschnitten gezeigt, aber die Analyse kann weiter auf bis zu 12 Abschnitte erhöht werden, um den gesamten SNpc zu umfassen, abhängig vom Modell und der Intervention, die vom Prüfarzt untersucht werden.
Unvoreingenommene Stereologie wurde auch wie zuvor beschrieben12 an einem anderen Satz von Gehirnabschnitten von denselben Tieren durchgeführt. Mit dieser Methode haben wir auch gezeigt, dass die stereotaktische Injektion von mutiertem A53T α-syn im SNpc des Rattengehirns zu einer signifikanten Verringerung der geschätzten Gesamtzahl der TH-positiven Neuronen im SNpc im Vergleich zur Injektion von EV-AAV führt (Abbildung 5C). Wichtig ist, dass es eine starke Korrelation zwischen der dopaminergen Neuronendichte, die mit automatisierter Bildanalysesoftware geschätzt wurde, und der dopaminergen Neuronenzahl, die mit unvoreingenommener Sterologie geschätzt wurde (r = 0,8819, P = 0,0007) (Abbildung 5D).
Wir haben unsere Methoden auch mit automatisierter Bildanalysesoftware angewendet, um die Anzahl der TH-positiven Neuronen/ mm2 auf der nicht injizierten Seite von Ratten zu bestimmen, die mit AAV-A53T oder AAV-EV injiziert wurden. Die mittlere Anzahl von TH-positiven Neuronen/mm2 im nicht injizierten SNpc von Ratten, denen AAV-A53T injiziert wurde, betrug 123,2 ± 26,4, was signifikant größer war als im injizierten SNpc, der 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331) betrug (Ergänzende Abbildung 1A). Die mittlere Anzahl von TH-positiven Neuronen/mm2 im nicht injizierten SNpc von Ratten, die mit AAV-EV injiziert wurden (215,6 ± 35,5), unterschied sich nicht signifikant von dem injizierten SNpc (276,2 ± 34,7), was bestätigt, dass keine Degeneration aufgrund der Injektion mit AAV-EV vorliegt (ergänzende Abbildung 1B). Wir berechneten diese Ergebnisse als Prozentsatz der injizierten/nicht injizierten Tiere und stellten fest, dass Tiere, denen AAV-A53T injiziert wurde, im Vergleich zu den AAV-EV-Tieren eine Reduktion von 69% aufwiesen (Ergänzende Abbildung 1C).
Abbildung 1: Workflow der Methode. Workflow, der die Schritte demonstriert, die erforderlich sind, um AAVs, Schnitt- und Fleckengewebe zu injizieren, einen Interessenbereich zu definieren und die Software für die Zählung von Zellen zu optimieren. Repräsentative Bilder des konfokalen Kachelscans, roi-Definition und Quantifizierung von Zellen. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Definition der region von interesse. (A) Koronaler Hirnschnitt, einschließlich des für TH immungefärbten SNpc (grün) von einer Ratte, die mit AAV-A53T α-syn injiziert wurde. Bei Ratten mit schwerer Neurodegeneration (wie hier gezeigt) kann es schwierig sein, den SNpc zu identifizieren. (B) Eine vorübergehende Erhöhung der Absorption des Bildes kann die Struktur identifizieren und eine genaue Identifizierung der interessierenden Region ermöglichen. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Optimierung der Zelldetektion mit der cytonukleären Methode in HALO. Die Echtzeitabstimmung des zytonukleären Moduls ermöglicht es dem Benutzer, Änderungen in der Zelldetektion in Echtzeit zu sehen, indem er die Kernkontrastschwelle, die minimale Kernintensität, die aggressivität der Kernsegmentierung und die Kerngröße ändert. (A) Repräsentatives Bild mit angezeigtem Interessenbereich. (B) Echtzeit-Tuning mit Unterabtastung, bei der die Software nicht alle Zellen im Tuning-Fenster erkennt. (C) Überabtastung, bei der die Software mehr Zellen erkennt, als im Tuning-Fenster ersichtlich sind. (D) Optimierte Abstimmung, bei der die richtige Anzahl von Zellen gezählt wird. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:HALO-optimierte Einstellungen innerhalb eines definierten Interessenbereichs. Repräsentative Bilder der abgeschlossenen Analyse mit optimierten Einstellungen für den zytonukleären Nachweis in HALO. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Expression der humanen Mutante A53T α-syn in SNpc führt zu einer schweren Neurodegeneration nach 6 Wochen, quantifiziert durch HALO und unvoreingenommene Stereologie. (A) Repräsentative Bilder, die eine Degeneration von TH-positiven Neuronen im SNpc 6 Wochen nach stereotaktischer Injektion von AAV-A53T α-syn bei einem Titer von 3,4 x 1012 Viruspartikeln/ml zeigen. Immunfluoreszierende Färbung mit Anti-TH (grün) und Anti-α-Syn (rot) Antikörpern. Skalenbalken = 200 μm. (B) Die Quantifizierung der Anzahl der TH-positiven Neuronen im SNpc von Ratten, denen AAV-A53T α-syn oder AAV-EV injiziert wurde, zeigt, dass die Expression von mutiertem α-syn zu einem signifikanten dopaminergen Neuronenverlust führt. Ungepaarter t-Test; n = 5 Ratten/Gruppe. Die Grafik zeigt den Mittelwert ± SEM, ***P < 0,001. (C) Repräsentative Bilder der kolorimetrischen Färbung dopaminerger Neuronen im SNpc von AAV-A53T (links) oder AAV-EV (rechts) injizierten Ratten, die zur Durchführung einer unvoreingenommenen Stereologie verwendet werden. Skalenbalken = 200 μm. (D) Eine signifikante Korrelation zwischen halo-Zählung von TH-positiven Neuronen/mm2 (y-Achse) und unvoreingenommenen stereologen Zellzahlen (x-Achse). Pearson-Korrelation (r = 0,8819, P = 0,0007). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Signifikante einseitige Neurodegeneration wird im SNpc von Ratten beobachtet, die eine AAV-A53T-Injektion erhielten. (A) Die Quantifizierung der Anzahl der TH-positiven Neuronen im injizierten oder nicht injizierten SNpc von Ratten, die eine einseitige stereotaktische AAV-A53T-Injektion erhalten haben, zeigt eine signifikante Abnahme auf der injizierten Seite. (B) Die Quantifizierung der Anzahl der TH-positiven Neuronen im injizierten oder nicht injizierten SNpc von Ratten, die eine einseitige stereotaktische AAV-EV-Injektion erhalten haben, zeigt keine signifikanten Veränderungen. (C) Die Normalisierung auf die nicht indektierte kontralaterale Seite zeigt eine abnahme von >50% bei der Injektion mit AAV-A53T α-syn im Vergleich zu AAV-EV. Ungepaarter t-Test; n = 5 Ratten/Gruppe. Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um diese Zusatzfigur herunterzuladen.
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Discussion
Die zuverlässige Beurteilung der Integrität des dopaminergen Systems in präklinischen Modellen der Parkinson-Krankheit ist entscheidend, um die Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika zu bestimmen. Daher ist es wichtig, potenzielle Verrenkungen zu kontrollieren und zu minimieren, die die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit histopathologischer Daten verringern können. Sorgfältige quantitative Ergebnisse können mehr Informationen liefern als qualitative oder semi-quantitative Beschreibungen allein. Gleichzeitig müssen wir erkennen, dass Zeit- und Ressourcenbeschränkungen es schwierig machen können, unvoreingenommene stereologische Zählungen durchzuführen, um pathologische Veränderungen oder den Verlust von Zellen zu quantifizieren. Mit den jüngsten Fortschritten können jedoch viele dieser Kriterien mit computergestützten und automatisierten Bildgebungsplattformen erfüllt werden6.
Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe wichtiger Schritte zur Bestimmung der stereologischen Abschätzung dopaminerger Neuronen/mm2 im Nagetiergehirn. Es sollte beachtet werden, dass wir stereotaktische Injektion verwendet haben, um AAVs an den SNpc zu liefern, was Wert auf eine genaue Abgabe dieser Viren legt, um die Wirkung einer Behandlung zu bestimmen. Die für unsere Studie verwendeten Koordinaten sind Bregma -5,2 mm (anterior-posterior), -2 mm (medial-lateral nach rechts) und -7,5 mm (dorsal ventral vom Schädel) bei erwachsenen weiblichen Ratten mit einem Gewicht von ~ 275 g. Die korrekte Abgabe des Virus unter Verwendung dieser Koordinaten stellt die Lieferung der AAVs an den SNpc sicher.
Darüber hinaus muss bei der Vorbereitung von Geweben auf die Färbung vorsicht geachtet werden. In erster Linie sollte darauf geachtet werden, welche Seite rechts/links ist. In unseren Händen, die einfachsten und meisten
Reproduzierbarer Weg, dies zu tun, bestand darin, eine 25G-Nadel zu verwenden, um regelmäßig ein Loch in das linke dorsale Mittelhirn zu stechen und gleichzeitig die nicht eingeworfene Seite zu identifizieren. Eine gründliche Kenntnis der neuroanatomischen Regionen des Nagetiergehirns ist wichtig, um zu unterscheiden, wann mit dem Schneiden begonnen werden muss, und später, um den SNpc beim Zeichnen einer Region von Interesse zu identifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die TH-Färbung nicht ausschließlich Neuronen des SNpc färbt, und man sollte in der Lage sein, zwischen TH-positiven Neuronen im ventralen tegmentalen Bereich und retrorubalen Bereich zu unterscheiden. Ein Rattenhirnatlas ist ein nützlicher Leitfaden für diejenigen, denen es an Erfahrung in der Neuroanatomie von Nagetieren mangelt. Die Inkubationszeiten der Antikörper sind während des gesamten Protokolls einheitlich und der Fokus wird in kürzester Zeit eingestellt, um Photobleaching zu vermeiden.
Es gibt eine geringe Variabilität zwischen den Proben, sobald konsistente neuroanatomische Merkmale verwendet werden, um zwischen Abschnitten zu unterscheiden. Dass ein erfahrener, blinder Beobachter die Region von Interesse zeichnet, ist wichtig, um die Konsistenz über die zu analysierenden Abschnitte hinweg aufrechtzuerhalten. Die Analyse der nicht eingeworfenen Seite, wie in ergänzende Abbildung 1 gezeigt, zeigt, dass die Methode konsistent ist. Bei der Interpretation von Daten auf diese Weise ist jedoch Vorsicht geboten. Das Schneiden von Gehirnen beruht konsequent auf dem Vergleich des Vorhandenseins bekannter neuroanatomischer Merkmale auf jeder Seite des Gehirns. Subtile Unterschiede können bedeuten, dass die nicht injizierte Seite auf einem bestimmten Abschnitt hinterer / vorderer sein kann als die injizierte Seite und daher kein genauer direkter Vergleich. Die weitere Analyse der vorgestellten Daten zeigt eine Einschränkung dieser Methode auf. Es gibt eine große Variabilität in den dopaminergen Neuronenzahlen auf der unausgestoßenen Seite (123,2 in der AAV-A53T-Gruppe gegenüber 215,6 in der AAV-EV), die man bei ähnlich alten Tieren nicht erwarten würde. Es gibt eine Reihe von möglichen Gründen für diese Diskrepanz, einschließlich der kleinen Stichprobengröße, die in dieser Studie verwendet wird, und der oben genannten anatomischen Unterschiede von Seite zu Seite. Darüber hinaus wird der Fokus für das fluoreszierende Signal auf der injizierten Seite eingestellt, was bedeutet, dass eine leichte Verschiebung in der z-Ebene die nicht injizierte Seite unsauchbar machen kann und daher einige Zellen von der Zellzählsoftware nicht erkannt werden können. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, die Anzahl der dopaminergen Neuronen/mm2 auf einer Seite anhand bekannter neuroanatomischer Merkmale zu vergleichen und wo der Fokus speziell für diese Region auf das Mikroskop gelegt wurde. Wenn ein Vergleich mit der unausgewürfeten Seite erforderlich ist, sollte die Bildgebung mit dem Fokus auf dieser Seite wiederholt werden.
Wir präsentieren Daten, die mit einem der verschiedenen Softwarepakete erhalten und analysiert wurden, die eine quantitative Bildanalyse mit minimaler Benutzerschulung ermöglichen13. Andere Programme sind verfügbar und werden zunehmend zur Untersuchung der Neuropathologie eingesetzt, einschließlich der Quantifizierung des dopaminergen Neuronenverlusts in experimentellen Modellen von PD6. Während einige integrierte Algorithmen zur Ausführung bestimmter Funktionen bieten (z. B. Amyloid-Plaque-Zählung), haben viele der Softwarepakete mehrere gemeinsame Funktionen, die sie besonders nützlich für Labore machen, die sich wiederholende Analysen durchführen. Zusätzlich zur Identifizierung von Interessengebieten können Vorverarbeitungsschritte, die das Signal stören (Gewebefalten, Kantenartefakte, Tintenflecken, Flecken usw.), durch manuelle und Mustererkennungswerkzeuge aus dem interessierenden Bereich entfernt werden. Darüber hinaus können die bereitgestellten Messwerte in Verbindung mit quantitativen Werten aus Protein-, Zell- oder Verhaltensstudien verwendet werden, um Beziehungen und mögliche Korrelationen zwischen Variablen zu untersuchen.
Die oben beschriebene Methode bietet ein genaues, semi-quantitatives und relativ kostengünstiges Verfahren zur Schätzung der Neuronenzahl in immunhistochemisch gefärbten Hirnabschnitten. Die Echtzeit-Tuning-Funktion ermöglicht die Anpassung der Methode für alle Abschnitte und gewährleistet Konsistenz auch bei geringen Abweichungen bei den Slicing-Methoden. Wenn ein verblindeter Beobachter Bereiche von Interesse im SNpc identifiziert, werden Bestätigungs- oder Selektionsverzerrungen gemildert, und die Software bietet eine einfache Auslesung, die die Berechnung von Neuronen / mm2ermöglicht. Diese Methode könnte leicht angepasst werden, um genaue Zählungen von Neuronen in verschiedenen Gehirnregionen zu liefern und gleichzeitig Effizienz- und Kostenvorteile gegenüber etablierteren stereologischen Protokollen zu erhalten. Die Weiterentwicklung der Dia-Scanning-Technologie für dickere Abschnitte würde auch eine effizientere Verarbeitungszeit für die oben beschriebene Methode ermöglichen.
Begrenzungen
Die beschriebene Methode hat eine Reihe von deutlichen Vorteilen in ihrer Geschwindigkeit und Fähigkeit, große Veränderungen der Neuronendichte zu erkennen, stellt aber auch ihre eigenen Herausforderungen dar. Im Gegensatz zur Sterologie kann die Methode keine Schätzung der absoluten Zellzahlen liefern, sondern berechnet stattdessen die Zelldichte innerhalb des SNpc. Die Schätzungen der Zelldichte korrelieren stark, aber nicht perfekt mit den Zellzahlen, die mit unvoreingenommener Stereologie erhalten wurden. Darüber hinaus basiert die Methode auf der Abstimmung der Zellgröße und -form durch den Benutzer vor Beginn der Analyse. Dies kann nicht garantieren, dass Zellen nicht übersehen werden, weil sie sich teilweise in der Fokusebene befinden, oder dass Zellen einer ungewöhnlichen Größe und / oder Form von der Software übersehen werden. Nach den Erfahrungen der Autoren ist die Methode besonders nützlich, um die Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika in präklinischen Nagetiermodellen zu untersuchen. Während stereologische Methoden zur Quantifizierung der Zellzahlen in den Neurowissenschaften nach wie vor weit verbreitet sind, deutet die rasante Beschleunigung der Digitalisierung darauf hin, dass automatisierte Bildanalyseplattformen zunehmend zur Erforschung der Neuropathologie eingesetzt werden, insbesondere wenn sie sich weiter verbessern. Es ist wichtig, dass der Prüfer die technischen Grenzen dieses Ansatzes versteht und diese Methodik nach sorgfältiger Überlegung anwendet.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Mitarbeitern der Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) des University Health Network für ihre Zeit und Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
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