Summary
Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.
Abstract
Schatting van het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra is een belangrijke methode in preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson. Momenteel is onbevooroordeeld stereologisch tellen de standaard voor kwantificering van deze cellen, maar het blijft een moeizaam en tijdrovend proces, dat misschien niet voor alle projecten haalbaar is. Hier beschrijven we het gebruik van een beeldanalyseplatform, dat de hoeveelheid gelabelde cellen in een vooraf gedefinieerde interesseregio nauwkeurig kan schatten. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor deze analysemethode in rattenhersenen en tonen aan dat het een significante vermindering van tyrosine hydroxylase positieve neuronen kan identificeren als gevolg van expressie van mutante α-synucleïne in de substantia nigra. We hebben deze methodologie gevalideerd door te vergelijken met resultaten verkregen door onbevooroordede stereologie. Samen biedt deze methode een tijdsefficiënt en nauwkeurig proces voor het detecteren van veranderingen in het aantal dopaminerge neuronen, en is dus geschikt voor efficiënte bepaling van het effect van interventies op de celoverleving.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een veel voorkomende neurodegeneratieve bewegingsstoornis die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van eiwitaggregaten die α-synucleïne (α-syn) bevatten en het voorkeursverlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kwantificering van dopaminerge neuronen is een essentieel onderdeel van PD-onderzoek omdat het de evaluatie van de integriteit van het nigrostriatale systeem mogelijk maakt, waardoor het een belangrijk eindpunt is om de effectiviteit van potentiële ziekte-modificerende therapieën te beoordelen. Momenteel is de standaard voor kwantificering van celgetal onbevooroordeeld stereologisch tellen, dat tweedimensionale (2D) doorsneden van weefsel gebruikt om volumetrische kenmerken in driedimensionale (3D) structuren te schatten2,3,4. Moderne op ontwerpen gebaseerde stereologische methoden maken gebruik van uitgebreide steekproefprocedures en passen telprotocollen (bekend als sondes) toe om potentiële artefacten en systematische fouten te voorkomen, waardoor betrouwbare detectie van verschillen slechts iets groter is dan variatie tussen dieren5. Hoewel stereologie een krachtig analytisch instrument is voor in vivo histologische studies, is het tijdsintensief, veronderstelt het een uniforme monstervoorbereiding en vereist validatie in verschillende stappen, wat van invloed kan zijn op de efficiëntie die steeds meer nodig is voor preklinisch translationeel onderzoek.
Recente technologische vooruitgang in de digitale wetenschap maakt het mogelijk om nieuwe toepassingen aan te nemen voor efficiëntere beoordelingen van pathologie zonder een stereomicroscoop, terwijl het een behoefte vervult als surrogaat van onbevooroordede stereologie. Deze methoden verhogen de snelheid, verminderen menselijke fouten en verbeteren de reproduceerbaarheid van stereologische technieken6,7. HALO is zo'n beeldanalyseplatform voor kwantitatieve weefselanalyse in digitale pathologie. Het bestaat uit een verscheidenheid aan verschillende modules en rapporteert morfologische en multiplexed expressiegegevens per cel over hele weefselsecties met behulp van patroonherkenningsalgoritmen. De cytonucleaire FL-module meet de immunofluorescente positiviteit van fluorescerende markers in de kern of cytoplasma. Dit maakt het mogelijk om het aantal positieve cellen voor elke markering en de intensiteitsscore voor elke cel te rapporteren. De module kan worden aangepast om individuele celgroottes en intensiteitsmetingen te bieden, hoewel deze functie niet nodig is voor kwantificering van dopaminerge neuronen.
Het doel van deze studie is deze methode te verifiëren met een eerder gevalideerd viraal vectorgebaseerd α-syn rat model van nigrale neurodegeneratie8,9,10. In dit model wordt humaan mutant A53T α-syn uitgedrukt in de SNpc door stereotactische injectie van adeno-geassocieerd virus hybride serotype 1/2 (AAV1/2), resulterend in significante neurodegeneratie over een periode van 6 weken. De contralaterale niet-geïnjecteerde SNpc kan in sommige studies dienen als een interne controle voor de geïnjecteerde kant. Vaker wordt injectie van AAV-Empty Vector (AAV-EV) in een controlecohort van dieren gebruikt als een negatieve controle. We presenteren een stapsgewijze handleiding om de dichtheid van dopaminerge neuronen te schatten die na 6 weken in de geïnjecteerde SNpc achterblijven met behulp van een geautomatiseerde beeldanalysesoftware (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door het University Health Network Animal Care Committee en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Canadian Council on Animal Care.
1. Stereotactische injectie
- Paar-huis volwassen vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (250-280 g) in kooien met houten beddengoed en ad lib toegang tot voedsel en water. Houd de dierenkolonie in een regelmatige 12 uur licht/donker cyclus (lichten op 06:30) met constante temperatuur en vochtigheid.
- Voer unilaterale stereotactische injectie van AAV rechtstreeks uit op de SNpc aan de rechterkant van de hersenen (rechter- of linkerkant, volgens de voorkeuren van elk laboratorium) zoals eerder beschreven8,10. Injecteer 2 μL AAV1/2 bij een eindtiter van 3,4 x 1012 genomische deeltjes/ml.
2. Hersensectie en immunohistochie (IHC)
- Verdoof de rat met 5% isofluraan door 3 minuten in een verdovingskamer te plaatsen. Andere goedgekeurde methoden kunnen voor deze stap worden gebruikt na een passende institutionele evaluatie.
- Zodra de rat een chirurgisch vlak van diepe anesthesie heeft bereikt, brengt u het over op een neuskegel die stevig op een obductietafel is bevestigd. Beveilig de voorpoten van de rat met behulp van tape en gebruik de pinch-response-methode om de diepte van de anesthesie te bepalen. Het dier moet niet reageren voordat het verder gaat.
- Maak een laterale incisie onder het borstbeen en snijd door het middenrif over de hele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte bloot te leggen. Til en klem het borstbeen met een hemostase en plaats boven het hoofd.
- Klem het hart met een tang en steek een vlindernaald die is aangesloten op een perfusiepomp in het achterste uiteinde van de linkerventrikel. Perfuseer rat transcardiaal met 150 ml gepariniseerde zoutoplossing, of totdat de ogen en huid helder zijn. Perfusie met 4% paraformaldehyde (PFA), in plaats van zoutoplossing, kan de voorkeur hebben om immunostaining met bepaalde antilichamen of dunnere hersendoorsnede te vergemakkelijken.
- Zodra de perfusie is voltooid, onthoofdt u met een guillotine en haalt u de hersenen naar een hersenmatrix, ventrale oppervlakte naar boven gericht.
- Maak met een vers scheermesje een snede in het coronale vlak 2 mm rostral naar het optische chiasme. Schuif het mes van links naar rechts om te voorkomen dat de hersenen kromtrekken tijdens het snijden.
- Dompel het achterste deel van de hersenen onder in een voorgelabelde flacon met ongeveer 20 ml 4% PFA gedurende 48 uur postfixatie bij kamertemperatuur. Het voorste deel van de hersenen kan worden bevroren in 2-methylbutaan gekoeld tot -42 °C vóór opslag bij -80 °C.
- Breng na 48 uur de vaste hersenen over naar een gelabelde flacon met 30% sacharose in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar ze bij 4 °C totdat ze zinken (48-72 uur).
- Bereid een microtome door droogijs in de trog van het monsterstadium te plaatsen, gevolgd door 100% ethanol. Zodra het podium is afgekoeld, knijpt u de optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding op het podium totdat deze een cirkel van 2 cm in diameter en 0,5 cm dik vormt. Zodra het gedeeltelijk bevroren is, laat u de hersenen voorzichtig zakken op de heuvel van OCT, zodat het striatale snijoppervlak parallel blijft met het podium.
- Voeg meer droogijs toe aan het podium om de hersenen te helpen bevriezen. Zodra de hersenen een crèmekleur hebben veranderd, ruim je het stadium van droog ijs op.
- Prik een gat in de rechterkant van de hersenen met een 25G-naald om de rechter- en linkerhersenhelft te onderscheiden. Zorg ervoor dat u de naald niet door anatomische structuren van belang passeert.
- Snijd 40 μm secties in het coronale vlak serieel, beginnend bij bregma -3.8 en eindigend bij bregma -6.8.
- Bewaar zes series in gelabelde tubes met antivriesoplossing (40% PBS, 30% 2-ethoxyethanol, 30% glycerol). Elke serie moet 12 hersensecties bevatten.
- Selecteer één set secties voor immunohistochemische kleuring en was antivriesoplossing af met wasbeurten van 3 x 10 minuten in 0,2% PBS-T.
- Blokkeer gedurende 1 uur bij RT met zachte notatie in blokkerende oplossing (10% normaal geitenserum (NGS), 2% runderserumalbumine (BSA) in 0,2% PBS-T). Volg dit met incubatie met konijn anti-tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam (1:500) en muis anti-α-syn antilichaam (1:500) in 2% NGS in 0,2% PBS-T 's nachts bij kamertemperatuur.
- Was het primaire antilichaam af met 3 x 5 minuten wasbeurten in 0,2% PBS-T, gevolgd door 1 uur incubatie met geitenanti-konijn Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:500) en geitenantimuis Alexa Fluor 555 secundair antilichaam in 2% NGS in 0,2% PBS-T. Zorg ervoor dat de secties zijn beschermd tegen licht en voorzichtig noteren.
- Was het secundaire antilichaam af met 3 x 5 minuten wasbeurten in 0,2% PBS-T en monteer de volledige set secties op dia's die beschermd zijn tegen licht en stof met behulp van een smalle kwast. Coverslip met fluorescentie montagemedium en afdichting met blanke nagellak.
3. Confocale microscopie en beeldverwerving
- Leg IHC-beelden vast met behulp van software die is gekoppeld aan een confocale microscoop met een vergroting van 10x. Open het pinhole tot 1,5 AU om een breed vlak van ~ 1,5 μm vast te leggen en de focus op de geïnjecteerde kant van de hersenen te leggen.
- Controleer op het tabblad Acquisitie de optie Tegelscanbeeldvorming en stel de afmetingen in op 10 x 4.
- Stel onder het deelvenster Acquisitiemodus de zoom in op 1.1. Dit helpt om duidelijke stiksporen tussen tegelscanafbeeldingen te voorkomen.
- Stel de framegrootte in op 1024 x 1024 pixels en de middeling op 2 om een hoge beeldkwaliteit te garanderen.
- Stel in het deelvenster Kanalen track 1 in op Alexa488 en track 2 op Alexa555.
- Plaats de dia op het podium en kies een sectie met sterke TH-kleuring. Klik op Live in het deelvenster Acquisitie.
- Stel in het deelvenster Kanalen de lasersterkte en versterking in op niveaus die het signaal maximaliseren en ruis vanaf de achtergrond beperken. Gebruik de bereikindicator om ervoor te zorgen dat de signalen niet overbelicht zijn (zoals aangegeven door een donkerrode overlay).
- Herhaal de bovenstaande stap met meerdere dia's om ervoor te zorgen dat de kleuring consistent is tussen dia's, omdat de lasersterkte/versterking niet kan worden aangepast tussen dia's.
- Schakel op het tabblad Acquisitie het selectievakje Posities in.
- Op dit moment bent u klaar om te beginnen met beeldvorming. Kies met behulp van het oculair het eerste gedeelte met positieve TH-kleuring, stel de focus in op het punt van belang (d.w.z. SNpc) en verplaats het werkgebied vervolgens naar de middellijn van de sectie. Hiermee wordt de positie in de assen x, y en z opgeslagen en wordt een tegelscan weergegeven die de hele sectie vastlegt.
- Herhaal de bovenstaande stap voor alle secties in de SNpc en geef een complete set afbeeldingen van de SNpc. Indien een gedetailleerde analyse van de niet-geïnjecteerde zijde vereist is, moeten de stappen 3.10 tot en met 3.11 worden herhaald door de nadruk op de niet-geïnjecteerde zijde te stellen.
4. Beeldanalyse en kwantificering
- Afzonderlijke afbeeldingsbestanden met behulp van de juiste software en importeer afbeeldingsbestanden naar geautomatiseerde beeldanalysesoftware.
- Definieer een interessegebied door het gereedschap Penannotatie te selecteren om een annotatie rond de SNpc te tekenen.
OPMERKING: In secties met een grote hoeveelheid dopaminerge neuron verlies, tijdelijk verhogen van de emittance / absorptie kan helpen om duidelijk te definiëren van de SNpc (Figuur 2). - Ga naar het tabblad Analyse en selecteer real-time tuningin het vervolgkeuzemenu Analyseren. Dit opent een apart venster op de sectieafbeelding, zodat analyseparameters in realtime kunnen worden gewijzigd (figuur 3).
- Selecteer in de sectie Analysevergroting de juiste afbeeldingszoom.
- Selecteer onder de sectie Celdetectie nucleaire kleurstof als de kleurstof die wordt gebruikt voor TH-kleuring (Alexa Fluor 488).
- Pas de nucleaire contrastdrempel, minimale nucleaire intensiteit, nucleaire segmentatieagressiviteiten nucleaire grootte-instellingen aan terwijl u het real-time tuningvenster zorgvuldig bekijkt.
OPMERKING: Een nauwkeurige weergave van elke afzonderlijke cel als één cel in het real-time tuningvenster is van vitaal belang voor de nauwkeurigheid. Deze instellingen zijn op willekeurige schaal, afhankelijk van de gebruikte software, maar de juiste aanpassing is nodig om de software in staat te stellen nauwkeurig onderscheid te maken tussen afzonderlijke cellen en tussen cellen en de achtergrond (figuur 3). - Herhaal dit proces met minimaal 10 afzonderlijke monsters om een uniforme overeenstemming te garanderen van wat een cel over verschillende secties vormt.
OPMERKING: Extra celmarkeringen (zoals α-syn of NeuN) kunnen binnen hetzelfde analyseplatform worden geïdentificeerd met behulp van de secties Marker 1 of Marker 2 op het analysetabblad. - Zodra een passend aantal afbeeldingen is gesampled en Real-Time Tuning dienovereenkomstig is aangepast, slaat u de analyse-instellingen op in het vervolgkeuzemenu Instellingenacties.
- Selecteer alle te analyseren afbeeldingen en klik op Analyseren.
- Kies de analyse-instelling die u zojuist hebt opgeslagen en vink in het venster Analysegebied het selectievakje Annotatielaag(en) aan. Controleer vervolgens Laag 1 en klik op Analyseren.
OPMERKING: Voor een enkel brein duurt de analyse meestal ongeveer 5 minuten. Het voltooide resultaat toont duidelijk elk item dat als cel is geteld (figuur 4). - Als u klaar bent, exporteert u de overzichtsanalysegegevens voor alle secties. Er is een optie om objectanalysegegevenste exporteren, die gedetailleerde gegevens geven, waaronder de celgrootte van elke gedetecteerde afzonderlijke cel. Deze dataset kan worden gebruikt om veranderingen in celgrootte te onderzoeken als reactie op een toxine/therapeutisch middel.
- Voeg de totale cellen van elke geanalyseerde sectie per dier en het totale geanalyseerde gebied (mm2 ) toe. Deel het totale aantal cellen door het totale geanalyseerde gebied om het aantal cellen/mm2 in de SNpc voor elke rat te berekenen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door de bovenstaande methoden toe te passen op hersenweefsel dat 6 weken na AAV-injecties is verzameld, hebben we aangetoond dat stereotactische injectie van AAV-expresserende mutant A53T α-syn (AAV-A53T) in de SNpc van rattenhersenen resulteert in een significante vermindering van de dichtheid van dopaminerge neuronen in vergelijking met injectie van lege vector AAV (AAV-EV) als controle (Figuur 5A, B). Het gemiddelde aantal TH-positieve neuronen/mm2 in de SNpc van ratten geïnjecteerd met AAV-EV was 276,2 ± 34,7, en in de SNpc van ratten geïnjecteerd met AAV-A53T was 41,2 ± 17(P = 0,0003). Kwantificering van het aantal dopaminerge neuronen/mm2 in de SNpc is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde rapporten10,11. Voor de hier beschreven methoden werden 4 opeenvolgende secties per dier geanalyseerd. Eerdere studies hebben significante verschillen aangetoond met slechts 3 secties, maar de analyse kan verder worden verhoogd tot 12 secties om de hele SNpc te omvatten, afhankelijk van het model en de interventie die door de onderzoeker worden bestudeerd.
Onbevooroordede stereologie werd ook uitgevoerd zoals eerder beschreven12 op een andere set hersensecties van dezelfde dieren. Met behulp van deze methode hebben we ook aangetoond dat stereotactische injectie van mutant A53T α-syn in de SNpc van rattenhersenen resulteert in een significante vermindering van het geschatte totale aantal TH-positieve neuronen in de SNpc, in vergelijking met injectie van EV-AAV (Figuur 5C). Belangrijk is dat er een sterke correlatie was tussen de dopaminerge neurondichtheid geschat met behulp van geautomatiseerde beeldanalysesoftware en dopaminerge neuronenaantal geschat met behulp van onbevooroordeelde stereologie (r = 0,8819, P = 0,0007) (Figuur 5D).
We hebben onze methoden ook toegepast met behulp van geautomatiseerde beeldanalysesoftware om het aantal TH-positieve neuronen / mm2 te bepalen aan de niet-geïnjecteerde kant van ratten geïnjecteerd met AAV-A53T of AAV-EV. Het gemiddelde aantal TH-positieve neuronen/mm2 in de niet-geïnjecteerde SNpc van ratten geïnjecteerd met AAV-A53T was 123,2 ± 26,4, wat significant groter was dan in de geïnjecteerde SNpc, die 44,0 ± 15,8 (P = 0,0331) was (Aanvullende figuur 1A). Het gemiddelde aantal TH-positieve neuronen/mm2 in de niet-geïnjecteerde SNpc van ratten geïnjecteerd met AAV-EV (215,6 ± 35,5) verschilde niet significant van de geïnjecteerde SNpc (276,2 ± 34,7), wat bevestigt dat er geen degeneratie was als gevolg van injectie met AAV-EV (Aanvullend figuur 1B). We berekenden deze resultaten als een percentage geïnjecteerde/niet-geïnjecteerde dieren en ontdekten dat dieren die met AAV-A53T werden geïnjecteerd een vermindering van 69% hadden in vergelijking met de AAV-EV-dieren (Aanvullend figuur 1C).
Figuur 1: Workflow van de methode. Workflow die de stappen demonstreert die nodig zijn om AAV's, sectie- en vlekkenweefsel te injecteren, een interessegebied te definiëren en de software voor het tellen van cellen te optimaliseren. Representatieve afbeeldingen van confocale tegelscan, ROI-definitie en kwantificering van cellen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Definiëren van de interesseregio. (A) Coronale hersensectie, inclusief de SNpc immunostained voor TH (groen) van een rat geïnjecteerd met AAV-A53T α-syn. Bij ratten met ernstige neurodegeneratie (zoals hier getoond) kan het moeilijk zijn om de SNpc te identificeren. (B) Het tijdelijk verhogen van de absorptie van het beeld kan de structuur identificeren en een nauwkeurige identificatie van het interessegebied mogelijk maken. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Celdetectie optimaliseren met behulp van de Cytonucleaire methode in HALO. Real-time tuning van de cytonucleaire module stelt de gebruiker in staat om veranderingen in celdetectie in realtime te zien door de nucleaire contrastdrempel, minimale nucleaire intensiteit, nucleaire segmentatieagressiviteit en nucleaire grootte te wijzigen. (A) Representatieve afbeelding met regio van belang weergegeven. (B) Real-time tuning met onderbemonstering waarbij de software niet alle cellen in het tuningvenster detecteert. (C) Overbemonstering waarbij de software meer cellen detecteert dan in het stemvenster zichtbaar is. (D) Geoptimaliseerde afstemming waarbij het juiste aantal cellen wordt geteld. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: HALO geoptimaliseerde instellingen binnen een bepaald interessegebied. Representatieve beelden van voltooide analyse met behulp van geoptimaliseerde instellingen voor cytonucleaire detectie in HALO. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Expressie van humane mutant A53T α-syn in SNpc resulteert in ernstige neurodegeneratie na 6 weken zoals gekwantificeerd door HALO en onbevooroordeelde stereologie. (A) Representatieve beelden die degeneratie van TH-positieve neuronen in de SNpc laten zien 6 weken na stereotactische injectie van AAV-A53T α-syn bij een titer van 3,4 x10 12 virale deeltjes/ml. Immunofluorescente kleuring met anti-TH (groen) en anti-α-syn (rood) antilichamen. Schaalbalk = 200 μm. (B) Kwantificering van het aantal TH-positieve neuronen in de SNpc van ratten geïnjecteerd met AAV-A53T α-syn of AAV-EV toont aan dat expressie van mutante α-syn resulteert in significant dopaminerge neuronverlies. Ongepaarde t-test; n = 5 ratten/groep. Grafiek toont gemiddelde ± SEM, ***P < 0.001. (C) Representatieve beelden van colorimetrische kleuring van dopaminerge neuronen in de SNpc van AAV-A53T (links) of AAV-EV (rechts) geïnjecteerde ratten die worden gebruikt om onbevooroordete stereologie uit te voeren. Schaalbalk = 200 μm. (D) Een significante correlatie tussen halotelling van TH-positieve neuronen/mm2 (y-as) en onbevooroordeelde stereologiecelgetallen (x-as). Pearson correlatie (r = 0,8819, P = 0,0007). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Significante unilaterale neurodegeneratie wordt waargenomen bij de SNpc van ratten die AAV-A53T injectie kregen. (A) Kwantificering van het aantal TH-positieve neuronen in de geïnjecteerde of niet-geïnjecteerde SNpc van ratten die een eenzijdige AAV-A53T stereotactische injectie kregen, laat een significante afname aan de geïnjecteerde kant zien. (B) Kwantificering van het aantal TH-positieve neuronen in de geïnjecteerde of niet-geïnjecteerde SNpc van ratten die unilaterale AAV-EV stereotactische injectie kregen, vertoont geen significante veranderingen. (C) Normalisatie naar de niet-geïnjecteerde contralaterale zijde toont een afname van > 50% aan bij injectie met AAV-A53T α-syn in vergelijking met AAV-EV. Ongepaarde t-test; n = 5 ratten/groep. Grafieken tonen gemiddelde ± SEM, *P < 0,05, ***P < 0,001. Klik hier om deze aanvullende figuur te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De betrouwbare beoordeling van de integriteit van het dopaminerge systeem in preklinische modellen van PD is van cruciaal belang om de effectiviteit van potentiële ziektemodificerende therapieën te bepalen. Daarom is het belangrijk om potentiële verwarringen te beheersen en te minimaliseren die de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histopathologische gegevens kunnen verminderen. Zorgvuldige kwantitatieve uitkomsten kunnen meer informatie opleveren dan alleen kwalitatieve of semi-kwantitatieve beschrijvingen. Tegelijkertijd moeten we erkennen dat beperkingen in tijd en middelen het moeilijk kunnen maken om onbevooroordeelde stereologische tellingen uit te voeren om pathologische veranderingen of verlies van cellen te kwantificeren. Met recente verbeteringen kan echter aan veel van deze criteria worden voldaan met behulp van geautomatiseerde en geautomatiseerde beeldplatforms6.
Dit protocol beschrijft een aantal belangrijke stappen bij het bepalen van de stereologische schatting van dopaminerge neuronen/mm2 in knaagdierhersenen. Opgemerkt moet worden dat we stereotactische injectie gebruikten om AAV's aan de SNpc te leveren, wat een belang hecht aan een nauwkeurige levering van deze virussen om het effect van elke behandeling te bepalen. De coördinaten die voor onze studie worden gebruikt zijn bregma -5,2 mm (voorste-posterieure), -2 mm (mediaal-laterale naar rechts) en -7,5 mm (dorsale ventrale van de schedel) op volwassen vrouwelijke ratten met een gewicht van ~ 275 g. Correcte levering van het virus met behulp van deze coördinaten zorgt voor de levering van de AAV's aan de SNpc.
Daarnaast moet voorzichtig worden opgetreden bij het voorbereiden van weefsels op vlekken. Zorg er vooral voor dat u aanmarkering geeft welke kant de rechter/linkerkant is. In onze handen, de gemakkelijkste en meest
reproduceerbare manier om dit te doen was om een 25G-naald te gebruiken om periodiek een gat in de linker dorsale middenhersenen te prikken terwijl de niet-geïnjecteerde kant werd geïdentificeerd. Een diepgaande kennis van de neuroanatomische gebieden van de knaagdierhersenen is belangrijk om te differentiëren wanneer te beginnen met snijden en later om de SNpc te identificeren bij het tekenen van een interessegebied. Het is belangrijk op te merken dat TH-kleuring niet uitsluitend neuronen van de SNpc bevlekt, en men moet in staat zijn om onderscheid te maken tussen TH-positieve neuronen in het ventrale tegmentale gebied en retrorubale veld. Een rattenhersenatlas is een handige gids voor mensen die geen ervaring hebben met neuroanatomie van knaagdieren. De incubatietijden van antilichamen zijn uniform gedurende het hele protocol en de focus wordt ingesteld in de minimale tijd die mogelijk is om fotobleaching te voorkomen.
Er is een lage variabiliteit tussen monsters zodra consistente neuroanatomische kenmerken worden gebruikt om onderscheid te maken tussen secties. Het is belangrijk om een ervaren, geblindeerde waarnemer de interesseregio te laten tekenen om consistentie te behouden tussen de te analyseren secties. Analyse van de niet-geïnjecteerde zijde zoals weergegeven in aanvullende figuur 1 toont aan dat er een consistentie is met de methode. Bij het op deze manier interpreteren van gegevens moet echter voorzichtig worden omgegaan. Het snijden van hersenen is consequent afhankelijk van het vergelijken van de aanwezigheid van bekende neuroanatomische kenmerken aan elke kant van de hersenen. Subtiele verschillen kunnen betekenen dat de niet-geïnjecteerde kant op een bepaalde sectie meer posterieure/anterieure kan zijn dan de geïnjecteerde kant, en dus geen nauwkeurige directe vergelijking. Verdere analyse van de gepresenteerde gegevens wijst op een beperking van deze methode. Er is een grote mate van variabiliteit in de dopaminerge neurontellingen in de niet-geïnjecteerde kant (123,2 in de AAV-A53T-groep versus 215,6 in de AAV-EV), wat men niet zou verwachten tussen vergelijkbare oudere dieren. Er zijn een aantal mogelijke redenen voor deze discrepantie, waaronder de kleine steekproefgrootte die in deze studie wordt gebruikt en de bovengenoemde anatomische verschillen van links naar rechts. Daarnaast wordt de focus voor fluorescerend signaal ingesteld op de geïnjecteerde kant, wat betekent dat een lichte verschuiving in het z-vlak de niet-geïnjecteerde kant onopgeraakt kan laten, en dus zullen sommige cellen niet detecteerbaar zijn door de celtellingssoftware. Om deze reden wordt aanbevolen om het aantal dopaminerge neuronen / mm2 aan één kant te vergelijken met behulp van bekende neuroanatomische kenmerken en waar de focus specifiek voor deze regio op de microscoop is ingesteld. Als een vergelijking met de niet-geïnjecteerde kant nodig is, moet de beeldvorming worden herhaald met de focus aan deze kant.
We presenteren gegevens verkregen en geanalyseerd met een van de verschillende softwarepakketten die kwantitatieve beeldanalyse bieden met minimale gebruikerstraining13. Andere programma's zijn beschikbaar en worden steeds vaker gebruikt om neuropathologie te bestuderen, waaronder de kwantificering van dopaminerge neuronverlies in experimentele modellen van PD6. Hoewel sommige ingebouwde algoritmen aanbieden om specifieke functies uit te voeren (bijv. het tellen van amyloïde plaque), delen veel van de softwarepakketten verschillende gemeenschappelijke functies die ze bijzonder nuttig maken voor laboratoria die repetitieve analyses uitvoeren. Naast de identificatie van het interessegebied kunnen voorbewerkingsstappen die het signaal verstoren (weefselplooien, randartefacten, inktvlekken, vlekken, enz.) uit het interessegebied worden verwijderd met handmatige en patroonherkenningstools. Bovendien kunnen de verstrekte uitlezingen worden gebruikt in combinatie met kwantitatieve waarden verkregen uit eiwit-, cellulaire of gedragsstudies om relaties en potentiële correlaties tussen variabelen te onderzoeken.
De hierboven beschreven methode biedt een nauwkeurige, semi-kwantitatieve en relatief goedkope procedure voor het schatten van neuronaantallen in immunohistochemisch bevlekte hersensecties. De real-time tuning-functie maakt aanpassing van de methode voor alle secties mogelijk en zorgt voor consistentie, zelfs met kleine afwijkingen in snijmethoden. Het hebben van een verblinde waarnemer identificeren regio's van belang in de SNpc vermindert bevestiging of selectie biases en de software biedt een eenvoudige uitlezing waardoor berekening van neuronen / mm2. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om nauwkeurige tellingen van neuronen in verschillende hersengebieden te bieden met behoud van efficiëntie en kostenvoordelen ten opzichte van meer gevestigde stereologische protocollen. De vooruitgang van de diascantechnologie voor dikkere secties zou ook een efficiëntere verwerkingstijd voor de hierboven beschreven methode mogelijk maken.
Beperkingen
De beschreven methode heeft een aantal duidelijke voordelen in zijn snelheid en vermogen om grote veranderingen in neurondichtheid te detecteren, maar stelt ook zijn eigen uitdagingen. In tegenstelling tot stereologie kan de methode geen schatting van absolute celnummers geven, maar in plaats daarvan de celdichtheid binnen de SNpc berekenen. De schattingen van celdichtheid zijn sterk, maar niet perfect, gecorreleerd met celnummers verkregen met behulp van onbevooroordede stereologie. Bovendien is de methode afhankelijk van het afstemmen van de celgrootte en -vorm door de gebruiker voordat de analyse wordt begonnen. Dit kan niet garanderen dat cellen niet worden gemist omdat ze gedeeltelijk in het brandpuntsvlak zitten, of dat cellen van een ongebruikelijke grootte en/of vorm door de software worden gemist. In de ervaring van de auteurs is de methode bijzonder nuttig voor het onderzoeken van de werkzaamheid van potentiële ziektemodificerende geneesmiddelen in preklinische knaagdiermodellen. Concluderend, hoewel stereologische methoden om celnummers te kwantificeren op grote schaal worden gebruikt in de neurowetenschappen, suggereert de snelle versnelling van de digitalisering dat geautomatiseerde beeldanalyseplatforms steeds vaker zullen worden gebruikt om neuropathologie te bestuderen, vooral omdat ze blijven verbeteren. Het is belangrijk dat de onderzoeker de technische beperkingen van deze aanpak begrijpt en deze methodologie na zorgvuldige overweging toepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs rapporteren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen alle medewerkers van de Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) van het University Health Network bedanken voor hun tijd en hulp bij het ontwikkelen van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R.
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
