Summary
Her presenterer vi en protokoll for å tilpasse CLARITY-metoden til hjernevevet for helmonterte netthinner for å forbedre kvaliteten på standard immunhiistokjemisk farging og høyoppløselig avbildning av retinal nevroner og deres subcellulære strukturer.
Abstract
Vev hydrogel delipidation metoden (CLARITY), opprinnelig utviklet av Deisseroth laboratoriet, har blitt modifisert og mye brukt for immunstaining og avbildning av tykke hjerneprøver. Denne avanserte teknologien har imidlertid ennå ikke blitt brukt til helmonterte netthinner. Selv om netthinnen er delvis gjennomsiktig, begrenser tykkelsen på ca. 200 μm (hos mus) fortsatt penetrasjonen av antistoffer i det dype vevet, samt reduserer lysgjennomtrengning for høyoppløselig avbildning. Her tilpasset vi CLARITY-metoden for helmonterte muse netthinner ved å polymerisere dem med en akrylamidmonomer for å danne en nanoporøs hydrogel og deretter fjerne dem i natriumdidesulfat for å minimere proteintap og unngå vevsskader. CLARITY-bearbeidede netthinner ble immunostert med antistoffer mot retinal nevroner, glialceller og synaptiske proteiner, montert i en brytningsindeksmatchingsløsning og avbildet. Våre data viser at CLARITY kan forbedre kvaliteten på standard immunhiistokjemisk farging og avbildning for retinal nevroner og glialceller i helmontert forberedelse. For eksempel ble 3D-oppløsning av fine axon-lignende og dendritiske strukturer av dopaminerge amacrine celler mye forbedret av CLARITY. Sammenlignet med ikke-bearbeidede helmonterte netthinner, kan CLARITY avsløre immunostaining for synaptiske proteiner som postsynaptisk tetthetsprotein 95. Våre resultater viser at CLARITY gjør netthinnen mer optisk gjennomsiktig etter fjerning av lipider og bevarer fine strukturer av retinal nevroner og deres proteiner, som rutinemessig kan brukes til å oppnå høyoppløselig avbildning av retinal nevroner og deres subcellulære strukturer i helmontert forberedelse.
Introduction
Vertebrat netthinnen er kanskje den mest tilgjengelige delen av sentralnervesystemet (CNS), og det fungerer som en utmerket modell for å studere hjernens utvikling, struktur og funksjon. Fem klasser av nevroner i netthinnen fordeles i tre kjernefysiske lag atskilt med to plexiformlag. Det ytre kjernefysiske laget (ONL) består av klassiske fotoreseptorer (stenger og kjegler) som omdanner lys til elektriske signaler. Elektriske signaler behandles av nevroner i det indre kjernefysiske laget (INL), inkludert bipolare, horisontale og amacrine celler, og overføres deretter til retinal ganglion celler (RGCs) i ganglion cellelaget (GCL). RGCer er utgangsnevronene i netthinnen, med axonene som projiserer til hjernen for å bidra til bildedannende og ikke-bildedannende visuell funksjon. I tillegg gir tre typer glialceller (Muller-celler, astroglia og mikroglia) næringsstoffer til nevroner og beskytter nevroner mot skadelige endringer i deres ekstracellulære miljø.
En spesialisert subpopulation av amacrine celler produserer og frigjør dopamin, en viktig nevromodulator i CNS, rekonfigurere retinal nevrale kretser under lys tilpasning1,2. Dopaminerge amacrine celler (DACs) har et unikt trekk ved morfologiske profiler. Deres somata ligger i den proksimale INL med dendritter som ramifying i den mest distale delen av det indre plexiformlaget (IPL). Axon-lignende prosesser av DACs er unmyelinated, tynn og lang, sparsomt forgrenet, og bærer varicosities (stedene for dopaminutgivelse). De danner en tett plexus med dendritter i IPL, inkludert ringlignende strukturer rundt somataen til alle amacrine celler. Axonene går også gjennom INL mot OPL, og danner en sentrifugalbane over netthinnen3. Vi har vist at DAC-prosesser uttrykker reseptorer som svar på glutamatfrigivelse fra presynaptiske nevroner, inkludert bipolare celler og iboende lysfølsomme retinal ganglionceller (ipRGCer)4,5,6. Det er imidlertid uklart om glutamatreseptorer uttrykker på axoner, dendritter eller begge deler siden de er avskåret i vertikale retinal seksjoner og ikke kan skilles fra hverandre5,6. Immunostaining må utføres i helmonterte netthinner for å avdekke tredimensjonal forgrening av DACs og tilstedeværelsen av glutamatreseptorer på subcellulære rom. Selv om netthinnen er relativt gjennomsiktig, er tykkelsen på en mus helmontert netthinne ca. 200 μm, noe som begrenser penetrasjonen av antistoffer i det dype vevet, samt reduserer lysinntrengning for høyoppløselig avbildning på grunn av vevslysspredning. For å overvinne disse begrensningene tilpasset vi den immunstagende kompatible vevshydrgeldelipidasjonsmetoden (CLARITY) utviklet nylig for tykke hjerneseksjoner til helmonterte muse netthinner7.
CLARITY-metoden ble opprinnelig utviklet av Deisseroth-laboratoriet for immunstaining og avbildning av tykke hjerneprøver7. Den bruker et sterkt vaskemiddel, natrium dodecylsulfat (SDS) og elektroforese for å fjerne lipidkomponentene (som forårsaker lysspredning av vev), slik at proteiner og nukleinsyrer er på plass. De fjernede lipidene erstattes med et gjennomsiktig stillas som består av hydrogelmonomerer som akrylamid for å støtte den gjenværende proteinstrukturen. Det rensede vevet kan merkes via immunhiistokjemi og avbildet med betydelig økt lysinntrengningsdybde gjennom vevet (opptil flere millimeter under vevsoverflaten). Siden da har CLARITY-metoden blitt optimalisert og forenklet av flere forskningsgrupper8,9,10. En modifisert CLARITY-protokoll bruker en passiv clearing-teknikk for å unngå mulig vevsskade forårsaket av elektroforese for å rydde hele hjernen og andre intakte organer11. Denne metoden er imidlertid ennå ikke brukt på helmonterte netthinner. Her tilpasset vi den passive CLARITY-teknikken for helmonterte netthinner for å gjøre dem mer gjennomsiktige for immunhiistokjemi og avbildning. Vi fant at et flertall av de retinale proteinene som ble testet ble bevart under denne prosessen for immunhiistokjemi. Ved hjelp av refraktiv indeksmatchingsløsning kunne vi avbilde retinal neuroner over omtrent 200 μm tykkelse fra ONL til GCL i helmonterte netthinner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musepleie og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer for laboratoriedyr og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved Oakland University (protokoll nr. 18071).
MERK: Navn på løsningene og deres komposisjoner er oppført i tabell 1.
1. Vev forberedelse
- Euthanize musen med en overdose av CO2, etterfulgt av Cervical dislocation.
- Enucleate øynene med buede tang og overføre dem til en liten petriskål med 0,1 M PBS (Tabell 1). Under et disseksjonsmikroskop stikker du et lite hull langs hornhinnen-sclera-krysset med en nål. Overfør til 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time.
- Overfør øyet tilbake til en tallerken med PBS. Under et disseksjonsmikroskop, bruk disseksjonssaks for å kutte hele veien rundt hornhinnen-sclera-krysset. Fjern hornhinnen og linsen. Klipp ved foten av synsnerven og skrell forsiktig sclera av med tang for å isolere netthinnen.
- Lag fire små kutt jevnt rundt netthinnen og bruk en fin spissbørste dyppet i PBS for å legge den flatt (GCL-siden ned) i en kløverlignende form på en liten firkantet kutt fra nitrocellulose filterpapir for å stabilisere netthinnen.
- Overfør netthinnen ved hjelp av tang for å holde hjørnet av nitrocellulosepapiret (uten å berøre den monterte netthinnen) og legg det i en 48-brønnsplate med 4% PFA i 1 time.
- Overfør filterpapiret og netthinnen til en brønn med PBS og vask (3x i 5 min hver).
- Overfør til A4P0 (tabell 1) og inkuber over natten ved 4 °C med mild agitasjon.
- Pipette vegetabilsk olje inn i brønnen for å dekke A4P0-løsningen helt. Inkuber i et vannbad ved 40 °C i 3 timer uten risting.
- Vask (3x i 5 min hver) i PBS, og sørg for at all oljen er skyllet av. Bruk eventuelt en pipet for å fjerne gjenværende olje forsiktig fra toppen av brønnen før siste skylling.
- Inkuber i 10% SDS ved 40 °C i to dager med skånsom risting. Bytt ut SDS med fersk oppløsning den andre dagen.
- Overfør filterpapiret og netthinnen til PBS med Triton-X-100 (PBST, tabell 1) og vask (5x i 1,5 timer hver).
- Oppbevars ved 4 °C i PBST med 0,01 % natriumazid (NaN3) eller beveger seg direkte til immunstaining.
2. Immunstaining og brytningsindeksmatching
- Fjern netthinnen fra filterpapiret ved å skrelle den forsiktig av med en fin spissbørste i PBST.
- Inkuber netthinnen i primært antistoff (Tabell 2) fortynnet i blokkeringsløsning (Tabell 1) i 2 dager ved 40 °C med skånsom risting.
- Vask (5x, 1,5 timer hver) i PBST.
- Inkuber med passende sekundære antistoffer (Tabell 3) fortynnet i blokkeringsløsning i 2 dager ved 40 °C med skånsom risting og beskytt mot lys gjennom resten av prosedyren.
- Vask (5x, 1,5 timer hver) i 0,02 M fosfatbuffer (se tabell 1).
- Inkuber i sorbitolbasert refraktiv indeksmatchingsløsning (sRIMS, se tabell 1) ved 40 °C over natten med skånsom risting.
3. Montering
- Omriss en glassdeksle på 18 mm x 18 mm x 1,5 mm med en permanent finspissmarkør for å markere en firkantet grense på baksiden av et glassmikroskopsklie.
- Snu gliden og bruk en sprøyte til å spore grensen med en tynn linje med silikonfett på forsiden av lysbildet, og la det være et lite gap i ett hjørne for overflødig monteringsløsning å unnslippe.
- Overfør netthinnen til midten av det avgrensede området og ordne med en finspissbørste slik at den ligger flatt med fotoreseptorsiden mot glasssklie.
- Pipette ca 60 μL sRIMS slik at den dekker den flate netthinnen og strekker seg til ett hjørne av kabinettet, og pass på at netthinnen forblir flat og på plass.
- Påfør dekslene fra hjørnet med sRIMS og senk det sakte til det berører fettet på alle sider, og unngå dannelsen av luftbobler.
- Plasser en stabel med 3 deksler på hver side av den monterte netthinnen som avstandsstykke. Bruk langsiden på et annet lysbilde til å trykke ned dekslene slik at braketten er flat og jevn.
- Oppbevar skliene flatt ved 4 °C til bildebehandling.
4. Bildebehandling
- Bildeprøver på enten et konvensjonelt fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop (Materialtabell). Begynn med å plassere lysbildet på mikroskopstadiet og finne prøven.
MERK: Hvis et invertert objektivt mikroskop brukes, plasserer du lysbildet opp ned på scenen, først og sørger for at de utsatte områdene på lysbildet er fri for alt silikonfett og monteringsløsning. - For å få z-stablede bilder av co-labeled prøver, fokuser først på signalet i hver kanal individuelt og angi eksponeringstid eller skannehastighet, for henholdsvis fluorescens eller konfiskeringsmikroskop.
- Angi området for z-stabelen enten ved å angi fokusplanet manuelt øverst og nederst i ønsket område, eller ved å angi midtpunktet og deretter angi et område rundt midtpunktet.
- Juster trinnstørrelsen eller antall stykker etter ønske.
- Ta bildet og lagre den opprinnelige filen, i tillegg til å eksportere den som en TIFF-fil eller et annet ønsket format.
5. Bildeanalyse
- Bruk bildeanalyseprogramvaren (Tabell over materialer) til å justere lysstyrken og kontrasten i hver kanal til optimal klarhet oppnås i både enkeltbildene og den tredimensjonale gjengivelsen av z-stakken.
MERK: Hvis den valgte trinnstørrelsen er tilstrekkelig liten, kan 3D-dekonvolusjon også utføres for å forbedre signalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modifiserte CLARITY-bearbeidede netthinner er optisk gjennomsiktig vev.
For å formulere en vevsryddingsmetode som er kompatibel med immunhiistokjemiske applikasjoner i netthinnen samtidig som vi gir tilstrekkelig delipidasjon og beholder den strukturelle integriteten til de cellulære proteinene, tilpasset vi CLARITY-vevsryddingsmetoden til helmonterte muse netthinner. Vi var i stand til å forenkle protokollen og modifisere den for helmonterte netthinner (se Protokoll). Etter å ha fullført vevshybridisering, rydding og brytningsindeksmatching, viste netthinner behandlet med denne modifiserte CLARITY-protokollen nesten fullstendig optisk gjennomsiktighet gjennom tykkelsen på netthinnen (figur 1A) sammenlignet med ikke-bearbeidede kontroll netthinner (Figur 1B). Dette resultatet indikerer at denne modifikasjonen av CLARITY-protokollen gir tilstrekkelig ryddet helmontert netthinnevev.
Forbedret 3D-avbildning av nevroner i modifiserte CLARITY-behandlede netthinner.
For å vurdere kvaliteten og praktiske egenskapene til immunhiistokjemisk farging gitt av denne modifiserte CLARITY-metoden, farget vi CLARITY-bearbeidede netthinner med ulike primære antistoffer (tabell 2). Disse antistoffene markerer hver hovedcelletype i netthinnen: kegle fotoreseptorer, stang bipolare celler, amacrine celler, RGCer og glialceller, samt antistoffer mot subcellulære synaptiske proteiner. Med unntak av celleaktivitetsmarkøren fosfo-S6 (pS6) viste alle antistoffer som ble testet å være kompatible med CLARITY. Typiske eksempler er illustrert i figur 2. Vi utførte trippelmerking med antistoffer mot kjegle arrestin, tyrosinhydroksylase (TH) og RNA-bindende protein med multippel skjøting (RBPMS). Vi tok en serie med z-stable konfokale mikroskopibilder fra ONL til GCL. Individuelle bilder viste arrestinmerkede kjegler i ONL(figur 2A), TH-merkede DACer i INL (figur 2B) og RBPMS-merkede RGCer i GCL (figur 2C). Et overleggsbilde avslørte den relative plasseringen av disse nevronene gjennom hele tykkelsen på netthinnen (Figur 2D). Disse resultatene tyder på at CLARITY kan forbedre kvaliteten på mange standard immunhiistokjemiske flekker og tydelig avsløre 3D-strukturen til nevroner over hele tykkelsen på netthinnen i helmonterte preparater.
Modifisert CLARITY gir forbedret 3D-oppløsning av fine prosesser av retinal nevroner og synaptiske proteiner.
Vi analyserte videre TH-farging i CLARITY-bearbeidede helmonterte netthinner (figur 3A,B) og sammenlignet den med avbildning hentet fra standard helmontert forberedelse (Figur 3C,D). Konfokale bilder viser at dendritter og axonlignende prosesser av DACer ble avslørt mye tydeligere i en CLARITY-behandlet netthinne (figur 3A) enn i en standard netthinne (figur 3C). Spesielt viste axonlignende prosesser av DACs mer komplette ringlignende strukturer i en CLARITY-netthinne (se en innsats i figur 3A) enn i en standard netthinne (se en innsats i figur 3C). Spesielt var ringlignende strukturer av en CLARITY-netthinne tatt ved hjelp av fluorescensmikroskopi (figur 3B) nesten identiske med de som ble observert ved hjelp av konfokal (figur 3A). I tillegg løp axonlignende prosesser også mot den ytre netthinnen, som ble observert i X-Z-orienterte bilder (Figur 4A). Disse dataene antyder at CLARITY kan brukes til å identifisere axonlignende prosesser av DACer i helmonterte netthinner selv ved bruk av konvensjonell fluorescensmikroskopi.
Da AMPA-reseptorunderenheten GluA2 og postsynaptisk tetthetsprotein 95 (PSD-95) ble undersøkt i standard helmonterte netthinner, ble ingen av dem oppdaget, sannsynligvis på grunn av dårlig penetrasjon av antistoffer mot disse synaptiske proteinene i den dype netthinnen. For å avgjøre om CLARITY-bearbeidede netthinner tillater disse antistoffene å immunostain synaptiske proteiner, tredobler vi merket TH med underenheten GluA2 og PSD-95. Immunstaining mot GluA2 og PSD-95 viste tydelig puncta som avslørte individuelle GluA2-inneholdende AMPA-reseptorer (figur 4B) og putative postsynaptiske steder (figur 4C). Et overleggsbilde viste noe punktsetting tydelig på DAC-prosesser (Figur 4D). Vi avbildet et punkt av putativ colocalization med alle tre flekker og presenterte det i 3D-visninger (Figur 5). Fra alle tre visningene colokalerte TH tydelig med både GluA2 og PSD-95 (Figur 5 A-C). Disse 3D-perspektivresultatene fra helmonterte netthinner validerer våre tidligere rapporter om synaptisk uttrykk for GluA2-inneholdende AMPA-reseptorer på DAC-prosesser i vertikale netthinneskiver5,6.
Figur 1. CLARITY gir optisk gjennomsiktig vev. Helmonterte musehinner ble behandlet med den modifiserte CLARITY-metoden (se Protokoll) og hele netthinnen avbildet med et disseksjonsmikroskop, lagt på et 0,67 cm firkantet rutenett for å vise skala. A: CLARITY-behandlet helmontert netthinne, med rutenettlinjer tydelig synlige gjennom det gjennomsiktige vevet. Piler avgrenser plasseringen av netthinnen. B: Ikke-CLARITY-behandlet kontroll netthinne, festet i PFA i 1 time og inkubert i PBS. Rutenettlinjer er skjult av vevets relative tetthet. Skalastang: ca. 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Forbedret 3D-avbildning av nevroner over tykkelsen på netthinnen i CLARITY-bearbeidede netthinner. Clarity-netthinner på hele fjellet ble immunostert med antistoffer mot kjegle arrestin, TH og RBPMS. Bildet representerer en gjengivelse av et 3D-volum av et z-stablet konfokalt bilde, vist i X-Z-retning. A: Kjegle fotoreseptorer (pil) merket med kjegle arrestin (blå). En liten flekk er synlig i den indre netthinnen (pilspisser), sannsynligvis på grunn av bakgrunnsfarging. B: DAC soma og dendritter (pil) merket med TH (rød). Pilspisser indikerer retinal blodårer i den indre netthinnen, synlig på grunn av multi-label immunostaining. C: RGC somata (pil) merket med RBPMS (grønn). Pilspisser indikerer retinal blodårer synlig på grunn av autofluorescence og ikke-spesifikk farging av blodårene. D: Sammenslått bilde av trippelmerket farging, avslører den relative plasseringen av disse nevronene over tykkelsen på netthinnen, med kjegle fotoreseptorer plassert i det ytre kjernefysiske laget, DACs i det indre kjernefysiske laget og RGCer i ganglion cellelaget. Skalaen på volumvisningen er merket i trinn på 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. CLARITY avslører fine strukturer av DAC-morfologi. TH-immunstaining ble utført i CLARITY-bearbeidet (A og B) og standard (C og D) netthinner. Z-stablede bilder ble tatt med konfokal (A og C) og fluorescensmikroskopi (B og D). En innsats fra et enkelt optisk plan i hvert bilde fremhever ringlignende strukturer som antagelig dannes av axonlignende prosesser. Pilspisser indikerer DAC somata, og mange ringlignende strukturer er synlige (eksempler er indikert med piler) i den tette plexusen av dendritter og axonlignende prosesser avslørt i CLARITY-bearbeidede netthinner (A og B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Modifisert CLARITY gir forbedret 3D-oppløsning av fine dendrittiske strukturer og synaptiske proteiner. Trippel immunstaining ble utført i CLARITY-bearbeidede helmonterte netthinner med antistoffer mot TH, GluA2 og PSD-95. En volumgjengivelse ble rekonstruert fra z-stablet konfokal avbildning og presentert i en vinklet X-Z-retning. A: TH-merket DAC somata (pilspisser) i det indre kjernefysiske laget og prosesser (gule piler) som stratifiserer i det distale indre plexiformlaget (rødt). Hvite piler indikerer sentrifugalprosesser som strekker seg mot den ytre netthinnen. B: Tett punkteringsuttrykk av GluA2-inneholdende AMPA-reseptorer over det indre plexiformlaget (grønt). Pil indikerer autofluorescens fra et netthinneblodkar. C: Puncta avslører postsynaptiske nettsteder merket av PSD-95 i det indre plexiformlaget (blått). Piler indikerer blodårer, tydelig på grunn av bruk av en mus monoklonalt antistoff mot PSD-95. D: Overleggsbilde som viser overlapping av TH-merkede DAC-prosesser med uttrykk for GluA2 og PSD-95. Skalaen på volumvisningen er merket i trinn på 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Synaptisk uttrykk for GluA2-inneholdende AMPA-reseptorer på DACer. Et punkt med putativ trippel colokalisering av TH, GluA2 og PSD-95 vist i figur 4 ble valgt og undersøkt i 3D. A1 representerer et segment av en DAC-prosess (rød) i X-Z-retningen (A5). A2 og A3 viser en enkelt GluA2 punktsetting (grønn) og PSD-95 punktspill (blå), henholdsvis i samme retning. Det sammenslåtte bildet (A4) demonstrerer trippel colokalisering av TH, GluA2 og PSD-95 (pil). B1-B4 viser samme punkt for colokalisering (pil) i en Y-Z-retning (B5). C1-C4 viser samlokalisering av samme punkt (pil) i X-Y-planet (C5). Trippel colokalisering er tydelig i hver retning. Skalalinje: 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| løsning | komposisjon | Notater |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | Juster pH til 7,4 |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% akrylamid | Forbered deg på is, aliquot og oppbevar på -20 ºC |
| 0,25 % VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1 % (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Blokkeringsløsning | 2 % NDS eller 1 % BSA | |
| 0.01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0,1 M Fosfatbuffer | 11,93 g Na2HPO4/liter | Juster pH til 7,5 |
| 15,34 g NaH2PO4/liter | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% sorbitol | Juster pH til 7,5 med NaOH |
| 0,1 % tween-20 | ||
| 0.01% NaN3 | ||
| 0,02 M fosfatbuffer | ||
Tabell 1. Sammensetning av løsninger.
| antistoff | IHC | vert | fortynning | katalog # | leverandør | Ab register-ID | mål |
| Blåfølsom opsin | +3 | Geit polyklonal | 1:1000 | SC-14363 | Santa Cruz bioteknologi | AB_2158332 | S-kjegle |
| Kjegle arrestert | +2 | Kanin polyklonal | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | kjegle |
| Protein kinase C alfa (PKC-α) | +3 | Kanin polyklonal | 1:1000 | SC-208 | Santa Cruz bioteknologi | AB_2168668 | Stang bipolar celle |
| Glial fibrillært surt protein (GFAP) | +3 | Geit polyklonal | 1:500 | SC-6170 | Santa Cruz bioteknologi | AB_641021 | Astrocytt |
| Tyrosinhydroksylase (TH) | +3 | Sau polyklonal | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Dopaminerg amacrine celle |
| Tyrosinhydroksylase (TH) | +2 | Kanin polyklonal | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Dopaminerg amacrine celle |
| Kolinacetyltransferase (ChAT) | +1 | Geit polyklonal | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Starburst amacrine celle |
| RNA-bindende protein med multippel skjøting (RBPMS) | +1 | Marsvin polyklonal | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Retinal ganglion celle |
| Glua2 | +3 | Kanin polyklonal | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Ca2 +-ugjennomtrengelig AMPA-reseptor |
| Glua2 | +2 | Mus monoklonal | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Ca2 +-ugjennomtrengelig AMPA-reseptor |
| Postsynaptisk tetthet protein 95 (PSD-95) | +3 | Mus monoklonal | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Synaptiske nettsteder |
| Fosfo-S6 (pS6) | 0 | Kanin polyklonal | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Markør for celleaktivitet |
Tabell 2. Sammendrag av primære antistoffer testet. IHC-legende: +3 = konsekvent, svært spesifikk farging; +2 = konsekvent god farging, minimal bakgrunn; +1 = god farging, litt bakgrunn; 0 = inkompatibel med CLARITY.
| vert | Målarter | Konjugat | fortynning | leverandør |
| esel | Anti-sauer | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Anti-sauer | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Anti-kanin | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Anti-kanin | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| geit | Anti-kanin | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Antimus | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Antimus | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Anti-geit | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| esel | Anti-geit | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| geit | Anti-marsvin | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Tabell 3. Sammendrag av sekundære antistoffer testet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifikasjon av CLARITY-protokollen for helmonterte netthinner.
Vi har forenklet CLARITY-protokollen for å oppnå tilstrekkelig polymerisering uten behov for vakuumevakuering eller uttørkingskammer, som det brukes i de fleste tidligere studier7,9,11. Polymerisasjonsprosessen hemmes av oksygen, og krever at prøven isoleres fra luft under polymerisasjonstrinnet i protokollen. Men i stedet for å avgasse med nitrogen, fant vi at å dekke prøven med olje tilstrekkelig isolerte prøven for å tillate polymerisering uten å påvirke resten av protokollen negativt etter en grundig skylling, som tidligere dokumentert12. Vi forenklet videre protokollen med en passiv clearingmetode for å begrense risikoen for vevsbruning og skade på vevsstruktur forbundet med elektroforetisk rydding11. Den passive ryddingen akselereres av mild agitasjon og forhøyet temperatur, slik at fullstendig vevsrydding på bare to dager. I løpet av denne tidsperioden oppnås tilstrekkelig delipidasjon for å resultere i optisk gjennomsiktig vev mens du minimerer tapet av proteiner og andre biomolekyler integrert i cellulær struktur og immunhiistokjemisk farging.
CLARITY bevarer proteiner av retinal nevroner og glialceller i helmonterte preparater.
Våre resultater viser at nesten alle antistoffer testet arbeid i CLARITY-bearbeidede netthinner. Disse antistoffene markerer fotoreseptorer, bipolare celler, amacrine celler, RGCer og glialceller. Selv om vi ikke var i stand til å teste antistoffer for undertyper av hver klasse av retinal neuroner, våre resultater innebærer at CLARITY behandlet netthinner kan brukes for de fleste cellulære markører i netthinnen. Selv om de fleste antistoffer vi testet også kan immunostain retinal nevroner i ikke-CLARITY behandlet netthinner, fant vi at CLARITY tillot tilstrekkelig antistoff penetrasjon i det dype vevet i netthinnen, noe som gir god spesifisitet av farging i midtlaget av netthinnen. I tillegg fant vi ut at CLARITY forbedret lysgjennomtrengning gjennom tykkelsen på netthinnen, noe som reduserte lysspredning og tillot høyoppløselig bildebehandling gjennom selv de dypeste lagene. Disse faktorene bidrar til en forbedring i både farging og avbildning i CLARITY-bearbeidede helmonterte netthinner sammenlignet med ikke-CLARITY standard helmontert IHC13. Den reduserte bakgrunnen og forbedrede 3D-bildebehandling og volumgjengivelser tillater en fullstendig undersøkelse av cellulære strukturer gjennom alle lag over tykkelsen på netthinnen.
CLARITY avslører fine prosesser og synaptisk struktur av DACer i helmonterte netthinner.
Våre resultater viser at ringlignende strukturer og sentrifugalprosesser av DACs avsløres i CLARITY-behandlet bedre enn i ikke-CLARITY helmonterte netthinner. Spesielt gir immunstaining med CLARITY-bearbeidet vev god oppløsning av disse fine strukturene selv med standard fluorescensmikroskopi uten behov for konfektavbildning. Gitt betydningen av DACs i visuell funksjon, kan CLARITY-preparatet brukes til å undersøke DACs strukturer i normale netthinner og morfologiske endringer under sykelige forhold.
Ved immunisering for PSD-95 og GluA2 med standard fullkomment vev observerte vi lite eller ingen merking av disse subcellulære strukturene i de dype lagene i netthinnen, noe som indikerer dårlig antistoffinntrengning. Anvendelsen av CLARITY-protokollen tillater tydelig farging av disse proteinene i de indre netthinnelagene, noe som indikerer forbedret antistoffinntrengning til det dype vevet. Våre resultater viser at CLARITY tillater påvisning av synaptiske proteiner på DAC-prosesser i helmonterte netthinner, som normalt observeres i vertikale skiverpreparater 6. Siden axonlignende prosesser ikke kan skilles fra dendritter i vertikale skiver, gir CLARITY helmonterte netthinner en mulighet til å avgjøre om synaptiske innganger til DACer fra andre nevroner som bipolare celler og ipRGCer forekommer i dendritter, axonlignende prosesser eller begge5,6. Siden AMPA-reseptorer og PSD-95-proteiner er utbredt i hele IPL, setter uttrykket av disse proteinene på DACs et utmerket eksempel for CLARITY-netthinner som skal brukes til identifisering av synaptiske proteiner i andre netthinne nevroner.
Vurderinger, begrensninger og fremtidige anvendelser av CLARITY-protokollen for netthinner med hel montering.
For det første legger polymerisasjons- og clearingprotokollene for CLARITY-bearbeidede helmonterte netthinner flere dager til vevsforberedelsesprosessen. Metoden er imidlertid fortsatt gjort svært praktisk av det faktum at avklarte netthinner kan lagres i natriumazidholdig PBS i opptil to uker med minimal vevsforringelse. For det andre ble det observert en viss utvidelse av vevet gjennom hele clearingprosessen som dokumentert i tidligere anvendelser av CLARITY7,11. Vi fant imidlertid at netthinnen returnerte til omtrent original størrelse ved likevekt med brytningsindeksmatchingsløsningen. De potensielle mindre endringene i vevsvolumet kan ikke forårsake betydelig forvrengning av cellulær eller subcellulær struktur7,11. For det tredje, når man ser på tykkere hjerneprøver, blir mikroskopmålet ofte nedsenket direkte i monteringsmediet for å tillate fullstendig brytningsindeks som samsvarer fra mikroskoplinsen gjennom vevet12. Med tynnere prøver som netthinnen brukte vi deksler for montering for å gjøre prøvene flatere og jevnere for avbildning. Effektene av brytning gjennom omslagsslipet ser ut til å være minimale på avbildning. For det fjerde viser noen av bildene våre ikke-spesifikke blodkarfarging fordi vi ikke parfymerer hele dyret med intrakariac perfusjon (foreslått å bli brukt til å unngå ikke-spesifikk farging) før vi forfører øynene. Til slutt kan den nåværende protokollen tilpasset mus brukes til netthinner av andre arter. Spesielt er netthinner av store dyr som hunder, griser, hester og primater mye tykkere enn mus. Denne CLARITY-protokollen kan gjøre netthinner av disse dyrene mer optisk gjennomsiktige etter fjerning av lipider og bevare de fine strukturene til netthinnene nevroner og deres proteiner for immunstaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil takke Bing Ye, Nathan Spix og Hao Liu for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) og Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
