Summary
ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。
Abstract
立体ニグラにおけるドーパミン作動性ニューロンの数の推定は、前臨床パーキンソン病研究における重要な方法である。現在、公平な立体的なカウントは、これらの細胞の定量化のための標準ですが、それは、すべてのプロジェクトのために実現可能ではないかもしれない、面倒で時間のかかるプロセスのままです。ここでは、あらかじめ定義された対象領域におけるラベル付き細胞の量を正確に推定できる画像解析プラットフォームの使用について説明する。我々は、ラット脳におけるこの分析方法のステップバイステップのプロトコルを説明し、実質的なニグラにおける変異型αシヌクレインの発現によるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンの有意な減少を同定できることを実証する。我々は、この方法論を、公平なステレロジーによって得られた結果と比較することによって検証した。この方法を組み合わせると、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率と正確なプロセスを提供し、したがって、細胞生存に対する介入の効果を効率的に決定するのに適している。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、α-シヌクレイン(α-syn)を含むタンパク質凝集体の存在と、実質的なニグラパルス・パルス・スプカ(SNpc)におけるドーパミン作動性ニューロンの優等喪失を特徴とする一般的な神経変性運動障害である。ドーパミン作動性ニューロン数の定量化は、結合トリアティアル系の完全性の評価を可能にするため、PD研究の重要な部分であり、したがって、潜在的な疾患修飾療法の有効性を評価する重要なエンドポイントを提供する。現在、細胞数の定量化基準は、組織の2次元(2D)断面を利用して、3次元(3D)構造における容積物特徴を2、3、4に推定する非バイアス的な立体数計数である。現代の設計ベースのステレオロジー手法は、包括的なランダムサンプリング手順を採用し、潜在的なアーティファクトと系統的エラーを回避するためにカウントプロトコル(プローブと呼ばれる)を適用し、動物間変動5よりもわずかに大きい差の信頼性の高い検出を可能にする。ステテロロジーは生体組織学的研究のための強力な分析ツールを提供するが、それは時間のかかる、均一な標本の準備を前提とし、臨床前の翻訳調査にますます必要とされる効率に影響を与えることができるいくつかのステップで検証を必要とします。
デジタル科学の最近の技術進歩により、非偏型ステレロジーの代理としての必要性を満たしながら、実体顕微鏡なしで病理学のより効率的な評価のための新しいアプリケーションを採用することが可能になりました。これらの方法は、速度を向上させ、人為的ミスを減らし、立体技術6,7の再現性を向上させる。HALOは、デジタル病理における定量的組織分析用の画像解析プラットフォームの1つです。それはさまざまなモジュールで構成され、パターン認識アルゴリズムを使用して組織のセクション全体の細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する。細胞核FLモジュールは、核または細胞質中の蛍光マーカーの免疫蛍光陽性を測定する。これにより、各マーカーの正のセル数と、各セルの強度スコアを報告できます。このモジュールは、個々の細胞サイズおよび強度測定を提供するように適合することができるが、この特徴はドーパミン作動性ニューロンの定量化に必要ではない。
本研究の目的は、ニグラル神経変性8、9、10の以前に検証されたウイルスベクターベースのα-synラットモデルを用いてこの方法を検証することである。このモデルでは、ヒト変異体A53T α-synは、アデノ関連ウイルスハイブリッド血清型1/2(AAV1/2)の立体的注射によりSNpcで発現し、6週間にわたって有意な神経変性をもたらす。逆側未注入SNpcは、いくつかの研究において、注入された側の内部統制として役立つかもしれない。より一般的には、動物のコントロールコホートにおけるAAV-空ベクトル(AAV-EV)の注入は、陰性対照として使用される。自動画像解析ソフトウェアを使用して、注入されたSNpcに残っているドーパミン作動性ニューロンの密度を6週間後に推定するためのステップバイステップガイドを提示する(図1)。
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Protocol
すべての手順は、大学医療ネットワーク動物ケア委員会によって承認され、動物ケアに関するカナダの評議会によって設定されたガイドラインと規制に従って行われました.
1. 定位注射
- ペアハウスの成人女性スプレイグ・ドーリーラット(250-280 g)は、木製の寝具と食べ物と水へのアドリブアクセスを備えたケージに入っています。一定の温度と湿度で定期的に12時間の明暗サイクル(06:30のライト)で動物のコロニーを維持します。
- 前に説明した8,10のように脳の右側のSNpcに直接AAVの一方的な定位注射を行う(各ラボの好みに応じて、右または左側)。3.4 x 1012ゲノム粒子/mLの最終用の引き込みで、AAV1/2の2 μLを注入します。
2. 脳切除・免疫検査(IHC)
- 3分間麻酔室に入れることで、5%イソファランでラットを麻酔します。他の承認された方法は、適切な制度的レビューの後、このステップのために使用することができます.
- ラットが深部麻酔の外科面に達したら、壊死表にしっかりと貼られた鼻コーンに移す。テープを使用してラットの前足を固定し、つま先のピンチ応答法を使用して麻酔の深さを決定します。続行する前に、動物が応答しない必要があります。
- 胸骨の下に横切りを行い、胸膜腔を露出させるために、胸部ケージの全長に沿って横隔膜を切断します。胸骨を止め、頭の上に置きます。
- 鉗子を使用して心臓をクランプし、左心室の後端に灌流ポンプに接続された蝶の針を挿入します。ラットを150mLのヘパリン化食ラインで経皮的に、または目と皮膚が透明になるまでパーフューズする。4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流は、生理食動物の代わりに、ある種の抗体またはシンナー脳切血で免疫染色を容易にすることが好ましい。
- 灌流が完了したら、ギロチンで切断し、脳を脳マトリックスに抽出し、腹側表面を上に向けます。
- 新鮮なカミソリの刃を使用して、コロナ平面2 mmのロストラルを光学チアズムにカットします。スライスしながら脳をゆがめないように、ブレードを左右にスライドさせます。
- 脳の後部を、4%PFAの約20mLを含む前ラベル付きバイアルに浸し、48時間の後固定を室温で行います。脳の前部は、−80°Cで保存する前に−42°Cに冷やした2−メチルブタンでフラッシュ冷凍されてもよい。
- 48時間後、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)に30%スクロースを含む標識されたバイアルに固定脳を移し、沈むまで4°Cで保存します(48-72時間)。
- 試料ステージのトラフにドライアイスを入れ、その後100%エタノールを入れてミクロトームを準備します。ステージが冷却されたら、最適な切断温度(OCT)化合物をステージに絞り、直径2cm、厚さ0.5cmの円を形成します。部分的に凍結したら、慎重にOCTのマウンドに脳を下げ、線条体切断面がステージと平行に保たれます。
- 脳が凍結するのを助けるためにステージに多くのドライアイスを追加します。脳がクリーム色になったら、ドライアイスの段階をクリアします。
- 右半球と左半球を区別するために25G針で脳の右側に穴を開けます。目的の解剖学的構造を通して針を渡さないで注意してください。
- ブレグマ-3.8から始まり、ブレグマ-6.8で終わるコロナ平面の40 μmのセクションを連続的に切断した。
- 凍結防止液(40%PBS、30%2-エトキシエタノール、30%グリセロール)を用いたラベルチューブに6シリーズを保管してください。各シリーズは、12の脳のセクションを含む必要があります。
- 免疫ヒストケミカル染色用のセクションを1セット選択し、0.2%PBS-Tで3 x 10分洗浄で凍結防止液を洗い流します。
- ブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清(NGS)、2%ウシ血清アルブミン(BSA)0.2%PBS-T)で穏やかな栄養を伴うRTで1時間ブロックする。ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体(1:500)およびマウス抗α-syn抗体(1:500)を室温で一晩0.2%PBS-Tで2%NGSでインキュベーションしてこれに従ってください。
- 0.2%PBS-Tで3 x 5分洗浄で一次抗体を洗い流し、続いてヤギ抗ウサギアレクサフルオール488二次抗体(1:500)とヤギ抗マウスアレクサフルオール555二次抗体を2%NGSで0.2%PBS-Tで1時間インキュベーションします。セクションが光から保護され、優しく栄養を取り除かれるようにします。
- 0.2%PBS-Tで3 x 5分洗浄で二次抗体を洗い流し、狭いペイントブラシを使用して光とほこりから保護されたスライドにセクションの完全なセットを取り付けます。蛍光実装媒体と透明な爪のニスとシールカバースリップ。
3. 共焦点顕微鏡と画像取得
- 10倍の倍率でコンフォーカル顕微鏡に結合されたソフトウェアを使用してIHC画像をキャプチャします。ピンホールを1.5 AUに開き、合計1.5μmの広い平面をキャプチャし、脳の注入側に焦点を当てます。
- [ 取得 ]タブで、[ タイルスキャン イメージング]オプションをオンにして、寸法を10 x 4に設定します。
- 取得モードパネルで、ズームを 1.1 に設定します。これにより、タイル スキャン イメージ間の明白なステッチ マークを回避できます。
- 高品質の画像取得を確実にするため、 フレーム サイズ を 1024 x 1024 ピクセルに設定し 、平均 を 2 に設定します。
- チャンネルパネルでトラック1をAlexa488に、トラック2をAlexa555に設定します。
- ステージにスライドをロードし、強いTH染色のセクションを選択します。[取得]パネルで[ライブ]をクリックします。
- チャンネルパネルで、信号を最大化し、バックグラウンドからのノイズを制限するレベルにレーザー強度とゲインを設定します。範囲インジケータを使用して、信号が露出過多にならないようにします(濃い赤色のオーバーレイで示されます)。
- 複数のスライドで上記の手順を繰り返して、スライド間のレーザー強度/ゲインを調整できないため、スライド間で一貫した染色を行います。
- [ 取得 ] タブで、[ 職位] ボックスをオンにします。
- この時点で、イメージングを開始する準備が整いました。接眼レンズを使用して、正のTH染色を示す最初のセクションを選択し、目的のポイント(すなわち、SNpc)に焦点を当て、その後、セクションの中線にステージを移動します。これにより、x、y、z 軸の位置が保存され、セクション全体をキャプチャするタイル スキャンがイメージ化されます。
- SNpc 全体のすべてのセクションに対して上記の手順を繰り返し、SNpc の画像の完全なセットを提供します。未注入側の詳細な分析が必要な場合は、非注入側にフォーカスを設定してステップ3.10から3.11を繰り返す必要があります。
4. 画像解析と定量
- 適切なソフトウェアを使用して画像ファイルを分離し、画像ファイルを自動画像解析ソフトウェアにインポートします。
- ペン注釈ツールを選択して、SNpc の周囲に注釈を描画して、関心のある領域を定義します。
注:ドーパミン作動性ニューロンの損失が多いセクションでは、一時的に放出/吸収を増加させることで、SNpcを明確に定義するのに役立ちます(図2)。 - [分析] タブに移動し、ドロップダウンメニューから [リアルタイムチューニング] を選択します。これにより、セクションイメージに別のウィンドウが開き、解析パラメータをリアルタイムで変更できます(図3)。
- [ 解析倍率 ]セクションで、適切な画像ズームを選択します。
- [ 細胞検出 ]セクションで、TH染色に使用する色素として核色素を選択します(Alexa Fluor 488)。
- リアルタイムチューニングウィンドウを注意深く見ながら、 核コントラストしきい値、 最小核強度、 核セグメンテーション攻撃性、 核サイズ の設定を調整します。
注: 個々のセルを[リアルタイム チューニング]ウィンドウ内の 1 つのセルとして正確に表現することは、正確性にとって重要です。これらの設定は、使用するソフトウェアによって任意のスケールになりますが、ソフトウェアが個々のセルを正確に区別し、セルと背景を正確に区別するには、正しい調整が必要です(図3)。 - このプロセスを少なくとも 10 個の別々のサンプルで繰り返し、異なるセクション間でセルを構成するものの一様な一致を確認します。
注: 分析タブのマーカー 1 またはマーカー 2 セクションを使用して、同じ解析プラットフォーム内で(α-syn または NeuN など)セルマーカーを追加で識別できます。 - 適切な数の画像をサンプリングし、リアルタイムチューニングを調整したら、[ 設定アクション] ドロップダウンメニューで分析設定を保存します。
- 分析するすべての画像を選択し、[ 分析] をクリックします。
- 保存した解析設定を選択し、[ 解析領域 ] ウィンドウで [アノテーション レイヤー] チェックボックスをオンにします。次に、 レイヤ 1 を チェックして、[ 解析] をクリックします。
注:単一の脳の場合、分析は通常約5分かかります。完成した結果は、セルとしてカウントされた各項目を明確に示します (図 4)。 - 完了したら、すべてのセクションのサマリー分析データをエクスポートします。 オブジェクト分析データをエクスポートするオプションがあり、検出された個々のセルのセルサイズを含む詳細なデータを提供します。このデータセットは、毒素/治療に応答して細胞サイズの変化を調べるために使用することができます。
- 動物ごとに分析された各セクションの合計セルと、分析された領域の合計 (mm2)を追加します。分析したセルの総数を分析した領域の合計で割って、各ラットの SNpc 内のセル/mm2 の数を計算します。
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Representative Results
上記の方法をAAV注射の6週間後に採取した脳組織に適用することにより、ラット脳のSNpcにおけるAAV発現変異体A53T α-syn(AAV-A53T)の立体的注射は、コントロールとしての空のベクターAAV(AAV-EV)の注入と比較してドーパミン作動性ニューロンの密度の有意な減少を生じることを実証した(図5A、B)。AAV-EVを注射したラットのSNpcにおけるTH陽性ニューロン/mm2の平均数は276.2±34.7であり、AAV-A53Tを注射したラットのSNpcは41.2±17(P= 0.0003)であった。 SNpcにおけるドーパミン作動性ニューロン/mm2の数の定量化は、以前に公表されたレポート10,11と同様である。ここで説明する方法について、動物ごとに4つの逐次セクションを分析した。これまでの研究では、わずか3つのセクションで有意な違いが示されていますが、分析はさらに12セクションまで増加し、研究者が研究しているモデルと介入に応じてSNpc全体を包含することができます。
偏りのないステレロジーはまた、同じ動物からの脳切片の別のセットに前述の12のように行われた。この方法を用いて、ラット脳のSNpcにおける変異A53T α-synの定位的注入は、EV-AAVの注入と比較してSNpcにおけるTH陽性ニューロンの推定総数を有意に減少させることも実証した(図5C)。重要なのは、自動画像解析ソフトウェアを用いて推定されるドーパミン作動性ニューロン密度と、バイアスされていないステレロジーを用いて推定されるドーパミン作動性ニューロン数(r =0.8819,P=0.0007)(図5D)との間に強い相関関係があった。
また、自動画像解析ソフトウェアを用いて、AAV-A53TまたはAAV-EVを注入したラットの未注入側のTH陽性ニューロン/mm2の数を決定する方法を適用しました。AAV-A53Tを注射したラットの未注入SNpcにおけるTH陽性ニューロン/mm2の平均数は123.2±26.4であり、注射されたSNpc±44.0であった(P= 0.0331)(補足図1A)。AAV-EVを注射したラットの未注入SNpcにおけるTH陽性ニューロン/mm2の平均数(215.6±35.7)は、注入されたSNpc(276.2±34.7)と有意に異なっていなかった、AAV-EVによる注射による変性がないことを確認した(補足図1B)。我々は、これらの結果を注射/非注入の割合として計算し、AAV-A53Tを注射した動物がAAV-EV動物と比較して69%減少したことを発見した(補足図1C)。
図1: メソッドのワークフロー AAV、セクション、染色組織を注入し、関心領域を定義し、細胞のカウント用ソフトウェアを最適化するために必要な手順を示すワークフロー。共焦点タイルスキャン、ROI定義、セルの定量の代表的な画像。スケールバー= 100 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 対象領域を定義する (A)、AAV-A53T α-synを注射したラットからTH(緑色)に対してSNpc免疫染色を含む。重度の神経変性を有するラット(ここに示すように)では、SNpcを同定することは困難であり得る。スケールバー= 1 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3HALOにおける細胞核法を用いた細胞検出の最適化 細胞核モジュールのリアルタイムチューニングにより、核コントラスト閾値、最小核強度、核セグメンテーション攻撃性、核サイズを変更することで、リアルタイムで細胞検出の変化を確認できます。(A) 対象地域が表示された代表的な画像。(B) ソフトウェアがチューニングウィンドウ内のすべてのセルを検出しないアンダーサンプリングを示すリアルタイムチューニング。(C) 調整ウィンドウで明らかなセル数を超えるセルを検出するオーバーサンプリング。(D) 正しいセル数がカウントされる最適化されたチューニング。スケールバー= 500 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:HALO は、定義された対象領域内の設定を最適化しました。 HALOでの細胞核検出に最適化された設定を用いた、完成した分析の代表的な画像。スケールバー= 500 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:SNpcにおけるヒト変異体A53T α-synの発現は、HALOおよび公平なステレロジーによって定量化された6週間で重度の神経変性をもたらす。(A)3.4 x 1012ウイルス粒子のタイターでAAV-A53T α-シンの立体的注射後6週間のSNpcにおけるTH陽性ニューロンの変性を示す代表的な画像抗TH(緑色)および抗α-syn(赤色)抗体による免疫蛍光染色。スケールバー=200μm(B)AAV-A53T α-synまたはAAV-EVを注射したラットのSNpcにおけるTH陽性ニューロン数の定量化は、変異型α-synの発現が有意なドーパミン作動性ニューロン喪失を生じることを示す。ペアになっていないt-test;n = 5ラット/群。グラフは平均± SEM、***P < 0.001 を示しています。(C)AAV-A53TのSNpc(左)またはAAV-EV(右)注射ラットにおけるドーパミン作動性ニューロンの着色染色の代表的な画像は、非偏型ステレロジーを行うために使用される。スケールバー= 200 μm(D) TH陽性ニューロン/mm2(y軸)のHALOカウントとバイアスされていないステレオロジー細胞数(x軸)との間の有意な相関。ピアソン相関(r = 0.8819、P = 0.0007)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図1:AAV-A53T注射を受けたラットのSNpcにおいて有意な一方的神経変性が観察される。(A)一方的なAAV-A53T立体型注射を受けたラットの注入または未注入SNpcにおけるTH陽性ニューロンの数の定量化は、注入された側に有意な減少を示す。(B)一方的なAAV-EV定位注射を受けたラットの注射または未注入SNpcにおけるTH陽性ニューロンの数の定量化は有意な変化を示さない。(C)非注入対側側への正規化は、AAV-EVと比較してAAV-A53T α-synで注射すると>50%減少することを示す。ペアになっていないt-test;n = 5ラット/群。グラフは平均± SEM、*P < 0.05、***P < 0.001 を示します。この補足図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PDの前臨床モデルにおけるドーパミン作動系の完全性の信頼性の高い評価は、潜在的な疾患修飾療法の有効性を決定するために重要である。したがって、組織病理学的データの信頼性と再現性を低下させる可能性のある交点を制御し、最小限に抑えることが重要です。慎重な定量的結果は、定性的または半定量的な記述だけではより多くの情報を提供することができます。同時に、時間と資源の制約は、病理学的変化や細胞の喪失を定量化するために公平なステレオロジカルカウントを実行することが困難になる可能性があることを認識する必要があります。しかし、最近の進歩により、これらの基準の多くは、コンピュータ化された自動イメージングプラットフォーム6を使用して満たすことができます。
このプロトコルは、げっ歯類の脳におけるドーパミン作動性ニューロン/mm2 の立体的推定を決定する上で重要なステップの数を記述する。我々は、任意の治療の効果を決定するために、これらのウイルスの正確な配信を重要視するSNpcにAAVを提供するために定位注射を使用することに留意すべきです。我々の研究に使用されるコーディネートは、体重約275gの成体雌ラットのブレグマ-5.2mm(前部側)、-2mm(右側の内側側側)、-7.5mm(頭蓋骨からの側腹側)である。これらのコーディネートを使用してウイルスを正しく配信すると、SNpcへのAAVの配信が確実になります。
これに加えて、染色のための組織を準備する際には注意が必要です。まず第一に、どちら側が右/左かをマークするように注意する必要があります。私たちの手の中で、最も簡単で最も
これを行う再現性の方法は、25Gの針を使用して、未注入側を識別しながら、左の後ろ脳に定期的に穴を突く方法でした。げっ歯類の脳の神経解剖学的領域の詳細な知識は、切断を開始するタイミングを区別し、後で関心のある領域を描くときにSNpcを識別するために重要です。TH染色はSNpcのニューロンを排他的に染色するものではなく、腹側テグメンタル領域と後頭脳分野のTH陽性ニューロンを区別できることに注意することが重要です。ラット脳アトラスは、げっ歯類の神経解剖学の経験を欠いている人のための有用なガイドです。抗体インキュベーション時間はプロトコル全体で均一であり、焦点は光の漂白を避けるために可能な最小時間で設定されます。
一貫した神経解剖学的特徴を使用してセクションを区別すると、サンプル間の変動性は低くなります。経験豊富で盲目の観察者が関心領域を描くことは、分析されるセクション間の一貫性を維持するために重要です。 補助図1 に示すように未注入側の分析は、方法に一貫性があることを示している。ただし、この方法でデータを解釈する場合は注意が必要です。脳をスライスすることは、一貫して脳の両側に既知の神経解剖学的特徴の存在を比較することに依存しています。微妙な違いは、特定のセクションの未注入側が注入された側よりも後部/前部であり、したがって正確な直接比較ではないことを意味するかもしれません。提示されたデータのさらなる分析は、この方法の限界を強調する。未注入側のドーパミン作動性ニューロン数には大きな変動性があり(AAV-A53T群では123.2、AAV-EVでは215.6)、同様に高齢の動物の間では期待できない。この不一致には、この研究で使用される小さなサンプルサイズや、上記の解剖学的差異など、さまざまな原因が考えられます。これに加えて、蛍光シグナルの焦点は注入された側に設定され、Zプレーンのわずかなシフトが未注入側を焦点から外す可能性があり、したがって細胞内の一部の細胞は細胞計数ソフトウェアによって検出できない。このため、既知の神経解剖学的特徴を用いて片方のドーパミン作動性ニューロン/mm2 の数を比較することが推奨され、この領域に特異的に顕微鏡に焦点が設定されている場所。未注入側との比較が必要な場合は、この側にフォーカスを設定してイメージングを繰り返す必要があります。
最小のユーザートレーニング13で定量的な画像分析を提供するいくつかのソフトウェアパッケージの1つで、取得し、分析されたデータを提示します。他のプログラムは、PD6の実験モデルにおけるドーパミン作動性ニューロン喪失の定量化を含む神経病理学を研究するためにますます採用されている。特定の機能(アミロイドプラークカウントなど)を実行するための組み込みアルゴリズムを提供するものがありますが、ソフトウェアパッケージの多くは、繰り返し分析を行う研究所に特に有用ないくつかの共通の機能を共有しています。関心領域の同定に加えて、信号を妨害する前処理ステップ(組織の折り目、エッジアーチファクト、インクマーク、汚れなど)は、手動およびパターン認識ツールによって対象領域から除去することができます。さらに、提供される読み出しは、タンパク質、細胞、または行動の研究から得られた量的な値と組み合わせて使用して、変数間の関係および潜在的な相関関係を探る。
上述の方法は、免疫学的に染色された脳切片におけるニューロン数を推定するための正確で、半定量的、かつ比較的安価な手順を提供する。リアルタイムチューニング機能により、すべてのセクションに対するメソッドの適応が可能となり、スライス法のわずかな差異でも一貫性を確保できます。盲目の観察者がSNpcの関心のある領域を識別することは確認または選択バイアスを軽減し、ソフトウェアはニューロン/mm2の計算を可能にする簡単な読み出しを提供する。この方法は、より確立されたステレオロジープロトコルよりも効率とコストの利点を維持しながら、異なる脳領域のニューロンの正確なカウントを提供するために容易に適応することができます。より厚いセクションのためのスライドスキャン技術の進歩はまた、上記の方法のためのより効率的な処理時間を可能にするであろう。
制限
説明された方法は、その速度とニューロン密度の大きな変化を検出する能力に多くの明確な利点を有するが、また、独自の課題を提起する。ステレロジーとは異なり、この方法は絶対細胞数の推定を提供することはできませんが、代わりにSNpc内の細胞密度を計算します。細胞密度の推定値は、公平なステレロジーを用いて得られた細胞数と高いが、完全ではない。さらに、この方法は、分析を開始する前に、ユーザーによるセルサイズと形状の調整に依存しています。これは、部分的に焦点面に存在するためセルが見逃されないこと、または異常なサイズや形状のセルがソフトウェアによって見逃されることを保証することはできません。著者らの経験では、この方法は、前臨床げっ歯類モデルにおける潜在的な疾患修飾治療薬の有効性を調べるのに特に有用である。結論として、細胞数を定量化するステレオロジー手法は神経科学において広く使用されているが、デジタル化の急速な加速は、特に改善し続ける中で、神経病理学を研究するために自動化された画像分析プラットフォームがますます採用されることを示唆している。このアプローチの技術的な制限を理解し、慎重に検討した後、この方法論を適用することが重要です。
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Disclosures
著者らは競合する利益を報告していない。
Acknowledgments
著者らは、大学保健ネットワークの先端光学顕微鏡施設(AOMF)のスタッフの皆さんに、このプロトコルの開発に時間と支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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